ACIZII NUCLEICI ROL BIOLOGIC, STRUCTURA SI ORGANIZAREGenetică moleculară

1 ROLUL BIOLOGIC SI STRUCTURADEFINIŢII Genom – setul unic de gene aparţinând unui organism Cromosom – structură alcătuită dintr-o macromoleculă de ADN, de regulă asociată cu ARN şi proteine, conţinând un set specific de gene Plasmidă – ADN extra-cromosomial cu replicare autonomă Transformare – modificarea directă a unui genom, prin introducerea de ADN provenit dintr-o celulă cu un alt genotip

Genetică moleculară DOVEZI PRIVIND NATURA CHIMICĂ A MATERIALULUI GENETIC Transformarea (preluarea de ADN străin) la procariote şi eucariote, demonstrează că ADN-ul reprezintă materialul genetic Griffith (1928) reuşeşte să transforme stabil o tulpină nevirulentă de Pneumococcus într-una virulentă, utilizând un extract obţinut dintr-o cultură de celule virulente distruse cu ajutorul căldurii

Avery (1944) reuşeşte să demonstreze că principiul transformant este reprezentat de ADN Metoda: Distrugerea selectivă a majorităţii componentelor extractului acelular şi testarea capacităţii sale transformante, în vederea evidenţierii componentului responsabil de transformare A devenit o rutină astăzi, utilizarea ADN-ului purificat, pentru transformarea celulelor

Genetică moleculară ROLUL ADN-ULUI ADN-ul trebuie să se replice cu mare acurateţe, înainte de fiecare diviziune ADN-ul codifică toate proteinele necesare celulei ADN-ul este capabil de a suferi mutaţii, oferind baza materială a transformărilor evolutive ADN-ul stochează stabil informaţia genetică

Molecula de ADN

NUCLEOTIDELE “Cărămizile” din care este format ADN-ul (şi ARN-ul) Dezoxiriboza (pentoza), cu gruparea –OH

la carbonul 3’ al pentozei Fosfatul (la carbonul 5’ al pentozei)

Bazele azotate –purine adenina

guanina –pirimidine timina

citozina

ADN-ul este alcătuit de regulă, din două catene polipeptidice, antiparalele “scheletul” glucido-fosforic Legături fosfodiesterice Polaritatea legăturilor este 5’ spre 3’

–Complementaritatea bazelor azotate A – T

G – C

legăturile de hidrogen –2 per A – T

–3 per G – C 5’ −› 3’ polaritatea catenei Incizurile majore şi minore 5’-AATTGGCCGATC-3’ 3’-TTAACCGGCTAG-5

Genetică moleculară ROLUL ADN-ULUI Replicarea: fiecare catenă serveşte ca matriţă pentru sinteza unei catene complementare, pe baza principiului complementarităţii bazelor azotate Stocarea informaţiei: este asigurată de secvenţa specifică de nucleotide; aceasta poate fi copiată în ARN Modificare prin mutaţie: substituţia, deleţia sau inserţia de nucleotide modifică secvenţa nucleotidică

STRUCTURA GENEI Genele codifică molecule funcţionale de ARN, în principal ARNm, dar şi alte specii (ARNt, ARNr etc.) Gene reprezintă o parte funcţională a cromosomului, care este transcrisă în ARN în momentul şi locul potrivit, pe parcursul ciclului celular Gena include în structura sa si una sau mai multe regiuni adiacente, cu funcţie reglatoare

GENA LA PROCARIOTE

GENA LA EUCARIOTE

EUCARIOTELE: INTRONI ŞI EXONI Intron: regiune necodificatoare a unei gene, care va fi eliminată pe parcursul proceselor de modificare post-transcripţională a transcriptului ARN primar. Numărul lor variază de la zero la foarte multe, au lungime variabilă, iar funcţia lor este de regulă, necunoscută

Exon: regiune codificatoare a unei gene (care va fi inclusă în transcriptul matur)

Genetică moleculară REGIUNILE ADIACENTE SECVENŢELOR GENICE La procariote, genele sunt aranjate de regulă în tandem, cu foarte puţin spaţiu (nucleotide) între ele. Cel mai frecvente, secvenţele de spaţiere lipsesc.

La eucariote, există regiuni de dimensiuni considerabile, cu rol de spaţiere, între gene: –Unele dintre aceste secvenţe sunt reprezentate de ADN repetitiv, format din unităţi identice sau aproape identice care se repetă, plasate dispersat sau alăturat (în tandem) –Unele regiuni de spaţiere sunt provenite din secvenţa unor elemente genetice mobile

STRUCTURA GENOMULUI STRUCTURA CROMOSOMILOR Genetică moleculară SUMAR Fiecare specie conţine un set unic de informaţie genetică = genomul speciei Genomul este alcătuit din una sau mai multe molecule de acizi nucleici, fiecare molecula fiind organizata sub forma unui cromozom Genomul la procariote este reprezentat de un unic cromozom Genomul la eucariote este format din unul sau două seturi de cromozomi liniari, plasaţi în nucleu Genomul viral poate fi circular, mono sau dublucatenar şi poate fi format fie din ADN, fie din ARN NATURA GENOMURILOR Genomică : studiul structurii / funcţiilor genomului Dimensiunea genomului:

variabilă; numarul de gene nu prezintă un indicator absolut al gradului de evolutie al speciei

Genetică moleculară GENOMURILE MICI Plasmidele –Molecule de ADN simbionte; neesentiale pentru viabilitatea celulara Replicarea lor este controlata de gazda –La procariote, majoritatea plasmidelor sunt circulare

–De multe ori codifica rezistenta la antibiotice, sau alte functii care confera gazdei avantaj selectiv ADN-ul din organite

–cloroplastidial, mitocondrial

–Numeroase copii / organit si desigur, numeroase organite / celula Cantitatea totala de ADN din organite poate fi destul de mare –Genele lor au functii foarte specifice

–Au aparut prin endosimbioze dintr-un ancestor procariot

ADN plasmidial / ADNmt

Genetică moleculară GENOMURILE VIRALE Particule nevii –Utilizeaza echipamentul de sinteza celular in vederea propriei reproduceri –La procariote, virusurile care infecteaza celulele se numesc bacteriofagi –Au genom format din acizi nucleici –Poseda un invelis proteic Genom ADN sau ARN –Mono sau dublucatenar –Liniar sau circular Genomurile sunt compacte, cu putin ADN spatiator

Genetică moleculară GENOMUL PROCARIOT De regula, genomul este dublu-catenar, circular –Cu cat sunt secventiate mai multe genomuri bacteriene, se constata ca exista si numeroase specii cu genom liniar –Ocupa o regiune numita nucleoid –Este atasat la membrana celulara Genele nu sunt separate de secvente extinse de spatiere Operonul –Reprezinta grupuri de gene plasate in tandem, a caror functionare este reglata coordonat –Se transcriu ca un singur ARNm Intronii sunt extrem de rari ADN-ul este extrem de bine impachetat

Genetică moleculară GENOMUL NUCLEAR EUCARIOT Fiecare specie are un numar caracteristic de cromosomi La diploizi, cromozomii formeaza perechi (omologi) –Sunt similari structural –Au aceeasi secventa genica –Pot contine alele diferite Ploidia se refera la numarul de seturi complete de cromosomi

–Haploidie (1n): un singur set complet de gene

–Diploidie (2n) (celulele somatice la om contin 2n = 46)

–Poliploidie (≥3n) Genele reprezinta segmente din ADN-ul cromozomial CROMOSOMII OMOLOGIFiecare membru a unei perechi de omologi este similar cu partenerul sau, in privinta dimensiunii si secventei genice Fiecare gena are aceeasi pozitie relativa

Genetică moleculară CROMOSOMUL EUCARIOT (1) citogenetica: studiul microscopic al cromosomilor –combina citologia si genetica Diferente considerabile ca dimensiuni si numar de gene intre cromosomi Centromerul are pozitie variabila –telocentric: centromer plasat terminal –acrocentric: centromer plasat in apropierea unui capat –metacentric: centromerul este plasat la mijloc –Bratul p este bratul scurt, bratul q este bratul lung Telomer: capatul cromosomului Organizatorul nucleolar (ARNr) –Situsul sintezei ARNr; genele ARNr sunt plasate in tandem

Genetică moleculară CROMOSOMUL EUCARIOT (2)

Heterocromatina –Regiuni intens colorabile de ADN extrem de compact Eucromatina: regiuni care se coloreaza slab, mai putin compacte, continand gene care se transcriu activ Pattern-ul de benzi (a cromosomilor metafazici) –Regiuni care se coloreaza diferit –Benzile G, obtinute prin colorare Giemsa (bogate in A/T) –Benzile R, revers-Giemsa (bogate in G/C) Cromosomii politenici –Cromosomi replicati dar fara separarea cromatidelor –Sunt prezenti in anumite tesuturi la diptere

CARIOTIPUL UMAN

ARHITECTURA CROMOSOMILOR

Pattern-ul de benzi G in cariotipul uman (46, XX)

INTERFAZA vs METAFAZA

Genetică moleculară ADN NUCLEAR Inalt organizat, cu diverse grade de impachetare

Nucleosomul –Unitatea fundamentala a cromatinei

–ADN-ul se infasoara in jurul unui miez de proteine histonice (un octamer) Histonele sunt proteine inalt conservate

H2A, H2B, H3, H4 –Fibra de 10 nm

–Solenoidul, fibra de 30 nm Impachetarea ordonata –Bucle ale solenoidului se cupleaza la scheletul proteic al cromozomului

–Acest matrix contine topoizomeraza II

–Se formeaza fibre cu grosime mai mare

Genetică moleculară GENOMICA COMPARATIVA Studiaza diferentele si asemanarile dintre diferitele genomuri Numeroase gene se regasesc la toate organismele vii sau la grupuri relativ inrudite de specii Studierea genelor la organismele model ofera informatii valoroase privind genele de la diferite organisme Genomurile de dimensiuni mari ofera o cantitate considerabila de informatie –analiza computerizata

Compararea genelor inductoare de cancer la om si gene omoloage de la Drosophila, Caenorhabditis si levuri

F = Drosophila W = Caenorhabditis elegans Y= yeast (S. cerevisiae) Albastru inchis = secventa inalt omoloaga Albastru deschis/purpuriu = similitudine relativ redusa Alb = lipsa de omologie

TRANSMITEREA INFORMATIEI GENETICE REPLICAREA ADN SUMAR Replicarea ADN precede diviziunea celulara ADN-ul este replicat prin intermediul utilizarii uneoi catene drept matrita pentru sinteza unei catene complementare. –toate nucleotidele sunt adaugatela capatul 3’ al catenei in crestere –una dintre catene este sintetizata continuu, in timp ce cealalata este sintetizata discontinuu cromosomii replicati sunt distribuiti in nucleii celulelor fiice, care rezulta in urma diviziunii

Replicarea are loc in faza S a ciclului celular Replicarea este semiconservativa, fiecare catena servind ca matrita pentru sinteza unei catene complementare Sinteza ADN se desfasoara la nivelul unor repliconi, alcatuiti fiecare dintr-o origine de replicare si doua furci de replicare divergente (bidirectional) La nivelul fiecarei furci de replicare se afla un complex de enzime, incluzand ADN polimeraza. Celelalte enzime sunt primaza, helicazele si topoizomeraza

REPLICAREA ADN ESTE SEMICONSERVATIVA Replicarea este semiconservativa, fiecare catena a ADN-ului servind ca matrita pentru sinteza uReplicarea se desfasoara conform acestui model, atat la eucariote, cat si la procariote si virusuri nei catene complementare.

EXPERIMENTUL MESELSON-STAHL

POLIMERIZAREA ADN polimerizarea nucleotidelor in ADN necesita: –ADN polimeraza

–dATP, dGTP, dCTP, dTTP (dNTPs) (nucleotidele in forma trifosfat)

–matrita monocatenara de ADN

–un primer, cu un capat 3’ hidroxil liber, la nivelul caruia sa se accepte nucleotida nou-venita enzime/proteine accesorii: –proteine care se leaga la monocatena ADN (single-strand binding proteins)

–primozomul, care contine ARN primaza

–helicaza, necesara anularii spiralizarii ADN

–giraza, necesara relaxarii superrasucirilor aparute in fata furcii de replicare

CATENA CONDUCATOARE SI CATENA INTARZIATA Limitarea este impusa de sinteza ADN, strict in directia 5’ spre 3’ Cele doua catene ADN sunt utilizate diferit la nivelul furcii de replicare –catena conducatoare (leading strand) este sintetizata continuu

–catena intarziata (lagging strand) este sintetizata de o maniera discontinua sunt sintetizate fragmente Okazaky fragmentele sunt cuplate intre ele cu ajutorul ADN ligazei

SINTEZA CATENEI INTARZIATE

ORIGINEA DE REPLICARE Replicarea ADN debuteaza la nivelul unei secvente specifice de nucleotide, numita origine de replicare –initierea are loc prin cuplarea proteinelor care recunosc originea de replicare, a caror functie este de a deschide helixul si de a recruta apoi componentele aparatului de replicare Sinteza ADN se va desfasura in continuare bidirectional, plecand de la nivelul originii de replicare REPLICAREA BIDIRECTIONALA Fiecare replicon poseda o origine de replicare, de la nivelul careia replicarea se desfasoara bidirectional

REPLICAREA CROMOSOMULUI CIRCULAR • Exista o singura origine de replicare • Replicarea este bidirectionala, cu formarea unei structuri intermediare, numita structura theta ALTE SITUATII Unele molecule de ADN circular (ex. plasmidele) se replica dupa modelul cercului rotativ –matrita circulara este replicata continuu –catena liniara este replicata discontinuu, cu ajutorul fragmentelor Okazaki Telomerii –reprezinta capetele specializate ale cromosomilor liniari de la eucariote –sunt replicate cu ajutorul telomerazei telomeraza foloseste ca matrite mici fragmente de ARN telomeraza este o specie de revers transcriptaza –in absenta telomerilor, catena conducatoare se va scurta de fiecare data, la indepartarea primerului de la nivelul caruia a debutat replicarea, ceea ce va conduce la deletia unor gene esentiale bunei functionari a celulei REPLICAREA DUPA MODELUL CERCULUI ROTATIV

- caracteristic anumitor plasmide si fagi - o catena ramane circulara si functioneaza ca matrita pentru sinteza continua - catena decuplata, va oferi un capat 5’ si va servi ca matrita pentru sinteza discontinua - sinteza continua cu formarea mai multor copii ale genomului, intr-o strunctura multimerica - are loc clivajul si separarea, precum si incliderea circulara a moleculelor nou sintetizate

REPLICAREA TELOMERILOR

- replicarea normala a capetelor cromosomului ar conduce la scurtarea acestei regiuni si, implicit, la pierderea de informatie genetica - telomerii contin multiple copii ale unor mici secvente repetitive - au rolul de a preveni pierderea de informatie genetica si aderarea cromosomilor la nivelul capetelor - sunt replicati printr-un mecanism special

GENETICA a apărut ca ştiinţă la începutul secolului trecut (a devenit domeniu de sine stătător în anul 1900) şi în doar câteva decenii a revoluţionat întreaga biologie, explicând geneza întregii diversităţi a lumii organice la nivel cromosomial şi cu ajutorul biochimiei la nivel molecular. Este percepută drept disciplina biologică ce se preocupă cu studiul eredităţii, variabilităţii şi determinismului caracterelor. Termenul a provenit din grecescul gennao = "a naşte“. –Ereditatea, din latinescul hereditas = "moştenire", reprezintă o calitate intrinsecă a sistemelor biologice individuale, care asigură transmiterea nealterată în şirul de generaţii, a bagajului informaţional specific.

–Variabilitatea, din latinescul variare = "a se schimba", reprezintă calitatea sistemelor biologice individuale, care permite schimbarea conţinutului informaţiei ereditare, în şirul de generaţii.

Johann Gregor Mendel (n. 22 iulie 1822 - d. 6 ianuarie 1884) a fost călugăr augustinian şi cercetător ştiinţific, cunoscut ca fondator al geneticii.

LEGITĂŢILE EREDITĂŢII Experimentele lui Mendel •Mendel nu a fost primul care a efectuat experimente de încrucişare, dar a fost unul dintre primii care a făcut observaţii referitoare la câte un singur caracter. •Mendel a formulat ipoteze, a prezis şi verificat transmiterea caracterelor de-a lungul generaţiilor, fără a cunoaşte însă mecanismele biologice implicate în acest proces. •a ales ca obiect de studiu o specie autogamă, Pisum sativum, putând urmări în descendenţă comportarea hibrizilor •a verificat puritatea genetică a plantelor luate în studiu, timp de 3-4 generaţii.

Monohibridarea •Monohibridarea reprezintă procesul de încrucişare (hibridare) a doi indivizi : 1.aparţinând aceleiaşi specii 2. puri din punct de vedere genotipic (homozigoţi) 3. deosebiţi între ei prin manifestarea fenotipică a unui singur caracter. •Mendel a utilizat, pentru monohibridare, două soiuri de mazăre, pure din punct de vedere genotipic, ce prezentau caractere stabile şi care se deosebeau prin:

-culoarea tegumentului la boabe: 1.cu boabe de culoare galbenă

2.cu boabe de culoare verde

SAU -forma boabelor : 1.zbârcite

2.netede

SAU -culoarea pastaii SAU -culoarea florii

•În prima generaţie hibridă (F1) a obţinut numai plante cu boabe de o singură culoare – galbenă in cazul experimentelor ce vizau caracterul culoare, sau toţi indivizii aveau boabe netede, in cazul experimentelor ce vizau caracterul forma . •toţi hibrizii din F1 (prima generaţie) aveau o singură culoare a boabelor sau respectiv aceeasi forma •Pe baza acestui experiment, Mendel a enunţat principiul uniformităţii hibrizilor în F1. •Perpetuând respectivii hibrizi prin autofecundare, în cea de a doua generaţie, Mendel a constatat reapariţia fenotipurilor parentale (reapariţia expresiilor fenotipice etalate de cei doi părinţi), în raport de aproximativ 3:1. În consecinţă, a fost enunţat cel de-al doilea principiu - segregarea hibrizilor în F2. • Mendel a precizat că în F1 se manifestă fenomenul de dominanţă şi recesivitate, în sensul că este etalat doar caracterul dominant, cel recesiv rămânând ascuns.

Mendel a încercat să interpreteze şi să-şi explice rezultatele obţinute. Întrucât, la acea vreme, nu se cunoştea nimic despre cromosomi şi gene (substratul material al informaţiei ereditare), Mendel a folosit termenul de factori ereditari şi a presupus, cu o extraordinară intuiţie, că în fiecare celulă a organismului factorul ereditar determinant al unui caracter se află în doză dublă, în timp ce în celulele sexuale se află în doză simplă. Apoi Mendel a precizat că, după fecundare şi formarea zigotului, factorii ereditari nu se contopesc, ci doar se alătură.

În consecinţă, când se formează din nou gameţii, ei se vor despărţi, fiecare trecând într-un gamet. Astfel, gameţii sunt puri din punct de vedere genetic. Aceasta este considerată prima lege elaborată de Mendel, supranumită: LEGEA PURITĂŢII GAMEŢILOR. Dihibridarea Mendel a recurs şi la încrucişarea de indivizi care se deosebeau prin expresia fenotipică a două caractere: -culoarea

-forma boabelor. El a încrucişat mazăre cu boabe netede şi galbene cu mazăre cu boabe zbârcite şi verzi. În F1, ca şi la monohibridare, toţi indivizii au fost uniformi, având boabe netede şi galbene. S-au manifestat fenomenele de dominanţă şi recesivitate. În F2 a avut loc segregarea independentă a caracterelor, fiind posibilă recombinarea acestora şi apariţia de noi fenotipuri.

Atât forma cât şi culoarea boabelor a segregat în raport de 3:1. În plus, au apărut şi noi combinaţii de caractere- boabe netede şi verzi, pe de o parte, şi boabe zbârcite şi galbene, pe de altă parte.

DIVIZIUNEA CELULARA - MITOZA SI MEIOZA

SUMAR Replicarea ADN reprezinta o prerecuzita a diviziunii celulare Cromosomii replicati sunt distribuiti in nucleii celulelor fiice in timpul mitozei. –procesul mentine continutul informational (genomul) celulei Meioza este procesul prin care cromosomii replicati sunt distribuiti in celule haploide, pe parcursula doua diviziuni si celulare, precedate de o unica runda de replicare a ADN-ului –continutul de ADN al celulei se reduce la 1/2

DIVIZIUNEA CELULELOR PROCARIOTE Cromosomul este replicat cu producerea a doua molecule de ADN identice Moleculele ADN fiice sunt distribuite fiecare intr-o noua celula Celulele fiice sunt genetic identice

DIVIZIUNEA CELULARA LA EUCARIOTE Mitoza –diviziune somatica –distribuie echilibrat cromosomi replicati –reprezinta o etapa distincta a ciclului celular Ciclul celular –G1: gap (crestere) –S: replicarea ADN (formarea cromatidelor surori)

–G2: gap (crestere) –M: mitoza (diviziunea nucleara) si citochineza

Diviziunea celulara conservativa (asexuata)

FORMAREA CROMATIDELOR IN CELULE HAPLOIDE Celulele haploide contin cate o singura copie a fiecarui cromosom

FORMAREA CROMATIDELOR IN CELULE DIPLOIDE

MITOZA diviziunea nucleara urmata, de obicei, de diviziunea celulei se desfasoara in patru faze: –profaza cromosomii se condenseaza si se ataseaza la fusul de diviziune prin intermediul kinetochorului nucleolul si membrana nucleara dispar –

metafaza: cromosomii se aliniaza in placa ecuatoriala –anafaza: cromatidele surori se separa si migreaza la polii opusi ai fusului de diviziune –telofaza: se desavarseste diviziunea celulei si reformarea nucleilor si nucleolilor, in celulele fiice

SEGREGAREA CROMOSOMILOR cromatidele surori (cromosomi replicati) sunt atasate prin intermediul centromerului

–secventele ADN sunt identice (replicarea ADN se desfasoara pe baza complementaritatii bazelor azotate) –centromerul functioneaza ca situs de legare la kinetochor, in vederea atasarii la microtubuli fusul mitotic de diviziune –microtubulii sunt asamblati din tubulina –contine proteine motoare –ofera forta necesara separarii cromatidelor –este responsabil de impartirea fidela a cromosomilor (cromatidelor) in celulele fiice

ASAMBLAREA FUSULUI DE DIVIZIUNE

MEIOZA diviziune specializata, reductionala, care provoaca reducerea la jumatate a numarului de cromosomi ai unei celule –are loc in celulele sexuale si are ca functie producerea gametilor haploizi, ceea ce duce la evitarea dublarii numarului de cromosomi, in procesul fecundatiei se desfasoara in meiocite

–in faza S premeiotica are loc replicarea cromosomilor –meiocitele se divid apoi de doua ori, fara ca intre cele doua diviziuni sa mai aiba loc replicarea ADN, cu formarea unor tetrade de celule haploide

DIVIZIUNEA MEIOTICA perechile de cromosomi omologi replicati, sinapseaza (se alipesc) pe toata lungimea lor –are loc formarea de tetrade de cate patru cromatide

–cromatidele nesurori din tetradele sinapsate, pot suferi crossing-over (schimb reciproc de segmente cromatidice) in urma primei diviziuni meiotice, spre polii fusului de diviziune migreaza cromosomi intregi, cate unul din fiecare pereche de omologi, spre alt capat al fusului in urma celei de a doua diviziuni meiotice, la polii fusului de diviziune migreaza cromatide

FAZELE MEIOZEI Profaza I –leptoten: debuteaza spiralizarea cromosomilor –zigoten: sinapsarea omologilor

se formeaza complexele sinaptonemale, intre cromosomii apartinand aceleeasi perechi de omologi se formeaza bivalentii –pachiten: are loc crossing-over-ul –diploten: devin vizibile incalecarile de cromatide (chiasmata) –diachineza: terminalizarea chiasmelor (bivalentii incep sa se separe) Metafaza I: asortarea independenta a perechilor de bivalenti –dansul cromosomilor

Anafaza I: cromosomii se deplaseaza spre polii fusului de diviziune –cromatidele surori raman impreuna, legate prin intermediul centromerului Telofaza I –are loc diviziunea celulei –cromosomii se despiralizeaza –se reformeaza membrana nucleara Poate avea loc interchineza (nu are loc sinteza de ADN)

Profaza II: –spiralizarea comosomilor

–atasarea cromosomilor la fibrle fusului de diviziune Metafaza II: deplasarea si alinierea cromosomilor in placa ecuatoriala Anafaza II –clivarea centromerilor

–cromatidele surori migreaza spre polii fusului (cromosomi unicromatidici) Telofaza II –diviziunea celulei

–reconstructia nucleilor si nucleolilor

CONSECINTELE MEIOZEI formarea a patru celule haploide, fiecare continand o copie intreaga a genomului recombinarea genetica –crossing-over in profaza I –asortarea independenta a perechilor de cromosomi (“dansul cromosomilor”) –asigurarea variabilitatii genetice meioza are loc intr-un anumit moment al ciclului de dezvoltare la organismele cu reproducere sexuata

TEORIA CROMOSOMIALA A EREDITATII ( MORGANISMUL)

Thomas Hunt Morgan (1866-1945), în laboratorul său din Universitatea Columbia

Ciclul de viaţă la Drosophila melanogaster

S-a efectuat o experienţă de hibridare (tip dihibridare), între indivizi de D. melanogaster ce difereau între ei prin culoarea ochilor şi forma aripilor. Femela era fenotipic normală (pr+pr+vg+vg+), iar masculul dublu mutant - avea ochii purpurii (prpr) şi aripile vestigiale (vgvg). În F1 s-au obţinut doar indivizi fenotipic normali. Prin încrucişarea lor, în F2, în loc să se obţină segregarea de tip mendelian, de 9:3:3:1, s-au obţinut doar două categorii de fenotipuri - 75% de tip parental dominant şi 25% de tip parental recesiv. Deci, un raport tipic monohibridării (adică 3 : 1). Segregare genotipică: 25% homozigot dominant + 50% heterozigot, + 25% homozigot, recesiv

Segregare fenotipică: 75% dominant + 25% recesiv

Prin urmare, se impune o primă concluzie. Cele două caractere nu segregă independent. De aici supoziţia că ele sunt plasate (genele ce le determină) pe acelaşi cromosom. Adică, pentru individul normal vom avea pr+ vg+, şi pr wg pentru cel mutant. pr+ vg+ pr wg Pentru a elimina confuziile, precizăm că cele două gene sunt cantonate pe cromosomii perechii a II-a. Indicativul "pr" redă mutanta purple (purpuriu, în engleză).

Moştenirea culorii ochilor la Drosophila melanogaster, în descendenţa unei femele normale şi a unui mascul cu ochii albi (După Snustad & co., 1997)

Transmiterea culorii ochilor, la D. melanogaster, prin hibridarea dintre o femelă heterozigotă şi un mascul mutant (sus) şi o femelă mutantă şi un mascul normal (jos) (După Snustad & co., 1997)

Prin urmare, s-a reuşit să se demonstreze că gena responsabilă de determinismul culorii ochilor este cantonată pe heterosomul X. În fapt totul a început după ce a fost sesizată prezenţa unui mascul cu ochii albi. Când respectivul mascul a fost încrucişat cu o femelă normală (de tip sălbatic), toţi descendenţii au avut ochii de culoare roşie, demonstrând recesivitatea culorii albe şi dominanţa celei roşii. Prin încrucişarea descendenţilor între ei s-a constatat că situaţia se schimbă şi se complică – femelele apăreau numai cu ochii roşii în timp ce masculii apăreau atât cu ochi albi (50%) cât şi cu ochi roşii (50%). Este clar, deci, că respectivul caracter (mai exact spus gena care-l determină) este cantonat pe cromosomul X. Altfel spus transmiterea respectivei gene este sex-linkată. Gena pentru culoarea ochilor este plasată pe cromosomul X şi nu pe Y şi, prin mutaţie, apar alele. Tipul sălbatic (normal) este desemnat prin w+, iar alela pentru culoarea albă prin w. Genele care fac parte din aceeaşi grupă de linkage, sunt gene linkate. Cromosomii reprezentând substratul (suportul) material al genelor, rezultă că în meioză asortarea întâmplătoare a cromosomilor în gameţi este, în fapt, asortarea întâmplătoare a grupelor de linkage. Altfel spus, o genă şi chiar o grupă de linkage, au comportamente identice cromosomilor. În cazul sex-linkage-ului, are importanţă sexul indivizilor pe care-i folosim în încrucişare. Evident, când genele sunt localizate pe autosomi, sexul indivizilor utilizaţi pentru încrucişare nu ar trebui să aibă importanţă. Dar, aşa cum precizam mai sus, la Drosophila melanogaster, între autosomii masculului nu are loc fenomenul de crossing-over. Prin urmare, când se aşteaptă o constanţă a rezultatelor, este bine să se ţină cont de acest lucru.

Prin încrucişarea unei femele de Drosophila melanogaster, dublu mutantă (cu două mutaţii recesive, ale genelor localizate pe cromosomul X, determinând culoarea galbenă a corpului şi culoarea albă a ochilor), cu un mascul normal, în F1 s-au obţinut doar indivizi de două tipuri - deci, o segregare de 1:1. Femelele erau cu fenotip normal, dar heterozigote şi masculii cu fenotipizare mutantă, dar hemizigoţi genotipic. Fenomenul a primit denumirea de ereditate în cruciş (criss-cross), deoarece fenotipul mamei se manifestă la fii, iar cel al tatălui la fiice. Prin încrucişarea indivizilor femeli şi masculi din F1, s-a constatat apariţia, în F2, a patru clase de indivizi - două clase conforme rezultatelor determinate de linkage şi alte două clase cu recombinare de caractere. Proporţia era de 49,25% pentru fiecare dintre primele două clase şi de 0,75% pentru fiecare din clasele cu recombinare.

Precizăm că w reprezintă mutanta pentru culoarea ochilor (ochi albi) şi y reprezintă mutanta pentru corp galben (de la cuvântul englezesc yellow), w+ şi, respectiv, y+ reprezentând genele normale. Deci, plecându-se de la femele dublu mutante şi masculi normali, în F1 s-a obţinut o segregare fenotipică (Sf) de 1:1 şi una genotipică (Sg) tot de 1:1, femelele fiind heterozigote, cu fenotip normal (dominant) şi masculii hemizigoţi, cu fenotip recesiv (mutant).

Teoretic, gameţii indivizilor de F1 trebuiau să fie doar de două tipuri: la femele Xyw şi Xy+w+, iar la masculi Xyw şi Y. Dar rezultatele încrucişării indivizilor din F1, dând un cu totul alt raport de segregare în F2 şi, mai ales, dând o categorie de indivizi cu recombinări de caractere, s-a ajuns la concluzia că a avut loc crossing-overul între cromosomii omologi şi apariţia a două noi tipuri de gameţi în cazul femelelor: Xy+w şi Xyw+. Prezenţa acestor gameţi explică apariţia indivizilor cu fenotipuri recombinate, în F2. Aceştia sunt atât masculi, cât şi femele, cu corp gri şi ochi albi sau cu ochi roşii şi corp galben. Deci, între genele y+ şi w+ şi alelele lor, situate pe cromosomii X omologi, au avut loc schimburi, rezultând noi grupe de linkage. Adică, din y+w+ şi yw, au rezultat y+w şi yw+, alături de tipurile parentale care s-au menţinut.

Un alt experiment, efectuat de Morgan şi colaboratorii săi, a demonstrat existenţa crossing-overului şi între autosomi. Încrucişând o femelă de Drosophila melanogaster cu corpul negru (b - de la black) şi aripi normale (vg+) cu un mascul cu corpul gri (b+) şi aripi vestigiale (vg), în F1 s-au obţinut indivizi heterozigoţi b+bvg+vg, cu fenotipul normal. Încrucişându-se indivizii din F1 cu indivizi dublu mutanţi (încrucişare de analiză genetică), s-a constatat că în FT, fenotipul indivizilor diferă în funcţie de sexul lor. Astfel, dacă se efectuează o retroîncrucişare între un mascul din F1, heterozigot (b+bvg+vg) cu o femelă mutantă (bbvgvg), în FT se obţine segregarea de 1:1, ca în experimentele pentru demonstrarea fenomenului linkage (adică reapar indivizii cu fenotip parental - corp negru şi aripi normale şi corp gri cu aripi vestigiale). Deci, linkage-ul este total. Precizam anterior că, în acest caz, este vorba de autosomi - mai concret, de perechea a II-a de omologi. Atunci, cum se explică diferenţa de comportament dintre masculi şi femele? S-a ajuns la concluzia că, în cazul masculilor de Drosophila melanogaster, cromosomii din perechea a II-a nu prezintă fenomenul de crossing-over. Lipsa crossing-overului este valabilă şi pentru cromosomii sexului (la mascul), în sensul că între cromosomii X şi Y nu se cunoaşte existenţa acestui fenomen. În încrucişarea reciprocă (retroîncrucişare) dintre o femelă hibridă de F1 (b+bvg+vg) şi un mascul dublu mutant (bbvgvg), în FT, pe lângă tipurile parentale (corp negru şi aripi normale; corp gri şi aripi vestigiale), mai apar încă două clase fenotipice (care, în mod normal, nu trebuiau să apară: corp gri şi aripi normale; corp negru şi aripi vestigiale). Într-o populaţie suficient de mare, proporţia indivizilor este de 41,5% pentru fiecare dintre tipurile parentale şi câte 8,5% pentru fiecare dintre tipurile recombinante. Deci, linkage-ul genelor b+ şi vg+ se dereglează şi respectivele gene "segregă", datorită schimbului reciproc de material cromatic între cromosomii omologi.

Rezultă că femelele din F1 pot forma patru tipuri de gameţi - două normale şi două recombinate, primii fiind numiţi gameţi crossing-overi, ceilalţi fiind gameţi necrossing-overi.

Pentru explicarea modalităţilor concrete prin care se realizează crossing-overul s-au emis mai multe ipoteze, care pot fi grupate în două mari categorii, şi anume: Cele ce consideră că fenomenul se datorează ruperii cromatidelor şi schimbului reciproc de segmente (breakage theory). Cele ce consideră drept cauză a fenomenului replicaţia selectivă a cromatidelor în timpul dublării materialului cromosomial (copy-choise theory).

Schimb reciproc de segmente prin ruperea cromatidelor

Schimb reciproc de segmente cromatidice prin copiere selectivă

Din cadrul primului grup de ipoteze, cea mai cunoscută este teoria chiasmatipiei. Ea a fost elaborată de către F.A. Jannsen (1909, 1924), reluată apoi şi dezvoltată de C.D. Darlington şi K. Mathei (1932), fiind ulterior verificată de către J.H. Taylor (1957, 1958, 1963) prin metoda izotopilor radioactivi. Conform acestei ipoteze, în profaza meiozei, între leptoten şi pachiten, între cromosomii omologi (unul de provenienţă paternă şi celălalt, de provenienţă maternă) se produc sinapse. Între pachiten şi diploten, fiecare cromosom apare format din două cromatide. Între cromatidele unei perechi de omologi se menţin puncte de contact, numite chiasme. În ipoteza chiasmatipiei, anterior diplotenului, se produce un schimb de segmente cromatidice (egale) - fenomen cunoscut sub numele de chiasmata. Prin urmare, doi gameţi rămân nerecombinaţi, iar ceilalţi doi vor avea cromosomii recombinaţi. O chiasmă nu poate afecta decât două dintre cele patru cromatide ale unei perechi de omologi. În principiu, deci, crossing-overul între doi cromosomi omologi nu poate depăşi 50%. Fără îndoială, mai ales între cromosomii lungi, se pot forma mai multe chiasme, explicându-se astfel, crossing-overul dublu, triplu, multiplu. În explicaţia crossing-overului, pe baza acestor ipoteze, intervin şi unele precizări. Una dintre ele priveşte repartiţia chiasmelor. Astfel, prima chiasmă apare la o anumită distanţă de centromer, denumită distanţă diferenţială, care este mai mică la cromosomii mai scurţi. Distanţele dintre chiasme, pe aceeaşi

cromatidă, se numesc distanţe de interferenţă şi reprezintă caracter de specie.

Formarea chiasmelor şi producerea gameţilor recombinaţi (50%) şi de tip parental (50%)

Pentru a explica mecanismul ruperii şi schimbului de material cromatidic, C.D. Darlington a propus o ipoteză conform căreia ruperea cromatidelor se datoreşte răsucirii foarte strânse a cromosomilor, unul în jurul celuilalt, în zigoten. Prin aceasta, s-ar crea o tensiune mare asupra cromatidelor externe. Ca urmare, acestea se rup, se derulează parţial şi, apoi, se resudează, fie în cadrul aceleiaşi cromatide, fie în cromatidele surori. Evident, în primul caz nu se poate vorbi de crossing-over, în cele de-al doilea, da. De aceea se apreciază că probabilitatea maximă de a se manifesta crossing-overul este de 50%. Teoria copierii selective (replicaţiei selective) consideră că fenomenul de crossing-over se realizează în stadiul S din interfaza ciclului celular.

Plecând de la faptul că sinteza ADN şi, deci, a materialului cromosomial în ansamblu, se realizează după modelul semiconservativ, s-a presupus că replicaţia cromosomului nu are loc după propria matriţă, ci după cea a cromosomului pereche şi vice-versa. În consecinţă, cromatidele nou formate ar copia o parte a materialului genetic de pe un cromosom şi o parte de pe celălalt cromosom. Aşa ar rezulta recombinările cromatidiene. erificarea experimentală a acestor ipoteze s-a efectuat prin marcarea unor bacteriofagi cu 15N. S-au infectat bacterii cu un astfel de virus, după care s-au cultivat pe un mediu cu 14N. Ipoteza copierii selective s-a dovedit neviabilă.