CUPRINSARGUMENT I. Definiie i roluri .. II. Compoziia acizilor nucleici ARN i AND ... 2.1. Proporia molar a bazelor n ARN . 2.2. Proporia molar a bazelor n ADN ..... 2.3. Structura macromolecular a ARN . 2.4. Structura macromolecular n ADN ... 2.5. Forme moleculare ale ADN .. 2.6. Forme moleculare n ARN .... III. Fracia biologic a acizilor nucleici 3.1. Acizii nucleici purttori ai caracterelor ereditare ale organismelor.. 3.2. Date experimentale care au demonstrat c acizii nucleici stau la baza ereditii . IV. Proprieti ale acizilor nucleici 4.1. Proprieti fizico chimice . 4.2. Transcrierea ADN 4.3. Traducerea ARN .. 4.4. Replicarea ADN ... 4.5. Replicarea ARN ... V. Codul genetic .... Anexa 1 . Bibliografie 2 4 6 7 8 8 10 11 13 13 13 15 16 16 17 17 18 22 32

1

ARGUMENTProgresele tiinei contemporane au impus schimbri eseniale n cunotinele noastre despre natura vie, determinnd formarea unui nou mod de gndire i aciune. Cercetrile de biologie molecular, care au condus la descoperirea structurii i funciei acizilor nucleici au produs o revoluie n biologie cu implicaii profunde n medicin. Genetica este o ramur a tiinelor biologice care studiaz ereditatea i variabilitatea organismelor vii, fiind una dintre cele mai tinere tiine. Denumirea de acizi nucleici a fost introdus de biochimistul Richard Altmann (1899), datorit combinrii selective cu colorani bazici a acestora. Altmann, folosind o metoda de preparare a nucleinii, a obinut rezultate asemntoare cu cele ale lui Miescher. Interesul deosebit de care se bucur azi acizii nucleici, datorit rolului pe care l au n procesele fundamentale ale vieii: replicarea, transmiterea caracterelor ereditare ale organismelor, biosinteza proteinelor, transformarea celular este ilustrat de cunotinele acumulate n descifrarea structurii i funciei acizilor nucleici, de modul n care informaia genetic a celor mai variate organisme este pstrat cu maximum de fidelitate, de modul n care organismul se replic i i transmite proprietile din generaie n generaie. Studiile din acest domeniu au artat c diversitatea organismelor (virusuri, bacterii, plante, animale) este condiionat de un singur cod, care are la baz numai patru elemente specifice ale acizilor nucleici, denumite nucleotide. Acestea, nlnuite n macromolecule de acizi nucleici ntr-o anumit succesiune, determin identitatea fiecrei specii, iar numrul lor n macromolecule reflect complexitatea unui organism oarecare. Acizii nucleici sunt substane chimice macromoleculare cu grad nalt de polimerizare, formate prin nlnuirea unor molecule de nucleotide (Anexa 1, fig 1). Nucleotidele reprezint unitatea monomeric a acizilor nucleici i sunt compuse din: o baz azotat heterociclic, o pentoz i un radical fosforic. Bazele azotate - din macromolecula acizilor nucleici sunt de doua tipuri: purinice si pirimidinice: bazele azotate purinice - din structura acizilor nucleici sunt adenina (A) si guanina (G); bazele azotate pirimidinice - sunt reprezentate de timina (T), citozina (C) pentru ADN si citozina (C), uracil (U) pentru ARN. Pentoza - din componenta acizilor nucleici sunt dezoxiriboza (dR) pentru ADN si riboza (R) pentru ARN. Radicalul fosforic (P) - este acelai pentru ambii acizi nucleici. Proporia pentru cele trei componente de structura ale acizilor nucleici (radical fosforic, pentoza si baza azotata), pentru fiecare nucleotid este de 1 Componenta de baza a acizilor nucleici se structureaz n felul urmtor: - pentoza (dR sau R) se leag cu o baza azotata printr-o legtur N - glucidica si formeaz nucleozidul; - nucleozidul legat cu o molecula de acid fosforic formeaz nucleotidul, Dup proveniena lor, respectiv dup materialele din care au fost extrase, acizii nucleici erau considerai de dou tipuri: acizi timonucleici (acizi nucleici din timus sau acizi nucleici animali) i acizi zimonucleici (acizi nucleici din drojdie sau acizi nucleici vegetali). ntruct s-a constatat c deosebirea dintre ei const n natura componentului glucidic (acizii timonucleici conin n molecula lor dezoxi-D-riboza, iar acizii zimonucleici conin D-riboza), denumirile lor au fost nlocuite cu denumirile de 2

acizi dezoxiribonucleici (ADN), i acizi ribonucleici (ARN). Cercetri ulterioare au dovedit, ns, c aceste dou tipuri de acizi nucleici sunt prezente n toate organismele vii, avnd rol important n desfurarea proceselor vitale normale i patologice; acizii dezoxiribonucleici sunt substanele de baz n aparatul genetic, care asigur ereditatea i variabilitatea, pe cnd acizii ribonucleici au mai mult rol funcional legat de sinteza proteinelor. Cercetrile lui O. T. Avery si colaboratorilor si, au revoluionat genetica, punnd bazele geneticii moleculare. Fenomenul de transformare genetica, a evideniat rolul ADN-ului in ereditate, confirmat in continuare de numeroase cercetri. Se poate afirma in mod indubitabil, ca pentru toate organismele vii materialul ereditar este constituit din acizi nucleici. Anul 1953 marcheaz nceputul unei noi ere n cercetarea biologic prin descoperirea de ctre Watson i Crick a structurii DNA, precum i a tuturor implicaiilor biologice care au derivat din structur. Conform modelului propus, ADN (deoxyribonucleic acid) este format din dou catene rsucite sub form de elice dubl (Anexa 1, fig. 2).

3

I. DEFINIIE I ROLURIADN este prescurtarea de la acidul dezoxiribonucleic (n englez: desoxyribonucleic acid, DNA). Acesta este format din molecule organice dintre cele mai complexe (Anexa 1, fig. 3). Substana se gsete n fiecare celul a fiinelor vii i este esenial pentru identitatea oricrui organism, de la Euglena viridis, mica fiin unicelular aflat la grania dintre plante i animale, i pn la Homo sapiens sapiens, omul contemporan. Molecula de ADN este format din dou catene polinucleotidice rsucite una n jurul celeilalte n spiral, cu bazele azotate spre interior. Totodat, dac pe o caten ntr-un anumit punct, este adenina, pe catena opus n dreptul adeninei este timina. ntre ele sunt dou legturi de hidrogen. n dreptul guaninei este citozina, ntre ele fiind trei legturi de de H. Adenina cu timina i guanina cu citozina formeaz perechi, sunt complementare i se atrag ntre ele. Privind cu atenie schema viei vei observa c legturile C5 C3 au sensuri opuse pe cele dou catene(care sunt antiparalele). Acest amnunt este foarte important deoarece informaia genetic este lecturat totodat n sensuri C5 C3. n molecula de ADN complementaritatea dintre bazele purinice i cele pirimidinice ine cele dou catene alturate, orict ar fi ele de lungi. Datorit ei, molecula, este foarte stabil dei foarte complex. De aici rezult stabilitatea informaiei eriditare fra de care viaa ar fi imposibil. Legturile de H sunt mai slabe dect cele esterice i se rup dac ADN este nclzit peste 100 grade C(denaturare) rezultnd DN monocatenar. Prin rcire treptat, cele dou catene se atrag datorit complementaritii bazelor azotate i revin n vechile poziii(renaturare). Dac rcirea este brusc, ADN rmne denaturat. Amestecnd monocatene ADN de origini diferite se formeaz prin renaturare parial hibrizi moleculari. Pocedeul este folosit de oamenii de stiin n studiul relaiilor filogenetice dintre specii. Speciile nrudite au temperaturi apropiate de denaturare a ADN i realizeaz o renaturare rapid i de mari proporii cnd li se amestec monocatenele deoarece secvenele polinucleotidice sunt identice pe mari propori. Ereditate nu presupune doar stocarea informaiei genetice dar i transmiterea ei. ADN ca purttor de informaie are o proprietate care ine de nsi esena vieii: se autocopiaz! Replicaia (autocopierea) ADN are loc atunci cnd o celul se pregtete de diviziune: cantitatea de ADN dublndu-se, celulele fiice vor moteni n mod egal ntreaga informaie genetic de la celula mam. n acest proces intervin mai multe enzime. Una dinte ele este DN polimeraza. Ele acioneaz precum cursorul unui fermoar desprind cele dou catene. Fiecare caten atrage acum nucleotide libere care se aflau gata sintetizate n lichidul nconjurtor. Datorit complementaritii, nucleotidele libere se vor organiza formnd o caten nou pe lnga fiecare din cele dou catene vechi(care funcioneaz ca o matri). Vor rezulta dou molecule bicatenare de ADN, identice cu cea iniial, fiecare avnd o caten avnd o caten veche i una nou sintetizat. Cele dou catene ale macromoleculei de ADN nu se separ tot de la nceputul replicrii. Separarea total este treptat, pornit fiind din punctul de iniiere al replicrii i continuat progresiv spre un punct terminus. Astfel, n plin proces de replicare, macromolecula de ADN capt forma literei Y. Punctul de ramificare a macromoleculei de ADN se numete bifurcaie de replicare. nalta fidelitate a replicaiei ADN asigur transmiterea nealterat a informaiei genetice de la o generaie de celule la alta, condiie esenial a continuitii vieii. 4

Din punct de vedere chimic, ADN-ul este un acid nucleic, este o polinucleotid, adic un compus n structura cruia se repet un set limitat de macromolecule numite nucleotide; n acest sens, el este definit ca fiind un copolimer statistic: -un copolimer este un polimer n compoziia cruia se repet mai multe "motive" (monomeri); n cazul ADN-ului, monomerii sunt nucleotidele. -iar statistic nseamn c monomerii se repet de manier aleatorie n lanul polimer, fr ca ei s fie dispui alternativ sau dup oricare alt aranjament repetitiv (aa cum se ntmpl, de exemplu, n etilen-acetatul de vinil (EVA) sau n acronitrilbutadien-stiren (ABS)). Nucleotida ca unitate de baz a ADN-ului este o macromolecul organic (o N-glicozid) compus (prin policondensare) din: -un carbohidrat, adic o glucid (mai exact o monozaharid) de tipul pentoz (n form furanozic) -o baz azotat heterociclic ("inel" sau "ciclu" aromatic n 6 atomi) de tipul pirimidinei, sau o variant a acesteia condensat cu inelul imidazolic, numit purin -i un rest de acid fosforic (esterificat cu unul din hidroxilii pentozei), adic un "grup fosfat". Datorit descoperirii i cunoaterii structurii ADN avem o imagine clar despre: felul n care este stocat i transmis la descendeni informaia genetic, codul genetic; mecanismul reglrii sintezei proteinelor; mecanismul mutagenezei; rolul unor acizi nucleici n procesul malignizrii celulare. ARN (acidul ribonucleic) este alctuit dintr-un singur lan polinucleotidic si are n general o structur cu o singur caten (Anexa 1, fig. 4). Este un complex macromolecular, structural i funcional, similar n anumite privine ADN-ului. ARNul rezult din polimerizarea unor ribonucleotide, care determin formarea unor lanuri lungi, monocatenare (structura primar). ARN-ul, spre deosebire de ADN, este o macromolecul alctuit, de regul, dintro singur caten polinucleotidic care se formeaz tot prin legturile diestericedinte radicalul fosfat i pentoz. Moleculele ARN nu pot avea dimensiuni foarte mari deoarece, cu ct crete numrul nucleotidelor (peste cteva mii ) cu att stabilitatea moleculei scade. Sinteza ARN (transcrierea) se realizeaz tot pe baza complementaritii bazelor azotate ca i n cazul replicaiei ARN. Cele dou catene ale moleculei ADN se despart pe intervalul care urmeaz a fi transcris, numai c de data aceasta va aciona enzima ARN polimeraza. Acum se va transcrie numai una din catene din molecula ADN: catena sens care va servi ca matri. Nucleotidele libere care se vor alinia pe baza complementaritii vor conine riboz. n dreptul adeninei de pe catena veche acum se va ataa uracilul n catena nou sintetizat. Dup formarea catenei, molecula ARN prsete locul transcrierii iar catenele ADN revin la poziia iniial (Anexa 1, fig. 5). ARN este purttor unic al informaiei ereditare la virusurile ARN (ribovirusuri) i la viroizi. Acetia din urm au doar o molecul mic da ARN fr nveli proteic. Ei produc unele boli la plante(boala tuberculilor fusiformi la cartofi). La restul organismelor, ARN contribuie n diferite moduri la structura si funcionarea materialului genetic existnd de aceea mai multe tipuri de ARN. Exist trei tipuri de acid ribonucleic celular prezente n toate celulele i care, avnd structuri i funcii 5

diferite, joac un rol esenial n biosinteza proteinelor. Aceste tipuri sunt: acidul ribonucleic mesager - ARNm, acidul ribonucleic solubil sau de transfer - ARNs sau ARNt i acidul ribonucleic ribozomal ARNr, la care se adaug ARN cromosomial i ARN nuclear. ARN mesager(ARNm) are rolul de a copia informaia genetic dintr-un fragment de ADN i de a o aduce, ca pe un mesaj, la locul sintezei proteice. Moleculele sunt todeauna monocatenare i au lungimi diferite, n funcie de marimea moleculelor care urmeaz a fi sintetizate. ARN ribozomal (ARNr) intr n alctuirea ribozomilor asociat cu diferite proteine. El este sintetizat tot prin transcrierea din ADN, dup care catena ARNn se pliaz formnd poriuni bicatenare datorit complementaritii bazelor azotate. Un ribozom este format din dou subuniti care vor recunoate (tot pe baza complementaritii) i vor ataa ntr ele nucleotidele de recunoatere de la nceputul moleculei de ARNm. Ribozomii au fost descoperii de savantul George Emil Palade, laureat al premiului Nobel. ARN de transfer (ARNt) este specializat pentru aducerea aminoacizilor la locul sintezei proteice. Molecula este format din 70-90 de nucleotide. Are poriuni bicatenare care i dau forma unei frunze de trifoi. Are doi poli funcionali: unul la care se ataeaz un anumit aminoacid; altul care conine o secven de 3 nucleotide care recunoate o anumit secven a ARNm unde se ataeaz pe baza complementaritii.Alte tipuri de ARN intr n constituia cromozomilor att la procariote ct i la eucariote.

II. COMPOZIIA ACIZILOR NUCLEICI ARN I ADNAcizii nucleici (AN) acidul ribonucleic (ARN) i acidul dezoxiribonucleic (ADN) sunt macromolecule organice (polimeri) formate prin combinarea unor uniti structurale numite mononucleotide (monomeri). Fiecare nucleotid este constituit din trei subuniti i anume: o baz azotat, care poate fi o purin sau o pirimidin, un compus glucidic cu 5 atomi de carbon o pentoz i acid fosforic. Nucleotidele din ARN se numesc ribonucleotide, iar cele din ADN deoxiribonucleotide. Exist dou diferene principale ntre ADN i ARN: la nivelul compusului glucidic, al pentozei: ARN conine riboz, n timp ce ADN conine deoxiriboza ca o component glucidic; la nivelul bazelor: o baz azotat pirimidinic din ARN, numit uracil, este nlocuit n ADN cu o alt baz, tot pirimidinic, numit timin. De la coninutul acidului nucleic n pentoz deriv de fapt prefixul ribo i deoxiribo, specific pentru fiecare tip de acid nucleic (Anexa 1, fig. 6). Acidul ribonucleic conine patru ribonucleotide principale, care difer ntre ele prin natura bazelor pe care le conin, i anume: adeina, uracil, citoza, guanina. Dintre acestea adeina i guanina sunt purine, iar uracilul i citoza sunt pirimidine (Anexa 1, fig. 7, 8, 9). Acidul deoxiribonucleic conine patru deoxiribonucleotide principale, care difer ntre ele prin natura bazelor pe care le includ. Bazele care apar n ADN sunt aceleai ca i n ARN cu excepia uracilului din ARN care este nlocuit cu timina n ADN. Uneori att ARN ct i ADN conin n afara celor patru baze azotate de mai sus i alte baze, dar care se gsesc n cantitate mic, motiv pentru care se numesc baze minore (Anexa 1, fig. 10).

6

Cele patru nucleotide din ADN sunt:deoxiadenilat, deoxiguanilat, deoxitimidilat, deoxicitidilat. Legtura ntre acidul fosforic i pentoza din nucleotide se face la C5 al pentozei, iar cea ntre pentoz i baza azotat se face la C1 al pentozei cu azotul N9 pentru baza prurinic sau cu azotul N3 pentru baza pirimidinic. Partea nucleotidului care const n baza purinic sau pirimidinic i pentoz se numete nucleozid. Pentru nucleotzidele ADN se utilizeaz urmtoarele denumiri: deoxiadenozin, deoxiguanozin, deoxicitidin iar nucleozidul care conine timina se numete timin (Anexa 1, fig. 11). n cazul bazelor, nucleozidelor i nucleotidelor derivate din ARN denumirile i prescurtrile sunt: BAZA NUCLEOZID NUCLEOTID Adein Adenozin (A) Acid adenilic, acid adenozin monofosforic (AMP) Guanin Guanozin (G) Acid guanilic, acid guanozin monofosforic (GMP) Uracil Uridin (U) Acid uridilic, acid uridin monofosforic (UMP) Citozin Citidin (C) Acid citidilic, acid citidin monofosforic (CMP) Importana biochimic a nucleotidelor: Acidul citidilic a fost obinut prin hidroliza acizilor nucleici din drojdii i din germenii de gru. Acidul uridilic este component a multor coenzime i a fost separat prin hidroliza acizilor nucleici din drojdii i germeni de porumb. Acidul adenilic (AMP) se gsete n drojdia de bere, iar acidul guanilic intr n structura ARN din organismele vegetale i animale. Hidroliza nucleotidelor n prezena enzimei 5-nucleotidaza conduce la eliberarea acidului fosforic i a unei cantiti de energie corespunztoare fiecrei legturi macroergice, cu pstrarea legturii N-glicozidice dintre baza azotat i componenta glucidic. Unele difosfonucleotide acioneaz drept coenzime, activnd unele glucide participante labiosinteza diglucidelor i poliglucidelor. De exemplu: Adenozinmonofosfatul (AMP) este component a coenzimei NAD (nicotinamida denindinucleotida) mpreun cu nicotinamidnucleotida. Nucleotida UTP (uridintrifosfatul) activeaz glucoza n vederea biosintezei diglucidelor maltoza i zaharoza. Acidul cidintrifosforic (CTP) activeaz bazele azotate participante la biosinteza lipidelor complexe. ATP (acidul adenozintrifosforic) este unul dintre cei mai importani compui macroergici, care elibereaz la hidroliz o mare cantitate de energie, necesar bunei desfurri a proceselor metabolice. Refacerea ATP este un proces endergonic, care se realizeaz cu aport de energie. 2.1. PROPORIA MOLAR A BAZELOR N ARN Acizii ribonucleici izolai din aceleai celule avnd ns structuri i funcii diferite cum sunt acizii ribonucleici de transfer, ribozomali sau mesageri prezint diferene n proporia molar a bazelor lor. De asemenea, exist diferene i ntre acizii ribonucleici avnd aceeai funcie dar fiind de origine diferit. Datele experimentale au artat c: fiecare ARN analizat are o compoziie particular a bazelor sale ceea ce arat c ordinea n care sunt nlnuite nucleotidele n interiorul macromoleculelor este specific; exist o echivalen adenin uracil i guanin citozin n cazul unor acizi ribonucleici, echivalen 7

care este o regul pentru marea majoritate a moleculelor de ADN i este o indicaie c moleculele respective sunt bicatenare. 2.2. PROPORIA MOLAR A BAZELOR N ADN Pentru ADN avem echivalena bazelor, deoarece analizele compoziiei n baze de ADN de diferite origini efectuate de Chargaff au artat, n majoritatea cazurilor, existena unei echivalene a rezidiilor de adenin i timin, precum i a celor de guanin i citozin. ADN de diferite origini, analizai, au permis observarea unor regulariti a compoziiei n baze a ADN astfel: suma bazelor purinice este egal cu suma bazelor pirimidinice raportul molar dintre adenin i timin, precum i cel dintre guanin i citozin este egal cu unitatea; suma bazelor aminice (adenin i citozin) este egal cu suma bazelor cetoxo (guanin i timin). Aceste particulariti ale compoziiei moleculelor de ADN au fost puse n eviden pentru prima dat de Chargaff, de aceea sunt numite regulile lui Chargaff. n afara acestor reguli, care se refer la structura moleculelor de ADN, din datele compoziiei n baze a ADN se mai pot deduce i constatri de ordin general privind particularitile ADN de diferite origini. Este foarte important de menionat faptul c ADN provenit din diferite esuturi (timus, splin, ficat) ale aceluiai organism are aceeai compoziie n baze. Dea ici a rezultat ideea stabilitii structurale a ADN, precum i formularea concepiei conform creia ADN este purttorul informaiei genetice a unui organism dat. Conform acestei concepii, observm c fiecare specie de organism are un ADN cu o compoziie n baze caracteristic. Aceast compoziie variaz de la o specie la alta, dar se poate observa c ADN din specii apropiate de organisme are compoziia n baze asemntoare, iar cele care difer mult ntre ele au i compoziia n baze foarte deosebit. 2.3. STRUCTURA MACROMOLECULAR A ARN Acizii nucleici sunt polimeri organici constituii din nucleotide, care au fost numite elementele din care se construiesc macromoleculele de acizi nucleici, motiv pentru care se numesc i polinucleotide. Considernd c (B R P) este un nucleotid, schematic structura unui acid ribonucleic poate fi : (B R p)n n care B este baza azotat (purinic sau pirimidinic), R este D-riboz, P este acidul fosforic iar n gradul de polimerizare. a. Structura primar n momentul definirii structurii unui acid nucleic, se are n vedere modul n care sunt nlnuite nucleotidele (succesiunea i secvena lor) n lanul polinucleotidic, precum i natura legturilor existent ntre nucleotide. Aceste date precizeaz ceea ce se numete structura primar a acidului nucleic. Unirea nucleotidelor ntre ele se face prin legtura 3, 5 fosfodiesteric. La aceast concluzie s-a ajuns n urma degradrii ARN cu alcalii i enzime specifice din tipul fosfodiesterazei din veninul de arpe sau din splin. De exemplu tratamentul cu alcalii (soluie 0,5N) a ARN conduce la scindarea tuturor legturilor internucleotidice cu punerea n libertate a nucleotidelor. n timpul hidrolizei se produce neutralizarea alcaliilor, ceea ce arat c s-au eliberat grupri fosforice care au fost implicate n legturile internucleotidice. De asemenea, s-a demonstrat c gruprile amino ale 8

bazelor nu sunt implicate n legturile internucleotidice fiindc ele pot i uor dezaminate de ctre acidul azotos n acidul nucleic intact (Anexa 1, fig. 13). b. Structura secundar Multe dintre proprietile fizico-chimice ale acizilor nucleici sunt diferite de cele ale nucleotidelor care-i compun, s-a observat c exist o anumit organizare a lanului polinucleotidic, o anumit structur secundar a acidului nucleic care duce la o comportare particuar a polinucleotidului fa de cea a nucleotidului. n cazul n care structura macromolecular a ARN n soluie ar fi aceea a unui lan monocatenar, fr o anumit organizare preferenial condiionat de interaciunile ce se produc ntre componentele lanului, atunci proprietile macromoleculei ar rezulta din nsumarea simpl a proprietilor monomerilor pe care i conine. Evident acest fapt nu este posibil, deoarece de fiecare dat se observ diferene ntre comportarea nucleotidului i a polinucleotidului. Dintre componentele ARN riboza, acidul fosforic i bazele sunt cele care determin structura secundar a lanului polinucleotidic. Bazele interacioneaz de preferin pe dou direcii principale: pe vertical i anume prin aceea c bazele nvecinate ajungnd cu planurile ciclurilor lor suprapuse determin ca orbitalele lor s interacioneze, ducnd la un proces de stivuire a bazelor, aceast interaciune produce o stabilizare a polinucleotidului care devine specific i dependent de natura i de succesiunea bazelor din lan; interaciune ntre baza care se exercit pe orizontal, prin legturile de hidrogen specifice care se formeaz ntre bazele complementare (adenina uracilul i guanina citozina). Aceste legturi de hidrogen se pot forma att ntre bazele aceluiai lan polinucleotidic, realizndu-se legturi de hidrogen intercatenare i n acest caz avem un polinucleotid monocatenar, ct i ntre bazele din dou lanuri polinucleotidice diferite, prin legturi de hidrogen intercatenare formndu-se un polinucleotid bicatenar. ntruct bazele care formeaz ntre ele legturi de hidrogen sunt complementare, cele dou lanuri polinucleotidice interacionate vor fi i ele complementare i anume: adenina dintr-o caten va avea n catena complementar corespunztoare uracilul, n timp ce guanina dintr-o caten se va uni prin legturi de hidrogen cu citozina din catena a doua. Marea majoritate a acizilor ribonucleici sunt monocatenari, catena acestora rsucindu-se n aa fel nct un numr de nucleotide dintr-o parte a moleculei formeaz intercatenar legturi de hidrogen cu nucleotidele complementare situate pe o alt poriune a catenei. n urma acestei interaciuni se obin zone moleculare ordonate, asemntoare cu zonele ordonate elicoidal n cazul ADN, care alterneaz cu zone moleculare n care nucleotidele sunt neangajate n legturi de hidrogen, motiv entru care acestea se numesc zone amorfe. Pentru a realiza maximul de legturi de hidrogen ntre baze, catena formeaz unele bucle care cuprind nucleotidele neinteracionare. Pentru a ilustra modul n care se realizeaz interaciunile dintre baze n cazul unui polinucleotid monocatenar vom prezenta modelul structurii secundare a ARN de transfer al alaninei. Datorit formei specifice pe care o are, modelul structurii secundare a tARN este numit foaie de trifoi (Anexa 1, fig. 14). Ceilali tARN, specifici pentru transferul altor acizi aminai au structuri secundare asemntoare. Acizii ribonucleici ribozomali sau cei de origine viral a cror molecul este mult mai mare (mase moleculare cuprinse ntre 0,52 x 106 daltoni, fa de 0,25 x 105 daltoni ct are tARN) au i ei lanul polinucleotidic ncolcit, n aa fel nct anumite pri 9

formeaz regiuni elicoidale n care exist perechi de baze de tipul guanina-citozina i adenina-uracilul. c. Structura teriar Structura teriar a unui ARN nalt polimerizat const n aranjarea regiunilor ordonate, elicoidale ale lanului polinucleotidic, perpendicular pe axa lung a moleculei. n acest caz, planurile bazelor se gsesc aezate paralel fa de direcia axei macromoleculei. n cazul n care moleculele de ARN ar fi ncolcite la ntmplare i deci planurile bazelor nu ar avea o anumit orientare, nu s-ar observa nici un fel de diferen a valorii absorbanei lor prin orientarea vectorului electric al luminii perpendicular sau paralel cu axa moleculei. Dar pentru ARN nalt polimerizat s-a observat c absorbana este maxim atunci cnd direcia vectorului electric al luminii coincide cu axul lung al macromoleculei. La acizii ribonucleici se pune n eviden un dicroism pozitiv, spre deosebire de dicroismul negativ de regul observat pentru moleculele native de ADN, care au ntotdeauna bazele aezate perpendicular pe axa molecular. Datorit aranjrii zonelor elicoidale perpendicular pe axa lung a macromoleculei, i acestea pot ajunge n aceast poziie datorit flexibilitii deosebite a zonelor n care nucleotidele sunt interacionate, iar ntreaga molecul are tendina evident de a lua forma unui bastona. O serie de msurtori enzimatice i fizico-chimice au artat c i moleculele mici de ARN de tipul celor de transfer ale acizilor aminai, au o structur foarte compact. Astfel, atacul unor nucleaze manifestndu-se numai n anumite locuri ale moleculelor de tARN, sugereaz c acestea trebuie s fie situate pe suprafaa moleculei, celelalte pri ale moleculei fiind pliate spre interiorul moleculei i deci inaccesibile enzimelor. De asemenea, determinarea razei Stoke (mrime ce definete conformana moleculei) pentru tARN a condus la concluzia c aceasta trebuie s aib o structur foarte compact. Avnd n vedere aceste date experimentale s-au propus mai multe modele pentru structura teriar a tARN (Anexa 1, fig. 15). n figura 15 se observ c cele trei brae ale modelului n form de foaie de trifoi a tARN se pliaz, rezultnd un bastona mic avnd la o extremitate captul CCA care este implicat n transferul acidului aminat, iar la cealalt extremitate buclele B1, B2 i B3 dintre care cea mai important este cea purttoare a antocodonului (B1). 2.4. STRUCTURA MACROMOLECULAR N ADN Formularea modelului molecular al unei macromolecule cu funcii biologice bine conturate trebuie s in seama att de datele analizelor fizice i chimice care prezic o anumit structur, ct i de posibilitatea de a explica cu acea structur natura proceselor biologice pe care le condiioneaz. n cazul ADN, material genetic prin excelen, modelul molecular trebuie s fie n concordan perfect cu funcia sa ca matri pentru reproducerea lui nsui, precum i a moleculelor noi de ADN identice. Metoda difraciei razelor X nu a putut elucida singur structura moleculei de ADN, de aceea au fost necesare informaii privind natura legturilor covalente i a tipurilor de legturi de hidrogen care se formeaz ntre nucleotide, date fundamentale care precizeaz din punct de vedere chimic structura macromoleculei. n plus, sunt luate n considerare informaii fizico-chimice (optice i hidrodinamice) care s precizeze structura filamentoas a moleculei, precum i felul n care sunt orientate bazele nucleotidelor fa de axa moleculei. 10

Studiul difraciei razelor X n fibrele de ADN a fost nceput de Astbury n anul 1947, cercetrile sale au sugerat c moleculele de ADN au probabil o configuraie elicoidal i c n moleculele de ADN bazele sunt aezate unele peste altele ca i monedele ntr-o stiv. Mai trziu n anul 1953, Franklin i Gasling au perfecionat metoda, obinnd imagini mult mai clare ale moleculelor de ADN, ceea ce a permis determinarea configuraiei tridimensionale a ADN. n astfel de studii se trece un fascicul de raze X prin substan, iar diferena este nregistrat pe o plac fotografic. Dac substana nu are un aranjament regulat al subunitilor sale, razele X vor produce un spot central pe placa fotografic marcnd poziia fasciculului principal. Moleculele de ADN de diferite origini au dat difracia razelor X aproape identic, ceea ce a sugerat structuri asemntoare. Totodat, analizele au artat c nucleotidele din diferii ADN sunt orientate spaial identic. Modelul molecular al ADN propus de Watson i Crick Anul 1953 cnd a fost publicat lucrarea lui Watson i Crick privind modelul molecular al ADN, a fost considerat anul n care a avut loc nceputul noii ere a biologiei moleculare, iar descoperirea structurii ADN a avut valoare tot att de mare ca i teoria lui Darwin despre evoluia speciilor. Conform modelului propus de Watson i Crick, molecula de ADN conine dou catene rsucite n jurul unei axe comune, unite prin legturi de hidrogen care se formeaz ntre bazele nucleotidelor. Fiecare caten este constituit din grupe fosfodiesterice legate de rezidii de deoxiriboz n poziia 3, 5. Ambele catene urmresc sensul unor elice care se rsucesc spre dreapta, iar secvenele componentelor din lanul de fosfat-pentoz merg n direcii opuse. Grupele fosforice i pentozice se situeaz la exteriorul elicei, formnd ceea ce se numete coloana vertebral a moleculei, n timp ce bazele situate n interiorul ei sunt orientate perpendicular pe axa moleculei, la fel ca i treptele unei scri n spiral (Anexa 1. fig. 16). Distana atomilor de fosfor de la axa fibrei este de 10A. O rsucire complet a dublei elice se face dup 34A, iar bazele sunt situate la o distan de 3,4A unele de altele, avem deci 10 perechi de baze care intr ntr-un tur complet al elicei. Pe baza datelor privind echivalena coninutului n adein i timin, respectiv de guanin i citozin (ceea ce sugereaz c bazele sunt distribuite n perechi), precum i n urma studiilor de filtrare acido-bazic a ADN, care au artat c bazele interacioneaz prin legturi de hidrogen, mpreun cu datele difraciei razelor X, Watson i Crick au formulat modul de aezare a bazelor. Soluia pe care au ales-o ei au considerat-o elementul esenial al structurii. Bazele care se pot combina ca perechi sunt: adenina (purina) cu timina (pirimidina) pe de o parte i guanina (purina) cu citozina (pirimidina) pe de alt parte fiind stabilite de Watson i Crick, ele se numesc perechi de baze complementare de tip Watson-Crick (Anexa 1, fig. 17). Pentru a forma perechile de baze (Anexa1, fig. 18) este necesar s se ndeplineasc dou condiii structurale i anume: a. atunci cnd adeina este ntr-o caten, partenera ei din catena a doua trebuie s fie n mod obligatoriu timina b. n cea de a doua pereche de baze complementare cele dou catene trebuie s fie antiparalele. 2.5. FORME MOLECULARE ALE ADN ADN monocatenari ciclici (circulari)

11

Forma general a modelului structurii ADN este elice dubl, valabil pentru majoritatea moleculelor de AND din diferite organisme, dar ADN prezint i alte forme moleculare. n anul 1959 Sinsheimer a izolat ADN dintr-un virus, care ataca bacteria Esterichia coli, pentru care pe baza analizelor fizico-chimice a constatat c este monocatenar. Examinarea proprietilor ADN extras, a artat c acest ADN este parial ciclic, parial linear. Recunoaterea unui ADN monocatenar ciclic se face dup urmtoarele caracteristici: a. enzimele specifice pentru capetele moleculelor de ADN, numite exonucleaze, nu atac acest tip de ADN; b. reacioneaz cu aldehida formic; dar moleculele bicatenare au grupri amine ale bazelor angajate n legturi de hidrogen care nu reacioneaz cu aldehida formic; c. analiza bazelor arat c nu exist o echivalen a adeninei i timinei, precum i a guaninei i citozinei, caracteristic moleculelor bicatenare; d. microscopia electronic, n specal tehnica lui Kleinschmidt, pune n eviden existena unui filament continuu de ADN. ADN monocatenat ciclic, scindat de ctre o enzim specific este convertit ntr-o form monocatenar linear (Anexa 1, fig. 19). Deosebirea dintre o molecul circular i una linear se face prin ultracentrifugare: forma circular, fiind mai compact, sedimenteaz mai uor dect forma linear i ca atare sub influena cmpului gravitaional se va deplasa mai mult spre fundul tubului dect cea linear. ADN bicatenari ciclici Pe baza datelor experimentale obinute n anii 60 de o serie de cercettori care au izolat i caracterizat ADN din virusurile polioma i papiloma, s-a ajuns la concluzia c moleculele lor de ADN sunt bicatenare i ciclice. Moleculele ADN bicatenare pot prezenta mai multe tipuri conformaionale (Anexa 1, fig. 20): primul tip (I) const din molecule de ADN bicatenare ciclice care au catenele nchise; tipul (II) care este obinut din ADN suprancolcit ce este supus scindrii uneia din catenele sale; tipul (III) este obinut prin scindarea n dreptul primei scindri a moleculei circular deschise. ADN bicatenari cu capetele coezive Unele organisme posed un ADN bicatenar care, chiar dac are dou capete, nu se prezint sub form linear, ci ciclic. Aceast conformaie este adoptat de molecul pentru c ea are dou capete coezive, adic molecula de ADN bicatenar este prelungit ntr-o direcie cu o poriune monocatenar, care este complementar n baze cu poriunea monocatenar a catenei a doua prelungit n direcia opus. Deci cele dou poriuni monocatenare complementare devin capetele coezive i determin circularizarea moleculei rezultnd n acest fel o conformaie circular cu dou catene nesudate prin legturi covalente, dar unite ntre ele prin legturi de hidrogen (Anexa 1, fig. 21).

12

2.6. FORME MOLECULARE N ARN Spre deosebire de ADN, care se ntlnete sub diferite forme moleculare, ARN prezint doar dou forme moleculare distincte: forma monocatenar i forma bicatenar linear. ARN monocatenari Marea majoritate a ARN extrai din celule i virusuri sunt constituii din molecule monocatenare. Prin aceasta se nelege existena unui lan polinucleotidic continuu, flexibil care posed zone ordonate, elicoidale, asemntoare dublei elice a ADN bicatenar rezultate prin interaciunea intramolecular a diferitelor segmente moleculare ale aceluiai lan. Aceast structur o prezint ARN ribozomal, ARN mesager, ARN din virusul gripal, virusul polio, virusul mozaicului tutunului. ARN bicatenari Forma replicativ a moleculelor de ARN monocatenar viral are o structur bicatenar, dar i virusurile care conin ADN monocatenar au forma replicativ bicatenar. Pe lng aceste forme replicative exist unele virusuri care au n structura lor ARN bicatenar n loc de ARN monocatenar, de exemplu retrovirusul conine un ARN bicatenar linear.

III. FRACIA BIOLOGIC A ACIZILOR NUCLEICI3.1. ACIZII NUCLEICI PURTTORI AI CARACTERELOR EREDITARE ALE ORGANISMELOR Cel mai important atribut al organismelor vii este capacitatea lor de autoreproducere generaie dup generaie, cu maxim de fidelitate, de a da natere la organisme identice cu ele ca mas, form, structur intern i funcie. Ideea c acizii nucleici sunt baza chimic a ereditii a fost formulat la sfritul secolului trecut i era justificat de Wilson astfel: exist o baz considerabil pentru ipoteza c n sens chimic aceast substan este elementul nuclear cel mai esenial transmis de la celul la celul, fie prin diviziune celular, fie prin fertilizare i c el poate fi factorul primar n procesele constructive ale nucleului i prin aceasta este direct legat de cele din citoplasm. Marea majoritate a organismelor procariote virusurile i bacteriile care conin informaia genetic ntr-un singur cromozom i eucariotele plantele i animalele, care au informaia genetic divizat n mai muli cromozomi conin ca material genetic molecule de ADN, aceste organisme au un mecanism de transmitere a informaiei genetice asemntor (Anexa 1, fig. 22). 3.2. DATE EXPERIMENTALE CARE AU DEMONSTRAT C ACIZII NUCLEICI STAU LA BAZA EREDITII Virusurile i bacteriile, datorit structurii lor relativ simple, sunt modele experimentale excelente pentru cercetrile fundamentale privind funcia celor mai importante macromolecule biologice, acizii nucleici i proteinele. Experiena realizat de Avery, McLead i McCarty privind transformarea bacterian cu ajutorul ADN este 13

considerat prima dovad convingtoare c ADN este purttorul caracterelor ereditare ale bacteriilor. n anul 1928, Griffith a descoperit fenomenul transformrii bacteriene. El a observat c inocularea oarecilor cu pneumococ de tip II avirulent, necapsulat, mpreun cu pneumococ de tip III capsulat, virulent, dar omort prin tratare termic a avut drept consecin septicemia i moartea animalelor. Analiza sngelui acestor animale a artat c ele au murit din cauza pneumococului de tip III. Deoarece pneumococul de tip II era avirulent i incapabil de a determina el nsui bacteremia fatal, iar suspensia de celule bacteriene de tip III nu a coninut organisme viabile, a adus argumente c pneumococii de tip II crescui n aceste condiii au dobndit o structur capsular i specificiti caracteristice pneumococilor de tip III viruleni. Aadar, dup inoculare n organismul oarecilor, pneumococul de tip II s-a transformat sub influena unei componente din pneumococul de tip III n pneumococ de tip III, adic s-a produs fenomenul transformrii care reprezint transferul de informaie genetic de la un anumit tip de celul donoare la un alt tip de celul receptoare. Dup descoperirea acestui fenomen s-a pus problema gsirii principiului activ, a substanei care este responsabil de transformarea bacteriilor. n anul 1944 Avery, McLeod i McCarty au reuit s dovedeasc natura chimic a principiului activ al transformrii. Pornind de la observaiile fcute de Griffith, au extras din celule de pneumococ de tip III virulent i capsulat, inactivate prin nclzire, molecule de AND n stare pur pe care le-au adugat la celulele de pneumococ de tip II nevirulent i nencapsulat. Experiena a fost realizat astfel: din pneumococii de tip III a fost izolat o fraciune biologic activ n form nalt purificat care, n cantiti foarte mici, este capabil, n condiii experimentale de cultur adecvat, s induc transformarea pneumococilor de tip III nencapsulai n celule total ncapsulate, avnd aceeai specificitate de tip ca i microorganismele din care s-a izolat materialul inductor. Principiul activ arat c datele obinute n urma analizelor chimice enzimatice i serologice mpreun cu rezultatele studiilor preliminare de electroforez, ultracentrifugare i spectroscopie n ultraviolet indic faptul c, n limitele metodelor, fraciunea activ conine cantiti nedemonstrabile de protein, lipide nelegate sau polizaharide serologic reactive i const n principal din acid deoxiribonucleic nalt polimerizat, n form vscoas. Transformarea indus de ADN s-a dovedit a fi transmisibil n serie, de aici sa tras concluzia c ADN este purttorul informaiei genetice la bacterii. Dup aceast descoperire privind identificarea AND cu principiul activ al transformrii bacteriilor, atenia cercettorilor s-a ndreptat spre compoziia chimic a nucleului celular al diferitelor organisme, sediul principal al AND celular. Astfel, n anul 1948, un grup de cercettori printre care Boivin i Vendrely plecnd de la ideea c toate celulele unui organism conin aceleai informaii genetice au emis ipoteza constanei cantitii de AND din nuclei: cantitatea absolut de acid deoxiribonucleic trebuie s fie aceeai pentru toi nucleii tuturor celulelor cu excepia gameilor (haploizi) care trebuie s conin de dou ori mai puin. Pentru a verifica valabilitatea ipotezei, att grupul de cercettori al lui Boivin ct i ali cercettori au analizat cantitatea de AND din nucleii celulari individuali de la diferite organisme. Ei au determinat AND n suspensii coninnd un numr cunoscut de nuclei purificai, iar apoi au calculat coninutul mediu de AND pentru un singur nucleu. Din valorile statistice obinute n urma experimentelor efectuate pe organisme le animalelor, pe caz particular organismul vacii (Anexa 1, tabelul 1), s-a artat c: nucleii din diferite esuturi au un coninut de ADN asemntor

14

-

n celulele haploide, cantitatea de ADN este numai pe jumtate fa de cea existent n celulele somatice ale aceleiai specii (care sunt diploide i conin dou seturi de cromozomi)

IV. PROPRIETI ALE ACIZILOR NUCLEICI4.1. PROPRIETI FIZICO CHIMICE - masa molecular mare; - proprietatile coloidale si osmotice, tipice pentru toi compuii macromoleculari. - Proprietile lor hidrofile depind de fosfai. - vscozitatea i densitatea nalt a soluiilor, - capacitatea de denaturare. - la pH fiziologic toi AN sunt polianioni (-) - Denaturarea sub aciunea temperaturii, mediului PH, substanelor chimice are loc ruperea legturilor de hidrogen i forelor hidrofobe ce stabilizeaz structura secundar i teriar a ADN. La denaturare ADN i pierde proprietile biologice. Ex. nclzirea ADN-duce la desfacerea spiralei duble n dou catene (are loc transformarea spiral - ghem). Degradarea unei jumti de structur de ADN are loc la temperatura de topire. ADN bogat n C i G au o t mai nalt dect cele bogate n A i T. - La rcirea treptat catenele din nou se reunesc dup principiul complementarittii, formnd spirala dubl nativ. Acest fenomen se numete renaturare (atunci cnd t e mai mic dect cea de topire). La rcirea brusc renaturarea nu are loc. - Denaturarea i renaturarea acizilor nucieici este nsoit de schimbarea activittii lor optice. Aceast metod a permis descoperirea particularitilor structurii primare a ADN. S-a stabilit, c n componena ADN a animalelor se afl sectoare cu o succesiune nucleotidic identic, care de multe ori se repet. Hibridizarea decurge foarte repede. Restul ADN este prezentat printr-o succesiune unical a nucleotidelor, care nu se dubleaz. Pe capacitatea de renaturare a AN este bazat metoda de determinare a gradului de nrudire a AN, care poart denumirea de hibridizare molecular. La baza ei st mperecherea complementar a sectoarelor unicatenare ale AN cu formarea unui heteroduplex - Hibridizarea se efectueaz n felul urmtor: 1. AN se denatureaz separat; 2. se incubeaz mpreun ambele tipuri de DNA (ori DNA i RNA). 3. n condiiile unui grad relativ crescut de complementaritate a acestora se formeaz moleculele hibride (DNA-DNA sau DNA-RNA). Aceste molecule constau din sectoare spiralate i nespiralate. Cu ct gradul de nrudire este mai nalt, cu att hibridizarea este mai complect. Postulatul de baz a genetici moleculare a fost formulat de Watson i Crick (Meselson, Stahl): transmiterea informaiei genetice de la ADN la protein. Snt ncluse trei procese: replicarea; transcripia; translaia.

15

Primele dou procese au loc n nucleu, iar al treilea n citozol. Procesul de transcripie este reversibil. Enzima care catalizeaz transcripia invers se numete revertaza (reverstranscriptaza) i a fost descoperit la oncovirui. Sinteza ARN-ului pe baza ARN se numete replicarea ARN, ea are loc la virui, care nu au ADN. Procesul de translaie este ireversibil i se numete biosinteza proteinei. 4.2. Transcrierea ADN ARN-ul este sintetizat ntr-un proces numit i transcriptie. n acest proces, secvenele ADN sunt copiate de enzime (ARN polimeraz), pentru a produce ARN complementar. Enzima are rolul de a desface dublul helix al ADN-ului, fiecare jumtate fiind transcripionat. Sinteza ARN-ului (transcripia) se realizeaz pe baza complementaritii bazelor azotate ca i n cazul replicaiei ADN-ului. Cele dou catene ale macromoleculei de ADN se despart, pe intervalul care urmeaz a fi transcris, numai c de data aceasta va aciona ARN polimeraza. Acum se va transcrie numai una din catenele moleculei de ADN. Catena de ADN care funcioneaz ca matri pentru sinteza ARN-ului se numete caten sens. Nucleotidele libere care se vor alinia pe baza complementaritii vor conine riboza. n dreptul adeninei de pe catena matri se va ataa uracilul n catena nou sintetizat. Polimerizarea de ribonucleotide n transcripie se desfoar n acelai sens ca reacia de polimerizare a dezoxiribonucleotidelor din cadrul replicaiei ADNului i anume de la 5' la 3'. ARN-ul avnd o molecula monocatenar, frecvena erorilor este mult mai mare decat la ADN, replicndu-se cu o fidelitate mult mai redus, deoarece in cazul ARN-ului nu exist un proces de reparare, iar frecvena mare a erorilor duce la o mare variabilitate genetic. 4.3. Traducerea ARN Procesul traducerii informaiei genetice const n modul n care informaia genetic nregistrat n secvena bazelor din mARN este convertit n secvena acizilor aminai ai proteinelor. Acest proces a fost denumit traducere sau translaie, ntruct limbajul celor patru litere specifice de baze este tradus n limbajul celor 20 de litere ale alfabetului proteinelor. Translaia = traducerea informaiei m-ARN n informaie de constituire a proteinelor. n limba englez translation poate nsemna att translaie ct i traducere. Dei mai potrivit ar fi fost termenul de traducere vom folosi termenul translaie utilizat n literatura de limba romn. O protein este un lung lant de aminoacizi. Exist 20 tipuri de aminoacizi ce apar n mod obinuit. Aceti amino acizi au o structur asemntoare diferind ntre ei prin lanurile lor laterale (radicali specifici). Mai exact aminoacidul este un compus organic ce conine un grup amino (NH2) un grup carboxil ( O = C - OH ), un atom de hidrogen i un radical specific. Aminoacizii succesivi sunt legai la capete lor prin legturi peptidice (legtura chimic ce se realizeaz ntre aminoacizi presupune eliminarea unei molecule de ap ntre grupul carboxil a unui aminoacid i gruparea amino a aminoacidului urmtor), deci proteinele sunt polipeptide. O protein se nfoar ntr-o structur tridimensional (3D) prin formarea unor legturi chimice ntre aminoacizi si. Aceast structur determin funia sa. Traducerea lui m-ARN n limbaj proteic este guvernat de codul genetic, care a fost pusa n eviden n 1964. Exist 4 3 = 64 triplei de baze diferii, numii codoni. aizeci dintre ei codeaz cte un amionoacid. Unul, AUG, codeaz i un aminoacid dar este n acelai timp i un codon de start semnalnd nceputul translaiei (traducerii).

16

Ceilali trei rmai sunt codoni de stop ce semnaleaz sfritul tranlaiei. Codul este degenerat deoarece un aminoacid poate fi specificat de civa codoni diferii. Astfel nu exist o secven de nucleotide unic pentru o protein dat. Codonii apar ca triplei consecutivi nesuprapui de-a lungul m-RNA. Translatia are loc n ribozomi: structuri submicroscopice din citoplasm. n timpul translatiei, ribozomul se mic de-a lungul moleculei m_ARN adaugnd cte un amino acid la lanul polipeptidic pentru fiecare codon citit. Exist o molecul tARN specific fiecrui tip de codon. Legturile ntre nucleotidele t-ARN i dau acestuia un aspect oarecum asemntor cu o frunz de trifoi (cloverleaf) care are o de recunoatere a codonului, numit anticodon, iar la unul dintre capetele lanului se va forma aminoacidul corespunztor. Translaia ncepe cu codonul de start AUG i succesivi t-ARN transport succesivi aminoacizi la locul de translaie, unde fiecare este adugat la lanul polipeptidic. Translaia se termin cnd este atins un codon de stop n m-ARN. Civa ribozomi pot traduce m-ARN simultan. n acest mod, mai multe polipeptide identice pot fi citite din aceeai secven m-ARN ntr-un timp scurt. Translaia are loc de la captul 5 la captul 3 al m-RNA i de la captul amino la captul carboxil al polipeptidei. 4.4. Replicarea ADN Replicarea transmiterea informaiei genetice de la ADN parental la ADN fiic (Anexa 1, fig. 24). n timpul replicrii, cele dou laturi se desfoar ntr-o anumit zon de-a lungul dublei elice. n prezena unei enzime numit polimeraza ADN lanul desfurat servete drept matri pentru formarea unei secvene complementare de nucleotide, care sunt adugate la lanul complementar una cte una. Multe segmente scurte sunt formate, i acestea sunt legate mpreun ntr-o reacie catalizat denumit ligaza ADN. Exist mecanisme pentru repararea erorilor care apar n timpul procesului de replicare, ce apare n timpul mitozei (Anexa 1, fig. 23). Caracteristicile: 1. Se petrece n nucleu 2. Proces semiconservativ 3. se desfoar n trei etape : iniiere, elongare, terminare 4. prezena praimerului este obligatorie 5. replicarea este cuplat cu desfurarea DNA parental (necesit energie) 6. replicarea decurge n ambele direcii cu aceeai vitez. 7. Pe catena ntrziat se sintetizeaz fragmentele Okazaki. 8. Este bazat pe mpachetarea complementar a BA 9. Catena-fiic este antiparalel cu catena parental dar nu identic dup secvena nucleotidic 10. Fora motrice a procesului este hidroliza pirofosfatului 11. angajeaza simultan intregul cromozom.

4.5. Replicarea ARN Replicarea virusurilor cu ARN constituie o problem unic n biologie, deoarece ofer singurul exemplu n care informaia genetic este codificat originar 17

nu n ADN depozitarul universal de informaie genetic ci tot ntr-o molecul de ARN nzestrat, ca i cea de ADN, cu capacitate de replicare. n cursul infeciei unei celule gazd, ARN viral ndeplinete o dubl funcie: a). acioneaz direct n procesul de biosintez a proteinelor ca transportor al mesajului genetic furniznd informaia necesar pentru sinteza proteinelor structurale ale capsidei i a enzimei ARN polimeraz; b). acioneaz ca model pentru sinteza a noi molecule de ARN sub aciunea acestei polimeraze. Studiile n aceast problem s-au fcut pe virusul polio virusul encefalomiocarditei. Dup infectara celulei gazd i dezvelirea genomului din virion, ARN viral rmne liber n citoplasm. Titrul infecios al virusului (apreciat prin capacitatea celulelor infectate de a determina infectarea altor celule) scade foarte mult datorit acestei stri particulare n care se gsete virusul (faza de eclips). n procesul de replicare, ARN viral acioneaz att ca model pentru propria sa reproducere ct i ca ARNm pentru sinteza proteinelor specifice virale. ntr-o prim faz acest ARN dezgolit dirijeaz sinteza unor proteine cu aciune inhibitoare fa de metabolismul celular, precum i sinteza unei ARN polimeraze corespunztoare lui. Urmeaz sinteza ARN viral, care ncepe dupa 30-45 minute de la infecie i continu exponenial 3 ore, apoi, liniar, nc 2-3 ore. Sub influena genomului poliovirusului (circa 6000 de nucleotide) n celula-gazd apar aproximativ 14 tipuri noi de proteine, dintre acestea, 4 au rol structural, participnd la formarea capsidei, iar celelalte, proteinele virus-specifice necapsidale ndeplinesc diferite funcii ca: a). alterarea metabolismului normal al celulei gazd prin blocarea sintezei propriului ei ARN; b). blocarea sintezei proteinelor celulare normale; c). cataliza formrii unor cantiti mari de ARN viral. Proteina capsidal este sintetizat cu puin nainte de formarea virusului matur. n acest timp se acumuleaz n celul o cantitate mare de proteine virale, constnd din agregate polimerice de subuniti proteice (capsomere), care vor fi utilizate pentru formarea de virus matur sau se vor acumula simplu, ca atare, n celul. Sinteza acestor proteine are loc n citoplasm, la nivelul unor agregate de ribosomi (polisomi), care n celula infectat sunt mai mari dect n celula normal i sunt asociai de obicei cu structuri membranoase lipidice, avnd rol de a separa sediul procesului infecios de restul citoplasmei. Maturarea sau morfogeneza virusului ar fi un process spontan, care nu necesit energie, evolund sub aciunea forelor reprezentate de afinitatea chimic existent ntre proteinele capsidale i, n mai mic msur, ntre acestea i ARN viral. El incepe dup 2-3 ore de la infecie i continu apoi n ritm foarte rapid: sinteza unei molecule de ARN dureaz aproximativ 1 minut, iar dup alte 2-3 minute el este incorporat n capsid. De fapt, numai 20-60% din ARN viral nou sintetizat este ncorporat n particule de virus matur, n timp ce restul rmne n celul fie pentru a fi folosit ca model sau ca mesager, fie pentru ca nu poate fi ncorporat. Dup 6 ore de la infecie, ncepe liberarea progresiv a virusului progen din celulagazd ca rezultat al modificrilor ei patologice induse de virus.

V. CODUL GENETICIngineria genetic este tiinta, preocupat de crearea noilor fenotipuri prin transplantarea genei unui organism n genomul altuia n scop de a lichida defectele ereditare ale genomului, adic tratarea afectiunilor ereditare (gena ntrodus nu gureaz n patrimoniul ereditar al genomului -gazd), se obtin molecule hibride (himerice). Procedura include etapele: 18

1. Cptarea genei 2. Cptarea ADN-ului recombinat 3. Clonarea ADN-ului recombinat Cptarea genei: Stiind structura primar a proteinei n laborator se poate obline gena respectiv (se oblin gene pn la 250 codoane)- mai greu e obtinerea genei din genomul celulei (genele se despart prin introni)- mai uor e cptarea genelor din virusuri cu enzima revertaza. Gena necesar se ntroduce n celul pentru a se integra cu genomul acestuia. Pentru aceastan vitro gena se unete cu ADN-vector (plasmide ce conin ADN inelar (cteva gene)). De regul se folosete E Coli, ce contine un cromozom i plasmide, ce plutesc n citozol (plasmida este de 1000 ori mai mica dect cromozomul). Plasmidele se replica independent de replicarea materialului genetic. Unele plasmide se pot include n cromozom i apoi din nou s-l prseasc. Plasmidele pot trece dintr-o celul n alta n procesul deconjugare. Plasmidele se separ din E.Coli i li se nltur o parte de ADN inelar cu ajutorulenzimelor restrictaze, care recunosc i taiediferite sectoare. Folosind restrictaze diferite se poate de tiat ADN n locusurile necesare. Inrezultat se formeaz capete lipicioase (sectoaremonocatenare, capabile de a uni nucleotide complimentare. La fel se procedeaz i cu gena,care trebuie ntrodus (se formeaz capete lipicioase complimentare capetelor plasmidei). Dac se amestec gena i plasmida ele se vor uni cu capetele lipicioase. Enzima ligaza va uni capetele i se va cpta molecula ADN inelara, care contine gena menit pentru transplantare. Clonarea este operaia prin care ADN-ului recombinat duce la obinerea cantitilor dorite de protein codificat de gena eucariot introdus n plasmid. Dac n cultura E.Coli se ntroduc plasmide recombinate, se formeaz bacterii recombinate. In celul plasmidele se replic. Bacteriile nmulindu-se formeaz celule, care conin aceste plasmide. Acum din masa bacterian se poate de capatat cantitti suficiente de ADN recombine. Ranadamentul sintezei bacteriene este impresionabil: de exemplu 100 celule E.Coli produc prin clonare 5 mg somatostatin (cantitate, ce se obine prin prelucrarea a 100 tone de creier de bovine). Prin tehnica ingineriei genetice s-au obtinut cantiti mari de insulin (Humulun), Interferon, vaccine. Diversitatea formelor n Iimita uneia i aceai specie se datorete mutaiilor i ntr-o msura mai mare recombinrii genetice. Mutaiile genetice reprezint modificrile genomului organismului, care se pstreaz i se transmit prin ereditate de la o generaie la alta. Modificrile pot interesa o pereche de baze (mutatii punctiforme) sau un grup de baze pe una sau pe ambele catene ale unei molecule de ADN. Mutatiile punctiforme: pot decurge prin: l. substituie (misens mutatii, unde deosebim 2 tipuri): a. Tranziie - o BA purinic este nlocuit tot cu una purinc, una pirimidinic -tot cu una pirimidinic. b. Transversie - o pereche de baze purinice este nlocuit cu una pirimidinic sau invers. 2. Inserie - acest mecanism const n introducerea unei perechi de baze suplimentare n catena de ADN. 3. Deleia const n excluderea unei perechi de baze n aa mod ca ea nu mai poate fi complementar i la replicare apare "golul" n ambele catene. Unele modificri n secventa nucleotidic pot duce la formarea codonului sinonim i succesiunea aminoacizilor nu se va schimba (mutaii benigne).

19

La afectarea segmentelor mari de gen apar mutatii ntinse. n dependen de consecinele modificrilor deosebim mutaie benign, neutr, nociv. Agenii mutageni pot provoca mutaiile spontane ct i mutaiile induse. Biosinteza proteic se desfoar n dou etape: - TRANSCRIPIA (copierea mesajului genetic din moleculele de ADN n molecule de ARNm) - TRANSLAIA (utilizarea mesajului genetic pentru sinteza proteinelor pe baza codului genetic) Transcriptia. O celula poate produce mii de proteine diferite. Sinteza fiecreia dintre ele ncepe prin activarea genei corespunztoare. n aceast prim faz, sub aciunea enzimei ARN polimeraz se transcrie mesajul genetic din fragmentul ADN respectiv sub forma unei molecule de ARNm. Translatia are loc la nivelul ribozomilor. Etape: 1. ARNm recunoate locul sintezei datorita primelor nucleotide ale sale care formeaz o secven de iniiere. 2. n citoplasma, aminoacizii sunt pregtii pentru sinteza n doua faze: a) n prima faza aminoacizii sunt activai prin reacia cu ATP care le va dona energie: AA + ATP ------------------ AA ~ AMP + P~P aminoacil sintetaze b) aminoacidul activat se ataeaz unei molecule de ARN de transfer (ARNt). AA ~ AMP + ARNt ------------------ AA ~ ARNt + AMP aminoacil sintetaze AMP (acid adenozinmonofosforic) apoi va fi rencrcat cu energie prin fosforilare ( AMP + P~P = ATP) la nivelul mitocondriilor. 3. ncepe etapa translaiei care presupune trecerea ARNm printre subunitile ribozomului. n spaiul dintre cele doua subuniti este loc pentru doi codoni ai ARNm. Prima etap n procesul de sinteza proteic o constituie transcripia informaiei genetice din ADN n ARNm, cu ajutorul enzimei ARN polimeraz. La procariote se copiaz informaia genetic a mai multor gene succesive, iar ARNm codifica mai multe proteine de care celula are nevoie n momentul respectiv. La eucariote se copiaz informaia genetic a unei singure gene rezultnd ARNm precursor separnd secvenele informaionale (exoni) de cele noninformaionale (introni). Alte enzime leag exonii ntre ei si rezulta ARNm matur care va ajunge la ribozomi prin difuziune. A doua etap a sintezei proteice este reprezentat de translaie n urma creia o secven de nucleotide din ARNm este transformat ntr-o secven de aminoacizi n molecula proteica. ARNm se cupleaz cu ribozomii din citoplasma formnd poliribozomi. Concomitent are loc activarea aminoacizilor (AA) din citoplasma prin legarea lor de ATP. Cele trei faze ale sintezei proteice pot fi redate sintetic astfel: 1. n prima faza un aminoacid este activat n urma reaciei cu molecula de ATP donatoare de energie sub influena enzimelor denumite aminocilsintetaze, deci aminoacidul se leag de AMP iar dou grupri fosfat sunt puse n libertate. 2. n a doua faza are loc transferul aminoacizilor activai de ARNt sub influena acelorai enzime din prima etapa. Cu ajutorul ARNt, aminoacizii sunt transferai la locul sintezei proteice n ribozomi.

20

3. n ultima faza are loc asamblarea polipeptidelor cu ajutorul ribozomilor. n aceasta faza aminoacizii se unesc ntre ei prin legturi peptidice cu ajutorul enzimelor peptid polimeraz. Legtura dintre secvena nucleotidelor n ADN i succesiunea aminoacizilor n molecula proteic se realizeaz cu ajutorul codului genetic. Codul genetic este alcatuit din 64 de codoni, cifra reprezentnd totalitatea combinatiilor celor 4 tipuri de nucleotide luate cte 3. innd seama ca exista mai multi codoni dect aminoacizi, s-a dovedit ca mai multi codoni pot codifica acelasi aminoacid. EX: fenilalanina este codificata de doua triplete: UUU si UUC. Codul genetic este nesuprapus, ceea ce nseamna ca doi codoni vecini nu au nucleotide comune. Este fara virgule: citirea informatiei se face continuu, deci ntre doi codoni succesivi nu exista semne de punctuatie. n codul genetic nu exista dect doi codoni (GUG si AUG) care marcheaza nceputul unui mesaj genetic si trei codoni (UAA, UAG si UGA) care indica sfrsitul unui mesaj genetic. Codul este universal la toate organismele vii, de la cele mai simple virusuri, la cele mai evoluate mamifere, aceleasi triplete codificnd acelasi aminoacid. Informaia necesara sintezei proteinelor care dein un limbaj de 20 de semne este depozitat n moleculele de ADN care dein limbaj de 4 semne. Pentru traducere limbajului de 4 semne al nucleotidelor n limbajul de 20 de semne al aminoacizilor este nevoie de un 'dicionar' pe care natura l-a inventat la nceputurile vieii i care se numete 'codul genetic'. El reprezinta un sistem biochimic pe care se stabilete relaia dintre acizii nucleici i proteine i const n corespondena dintre fiecare aminoacid i o succesiune de 3 nucleotide, numit 'codon'. Deci informaia genetic referitoare la biosinteza proteinelor se transmite cu ajutorul codului genetic - dicionar ce traduce secvena nucleotidelor din ADN n succesiunea AA din lanul polipeptidic. Proprietile codului genetic: - este triplet -64 codoni: 3 nonsens: UAG; UGA; UAA; 61 codific AA corespunztori; - este degenerat - unui AA poate s-i corespund mai muli codoni (Ex. Arg, Leu, Ser - codificate de 6 codoni; Met- i Trp - un codon). Codonii unui aminoacid sint sinonime. Specificitatea codonului e determinat de primele dou litere. Degenerarea se refer la nivelul nucleotidului 3 din codon sau 1 din anticodon care oscileaza. - nu este ambiguu- acelai triplet nu semnific 2 AA diferii - are o structur liniar (colinear) o concordan liniar ntre gen i proteina codifictoare - nu se suprapune (excepie- viruii) - este universal toate veuitoarele utilizeaz acelai mecanism de traducere (abatere prezint codul genetic al mitocondriilor); - nu are virgule, semne de punctuatie - ce ar indica nceputul i sfritul fiecarui codon. 1. AUG - este codonul de initiere 2. UAG, UAA, UGA - codoni stop (non sens) 3. toi codonii cu U (n pozitia 2) codifica AA hidrofobi 4. codonii cu A n pozitia -2 codific AA polari 5. Uracilul n poziia 1 prezint codonul nonsens 6. dac n anticodon n directia (5'->3') prima baz nucleotidic e: a) Citozina sau Adenina, el va citi un singur codon; b) Uracilul sau Guanina el va citi 2 codoni; c) inozina - respectiv va citi 3 codoni 21

ANEXE

Fig. 1. Prezena nucleotidelor n Acidul Deoxiribonucleic

.

Fig. 2. Spiral ADN format din dou lanuri polinucleotidice

22

Fig 3. Structura ADN

Fig. 4. Structura ARN

23

Fig. 5. Forma lanului ADN i ARN

Fig. 6. Formulele structurale ale celor dou pentoze, riboza i deoxiriboza

Fig. 7. Bazele purinice i pirimidinice n ADN

Fig. 8. Legturile de hidrogen ntre bazele citoz i guanin

24

Fig. 9. Legturile de hidrogen ntre bazele uracil i adein

Fig. 10. Legturile de hidrogen ntre bazele timin i adein

BAZA Adein Guanin Citozin Timin NUCLEOZID Deoxiadenozin (dA) Deoxiguanozin (dG) Deoxicitidin (dC) Timidin (dT) NUCLEOTID Deoxiadenozin monofosfat (dAMP) Deoxiguanozin monofosfat (dGMP) Deoxicitozin monofosfat (dCMP) Timidin monofosfat (dTMP)

25

Fig. 11. Compoziia i structura celor patru deoxiribonucleotide din ADN

26

Fig. 12. Structura adenozinei

Fig. 13. Prezentarea schematic a unui segment de ARN

27

Fig.14. Modelul structurii secundare a ARN n form de foaie de trifoi

Fig. 15. Structura teriar a ARN nalt polimerizat (a) i a unui tARN (b)

28

Fig. 16. Elicea dubl a ADN

Fig.17. Perechile de baze complementare de tip Watson-Crick

29

Fig . 18. Segment de ADN care prezint modul de interaciune a celor dou catene antiparalele

Fig. 19. ADN monocatenari: circular, linear

30

Fig. 20. ADN bicatenari de tip I, II, III

Fig. 21. ADN bicatenari cu capete coezive

31

Fig. 22. Dogma central a geneticii moleculare

Organ Timus Ficat Pancreas Rinichi

ADN (picograme) 6,6 6,4 6,9 5,9

Tabelul 1. Valorile ADN n organele vacii

32

Fig. 23. Molecula ADN este despicat n lung n dou iraguri care apoi integreaz nucleotidele prin mperecherea bazelor pentru a produce dou molecule ADN identice.

Fig . 24. Replicarea ADN

BIBLIOGRAFIE

Anghel I., Toma V., Citologie Vegetal, Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti Benzer S., Genetic fine structure, Editura Academic Press, New York Burns G. W., The Science of Genetics, Editura The Magmillan co. 33

Crciun T. , Mecanismele Ereditii, Editura Albatros. Covic, M., tefnescu D., Sandovici I., Genetic Medical, Ed. Polirom, Bucureti, 2004 Gavril L., Curs Genetic Ionescu Varo M. Biologie Celular, Raicu P., Genetic , Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti

34