Acizii nucleici

Obiectivele:Tipurile de acizi nucleici, funciile i repartizarea lor n celul.Constituienii acizilor nucleici; bazele azotate, pentozele, acidul fosforic.Nucleozidele i nucleotidele. 3, 5- cAMP Acidul Dezoxiribonucleic (ADN): structura i funciile. Dublul helix i conformaiile lui de tip B, A, Z.Nivelurile de compactizare a moleculei de ADN la procariote (nucleoidul) i eucariote (nucleozomii, cromatina i cromozomii). Proprietile fizico-chimice ale ADN. Denaturarea i renaturarea. Hibridizarea.Replicarea ADN la procariote matricea, substraturile, enzimele i factori proteici. Mecanismul biochimic i etapele biosintezei ADN. Particularitile replicrii la eucariote. Telomerele i telomeraza. Structura telomerazei. Rolul biomedical al telomerazei.Mecanismele biochimice ale reparaiei ADN. Enzimele implicate.Mecanismele biochimice ale genezei mutaiilor punctiforme. Rolul biomedical al mutaiilor

Acizi nucleiciAcizi nucleici sunt polinucleotide, alctuite din mononucleotide, unite prin legturi 3, 5-fosfodiesterice. ADN - acidul dezoxiribonucleic; ARN - acidul ribonucleic.

ADNLocalizarea: 97-99% - concentrat n nucleu 1-3% - situat n MC. Rolul: deine, pstreaz i transmite informaia genetic.

ARNLocalizarea:11% - n nucleu15% -n mitocondrii50% - n ribosomi24% - n hialoplasmDeosebim: ARN mesager ARN ribozomal ARN de transportARN nuclear heterogenARN nuclear cu molecul mic

ARN mesager (mARN) Localizat -n nucleu i citozol. prezint copia sectorului de ADN i conine informaia despre structura catenei polipeptidice a proteinei. Rolul:Transmite informaia de la ADN spre ribozomi, unde o traduce n sinteza de proteine. ARN ribozomal (rARN) constituie 60% din totalul ARN-ului. Localizat- n ribozomii citoplasmei.Rolul - formeaz scheletul ribozomilor. Joac un rol auxiliar n procesul de asamblare a proteinelor.

ARN de transport (tARN)constituie 15% din totalul ARN-lui. Localizat: n citoplasm, ribosomi, mitocondrii.Rolul: particip la activarea i transportul AA spre ribozomi i asamblarea lor n polipeptide.

Structura chimic a ANLa hidroliz AN degradeaz n mononucleotide (MN), MN la hidroliza complet degradeaz n BA, pentoze i acid fosforic. ADN----A; G; C; T + dR+ H2PO3ARN---- A; G; C; U+ R+ H2PO3

Bazele azotateBA se clasific n: 1. majore:purinice: A, G pirimidinice: C,T,U2. minore:purinice (2metil A; 1 metilG) pirimidinice (5 metil C;5 hidroximetil C)

Purine:Structura BApirimidine:

Structura BA minore

Proprietile BA:Sunt slab solubile n H2OBA pirimidinice prezint fenomenul de tautomerie: forme lactim (enol OH) lactam (ceto C=O)Sunt responsabile de informaia geneticBA purinice- au structur plan; cele pirimidinice- aproape plan, puin platmax capacitii de absorbie n ultraviolet este ntre 260-280 nm

Bazele azotate prezint fenomenul de tautomerie

Bazele azotate prezint fenonemul de tautomerieFormele mai stabile:Forma lactam este mai stabil dect forma lactimForma amino este mai stabil dect forma imino

n acizii nucleici exist formele lactam i amino

PentozeAtomii de carbon ai pentozelor sunt numerotai de la 1 la 5.Pentoza din ADN este dezoxiriboza, cruia i lipsete gruparea hidroxil 2-OH.Pentoza din ARN este riboza.12345lipsete2-OH

Structura R i dR

NucleozideAlctuite dintr-o BA (purinic sau pirimidinic) +o pentoz (R sau dR)

BA purinice +R(dR) --- ozin BA pirimidinice +R (dR) --- idin

Unite ntre ele prin legtura N glucozidic

Nucleozideatomul C-1 al pentozei este unit cu N-9 al purinei

Nucleozideatomul C-1 al pentozei este unit cu N-1 al pirimidinei

Structura nucleozidelor

Nucleozidele Proprietile:Mai solubile n H2O dect BAMai stabile n soluii alcalineUor se hidrolizeaz la nclzire cu acid

NUCLEOTIDE - compui alctuii din nucleozide i rest de acid fosforicNucleozid mono-; di-; trifosfafat

NUCLEOTIDE

Phosphate ester bondsNUCLEOTIDE

NUCLEOTIDE

Nucleotide - RolulElement structural al ANIntermediari energetici (ATP- purttorul energiei chimice n organism)Intr n componena CoServesc ca activatori ai unor molecule (UDP-Gl; CDP-colina)Servesc ca mesageri secunzi intracelulari ai hormonilor (AMPc; GMPc)

AMPc3,5adenozin monofosfatul ciclic (AMPc) este mesager secund imlicat n transmiterea mesajului hormonal din mediul extracelular n interiorul celulei.

NUCLEOTIDE

Structura primar a ANReprezint secvena mononucleotidelor n lanul polinucleotidic liniar, legate ntre ele prin legturile 3' - 5' fosfodiestericeCatenele au dou capete:5 nucleozid tri fosfatul;3 gr. OH liber

Str. primar a ADN i ARN

Str. primar a ADN

Dublu helixul ADNWatson i Crick (1953) au postulat modelul structural al moleculei de DNA - dublul helix (spiral dubl)

Caracteristicile dublei spirale:

2 lanuri polidezoxiribonucleotidice se rsucesc helicoidal n jurul unui ax comun, formnd dublul helix cu orientare spre dreapta;Cilindrul ce ncadreaz dublul helix are d=2nm

Caracteristicile dublei spirale:3. lanurile sunt antiparalele (unul are direcia 53, altul 35)4. complimentaritatea (A i corespunde T; iar G-C).5. Stabilitatea dublului helix este asigurat att de interaciunile hidrofobe dintre BA, ct i de legturile de hidrogen ntre BA (A=T formeaz 2 legturi de hidrogen, iar G C trei legturi).

Caracteristicile dublei spirale:6. BA hidrofobe sunt situate n interiorul spiralei duble i aranjate sub form de stive, pe cnd complexul pentozofosfat este situat la exteriorul spiralei duble, bine interacioneaz cu apa, de aceia molecula gigant de DNA se dizolva n ap.

Caracteristicile dublei spirale:7. Spiral este regulat (fiecare spir cuprinde 10 nucleotide). Distana dintre BA nvecinate este de 0,34 nm, perioada de identitate (pasul) 3,4 nm. 8. La pH=7 grupele fosfat sunt ionizate, poarta sarcini negative, deaceia DNA prezint acid puternic. 9. Dublul helix este de tip plectonemical (transversal n acelai plan), dar nu paranemical (longitudional)

10. nu este simetric, avnd adncituri mici i mariAsimetria demonstreaz orientarea steric a ADN n replicare i transcriereCaracteristicile dublei spirale:

Legitile lui ChargaffConinutul A=T, iar al G=C n orice preparat de DNA, independent de specie, suma bazelor purinice este egal cu cea a bazelor pirimidinice (A+G=T+C)Preparatele de DNA separate din diferite esuturi a uneia i aceeiai specie de organisme sunt absolut identice privind componena nucleotidic.Componena nucleotidic a DNA la aceeai specie nu se modific odat cu vrst, nu depinde de regimul alimentar i modificrile mediului.

Legitile lui Chargaff5. dac A+T este mai mare dect G+C avem DNA de tip AT6. dac G+C este mai mare dect A+T avem DNA de tip GC7. t de topire este mai mica cnd predomin perechile A-T8. t de topire este mai mare cnd predomin perechile G-C 9. la eucariote DNA mitocondrial este circular

Exist diferite forme de DNAcare sunt determinate de gradul de dehidratare a AN: A,B i Z.

forma A:conine 11 resturi la o spir, este rsucit spre dreapta.Pasul spirei este de 32 Aforma clasic B:conine 10,4 perechi de baze per spir.este rsucit spre dreapta.- 10 nucleotide ocup 34 A (3,4 nm).- o nucleotid cuprinde 3,4A (0,34 nm).Conformaia Z este rsucit spre stnga.conine 12 baze per spir pasul spirei este de 45 A

Caracteristicile conformaiilor elicei ADN

CaracteristiciConformaie BConformaie AConformaie ZSens de rsuciredreptdreptstngPerechi de baze per spir10,4 1112 Pasul (nlinea pe ax)/pe plan de baze3,4nm0,34 nm3,2 nm0,29 nm4,5 nmG-C -0,35 nmC-G 0,41 nmDiametru2 nm2,5 nm1,8 nmFosa: mare micMare i profundngust i profundngust i profundMare i profund-ngust i profund

Structura ADN BImaginea se bazeaz pe studiile cu raze X realizate pe dodecamerul d(CGCGAATTCGCG)

Structura ADN AVedere de-a lungul axei helixului

Structura ADN ZVedere de-a lungul axei helixului

Trecerea ADN B n ADN ZTrecerea ADN-B n ADN Z, reprezentat la nivelul unui fragment de 4 pb, implic rsucirea cu 1800 a fiecrei perechi de baze n raport cu lanul oz-fosfat

ADN circularLa bacterii, virui cele 2 extremiti ale unor molecule de ADN dublu catenare se pot lega covalent formnd ADN circular

De la ADN la cromozomiIn eucariote ADN-ul este stocat n nucleu. Deoarece nu este suficient spaiu iar molecula ADN-ului este extrem de mare (lungimea ADN de la o singur celul uman e 2m!!!), ADN-ul trebuie compactat.

Organizarea materialului cromosomial la eucarioten perioada de repaus a celulei, aproape tot ADN se afl n cromatina nucleului, care formeaz cromosomi naintea mitozei. Cromatina conine: ADN (35%); ARN (5%) proteinele bazice histone (H1, H2A, H2B,H3, H4) i proteine nehistonice- hertone. Unitatea structural a cromatinei este nucleosomul

Nucleosomul este un octamer histonic (2H2A; 2H2B; 2H3; 2H4) nfurat de aproximativ de 2 ori de ADN (dublul helix, cu lungimea de 146 perechi de nucleotide).ntre 2 nucleosomi se gsete ADN de legtur (linker) asociat cu H1

Nucleosomul

Nivelele de compactare a ADN n nucleu-Primul nivel-

rfiecare unitate de ADN spiralat de 1,75 ori n jurul unui compelx histonic se numete nucleozom.

Histonele sunt proteine bazice bogate n aa bazici (Arg pt.H2A, H2B i, Lys pt H3, H4).

Nivelele de compactare a ADN n nucleu-Primul nivel-r

Polinulceozomul seamn cu nite mrgele pe a (=fibrile de cromatin de 10nm ).

Mrgele de ametist

Nivelele de compactare a ADN n nucleu-al doilea nivel- Polinucleozomul se superspiraleaz pentru a forma structura de solenoid.

Solenoidul conine 6-7 nucleozomi per tur. Pasul e de 10nm, diametrul de 30 nm.

Solenoidul formeaz fibrele de cromatin de 30 nm.

30 nm Solenoid ~40 / 50DNAFirul de cromatin? ~ 1,000Cromosoma metafazic/ cromatina interfazic ~ 10,000Compactizarea cromatineiNucleosoma = ctamer de histoneH2a, H2b, H3, H4 146 / 200 bp DNACompactizare ~10 ori

Nivelele de compactare a ADN n nucleu-nivelele 3,4 i 5-

rFibrele de cromatin se compacteaz i mai mult formnd domenii n form de bucl.- Aceste domenii n bucl sunt superspiralizate i organizate n structuri distincte numite cromozomi.- ADN -ul uman nuclear ( genomul) const n 23 perechi de cromozomi.

Cromozomii genomului uman

STRUCTURA ADNului

Proprietile fizico-chimice ale acizilor nucleici- masa molecular mare.proprietatile coloidale si osmotice, tipice pentru toi compuii macromoleculari.proprietile lor hidrofile depind de fosfai.viscozitatea i densitatea nalt a soluiilor, capacitatea de denaturare.la pH fiziologic toti AN sunt polianioni (-)

Denaturarea i renaturareaDenaturarea sub aciunea agenilor denaturani (temperaturii, pH, substanelor chimice) are loc ruperea legturilor de hidrogen i forelor hidrofobe ce stabilizeaz structura AND -ului. ADN i pierde proprietile biologice.

Denaturarea ADN

RenaturareaLa rcirea treptat catenele din nou se reunesc dup principiul complementarittii, formnd spirala dubl nativ. Acest fenomen se numete renaturare (atunci cnd t e mai mic dect cea de topire). La racirea brusc renaturarea nu are loc. Denaturarea i renaturarea AN este nsoit de schimbarea activittii lor optice.

Renaturarea ADN

Hibridizarea ANPe capacitatea de renaturare a AN este bazat metoda de determinare a gradului de nrudire a AN, care poart denumirea de hibridizare molecular. La baza ei st mperecherea complementar a sectoarelor unicatenare ale AN cu formarea unui heteroduplex

Hibridizarea ANAN se denatureaz separat;se incubeaz mpreun ambele tipuri de DNA (ori DNA i RNA). n condiiile unui grad relativ crescut de complementaritate a acestora se formeaz moleculele hibride (DNA-DNA sau DNA-RNA). Aceste molecule constau din sectoare spiralate i nespiralate. Cu ct gradul de nrudire este mai nalt, cu att hibridizarea este mai complect.

Hibridizarea AN

Hibridizarea AN

Aceast metod a permis descoperirea particularitilor structurii primare a DNA. S-a stabilit, c n componena DNA a animalelor se afl sectoare cu o succesiune nucleotidic identic, care de multe ori se repet. Hibridizarea decurge foarte repede. Restul DNA este prezentat printr-o succesiune unical a nucleotidelor, care nu se dubleaz.

Hibridizarea AN

REPLICAREA TRANSCRIPIA

Dogma central a geneticei moleculare

Dogma central a geneticii moleculare

Replicarea

transmiterea informaiei genetice de la ADN parental la ADN fiic.Localizarea: n nucleolProces semiconservativBiderecionalSemidiscontinuu

Semi-conservativ

Replicarea ADN este bi-direcional (Cairns, 1963).

Replicarea ncepe ntr-un punct bine determinat numit origine de replicare (ori) i pornind din acest punct se deruleaz simultan n ambele direcii.bidirecional

Bidirectional DNA replication in E. coli

Replicarea este semi-discontinu

Reiji Okazaki a propus i demonstrat n 1968 c n timp ce sinteza unei catene (catena leading) este continu, sinteza celei de-a doua catene (catena lagging ) este discontinu (n runde de 150-250 nt).

Caracteristicile:

prezena praimerului este obligatoriereplicarea este cuplat cu desfurarea DNA parental (necesit energie)replicarea decurge n ambele direcii cu aceeai vitez. Pe catena ntrziat se sintetizeaz fragmentele Okazaki.

Caracteristicile:

Este bazat pe mpachetarea complementar a BACatena-fiic este antiparalel cu catena parental dar nu identic dup secvena nucleotidicFora motrice a procesului este hidroliza pirofosfatului

Componentele necesare replicrii:

Matri - ADN bicatenarSubstrat:dezoxiribonucleozid trifosfaii: dATP, TTP, dGTP, dCTP; ribonucleozid trifosfaii: ATP, GTP, CTP, UTP3. prezena ionilor de Mg, Mn; Zn4. Sistemul multienzimatic complex

Sistemul multienzimatic complexHelicaza (Proteina DnaB) - desfacerea dublului helix, treptat, pe poriuni mici (necesit energie; consum 2 molecule de ATP per 2 legturi de hidrogen desfcute).Single stranded proteins (SSBs) - se leag de cele dou catene ADN i le menine separate

Sistemul multienzimatic complex3. Topoisomerazele - I i II nltur supertorsiunile ADN, rezolv problemele topologice aprute n cursul desfacerii lui.

Topoizomeraza de tip I relaxeaz ADN prin inducerea de tieturi la nivelul unei singure catene a duplexului ADN

Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I acioneaz ca o endonucleaz reversibil, printr-un mecanism de tiere-coasere care permite rotaia liber a ADNmc (aciune de suveic) .economic (nu necesit aport energetic): hidrolizeaz o legtur fosfat diesteric a crei energie o conserv ntr-o legtur fosfat esteric implicnd Tyr din centrul activ al enzimei i ulterior o folosete la refacerea catenei incizate

tiererelaxarecoasere

topoizomeraza II ADN-girazaIntroduce n molecula de ADN supertorsiuni (-), spre stnga, n sens contrar celor create de naintarea bifurcaiei de replicare; astfel compeseaz n avans constrngerile impuse de desrsucirea duplexului de ADNNecesit energie (consum de ATP)

ADN giraza nltur super-rsuricirile pozitive care apar n mod normal la nivelul furcii de replicare

Topoizomeraza de tip II modific topologia ADN prin scindarea si resudarea ambelor catene

Modelul activitii catalitice a topoizomerazei II (ADN giraza) din E. coli

Sistemul multienzimatic complex4. . Primaz - sintetizeaz primerul n direcia 5'- 3 .

Sistemul multienzimatic complex5. ADN polimeraza ( ADNp I, II, III)- sinteza catenei fiice n direcia 5'3' . - ADN p III: aciune polimerazic (5'- 3)- aciune exonucleazic (3'- 5) ADN p II - este implicat n reparea leziunilor ADN (are activitate 3'->5 exonucleazic. - ADN p I - posed activitate 5'- 3 exonucleazic, nltur primerul i-l nlocuiete cu fragmente de ADN

PPPPPPPPPPCH2CH2CH2OHOHOOOBaseBaseBaseCH2CH2CH2OHOOOBaseBaseBaseCap 5' Cap 3 (n cretere)3'5'3'H20+REACTIA CATALIZAT DE ADN POLIMERAZPiro-fosfat

ADN polimerazele la procariote (continuare)

ADN pol IV- Pol IV este o ADN polimeraz predispus la erori de mperechere (nu are activitate de proof-reading ca la pol III, pol II i pol I) - Pol IV este responsibil de 50% din mutaiile adaptative.

ADN pol V- Pol V aparine unei ci speciale de reparare (un fel de ultima barier) denumit calea SOS de reparare a ADN.- Pol V este sintetizat cnd celula este expus la doze mari de radiaii sau de mutageni, cnd pot s apar lez. majore ADN.

Sistemul multienzimatic complex6. ADN ligaza- unete fragmentele Okazaki de pe catena ntrziat. Catalizeaz formarea unei legturi fosfat diesterice ntre 3'-OH a unui fragment de ADN i extremitatea 5' monofosfat al altuia.

Enzimele implicate n replicarea ADN

Mecanismul replicrii3 etape: iniierea, elongarea, Terminarea

ETAPELE REPLICRII ADN(i elementele-cheie ale fiecrei etape)

Iniierea: primozomul- un complex de proteine i originea replicrii ori

Elongarea: replizomul- un complex de proteine, asociate cu ADN cu rol n sinteza catenelor noi de ADNTerminarea: proteina Tus - situsul de terminare ter

Iniierea replicrii Identificarea originii de replicare

Dezrsucirea mediat de ctre helicaz (denaturarea) duplexului ADN cu fomarea ADNmc i a bifurcaiilor de replicare

Legarea SSB la ADNmc

Formarea primozomului (conine i primaza)

Sinteza ARN primer

Originea replicriiOriginea replicrii (oriC) este o regiune de 245 perechi baze bogat n ATOriC este recunoscut de ctre proteina dnaA care se leag la oriC, i care mpreun cu proteina dnaB (helicaza) desface ADNdc (folosind ATP).

Iniierea parcurge dou etape:

Formarea furcii de replicaie- sub aciunea helicazelor are loc desfacerea duplexului parental (la scindarea leg. de H dintre BA - se utilizeaz min 2 mol. de ATP). La desfacerea duplexului parental apar regiuni superhelicoidale, care se regleaz cu ajutorul girazei (topoizomerazei). Topoizomeraza efectueaz rupturi monocatenare apoi sudeaz legtura fosfodiesteric i favorizeaz relaxarea structurii DNAb. Sinteza primerului

Sinteza primerului - sub aciunea primazei se sintetizeaz o poriune mic de ARN n direcia 5'- 3'. Primerul este format din 4-12 ribonucleotide. Cruparea 3OH e un iniiator al sintezei de ADN.

2. ETAPA DE ELONGARE

ElongareaADN polimeraza III unindu-se la captul 3' OH al primerului ncepe sinteza ADN fiic. Reacia decurge prin atacul nucleofil al grupei 3' OH al primerului asupra unui dRNTP complementar catenei de ADN matri. Se formeaz legtura fosfodiesteric i se elibereaz PP; hidroliza PP determin polimerizarea propriu zis.

DNA Polymerase Mechanism

ElongareaElongarea decurge n direcia 5' 3 i parcurge cu aceeai vitez pe ambele cateneCatena de baz se va sintetiza continuu, iar cea ntrziat - discontinuu: va fi format din fragmente Okazaki (dimensiuni de 1000 2000 nucleotide la procariote i 150-200 la eucariote).

Etapa de elongare Catena parental 3- 5 (care este citit n aceei direcie cu deplasarea bifurcaiei de replicare) este copiat continuu.Catena nou astfel sintetizat este catena leading.

Etapa de elongare -Catena parental 5- 3 (care este citit n direcie opus fa de deplasarea bifurcaiei de replicare) este copiat discontinu.Catena nou astfel sintetizat este catena lagging i este sintetizat n fragmente mici (1fragment per rund sintez)-fragmentele Okazaki

Etapa de elongare

Etapa de elongare ADN polimeraza I exclude primerii i sintetizeaz complementar ADN.Fragmentele snt unite cu enzima ADN ligaza (necesit ATP la eucariote i NAD la procariote).

Schema etapelor de iniiere i elongareOkazaki fragment

3. ETAPA DE TERMINARE

Terminarea replicriiRegiunea de terminare : - situat la 180 grade fa de ori; conine capcane pentru bifurcaia de replicare- la acest nivel bifurcaiile de replicare se ntlnesc i dezleag catenele de ADN nc asociate.

Situsurile de terminaresunt pori care permit trecereabifurcaiei de replicare ntr-unsingur sens; - conin 23 perechi de bazeTerDTerCTerBTerA

Situsurile Ter foreaz cele dou bifurcaii de replicare s se ntlneasc ntr-un punct specific.

Helicaza se leag la originea de replicare i dezrsucete dublu helixul ADN.Replicarea

DNA pol adaug nucleotide la ARN primer.Replicarea

DNA pol verific bazele mperecheate i le nlocuiete pe cele greit mperecheate.Replicarea

Sinteza catenei leading continu n direcia 5 to 3.Replicarea

Sinteza discontinu produce segmente ADN numite fragmente Okazaki. Replicarea

5 5 5 35 3 3 5 3Direcia de avansare a bifurcaiei de replicare 3Alungirea fragmentului Okazaki.Okazaki fragmentReplicarea

5 5 3 5 3 35 3 3 5 5 3Alungirea catenei leading i sinteza de noi fragmente pe Okazaki msur de bifurcaia mai avanseaz.Replicarea

3 5 3Alungirea noului fragment Okazaki, n paralel cu alungirea catenei leading .Replicarea

Activitatea exonucleazic a ADN pol I ndeprteaz ARN primer.Replicarea

Activitatea polimerazic a ADN pol I umple golurile.Ligaza formeaz legturi fosfatdiesterice ntre gruparea 3 OH de la captul unui fragment Okazaki cu gruparea 5 fosfat de la captul altui fragment Okazaki. .Replicarea

Topoisomerase nicks DNA to relieve tension from unwinding2314567Pol III synthesises leading strandHelicase opens helixPrimase synthesises RNA primerPol III elongates primer; produces Okazaki fragmentPol I excises RNA primer; fills gapDNA ligase links Okazaki fragments to form continuous strandREPLICAREA ADN

Replicarea simultan prin formarea de bucle ale matriei catenei lagging.

Replicarea simultan: molecula ADN pol III este responsabil de sinteza ambelor catene de ADN.

Caracteristici ale replicrii la eucarioteReplicarea este bidirectionalAre mai multe origini de replicare deoarece molecula de ADN este foarte lung i viteza de aciune a replizomului este micHistonele vechi se asociaz cu duplexul nou care conine catena leading.

Multiple regiuni ori la eucariote

Replicarea la eucarioteParticulariti:ADN polimerazele: - implicat n replicarea ADN nuclear- responsabil de sinteza catenei ntrziate sinteza primerilor rspunde de sinteza catenei lider. Ea manifest aciune exonucleazic implicat n reparaia ADN - implicat n replicarea ADN mitocondrial, aciune exonucleazic

Proprietile ADN polimerazelor la eucariote

ADN pollocalizarenucleunucleumitocondrienucleunucleufuncienlocuire primer

Sinteza catena laggingrepararesinteza ADN mitocondrial Replicaza

Sinteza catenleading repararesimilaritatecu enzime de la procariotePol IPol IIPol IIPol IIIPol II

Tabel comparativ:

ProcarioteEucariote1 ori regionMultiple ori regions2 bifurcaii de replicare per cromozom100 bifurcaii de replicare per cromozomViteza replicrii1.000 perechi baze/secViteza replicrii100 perechi baze/secLungime frag. Okazaki1000-2000 nucleotideLungime fragmente Okazaki150-200 nucleotide

1 eoare la 1mil-10mil1 eroare la 1000 mil

Replicarea la eucarioteBifurcaia replicii este de 3000 baze pe minut comparativ cu 16.000 la procariotePe o molecul de ADN exist mai multe origini de replicare (3X104 - 3X105 separate prin perechi de baze). n aceste origini multiple de replicare se organizeaz bifurcaii- ce se deplaseaz biderecional pe cromosomul eucariot n curs de replicare.Fragmentele Okazaki 150-200 nucleotide

FIDELITATEA REPLICRIIEste asigurat de 2 factori:

respectarea principiului complimentaritiiActivitii exonucleazice a ADN polimerazei

Telomer TelomerazaReplicarea capetelor 5 ale catenei fiice este incomplet (teoria lui Olovnicov, 1971), deoarece dup nlturarea primerului ultimului fragment Okazaki, ADN p I nu e capabil s completeze aceste goluri. Astfel la fiecare replicare, capetele ADN se scurteaz.

TelomerulAceasta nu afecteaz informaia genetic deoarece catenele conin fragmente repetitive neinformative telomere. Telomer complex format din ADN i proteine- sunt segmente de ADN repetitiv GGGTTA

TelomerazaTelomerele sunt replicate de o E specific telomerazaTelomeraza - reprezint o ribonucleoproteid: ARN i proteinSubunitatea proteic TRT (telomeraze revers transcriptase) posed activitate catalitic

Telomeraza fiind o revertaz (ADN polimeraza ARN dependent) folosete ca matri propria coenzim un fragment de ARN.I etap are loc asocierea telomerazei la captul 3 al catenei lider din regiunea telomeric- TTAGGGII E extinde catena, utiliznd ca matri ARN telomeric (se repet)III Catena complementar a ADN telomeric e sintetizat dup principiul catenei ntrziate de ADNp

Mecanismul elongrii capetelor cromozomului la eucariote

Mecanismul elongrii capetelor cromozomului la eucariote

cromozoma GGGTTAG 3 AUCCCAAUC 5 Fixarea telomerei TTAGGG elongarea GGGTTAGGGTTAG 5 AUCCCAAUC translocarea GGGTTAGGGTTAG 5 AUCCCAAUC

Structura i funcia RNA telomerazice.Structura primar: la majoritatea RNA telomerice, regiunea matricial se afl la deprtarea de 50 nucleotide de la captul 5, i are urmtoarea succesiune de nucleotide 5-CUAACCCUA-3.Structura secundar e compus din 4 bucle i un fragment unicatenar, ce conine matria pentru sinteza DNA telomerice.

Inhibitorii telomerazei oligonucleotidele modificate, complementare regiunii matrice a RNA telomerazice. specific se fixeaz de matria RNA telo a omului, inhibnd activitatea telomerazic in vitro. In vivo apare problema transportului inhibitorilor prin membrana celular i micarea dirijat n nucleul celular. Ca inhibitori au fost testai i inhibitorii reverstranscriptazelor azidotimidina, didezoxiguanozina.

La om telomeraza e activ numai n celulele embrionale, n epiteliul intestinului, spermatozoizi i celule canceroase.

Numrul telomerilor determin durata vieii fiecrei celule i condiioneaz reducerea critic a numrului lor, induce moartea programat a celulei deci pierderea motivelor telomerice este cauza imbtrnirii (telomera conine mii de motive TTAGGG). lungimea telomerei este marcherul biologic al mbtrnirii.

Reparaia ADNErorile n timpul replicrii sunt reduse la minimum datorit DNA polimerazei ce posed funcie endonucleazicTipuri de deteriorri:Formarea de breeModificarea BAPierderea de BAFormarea dimerilor de pirimidin sub aciunea razelor ultraviolete

Dezaminarea BA

Mecanisme de reparare a ADNRepararea defectelor de mperechere a bazelor (prin excizia nucleotidelor) proteinele MUTRepararea defectelor cauzat de lumina UV (dimerii de timin)Corectarea defectelor BA (excizia bazelor)Repararea rupturilor bicatenare

Repararea defectelor de mperechere a bazelor (prin excizia nucleotidelor) proteinele MUT

Repararea prin excizia dimerilor de pirimidinRecunoaterea i excizarea dimerilor de ctre endonucleaze UV specificeSPAIU GOL E OCUPAT DE ADN polimerazei Isub aciunea ADN ligazei, gruparea 3-OH a catenei nou sintetizate este legat de 5-fosfat a ADN iniial.

Reparaia prin excizia dimerului

Repair of UV Induced Thymine Dimers

Reparaie prin fotoreactivare

Reparaie prin recombinare

Mutaiile

Modificrile genomului organismului, care se pstreaz i se transmit prin ereditate se transmit apoi de la o generaie la alta. Modificrile pot interesa o pereche de baze (mutatii punctiforme) sau un grup de baze pe una sau pe ambele catene ale unei molecule de DNA.

Mutatiile punctiforme: pot decurge prin:l. Substituie - misens mutatii, unde deosebim 2 tipuri: a. Tranziie - o BA purinic este nlocuit tot cu una purinc, una pirimidinic -tot cu una pirimidinic. b.Transversie - o pereche de baze purinice este nlocuit cu una pirimidinic sau invers.2. Inserie - const n ntroducerea unei perechi de baze suplimentare n catena de DNA.3. Deleia - const n excluderea unei perechi de baze n aa mod ca ea nu mai poate f complementar i la replicare apare "golul" n ambele catene.

Mutaiile

MutaiileLa afectarea segmentelor mari de gen apar mutaii ntinse. n dependen de consecinele modificrilor deosebim mutaie: benign, neutr, nociv. Agenii mutageni pot provoca mutaiile spontane ct i mutaiile induse.

BIOSINTEZA ARN

Obiectivele:ARN. Tipurile. StructuraDogma central a geneticii moleculare. Concepia: o gen - un polipeptid.Transcripia sau biosinteza ARN: matricea, substratele, enzimele, mecanismulTrsanscripia invers.Biosinteza ARN pe matrice de ARNModificrile posttranscripionale (processing)Inhibitorii sintezei acizilor nucleici.

TIPURI DE ARN

Structura secundar i teriar a ARNmARNm fiecrei gene i corespunde molecula sa de ARNm, de aceea el este foarte heterogenElementul de codificare al ARNm este tripletul nucleotidic numit codon. Fiecare codon corespunde unui anumit AAStructura secundar a ARNm o caten curbatStructura teriar se aseamn cu un fir nfurat pe bobin, rolul creia l ndeplinete o protein de transport numit informer

Structura secundar a t-RNAare infiarea unei "frunze de trifoi" - se formeaz n urma imperecherii complementare intracatenare a nucleotidelor anumitor sectoare. Sectoarele, care nu sunt ncadrate n formarea legturilor de H formeaz lanuri sau bucle

Structura secundar a ARNt

Sectorul de acceptare (4 nucleotide, 3 din care au aceeai succesiune- CCA cu hidroxilul 3OH liber la care se fixeaz grupa COOH al AA.Bucla anticodonic - format din 7 nucleotide. Conine un triplet nucleotidic specific pentru fiecare t-RNA numit anticodon. Anticodonul t-RNA dup principiul complementarittii se mperecheaz cu codonul respectiv din RNAm. Bucla pseudouridilic - const din 7 nucleotide (restul acidului pseudouridilic este obligatoriu), particip la interaciunea cu ribozomii.Bucla dihidrouridinic - const din 8-12 resturi nucleotidice ( resturi de dihidrouridin ), interactiuneaz cu E- aminoacil-RNAt-sintetaza

Structura teriar a tRNAAre forma LInclude 2 segmente de dublu helix situate perpendicular (fiecare helix-10 perechi de baze)n afara spiralei bazele formeaz legturi de hidrogen. Interaciuni apar ntre bazele necomplementare (A-A; A-C).Multe baze sunt aranjate n stive (hidrofobe)

Structura teriar a ARNt

ARNrStructura secundar e prezentat prin sectoare spiralate unite ntre ele cu ajutorul unei catene curbateStructura teriar prezint scheletul ribosomului. Are forma unui bastona sau ghem pe suprafaa cruia sunt nfurate proteinele ribosomului.

Transcripiabiosinteza ARN pe matri de ADNParticulariti:Matri - DNA dublu helicoidal (prezena catenei anticodogene de ADN) (catena+), Substrat - ribonucleozidtrifosfai (ATP, GTP, CTP, UTP)Sinteza are loc n direcia 53Este asimetric copierea catenei necodifictoareEste incomplet are loc copierea doar a unei poriuni de ADN (transcripton: promotor, operator, GS, terminator)Fora motrice a procesului e hidroliza PPEnzima - ARN polimeraza

ARN polimeraza

este o holoenzimla procariote - este oligomer din 5 protomeri (2, , 1 i sigma ). subunitile centre catalitice; - fixeaz substratul; 1 se leag de ADN, - are rol n recunoaterea secvenelor matriei numit promotor, unde ader enzima3. Nu necesit prezena primerului4. Nu posed funcie nucleazic, doar polimerazic5. ADN polimeraza conine Zn2+ i necesit prezena n mediu a ionilir de Mg2+, Mn2+

- ARN polimeraza

- ARN polimerazala eucariote: RNA p I sintetizeaza RNA ribozomal (28S si 18S)RNA p II sintetizeaza RNAmRNA p III sintetizeaza RNAt, RNAr 5S i molecule mai mici

Etapele transcripieiSinteza decurge n 3 etape: iniierea, elongarea, terminarea.Iniierea ncepe n anumite secvene de ADN numite promotor (P 40 nucleotide) recunoscut de ARN polimeraza.

CASETELE la procarioteToi P bacterieni au 2 secvene consens situate pe catena codifictoare: Caseta -35 - 5 TTGACA 3 - locusul de legare lax a ARN polimerazei. - Caseta Pribnow (-10) 5 TATAAT 3 locusul de recunoatere - responsabil de iniierea denaturrii locale a ADN. Locusul de recunoatere e situat la o distan de 25 nucleotide de locusul de legare i 10 nucleotide de la punctul de iniiere (+1) rspunde de exactitatea iniierii transcripiei.

1. subunitatea recunoate caseta -35 i E se leag2. ARNp alunec de-a lungul ADN i n jurul casetei -10 deschide dublul helix formnd complexul deschis de iniiere 3. se formeaz complexul de iniiere: legarea I nucleotid trifosfat (de regul purinic - captul 5 al ARN). CA al E se afl n punctul de start.

4. ARNp catalizeaz formarea primei leg. fosfodiesterice ntre nucleotidul +1 i +2 Sigma subunitatea :Activeaz identificarea secvenelor de ARN polimerazIa parte la desfacerea dublului helix Ia parte la formarea primei legturi fosfosiestericeAstfel complexul de iniiere este format, sigma subunitatea e disociat de la holoenzim i ia parte la iniierea unui alt ciclu de transcriere

Fig. 5.4

Elongarea i TerminareaElongarea - alunecarea ARN polimerazei pe matra de ADN sinteza transcriptului (50 nucleotide pe secund) . ARNp nu controleaz catena sintetizat erorile sunt mai multe fa de replicare. Pe msur naintrii ARNp are loc desprinderea ARN de la ADN i refacerea dublului helixTerminarea semnal de terminareARNp recunoate secvenele nucleotidice specifice de pe ADN, ce conin un numr mare de G, C .

Terminare dependent de factorul Proteina - se asociaz la E i se mic mpreun cu ea, ns la identificarea semnalelor de terminare coboar de pe matri i ncetinete aciunea E,producnd transcriptul cu folosirea energiei ATP. ADN-se reformeaz n dublul helix.

Transcripia la eucarioteRNA p alctuit din 9-11 subunitiFolosesc mai multe tipuri de ARN p:ARN polimeraza I ARNr (18S, 28S, 5,8S; 45S) ARN polimeraza II ARNm; ARN polimeraza III ARNt i ARNr (5S)ARN polimeraza IV (mitocondrial)- toate tipurile de ARN mitocondrial

Transcripia la eucariote3. P la eucariote: GC casete GGGCG (-90)CAAT casete 5-GGCCAATCT -3 (-75)Caseta Hogness TATAT/AT (-35)Primele 2 sunt responsabile de frecvena transcripiei (cnd ncepe), a 3 - - implicat n iniiere semnal (unde). 4. Secvenele alctuite din 10-20 nucleotide enhancers i silencers cresc i scad respectiv V transcrierii.

Procesingul la eucarioteARN-ul mesager obinut difer la procariote fa de eucariote. n ARN-ul procariot molecula este continu deci intreaga informaie de aici poate fi folosit pentru sinteza proteinelor. n ARN-ul eucariot s-a observat prezena unor poriuni repetitive de nucleotide numite introni care nu dein nici o informaie pentru sinteza proteic. ARN-ul mesager primar este mult mai lung dect ARN-ul mesager folosit de ribozom. Toi precursorii de ARN n nucleu trec etapa de maturizare posttranscripional. Pe parcursul procesingului - pre-ARN se transform n ARN matur.

Procesingul la eucarioteProcesingul nclude:1. Modificarea fragmentelor terminale 5 i 3 ale ARN: a. Cap-area: la captul 5 -este adiionat guanozina metilat (5- 5 trifosfat - protejarea mARN de atacul 5-exonucleazelor i pentru recunoaterea de ctre ribosomi ca semnal de iniiere); b. la captul 3 se adaug o secven mare de poli A (200 A -coad). Ea servete la exportul moleculelor de ARN din nucleu n citoplasm.

Procesingul la eucariote

Fig. 5.11

Procesingul la eucariote2.Splisingul - excizia intronilor i sudarea exonilor. Aa numitul splising are loc n nucleul celulei. Excizarea intronilor se poate face in 2 feluri: Cu ajutorul unor enzime speciale care recunosc capetele fiecarui intron (exemplu: ARN U1) acestia sunt eliminati si capetele libere ale exonilor sunt sudate. Prin autocataliza, fenomen remarcabil care pune pentru prima data in discutie posibilitatea catalitica a unui compus neproteic. Deci chiar ARN-ul ribozomal isi autoelimina intronii printr-un proces care genereaza o bucla (reprezentata de intron), eliminarea acestei bucle cu ajutorul guanozinei si coaserea exonilor.a.

a. ARN nuclear (ARN U1-U6): identific secvenele de baze la jonciunea intron exon(5 -GU, iar la 3 - AG), b. se fixeaz complementar la ele, bucleaz intronul, astfel apropiind capetele exonilor.c. Are loc scindarea legturilor fosfodiesterice dintre exoni i introni, capetele exonilor sunt juxtapuse, apoi sudate de RNA ligazele

MecanismulARN U1 se leag la GU a intronuluiARN U2 se unete la A din interiorul intronuluiARN U4,U5, U6 se asociaz cu U1 i U2 formnd bucla (5 al intronului cu 2 al A)Eliberarea lui U4 din complex duce la clivarea captului 3 al intronului. Intronul se nltur mpreun cu U2,U5, U6Formarea legturilor 3-5fosfodiesterice ntre capetele exonilor

Fig. 5.13

e.g., Fig. 5.13

Transcripia invers sinteza ADN pe catena de ARNMatria ARNSubstrat dRNTP:dATP, dGTP, dCTP, TTPEnzima revers transcriptazaCaracteristic viruilor oncogeniMecanismul:a. Revers transcriptaza sintetizeaz pe ARN viral catena de ADN- hibrid: ADN_ARNb. Scindarea ARN viral de o nucleazc. Autoreplicarea ADN cu formarea unui duplex de ADN

Reglarea sintezei proteinelorSinteza proteinelor nu e constant ea trebuie s se adapteze cerinelor vitaleCelulel dispun de 3 tipuri de enzime :Constitutive - se sintetizeaz n celul cu o vitez constant.Inductible - sunt E a cror c% depinde de prezena sau absena n mediu a unui compus denumit inductor. Sunt implicate n cile catabolice,Represible - sunt E a cror c% depinde de prezena sau absena n mediu a unui compus denumit corepresor. Sunt implicate n cile anabolice. n mod normal cantitatea de E inductibile n celule este foarte mic,dar ea poate crete atunci cnd apare necesitatea utilizrii substratului E respective ( S care se comport ca inductor).

Modelul operonuluiSchema reglrii biosintezei proteinei la procariote - - poart denumirea de teoria lac-operonului (Jacob i Monod, 1961) . Modelul e bazat pe studiul reglrii metabolismului lactozei n Escheria coli.Schema general a reglrii activitii genelor procariote a fost propus de F.Jacob i J.Monod n 1961.

Schema unui operon: R gena reglatoare; P promotor; O operator; S gene structurale; T terminator; r represor.

1. GS - codific sinteza celor 3 E inductibile impicate n utilizarea lactozei: -galactozidaza, permeaza i transacetilaza 1,2,3) 2. Expresia lor e controlat de gen reglatoare (GR), care codific represorul (R).

Funcionarea operonului lacGR determin sinteza unei proteine numit RR se leag de operator (O).Legarea R la O blocheaz accesul ARN polimerazei la promotor avnd ca rezultat suprimarea transcrierii GS.

Blocarea exprimrii operonului

Reglarea sintezei proteinei prin inducien prezena lactozei:Inductorul (n acest caz lactoza) se leag specific la R, ca urmare are loc desprinderea acestuia de la operator. n aceast situaie, ARN p se leag la promotor, iniiind transcrierea GS, adc a ARNm care codific E implicate n catabolismul lactozei.

Efectul tipului de substrat asupra functionarii operonului

Bacteria are ca surs lactoza

Ce se ntmpl dac bacteria dispune simultan de glucoz i lactoz? Bacteria nu consum energie pentru sinteza lac-operonului, atta timp ct dispune de glucoz.Bacteria crete pe seama glucozei - i numai atunci cnd c% acesteea devine minim ncepe s utilizeze lactoza. Metabolizarea simultan a glucozei i lactozei sunt excluse. Cum se comut activitatea bacteriei pe utilizarea lactozei cnd c% glucozei scade?

n lipsa glucozei se mrete c% AMPc ce reprezint semnalul foamei la bacterii. Ca urmare, AMPc se leag de o protein receptoare specific (proteina activatoare a genei catabolice CAP) - formeaz complex (CAP- AMPc), apt s se lege de promotor (p-locus)Acest proces favorizeaz ptrunderea ARNp n locusul de reglare. Dac lactoza este prezent n mediu, operatorul este liber i ARNp efectueaz transcrierea genelor lac.CAP dispune de 2 centre: pentru AMPc i pentru ADN

Reglarea lac-operonului ntr-un mediu ce conine glucozCu ct c% glucozei e mai mare, c%AMPc e mai mic. Lipsete i complexul CAP- AMPc. n final ARNp nu se leag de P i GS nu sunt transcrise, indiferent dac exist sau nu lactoz, indiferent de faptul dac operatorul este sau nu ocupat de R.

- AP catabolite activator protein cAMP ( )TGTGAACACTTCACA AGTGT

Ilustrarea mecanismului de reglare a sintezei proteinei prin represieTeoria operonului explic i represia prin produs final al biosintezei EEx: sinteza His: la c% mari de His (corepresor CoR) se leag de R, modificndu-i conformaia activndu-l n rezultat favorizeaz legarea R la O.His produs final, CoR- sisteaz transcrierea genelor ce codific E implicate n propria sa sintez

Ilustrarea mecanismului de reglare a sintezei proteinei prin represie

: Trp Trp Trp

REZUMM:GR controleaz exprimarea anumitor GS prin intermediul unei proteine RRa suprim sinteza de ARNm, deci de proteine; R inactivat permite transcrierea GS i sinteza proteineiE inductibile - cnd n mediul apare I R se inactiveaz are loc sinteza ARNm- proteineiE represibile R este inactiv are loc transcripia i translaia. Cnd n mediu se acumuleaz produsul final al cii anabolice (CoR)- R se activeaz, formarea complexului R-CoR i sistarea transcripiei i translaiei.

Reglarea sintezei la eucarioteAtt la nivelul transcripiei ct i la nivelul translaieiReglarea hormonal - reglarea biosintezei proteice la nivelul transcrierii:cortizol- induce sinteza E gluconeogenezei; estrogenii, androgenii, vitamina D sintez de proteine specifice)Amplificare genic anumite evenimente produse la nivelul genomului pot modifica numrul de exemplare a unei proteine sau al unui ARNm. Dac celula are nevoie de o P n cantitate mare, ea crete nr de copii per genom a genei ce codific P respectiv (iniiere repetat n cursul sintezei ADN).

Reglarea sintezei la eucarioteReglarea exspresiei genetice prin moleculele proteice legate de ADN (histonele) sinteza ARN pe ADN e inhibat prin adaosul de histoneMetilarea ADN-ului o gen mai puin metilat are anse mai mari de a se exprima comparativ cu una metilat.Reglarea proteinei la nivelul translaiei e posibil prin aciunea factorilor proteici, care contribuie iniierea, elongarea, terminarea

Codul genetic Translaia Reglarea sintezei proteinei

Obiectivele:Codul genetic. Proprietile.Ribozomii - sediul sintezei proteinelor, structura lor.Procesul de translare (sinteza proteinelor). Modificrile posttranslaionare ale proteinelor. Reglarea biosintezei proteinelor. Inducia i represia enzimelor.Inhibitorii sintezei proteice.Polimorfismul proteinelor (variantele hemoglobinei, enzimelor, grupelor sanguine).Bolile ereditare i diagnosticul lor biochimic.

Codul genetic

Informaia genetic referitor la biosinteza proteinelor se transmite cu ajutorul codului genetic - dicionar ce traduce secvena nucleotidelor din ARN n succesiunea AA din lanul polipeptidic.

Proprietile codului genetic Este triplet -64 codoni: 3 nonsens:UAG; UGA; UAA; 61 codific AA corespunztorieste degenerat - unui AA poate s-i corespunda mai muli codoni (Ex. Arg, Leu, Ser - codificate de 6 codoni; Met- i Trp - un codon). Codonii unui aminoacid sint sinonime. Specificitatea codonului e determinat de primele dou litere. Degenerarea se refer la nivelul nucleotidului 3 din codon sau 1 din anticodon care oscileaza.nu este ambiguu- acelai triplet nu semnific 2 AA diferiiAre o structur liniar (colinear) o concordan liniar ntre gen i proteina codifictoareNu se suprapune (excepie- viruii)

Proprietile codului geneticEste universal toate veuitoarele utilizeaz acelai mecanism de traducere (abatere prezint codul genetic al mitocondriilor);nu are virgule, semne de punctuatie - ce ar indica nceputul i sfritul fiecarui codon.

AUG - este codonul de initiere UAG, UAA,UGA - codoni stop (non sens) Toi codonii cu U (n pozitia 2) codifica AA hidrofobi codonii cu A n pozitia -2 codific AA polariUracilul n poziia 1 prezint codonul nonsens dac n anticodon n directia (5'->3') prima baz nucleotidic e: a) Citozina sau Adenina, el va citi un singur codon; b) Uracilul sau Guanina el va citi 2 codoni; c) inozina - respectiv va citi 3 codoni

RibozomiiReprezint sediul de traducere a ARNm i sinteza proteinelor.Structura- complexe ribonucleoproteice i sunt formai din dou subuniti de mrime inegal (mare i mic)

Structura ribozomilor:procariotici:subunitatea 30 S conine ARNr 16S i 21 proteine.subunitatea 50S ARN r 5S, 23S i 31 proteine. Sinteza ARNr i formarea subunitilor are loc n citoplasm.eucariotici: subunitatea 40S ARNr 18S i 33 proteine. subunitatea 60S ARN r 5S, 5,8S, 28S i 49 proteine. ARNr se formeaz n nucleol.Ribozomul va avea constanta de sedimentare 70S la procariote si 80S la eucariote. S este coeficientul de sedimentare Svedberg, care depinde de forma, densitatea i dimensiunea particulelor.

Prokaryotic Ribosome Structure

Eukaryotic Ribosome Structure

Centrele catalitice ale ribosomilor

Situsul A - aminoacil responsabil de unirea complexului aminoacil- ARNtSitusul P peptidil gzduiete ARNt legat de un lan polipeptidic deja sintetizatSitusul E e responsabil de eliminarea ARNtn starea complet nedisociat ribozomii sunt activi. Deplasarea lber a ribozomilor n diferite sectoare ale celulei, sau combinarea lor n diferite locuri cu membranele reticulului endoplasmatic ofer posibilitatea de asamblare a proteinei n celul.

POLIRIBOZOMULMai muli ribozomi pot citi simultan acela ARN mesager pe care il parcurg in acela sens. Se constituie astfel un poliribozom, structur ce permite accelerarea sintezei proteice.

TranslaiaTranslaia sau biosinteza proteinelor propriu zis. Bazele moleculare ale translaiei:m-RNA ca matri genetic (determin succesiunea AA n protein);aminoacil ARNt;ribozomii ca maini moleculare pentru unirea succesiv a AA n catena polipeptidic conform programului mRNA;GTP ca surs de energie;factorii proteici;ca cofactori - unii ioni (Mg 2+, K+).

Etapelese realizeaza in 5 etape: Activarea AA.Iniierea lanului polipeptidic.Elongarea lanului polipeptidic.Terminarea lanului polipeptidic si eliberarea acestuia.Prelucrri post traducere ale proteinei sintetizate.

Activarea AAare loc n citozolSunt necesare:AA (procariote Nformil-Met; la eucariote Met)ARNtATP, Mg, KE aminoacil ARNt sintetaza Posed 4 centre: pentru AA, ATP, ARNt, H2OSpecificitatea E e determinat de structura ARNtFidelitatea e asigurat de capacitatea de autocontrolConine grupri libere sulfhidrilicesunt ligazele, care au o specificitate absolut.

Se desfoar n dou etape: ATP PPi1. NH2-CH-COOH NH2-CH-CO O-AMP I I R R Aminoacil Adenilat

2. NH2-CH-CO O-AMP+ARNt NH2-CH-CO O-RNAt +AMP I I R R Aminoacil RNAtI etap - AA reacioneaz cu ATP rezultnd aminoacil-AMP. PP eliberat este hidrolizat i in acest fel reacia ireversibil.II etap - complexul cedeaz AA moleculei de ARNt, specific acelui AA

Activarea AA Aminoiacil ARNt sintetaza

Aminoacyladenylate Formation

Aminoacyl-tRNA Synthetase Rxn

Activarea AAEsena procesului este fixarea AA la ARNt n zona acceptorie la 3' CCA OHActivarea AA consum 2 legturi macroergiceE recunoate AA greit fixat pe ARNt - l elimina i l nlocuiete cu AA corespunztor (prezint i un locus hidrolitic).

Translaia propriu zisCitirea ARNm se face n direcia 5- 3' iar proteina se sintetizeaz de la captul Nterminal la C terminalse desting trei etape: IniiereaElongareaterminarea.

IniiereaNecesar:ARNm (AUG)Ribosomul cu subunitile disociateARNt f-met (Met)GTP, MgIF1, IF2, IF3Scopul: formarea complexului de iniiere

Formarea complexului de iniiere:Subunitatea mic leag IF3 i previne reasocierea ribosomilorLa subunitate adiioneaz ARNm (AUG)La complex adiioneaz IF1 legat de formil Met-ARNt i IF2 legat de GTPndat cum are loc fixarea anticodonului fMet-ARNt cu codonul AUG (ARNm), are loc hidroliza GTP, eliberarea FI i unirea subunitilorFormil Met-ARNt e fixat n centrul P30SFI3 P 50S AFI1FI2

ElongareaNecesar:ARNm cu urmtorul codonARNt cu urmtorul AAGTPFE: Tu, Ts, GElongarea translaiei include trei etape:Legarea aminoacil ARNt;Transpeptidarea- formarea legturii peptidice,Translocarea (deplasarea ARNm cu un codon).

1. Adaptarea (legarea)AAare loc dup principiul codon- anticodon n centrul Aa. Aminoacil-ARNt se fixeaz cu Tu+GTP adiioneaz la complexul de iniiere. b. AA se fixeaz n centrul A. Simultan are loc hidroliza GTP n GDP i PTu-GDP+GTP-Ts------Tu-GTP

Legarea AA

2. Transpeptidareaeste formarea legturii peptidice ntre doi aminoacizi.AA din centrul P sub aciunea peptidiltransferazei trece n centrul A.Se formeaz dipeptidan centrul P rmne ARNt liber

3. Translocareadeplasarea ribosomului pe ARNm cu un triplet n direcia 5- 3' .Dipeptida din centrul A trece n centrul P sub aciunea factorului G (translocazei) i GTPARNt din P prsete ribosomul

ElongareaDecurge n 3 etape :1 fixarea noului Aminoacil ARNt complexul: aminoacil-ARNt, factorul de elongare T (FE-T) i GTP. se fixeaz pe situsul A, dup ce are loc hidroliza GTP la GDP care se elibereaz mpreun cu FE-T.2. formarea legturii peptidice. Enzima peptidil-transferaza catalizeaz formarea legturii peptidice ntre doi AA din situsul A i P.Peptida rmne ataat de RNAt de pe situsul A.translocaia ribozomul se deplaseaz la urmtorul codon de pe ARNm i peptidilARNt trece de pe situsul A pe P aceast etap necesit factorul de elongare G (FE-G) i GTP (necesar pentru realizarea modificrilor conformaionale care deplaseaz ribozomul).30S P 50S AFE-TE-PTFE-GFE-T

Terminareaare loc cnd sunt ntlnii codonii UAA, UGA, UAG i factorii proteici de terminare: R1, R2, S. Nici un tRNA nu se poate lega cu codonii de terminare. Factorii de terminare: elibereaz lanul polipeptidicElimin ARNt din centrul PDisocierea ribosomului n subunitile respectiveDegradarea ARNm

DECI:

La formarea unei legturi peptidice se consum patru legturi macroergice: 2 n etapa de activare a AA (ATP) i2 n translaia propriu zis: - GTP.

Prelucrrile posttraducereModificarea captului N- i C-terminal; captul N se acetileaz;ndeprtarea secvenei semnalizante cu ajutorul unei peptidaze;modificarea unor AA: hidroxilarea enzimatic a Pro, Lyz obinerea hidroxiprolinei, hidroxilizinei . Metilarea (Lyz n muchi)Carboxilarea Glu - -carboxil-glutamatului (protrombin) oxidarea reziduuriilor de Cis - cistinei; iodurarea reziduurilor de Tir ale tireoglobulinei.

Prelucrrile posttraducereataarea unor gr. funcionale: fosfat, glicozil, metalelor pentru formarea fosfoproteinelor,glicoproteinelor, metaloproteinelor .a.Formarea punilor disulfuriceProteina se autoasambleaz formnd conformaia nativ structura tridimensional

Particularitile biosintezei proteice la eucarioteAA iniiator este MetARNm este monocistronic (un singur semnalde iniiere)Ribosomul eucariot nu sare peste codonii terminaliViteza procesului e mai mareFI (eIF1-eIF10); elongare i terminare.

Inhibitori ai sintezei proteinei

la nivelul replicrii: Mitomicina mpiedica separarea catenelor de ADNAcid nalidixic inhiba ADN girazala nivelul transcriptiei:- Actinomicina D - se fixeaza pe ADN Rifampicina - inhiba ARN polimeraza

Inhibitorii sintezei proteineila nivelul translatiei: Streptomicina inhiba legarea ARNt iniiator la subunitatea 30SCloramfenicol -inhiba peptidil transferazaTetraciclina - inhiba legarea ARNt la ribozomiEritromicina,Azitromicina blocheaza subunitatea 50SPuromicina blocheaza elongarea inhibnd competitiv ARNtNeomicina, Kanamicin - erori n reproducerea codului geneticToxina difteric - inhib translocaza

Polimorfismul proteinelorTipuri de Hb normale:Hb A 2 2 adult majorHb A2- 2 2 adult minor (2-3%) HbF - 2 2 fetal (la ft i 80% la nou-nscui)Hb E - 2 2 - embrionarVariante genetice ale Hb umane -300- hemoglobinoze

HemoglobinozeHb S- nlocuirea Glu din poziia a 6 a lanurilor cu Val deformarea i aglomerarea hematiilorModificri ale AA care tapeteaz buzunarul hemului duce la modificri ale oxigenrii formarea methemoglobinei (legarea Fe 3+): scderea afinitii pentru oxigen, dispariia cooperativitii)Talazemii care nu sintetizeaz lanurile sau .

*******************************Dublul helixModelul Watson i CrickAnul 1953 are o importan mare n domeniul biologiei: descoperirea structurii spaiale a ADN urma s deschid calea cunoaterii mecanismelor ereditii i ale biosintezei proteice, primele achiziii ale domeniului biologiei moleculare. Utiliznd i asamblnd toate cunotinele anterioare privind compoziia ADN, tautomeria bazelor, modelele moleculare anterioare, spectrele de difracie cu raze X (furnizate de M. Wilkins i R. Franklin), Watson i Crick au reuit n acest an de graie s deduc structura n dubl elice i s demonstreze existena structurii denumit de atunci B.1. Rsucirea n dubl elice (fig. 2.13)a) Dou polidezoxiribonucleotide (dou catene) de secvene simetrice sunt asociate prin formarea de perechi de baze complementare. Sensul celor dou catene este obligatoriu opus: ele sunt antiparalele (figura 2.13 a).b) Aceast dimerizare determin apariia de constrngeri care se traduc prin rsucirea obligatorie, n elice a unei catene n jurul celeilalte: nu pot fi separate dect dac pierd aceast structur elicoidal regulat. Structura n dubl elice (fig. 2.13 b i c) are cteva caracteristici:- bazele mperechiate i stivuite prin intermediul planurilor lor care au lungime egal constituie un cilindru central;- nlnuirile oz-fosfat polianionice formeaz scheletele elicoidale paralele exterioare, planurile bazelor fiind aproape perpendiculare pe cele ale bazelor;- marea ax a ansamblului este perpendicular pe planul de stivuire a bazelor.Aceast structur monoton de o remarcabil regularitate se stabilete pe toat lungimea unei molecule i i confer un caracter fibros. Ea este meninut prin dou ansambluri de fore discutate n paragraful precedent: legturile de hidrogen care se formeaz ntre bazele celor dou catene i forele de stivuire.2. Caracteristicile geometrice ale structurii 2-Da) din cele dou sensuri de rsucire posibile teoretic - drept/stng, care dau natere unor structuri care constituie fiecare imaginea celeilalte n oglind, pentru ADN se impune modelul considerat convenional drept. Acesta este dictat de geometria scheletului oz-fosfat (aa cum structura n elice alfa a proteinelor este impus de configuraia aminoacizilor.b) dimensiunile elicei (helixului) sunt indicate n tabelul 2.7. S-a constatat c sunt necesare, n medie, 10 perechi de baze pe tur, care au un pas de 3,4 nm ( distana dintre planurile bazelor corespunztoare grosimii nucleelor n contact) i diametrul de 2 nm.c) datorit poziiei axei n centrul fiecrei perechi de baze i de ataarea lor covalent di-simetric pe schelet, se formeaz dou fose (mare i mic) care au deschidere i profunzime diferit i care alterneaz la nivelul flancurilor elicei, pe toat lungimea acesteia.Morfologia acestor fose sufer variaii locale, n funcie de secvena de baze: de exemplu ntr-o regiune bogat n A-T, fosa mic este mult mai ngust dect n cazul unei regiuni bogate n G-C.c) reinem c n cazul dublei elice B (helix B), conformaiile pentozei i legturii glicozidice n structura unitilor nucleotidice sunt caracteristice (tabel 2.6).

Variantele conformaionale ale dublei elice (dublului helix)Conformaia B, cea descris de Watson i Crick, este cea mai stabil n condiii fiziologice i deci considerat ca o form nativ de referin pentru ADN. Totui, flexibilitatea relativ a structurii i permite acesteia s adopte conformaii n duplex diferite, dintre care dou sunt bine caracterizate prin cristalografie. n tabelul 2.7 sunt grupate principalele caracteristici ale diferitelor conformaii iar n figura 2.15 este dat reprezentarea lor.1. Conformaia A Cnd concentraia n ap a unei soluii de ADN este redus, moleculele ncep s treac reversibil ntr-o alt conformaie care a fost numit A, diferit. ADN-A rmne o dubl elice dreapt dar cu o geometrie particular:- aceasta este mult mai compact (pentru acelai numr de perechi de baze lungimea sa total este mai redus iar diametrul este mai mare dect n cazul ADN-B), i bazele sunt mai puin accesibile;- planurile bazelor sunt rsucite cu 1800 n raport poziiei celor din forma B i sunt mult nclinate fa de ax, ceea ce strivete i adncete fosa mare i aplatizeaz pe cea mic (calificativele de mare i mic i pierd sensul n acest caz);- conformaia furanozei trece n 3E (C3 endo) (vezi figura 1.13).Aceast conformaie A corespunde in vivo structurii:- ADN din anumii spori bacterieni formai ca rspuns la uscarea mediului. Aceast trecere poate explica rezistena la condiii extreme i efectul dimerizant al radiaiilor UV (folosite pentru sterilizare); - adoptat de mperecherile locale n dublu helix ale ARN (care prezint o preferin net pentru conformaia C3 endo a pentozei (3E);- hibrizilor ARN-ADN care se formeaz tranzitoriu (prin amorsarea replicrii i n timpul transcripiei).

2. Conformaia ZEste o structur radical diferit de precedentele deoarece se formeaz prin rsucire spre stnga. A fost evideniat o singur form prin cristalografie cu raze X pentru polinucleotidele sintetice C-G la 25 de ani de la descoperirea conformaiei B de ctre Watson i Crick.Aceast conformaie este prezent n segmentele de secven alternante Pur-Pyr (-G-C-G-C-). Unitatea devine mai degrab dinucleotid dect nucleotid iar constituenta purinic este ntr-o conformaie dublu modificate: modificarea formei envelope a pentozei i a poziiei bazei. Aceti doi parametri impun dubla elice stng (dublu helix) pentru care:- scheletele oz-fosfat descriu un zig-zag n jurul axei (de unde denumirea Z);- perechile de baze sunt nclinate;- forma global este mai subire avnd un diametru micorat;- fosa mare este nivelat, singura fos care a rmas este profund i ngust.Aceast conformaie Z a fost detectat la procariote i la eucariote la nivelul secvenelor bogate n metil-citozine care favorizeaz ale cror grupri hidrofobe favorizeaz formarea structurii. Regiuni scurte de ADN care prezint alternana necesar ar putea avea rol de comutator al expresiei genelor prin modificarea (trecerea) reversibil din B n Z.Dac emitem ipoteza c un astfel de proces care din punct de vedere energetic este foarte costisitor n condiiile ionice i de pH din celul , trebuie s admitem necesitatea pregtirii prealabile a dublei catene (de exemplu printr-o supra-rsucire) ca o etap absolut indispensabil.Spectroscopia prin dicroism circular (figura 2.16) a identificat net conformaiile B i Z i tranziiile lor.Interesul pentru ADN-Z Nu se cunoate nc exact funcia acestui ADN-Z. Totui, se pare c acesta joac un rol biologic important. Dup cum se tie, secvenele CG par s fie implicate n controlul expresiei genelor . Astfel, cel mai adesea, aceste secvene sunt metilate (la nivelul citozinei) n genele inactive i invers, nemetilate n genele care se exprim frecvent. De asemenea, se tie c metilarea secvenelor CG favorizeaz foarte mult formarea ADN-Z. Este necesar s se demonstreze dac aceste secvene CG sunt capabile, in vivo, s adopte o conformaie ADN-Z (dublu helix de stnga) n mijlocul unei zone de dublu helix de dreapta.Pe de alt parte, anumite proteine sunt capabile s se lege specific la ADN-Z i nu la ADN-B. Se pare c proteine capabile s lege la ADN-Z (Z-DNA binding protein) au un rol reglator important.Fig. 26. ADN-Z (helix de stnga i ADN-B (helix de dreapta)n rezumatDescoperim astfel c ADN nu conine numai informaia codant care dirijeaz sinteza ARN (prin secvena sa nucleotidic) ci i o informaie conformaional determinat de prezena anumitor secvene nucleotidice (de ex. succesiunile CG). Aceste informaii conformaionale ar putea permite ca segmentele de ADN s adopte conformaii diferite (ex. ADN-Z) care ar putea astfel juca un rol important n anumite mecanisme de reglare biologic, n particular la nivelul transcripiei.ADN nu este considerat o molecul static, ci este privit mai degrab ca o structur dinamic, flexibil, la nivelul creia diferite conformaii sunt n echilibru cu altele.

*****RenaturareaCa i n cazul proteinelor, restaurarea strii iniiale de dubl caten plecnd de la ADN denaturat este posibil. Succesul acestei renaturri depinde de:- condiiile de mediu: pH, trie ionic;- starea mai mult sau mai puin avansat a denaturrii;- protocolul adoptat pentru revenirea la temperatura ne-denaturant.Procesul de renaturare face obiectul a numeroase studii n intenia nelegerii cineticii i a modelrii etapelor. n figura 2.23 este prezentat o schem cu diferitele etape de denaturare/renaturare:- dac soluia este rcit prea repede, timpul de cutare al catenelor complementare este prea scurt: moleculele sunt ngheate n starea imperfect de cupluri inter- i intramoleculare.- dac soluia este meninut timp ndelungat la o temperatur inferioar Tm (Tm-20 sau 250C s-a dovedit temperatura optim) s-a observat, din contr, o revenire gradat la proprietile caracteristice structurii bicatenare. Trebuie asigurat durata necesar pentru explorarea bazelor prezente pe cele dou catene, reconstituirea mperecherilor complementare i formarea dublei elice. Aceste condiii denumite de anelare (annealing sau trempe, expresii mprumutate din activitatea de turnare a sticlei sau a metalelor).Plecnd de la o soluie complet denaturat, re-mperecherea se realizeaz n dou etape de cinetic diferite:1. catenele separate se ntlnesc la ntmplare (hazard); ele sunt complementare, o scurt regiune se poate mperechia i forma nceputul unui dublu helix. Aceast etap este lent i este limitant de vitez pentru viteza total de renaturare.2. Plecnd de la aceste puncte de iniiere a procesului, mperecherile se vor efectua foarte rapid dup modelul nchiderii unui fermoar, impunnd structura 2-D elicoidal pe toat lungimea moleculei.c) n afar de determinarea vscuozitii i absorbiei, starea ADN mai poate fi controlat prin microscopie electronic i prin tehnici de biologie molecular. Microscopia electronic vizualizeaz direct moleculele n timp ce biologia molecular furnizeaz metodele indirecte: studiul activitii transformante a ADN pentru un anumit tip celular; degradarea preferenial a duplexului de ctre enzime cum sunt nucleaza S1 i ExoII (tabel 2.4). Cromatografia de absorbie pe hidroxiapatit ofer o modalitate de separare a duplexului, prin reinerea pe suprafaa suport a monocatenelor.Denaturrile i renaturrile sunt etape cheie pentru numeroase manipulri de biologie molecular (pentru numeroase tehnici de biologie molecular): hibridizarea, tehnic important, presupune formarea de duplexuri artificiale ntre ADN din diferite surse sau ntre ADN i ARN.Regiunile de ARN al cror lan monocatenar se repliaz n structur 2-D dublu helix prezint acelai fenomen de denaturare. Aceste duplexuri ARN sunt mult mai stabile: fr a putea nelege bine motivaia valorile lor de Tm sunt mai mari cu 200C dect cele ale secvenelor de ADN echivalente*******Aciunea topoizomerazei Topo I de la E. ColiIntermediarul ADN-enzim conine o legtur covalent ntre captul 5P al ADN i restul tirozinic al proteinei. Dup scindare captul 3OH liber (rou) trece pe sub cealalt caten, nltur constrngerea, suprarsucirea i se reface elibernd enzima. Dup fiecare etap de scindare se elimin o suprarsucire. Nu se copnsum ATPMicarea furcii n cretere n timpul replicrii ADN induce formarea de supra-rsuciri pozitive la nivelul duplexului ADN, naintea furcii de replicare.Pentru ca sinteza ADN s se continue, supra-rsucirile pozitive trebuiesc nlturate (relaxate). Acest lucriu va fi realizat de ctre ADN giraza i de ctre topoizomerazele eucariote de tip I i II. Actiunea ADN girazei de la E. Coli, topoizomeraz de tip IIIntroducerea de suprarsuciri negative. Plierea iniial nu determin o schimbare stabil, dar activitatea ulterioar a girazei produce o structur stabil cu dou supra-rsuciri negative.Topizomeraza II de la eucariote nu poate induce supra-rsuciri dar poate nltura supra-rsucirile negative din structura ADN.b) Catenarea i decatenarea a dou molecule duplex diferite.- Aceast reacie poate fi catalizat de topoizomerazele de tip II de la pro- i eucariote.Modelul molecular al activitii cataliticve a topoizomerazei II de la E. ColiEnzima este un dimercu dou subuniti identice. Iniial, enzima leag o parte a catenei ADN, segmentul G (albastru mai nchis), inducnd o madificare conformaional la nivelul domeniilor B, B, A i A ale enzimei (2). Dup legarea ATP (indicat prin asterix) i a altei pri a catenei ADN, segmentul T (albastru deschis) se produc o serie de reacii n care segmentul G este scindat de ctre domeniile A i A (portocaliu deschis) ale enzimei i capetele segmentului G din ADN se leag covalent la un rest de tirozin cu trei domenii (3 i 3a). Simultan domeniile de legare al ATP (verde) se deplaseaz unele ctre altele, transportnd segmentul T ctre i n deschiderea cedntral (4). Segmentul G tiat este apoi resudat i segmentul T este eliberat ca urmare a unei modificri conformaionale care separ domeniile A i A la captul enzimei (5). Refacerea interfeei dintre domeniile A i A se reformeaz printr-o reacie care necesit utilizarea unei molecule de ATP (2). n acest punct, segmentul G poate disocia de pe enzim prin conversia 2 n 1. Alternativ, enzima poate trece ctre un alt ciclu, trecnd segmentul T peste segmentul G i astfel s nlture nc dou superture. *Phosphodiester bonds*************************************************************************************