METABOLISMUL ACIZILOR NUCLEICI

Metabolismul nucleotidelor purinice i pirimidinice se desfoar la nivelul majoritii celulelor nucleate. nucleotidele de origine alimentar ce trec de peretele intestinal, nu sunt ncorporate n acizi nucleici tisulari nucleotidele injectate sunt ncorporate. Intensitatea metabolismului nucleotidelor depinde de necesitile fiziologice, sinteza nucleotidelor crescnd n timpul creterii sau regenerrii tisulare. n cazul biosintezei ambelor tipuri de nucleotide exist un precursor comun, fosforibozil pirofosfat (PRPP), ce provine din riboza 5-fosfat, produs al cii pentozo-fosfailor. Acest precursor macroergic (PRPP) conine dou dintre cele trei componente ce formeaz o nucleotid (restul fosfat i pentoza). Acestui compus urmeaz s-i fie ataat baza azotat, purinic sau pirimidinic, obinut prin reacii specifice.

Biosinteza nucleotidelor purinice Sinteza trebuie s asigure necesarul pentru sinteza de ADN i ARN, ca i pentru nucleotidele care sunt necesare ca atare n metabolismul intermediar. Fondul necesar de nucleotide se asigur prin:sinteza de novo a ribonucleotidelor i dezoxiribonucleotidelor;interconversiunile nucleotidelor;reutilizarea bazelor azotate sau nucleotidelor ce rezult din degradarea celular a acizilor nucleici.Biosinteza nucleotidelor purinice cuprinde 3 etape: Transformarea -D-ribozo-5-fosfat n inozin monofosfat (IMP)Transformarea IMP n nucleozide purinice monofosfat AMP i GMP.Fosforilarea nucleozidelor purinice monofosfat cu obinerea de nucleozide purinice di- i respectiv trifosfat (ADP, ATP respectiv GDP, GTP).Sinteza nucleotidelor purinice necesit:aminoacizi (Gli, Asp, Gln) ca donori de C i N, CO2 ca surs de carbon i uniti monocarbon transferate prin intermediul FolH4, vitamine ca biotina si acidul folic, energie (ATP) si ionii Mg2+ i K+.

Sinteza cea mai intens are loc n ficat, organ ce asigur i necesarul esuturilor incapabile de biosintez. De exemplu, creierul are o activitate slab de biosintez i depinde parial de purine exogene. Eritrocitele i leucocitele polimorfonucleare nu pot sintetiza purine i depind n ntregime de purine plasmatice pentru a forma nucleotide.Sinteza purinelor se realizeaz cu consum mare de energie (ATP)enzimele implicate n calea metabolic au funcii catalitice multiple, cataliznd mai multe reacii succesive.

Reglarea sintezei purinelorprin concentraia reactanilor i a produilor de reacie. Reglarea de substrat se realizeaz prin disponibilul de precursori: riboz-5-fosfat, acid folic, glutamin i aspartat, formil FolH4. Reglarea enzimatic se realizeaz la nivelul enzimei fosforibozil-pirofosfat sintetaza si fosforibozil-pirofosfat amidotransferaza prin reglajul de tip feed-back realizat de produii procesului de biosintez: AMP, ATP, GMP i GTP. Deoarece transformarea IMP AMP necesit GTP, iar transformarea IMPGMP necesit ATP, cele dou tipuri de nucleotide i regleaz una alteia concentraia.NAD+-ul si FAD-ul inhib, de asemenea, sinteza, la nivelul PRPP-sintetazei.

Biosinteza nucleotidelor pirimidinice Procesul are loc n citoplasm, unde acioneaz enzima carbamoil-fosfat sintetaza II. Procesul de sintez se desfoar invers comparativ cu sinteza purinelor, deoarece nti se sintetizeaz nucleul pirimidinic i apoi se ataeaz restul fosforibozil. Primul nucleotid format este acidul orotidilic (OMP), care apoi se transform n acid uridilic (UMP). Acesta este precursorul sintezei celorlalte nucleotide pirimidinice CTP i respectiv dTMP. Enzimele ce particip la aceast cale metabolic sunt multifuncionale, cataliznd mai multe reacii consecutive.

Gln + HCO3 + 2 ATP carbamoil-fosfat + 2ADP + Pi

NMP + ATP NDP + ADPNDP + ATP NTP + ADP

O meniune special trebuie fcut pentru sinteza deoxitimidilatului (dTMP), ce utilizeaz ca precursor dUMP.

Enzima timidilat sintetaz catalizeaz transferul unei grupe metilen i reducerea acesteia la o grupare metil. Este o reacie unic n care FolH4, transportor de grupri monocarbon, este oxidat la FolH2. Ulterior FolH2 este redus la FolH4 sub aciunea enzimei FolH2 reductaz.

Reglarea biosintezei

- enzimei de ritm carbamoil-fosfat sintetaza II - alosteric- inhibat de UTP i nucleotide purinice, activat de fosforibozil-pirofosfat si ATP.

Produii finali ai cii de biosintez sunt UMP, UDP, UTP, CTP i dezoxi-TMP.

Reacii de salvare

proces costisitor energetic - 10 molecule ATP pentru sinteza unei molecule de AMP. sunt reutilizate elementele de baz ale nucleotidelor: baze azotate i nucleozide.bazele purinice libere sunt reutilizate printr-o reacie de fosforibozilare, prin care sunt transformate n nucleozide monofosfat.

Enzima hipoxantin-guanin fosforibozil transferaz (HGPRT) este reglat prin feed-back de concentraiile AMP i GMP.

n cazul nucleotider pirimidinice, reaciile de salvare utilizeaz doar nucleozide (uridina, citidina, timidina i d-citidina), pe care le convertesc prin fosforilare (fosforiltransferaza ATP- dependent) n nucleotide monofosfat.

Enzima orotat fosforibozil transferaz transform acidul orotic liber n orotidin monofosfat (OMP).

n ficat predomin sinteza de novo a nucleotidelor Ficatul export baze azotate libere, nucleozide i nucleotide spre alte esuturi (exemplu: esutul nervos, eritrocite), unde sinteza de novo este deficitar, n schimb sunt posibile reaciile de salvare.

Biosinteza deoxiribonucleozidelor Se reduce a grupareai hidroxil din poziia 2 a ribozei ribonucleozidelor difosfat. XMP XDPXDP dXDPEnzima complex : ribonucleotid reductaz. este activ doar atunci cnd celula sintetizeaz activ ADN. Echivalenii reductori - cofactor enzimatic, tioredoxina redus (o protein mic), ce posed dou grupri SH reductoare, care dup reducerea ribozei, formeaz o punte disulfidic, caracteristic tioredoxinei oxidate. Tioredoxina oxidat + NADPH,H tioredoxin redus

reglare prin feed-back de produii de reacie obinui: dATP, dGTP dCTP i dTTP. Deoxiadenozina, deoxiguanozina i deoxitimidina sunt toxici pentru celulele mamiferelor, inhibnd sinteza ADN i astfel replicarea celular. Catabolismul nucleotidelor Acizii nucleici sunt hidrolizai de nucleaze la nucleotide, Nucleotidele sunt hidrolizate de nucleotidaze la nucleozide, nucleozidele sub aciunea fosforilazelor se transform n bazele azotate corespunztoare i riboz-1-fosfat. Bazele azotate purinice sunt catabolizate la acid uric, produs greu solubil cu puternic potenial antioxidant, bazele azotate pirimidinice se catabolizeaz la produi uor solubili: CO2, NH3 i -aminoacizi (-alanina i acid -aminoizobutiric).

Catabolizarea nucleotidelor purinice

xantin oxidaza ionul superoxid. Ion - superoxid apa oxigenat enzima superoxid dismutaza. Apa oxigenat este ndeprtat de prezena catalazei. Xantin oxidaza este abundent in ficat (unde acioneaz asupra bazelor azotate endogene) i n intestin (cu aciune asupra bazelor azotate exogene).

Catabolizarea nucleotidelor pirimidinice

- Acidul betaaminoizobutiric metilmalonilsemialdehida, succinil-CoA, eliminarea urinar de acid betaamino-izobutiric crete n urma unor procese de distrugere a ADN cum ar fi n leucemii sau in radioterapie.

Acidul uricprodusul final al catabolismului bazelor purinice la om, primate, amfibieni, reptile i psri. La restul mamiferelor, enzima uricaz oxideaz acidul uric la alantoinSe produce aprox 1g de acid uric / zi Aproximativ 75% este excretat prin urin, iar restul este secretat la nivelul tractului gastro-intestinal unde este degradat pn la alantoin sub aciunea enzimelor bacteriene i eliminat n fecale.Concentraia plasmatic de acid uric este de 3-9 mg/100 mL la brbai i 2,5-7 mg/100 mL la femei. Eliminarea urinar >0,5 g acid uric/ zi.este un compus puin solubil, solubilitatea creste mult la trecerea sub form de urat. o urin acid, pH = 5 dizolv 15 mg de acid uric/l urin, o urin neutr cu pH = 7 dizolv o cantitate de peste 10 ori mai mare, 150-200 mg/l urin. depunerile de urat la nivel renal se previn prin alcalinizarea urinii.Solubilitatea uratului de sodiu n ser este de 7mg% la pH fiziologic, astfel c orice mic depire va precipita uraii. La brbai concentraia este n medie mai mare cu 1mg% dect la femei i crete cu vrsta. Concentraia acidului uric plasmatic este mai mare la persoanele care au o diet bogat n proteine, acizi nucleici (carne) precum i la consumatorii de alcool.

Patologia catabolismului purinelor A. Hiperuricemiilevalori 20-25 g duc la depirea limitei de solubilitate i depunerea cristalelor de urat de sodiu la nivelul articulaiilor extremitilor i n esutul interstiial renal sub form de tofi gutoi, fenomen nsoit de dureri acute. Cristalele pot fi vizualizate n lichidul sinovial. 1. Creterea produciei de urat se realizeaz datorit:creterii activitii enzimelor fosforibozil pirofosfat sintetaza i fosforibozilpirofosfat amidotransferaza, sau creterea concentraiei substratului su, fosforibozil pirofosfatul.creterii turnoverului sau distruciei celulare creterea ratei catabolismului acizilor nucleici ca urmare a scderea activitii cii de salvare a nucleotidelor, datorit absenei sau ineficienei enzimei HGPRT (hipoxantin-guanozin fosforibozil transferazei)creterea activitii xantin-oxidazei Circumstane:boli metabolice congenitale: sindromul Lesh-Nyhan (deficit de HGPRT), creterea activitii fosforibozil pirofosfat sintetazei, deficitul de glucozo-6-fosfat fosfatazei (boala Van Gierke) creterea activitii xantin-oxidazei.creterea ingestiei de purine;accelerarea catabolismului acizilor nucleici: boli maligne, medicamente citotoxice, psoriazis, boli mieloproliferative, boli limfoproliferative (leucemii, limfoame), carcinomatoz, degradarea ATP-ului (hipoxie sau consum de alcool).

2. Scderea eliminrii uratului: Scade rata filtrrii glomerulare indiferent de cauz, retenie de urat.secreia tubular distal. Acidul lactic, acidul 3-hidroxibutiric i unele medicamente (ca de exemplu diureticele tiazidice) se afl n competiie cu uratulOrice situaie care produce acidoz este asociat cu hiperuricemia.Majoritatea medicamentelor cu efect uricozuric scdere a reabsorbiei tubulare de urat.Circumstane:hiperuricemia familial juvenil;boli renale de diverse etiologii;medicamente sau alte substane: diuretice tiazidice, salicilai (doze mici), plumbul, acizii organici (acidul lactic, cetoacizii).

B. Guta

principala afeciune n care este implicat hiperuricemia. reprezint de fapt un grup de boli metabolice n cadrul crora simptomele i semnele de boal sunt rezultatul depunerii tisulare a unor depozite formate din cristale de urat de sodiu monohidrat.se caracterizeaz prin atacuri recurente de artrit monoarticular, fiind mai frecvent ntlnit la brbai. Simptomele acute sunt datorate microtraumatismelor sau modificrilor metabolice locale determinate de acumularea acestor cristale. Cristalele sunt fagocitate de ctre leucocite i macrofage i produc leziuni membranare leucocitare. Eliberarea lizozimului i a altor mediatori ai rspunsului inflamator acut (citokine, prostaglandine, radicali liberi) determin manifestri locale i sistemice de gut. Aceste depozite de urat n esuturile moi poart numele de tofi gutoi.deteriorare a excreiei renale i o eliminare deficitar a uratului. De asemenea, ei dezvolt adesea calculi renali formai din acid uric i urai dar formarea acestora este favorizat de deshidratare i de scderea pH-ului urinar.

Diagnosticul de laborator al gutei se realizeaz prin:creterea concentraiei plasmatice a acidului uric. Un numr mic de pacieni prezint totui valori normale ale acidului uric seric.examenul lichidului sinovial i examinarea microscopic a acestuia. Msuri terapeutice n cazul gutei:evitarea consumului de alimente care cresc acidul uric plasmatic: diet hiper-proteic, alcool.scderea n greutate;administrarea de inhibitori ai sintezei de urat: allopurinolul.

- Allopurinolul - analog structural al hipoxantinei, ce inhib competitiv activitatea xantin oxidazei. - Catabolismul purinic este blocat la nivelul xantinei, care fiind mai solubil dect acidul uric se elimin urinar mult mai uor. Alte msuri terapeutice- alcalinizarea urinii pentru a reduce riscul formrii calculilor;- administrarea de aniinflamatoare nesteroidiene (de exemplu indometacin) n faza acut, faz n care este contraindicat administrarea allopurinolului

C. Sindromul Lesh - Nyhamboal congenital grav - defect genetic al hipoxantin-guanin-fosforibozil-transferazei (HGPRP) ce reduce parial sau total activitatea enzimei. blocheaz total reaciile de salvare ale nucleotidelor, este amplificat sinteza de novo a nucleotidelor, ce vor fi catabolizate la acid uric. Boala se asociaz cu o cretere a produciei de purine, hiperuricemie, litiaz cu acid uric, gut i tulburri neurologice. Aceti pacieni prezint retardare mintal sever cu tulburri de comportament caracterizate n special prin automutilare.Prognosticul pe termen lung al acestor pacieni este nefavorabil. Totui, se poate ncerca administrarea de allopurinol care s previn guta i formarea calculilor urinari, tratament ce nu are nici un efect asupra tulburrilor neurologice.D. HipouricemiileSunt determinate fie de o scdere a produciei, fie de o cretere a excreiei. Scderea produciei are la baz fie defecte ale enzimelor implicate n catabolismul bazelor purinice: xantin oxidaza, purin nucleozid fosforilaza (asociat i cu imunodeficien), fie boli hepatice severe. n cazul unui defect al xantin oxidazei, generat de o mutaie genetic, sau de o afectare grav a ficatului, boala se manifest prin xantinurie i litiaz cu xantin. Creterea excreiei se datoreaz fie unui defect n transportul tubular (sindromul Fanconi, boala Wilson), fie unor medicamente: antiinflamatoare nesteroidiene (fenilbutazona), medicamente uricozurice.E. Sindromul imunodeficitar severSe manifest prin reducerea i disfuncionalitatea limfocitelor T i B, fapt ce reduce aproape total funcionalitatea sistemului imunitar. Este o boal congenital, astfel c nou-nscutul este vulnerabil fa de orice agent patogen. Boala se datoreaz defectului enzimei adenozin-dezaminaz sau a enzimei purin nucleozid fosforilaz. n ambele cazuri se acumuleaz dGTP i dATP, care inhib ribonucleotid reductaza, blocnd astfel sinteza de nucleotide pentru sinteza ADN.

Patologia metabolismului nucleotidelor pirimidinice aciduria orotic defecte congenitale ale enzimelor orotat fosforiboziltransferaza sau orotidilat decarboxilaza, fapt ce blocheaz sinteza de nucleotide pirimidinice la nivelul acidului orotic, care se acumuleaz n snge i se elimin urinar. Boala este periculoas prin deficitul de nucleotide pirimidinice creat. Pacienii depind de aportul extern i sunt tratai cu doze mari de uridin, administrat pe cale oral.

Substane chemoterapeutice ce interfer cu metabolismul nucleotidelorse folosesc inhibitori ai enzimelor importante, implicate n metabolismul nucleotidelor, care dup structura sau rolul funcional se mpart n: antimetabolii, antifolai, antagoniti ai glutaminei, virustatice. A. AntimetaboliiiSunt substane cu structur analoag cu a purinelor sau pirimidinelor, astfel c inhib prin inhibiie competitiv enzimele implicate n metabolismul normal al nucleotidelor. 6-Mercaptopurina, 5-Fluorouracilul, Citozin-arabinozid (Citarabina - are arabinoz n locul ribozei), 6-Tioguanina fie inhib sinteza nucleotidului specific, fie sunt ncorporate ca false nucleotide n ADN sau ARN, blocnd activitatea acestora.Din acest motiv sunt utilizate ca citostatice n tratamentul cancerului. Allopurinolul (un analog structural al hipoxantinei) este inhibitor competitiv al enzimei xantin-oxidaza, blocnd transformarea hipoxantinei i a xantinei n acid uric, fenomen asociat cu xantinurie. n acelai timp, allopurinolul este substrat alternativ pentru orotat fosforibozil transferaz, blocnd transformarea acidului orotic n uracil i producnd acidurie orotic. Este folosit n tratarea gutei i a unor tipuri de cancer.

B. Antifolaii Sunt ageni chemoterapeutici, cu structur analog acidului folic, ce blocheaz regenerarea FolH4 din FolH2 sau acid folic, inhibnd competitiv enzima FolH2 reductaza. Acest efect oprete sinteza de novo a nucleotidelor, blocnd diviziunea celular. Cel mai cunoscut agent este metotrexatul, utilizat curent ca agent antitumoral n tratamentul cancerului. Deoarece metotrexatul este toxic i pentru celulele normale, n tratamentul leucemiei cu metotrexat se asociaz cu administrarea de N5-formil-FolH4 (Leucovarin).

C. Antagoniti ai glutamineiGlutamina este un element esenial n sinteza nucleotidelor:este sursa pentru atomii de azot (N3 i N9) din nucleul purinic.intervine n transformarea IMP GMPintervine n transformarea UTP CTPparticip la sinteza de carbamoil-fosfat analogii structurali ai glutaminei ca 6-Diazo-5 oxo-L-norleucin sau Azaserina pot bloca aceste reacii eseniale n sinteza nucleotidelor. Compuii au un efect citotoxic foarte puternic. 6-diazo-5-oxo-L-norleucina azaserina

D. Ageni antiviralianalogi structurali ai purinelor sau pirimidinelor, n care: sunt substituii atomi de carbon cu halogeni (iodoxuridin, trifluoruridin), componenta glucidic este modificat (vidarabina este o adeninarabinoz, aciclovirul este aciclovirguanozin, azidotimidina este 3-azido-3-deoxitimidin).Aciclovirul este un agent antiviral pentru herpesvirus (HSV), iar azidotimidina - AZT pentru virusul imunodeficienei umane (HIV). Ambele substane inhib competitiv kinaze virale, transformndu-se n nucleotide aberante, blocnd activitatea ADN polimerazelor virale. aciclovir

Biosinteza ADN ADN este depozitarul informaiei genetice din celule. Aceast informaie este transferat integral sub raport calitativ i cantitativ, de la o generaie de celule la alta, prin procesul de replicare semiconservativ a ADN. n acelai timp celula utilizeaz permanent informaia genetic din ADN pentru sinteza proteinelor, acestea constituind principalul component n realizarea structurilor i funciilor celulare.- Principiul biosintezei sau replicrii ADN l constituie replicarea semiconservativ.- Catena parental se dedubleaz sub forma a 2 catene ADN fiice, fiecare fiind format dintr-o catena parental A i o caten nou format avnd ca matria catena parental complementar B. Procesul replicrii a fost descifrat mai nti la procariote (E. coli) i ulterior la eucariote. n linii mari procesul este acelai. Diferenele la eucariote sunt date de mrimea i complexitatea structural a ADN eucariot, precum i de numrul mult mai mare de factori de control implicai in proces.

Biosinteza ADN este realizat de un complex multienzimatic numit replizom. Segmentul de ADN care va fi sintetizat, este o copie complementar a unui segment, numit replicon, dintr-o caten parental matri.

n cazul ADN procariot (de dimensiuni reduse) el nsui n totalitate va constitui un singur replicon.n cazul ADN eucariot (cromozomi) exist cca. 100 de repliconi. Fiecare replicon are un punct de start i un punct terminal.

Complexul multienzimatic al replicarii sau replizomul este format din:ADN giraz (topoizomeraza II), helicaz, topoizomeraze, proteine de stabilizare i ADN polimeraze. Etapele replicriiIniierea ElongareaEtapa terminal

I. INIIEREA despiralarea celor 2 catene sub aciunea helicazei i ruperea legturilor de hidrogen dintre catene sub aciunea topoizomerazei, constituindu-se un ochi sau furca de replicare. Catenele astfel desfcute sunt mpiedicate s se respiraleze prin aciunea unor proteine de stabilizare, ce se fixeaz pe exteriorul celor dou catene.Topoizomerazele regleaz formarea structurii suprahelicoidale. Ele catalizeaz separarea i refacerea catenelor ADN i modific numrul de legturi de hidrogen din structura ADN. Prin despiralare, se creeaz fie o spiralare suplimentar (pozitiv) a poriunii care este nc spiralat, fie o micorare a numrului de spirale (negativ). Topoizomerazele i girazele (introduc spiralare negativ i acioneaz numai la bacterii) au rolul de a menine, n final, numrul de spirale caracteristic structurii ADN respective. Energia necesar este furnizat prin hidroliza ATP, utilizat pentru restaurarea conformaiei enzimei. Inhibitori ai acestor topoizomeraze i giraze acioneaz ca i ageni antibacterieni i antitumorali. Fiecare din segmentele desfcute ale celor dou catene va constitui o matri pentru sinteza unei catene noi, complementare i antiparalele. Orice nou caten ADN se va sintetiza ntotdeauna pe direcia 5 3 aceasta constituind o regula obligatorie.

II. ELONGAREA caten parental - catena conductoare, cu sensul 3 - 5, sintez 5-3 va coincide cu sensul de naintare al despiralrii sintez nentreruptcatena n ntrziere cu sensul 5-3 respect sensul de sintez 5-3 avanseaz n sens opus sensului de despiralare, sinteza mai lent. sintez discontinu fragment pentru fiecare ochi de despiralare OKAZAKIenzime numite ADN polimeraze inser deoxinucleotide secven complementar cu matria. ADN polimeraza are nevoie, pentru a insera prima nucleotid, de un capt 3-OH liber care s funcioneze ca o amors (primer). Acest lucru poate fi obinut in urmtoarele variante :sinteza mai nti a unui fragment de ARN la al crui capt 3-OH s se continue cu sinteza de ADN.sub aciunea unei proteine specifice se introduce forat un nucleotid legat de catena parental care s aib un capt 3-OH liber.

- Sinteza fragmentului ARN primer este efectuat de un complex numit primozom (parte a replizomului) constituit din: primaz (ARN polimeraz ADN dependent), helicaz, matrit ADN, ribonucleotide trifosfat. Dup sinteza unui segment ARN primer (40-80 ribonucleotide) ADN polimeraza III va ncepe s ataeze complementar dezoxiribonucleotide monofosfat la captul 3-OH liber al acestuia. Restul pirofosfat este detaat i hidrolizat sub aciunea pirofosfatazei, reacia devenind astfel ireversibil.

La terminarea copierii segmentelor parentale din ochiul de despiralare intr n aciune ADN polimeraza I. Acesta excizeaz n totalitate ARN primer i le nlocuiete cu dezoxiribonucleotide complementare catenei parentale. n acest mod, la sfritul sintezei, nu vor exista dect catene ADN. n cazul procariotelor i n curs de cercetare la eucariote, s-a identificat un model n care sinteza celor 2 catene se face simultan, sub aciunea aceleiai ADN polimeraze, cele 2 catene naintnd n aceeai direcie.

3. ETAPA TERMINALlipirea fragmentelor OKAZAKI, din catena n ntrziere, prin aciunea unei ADN ligaze. catena n ntrziere se va prezenta sub forma unei catene unice. Procesul de sintez se desfoar foarte rapid: n faa buclelor de replicare helicazele i topoizomerazele despiraleaz cele dou catene foarte rapid, iar n spatele buclei de replicare refac spiralarea celor dou ADN fiice rezultate n urma replicrii.

Particulariti ale sintezei ADN la procariote

Un singur centru de iniiere a replicrii numit Ori C cu structur standard coninnd 11 segmente metilate i 3 segmente bogate n Adenin i Timin. Formarea replizomului ncepe cu recunoaterea centrului de iniiere de ctre proteine specifice, helicaze i topoizomeraze.Catenele despiralate sunt stabilizate de ctre proteine de stabilizare, dup care acioneaz primozomul ce sintetizeaz fragmente ARN primer. Urmeaz sinteza catenei ADN de ADN polimeraza, iar terminarea sintezei are loc la nivelul unui fragment ADN numit T. Regiunea terminal, bogat n guanin i timin, leag proteina de terminare care blocheaz continuarea sintezei. Proteina de terminare este de fapt o contra helicaz ce intervine doar n momentul cnd replizomul a parcurs i secvena T (terminal).

Particulariti ale replicrii la eucariote

1. o complexitate mai mare datorit multitudinii de factori implicai i diferenelor generale dintre procariote i eucariote:La procariote cu cretere rapid, dup sinteza ADN are loc imediat diviziunea celular. La eucariote sinteza ADN i a histonelor este doar o faz a ciclului celular (faza S), diviziunea avnd loc n faza M.2. Diferena de mrime a ADN.3. Diferena de structur a ADN: la procariote exist un cromozom dublu catenar circular cu localizare citoplasmatic.la eucariote ADN are mai multe nivele de condensare care ncep cu nucleozomi i se termin cu cromozomii. Din acest motiv la eucariote viteza de sintez este mult mai redus (2500 nucleotide/sec fa de 15.000 nucleotide/sec la procariote). Viteza redus este compensat la eucariote de urmtoarele procese:Un numr mai mare de repliconi (cca 100 / cromozom fa de 1 la procariote).Numrul de molecule de ADN polimeraz este mult mai mare (20.000) fa de numai cteva zeci la procariote.Numrul de tipuri de ADN polimeraz. Astfel, n timp ce la procariote avem un tip de ADN polimeraz cu o structur dimeric, la eucariote avem cel puin 4 cu aciune specializat i anume:ADN polimeraza ce realizeaz sinteza catenei conductoare.ADN polimeraza care are rolul de reparare a erorilor n catena.ADN polimeraza sintetizeaz catena n ntrziere.ADN polimeraza care este specific pentru mitocondrie.

4. Centrul de origine (complex de recunoatere a originii de replicare)Dac la procariote acest centru este fix (Ori C), n cazul eucariotelor poziia acestui centru este variabil. In general, conine secvene bogate n adenin i timin, secvene de care se ataeaz un complex de proteine, denumit complex de recunoatere a originii de replicare. Recunoaterea centrelor de iniiere trebuie s se fac coordonat pentru toi cromozomii, astfel ca n faza S a ciclului celular s fie replicate toate regiunile din cromozomi i nici o regiune s nu se replice de mai multe ori. n acest sens intervin ciclinele i kinazele dependente de cicline (CDK) care controleaz ciclul celular. Degradarea acestora produce inhibiia diviziunii celulare.5. Replicarea capetelor cromozomilor (la eucariote).Capetele cromozomilor eucariotelor se numesc telomeri. Acestea sunt regiuni de mrime variabil (20 pb la protozoare i 150 kb la oarece). Sunt constituite din secvene repetitive care la om sunt secvene de cte 6 nucleotide - TTAGGG - repetate de mii de ori. Telomerii ndeplinesc dou roluri importante: a) Protejeaz cromozomii de atacul nucleazelor b) Blocheaz fuzionarea cap la cap a cromozomilorTelomerii prezint la capt o structur nchis n form de la.Sinteza telomerilor implic unele probleme generate de faptul c sinteza catenelor complementare este incomplet. Ca urmare noile catene sintetizate vor avea capete mai scurte. Se estimeaz c fiecare telomer pierde 100 pb (cca. 16 repetiii TTAGGG) la fiecare mitoz. Astfel, dup 125 de diviziuni mitotice, telomerii vor disprea complet. n general celulele umane se divid de aproximativ 100 de ori, dar frecvena de replicare scade cu vrsta.

Telomeraza sintetizeaz telomeri. Enzima conine un segment matri ARN de aproximativ 150 nucleotide din care cca. 15-20 sunt complementare secvenei telomerice TTAGGG. n plus exercit o activitate enzimatic de tip reverstranscriptaz (ADN polimeraz ARN dependent). Activitatea telomerazic menine lungimea constant a secvenelor telomerice ale cromozomilor, avnd o activitate maxim la celulele embrionare; dup natere activitatea scade, astfel c n stadiul adult activitatea telomerazic este nul. Din acest motiv, la fiecare replicare a celulelor somatice cromozomii devin tot mai scuri. n momentul n care aceast scurtare ajunge la nivelul secvenelor codante ale cromozomilor apare instabilitatea cromozomial, proces caracteristic mbtrnirii celulelor. Astfel lungimea telomerilor este considerat ca fiind ceasul biologic al celulelor i implicit al organismului.n cazul celulelor canceroase telomeraza redevine activ i din acest motiv celulele tumorale se pot divide la infinit fr a-i scurta cromozomii, astfel nct celulele canceroase pot fi considerate nemuritoare. Din acest motiv, telomeraza a devenit una din intele terapiei anticanceroase.

Sinteza ADN pe matri de ARN

Virusurile oncogene ce conin numai ARN (retrovirusuri) conin enzima reverstranscriptaz (ADN polimerizeaz ARN dependent). Aceste virusuri i introduc ARN-ul n celula gazd unde enzima reverstranscriptaza viral, utiliznd ARN-ul propriu ca matrice, va sintetiza o caten ADN complementar. ADN-ul complementar se autoreplic i, sub form dublucatenar, intr n nucleu unde se inser n ADN-ul celulei gazd. Aici iniiaz transcripia urmat de translaie, procese prin care se obin ARN i proteine virale, care prin asamblare vor produce copii virale multiple. Primerul folosit de reverstranscriptaza viral este un ARN de transfer preluat de particula viral din infecii ulterioare.Spre deosebire de ADN polimeraz, reverstranscriptaza nu posed activitate reparatorie (3-5 exonucleazic). Astfel, n procesul de sintez se vor produce foarte multe greeli (erori de replicare) ce vor modifica genomul viral. Acest lucru explic numrul enorm de tulpini virale i modificarea rapid a acestora n cursul proceselor de multiplicare. n cazul virusului HIV existena unui numr foarte mare de mutaii produse rapid, explic eficiena redus a tratamentelor de pn acum. Un alt exemplu de activitate reverstranscriptazic este aciunea telomerazei.Descoperirea reverstranscriptazei a dezvoltat tehnologiile de obinere de gene sintetice pornind de la ARNm citoplasmatic al genelor originale.

Modificri ale ADN n cursul procesului de replicare erorile de replicare: n cursul sintezei noilor catene apare o nucleotid eronat la fiecare 104-105 nucleotide inserate. Pentru a preveni aceasta, ADN polimerazele utilizate n procesul de replicare ADN exercit i o aciune reparatorie de tip 3-5 exonucleaz i 5-3 polimeraz. Astfel ele detecteaz nucleotidele ncorporate greit i le nlocuiesc cu nucleotide corecte. Aceast activitate continu i n perioada dintre replicri, ADN polimerazele fiind gardieni ai integritii ADN att n timpul replicrii cat i al funcionalitii ADN. se obine o fidelitate deosebit a procesului replicativ de 1 nucleotid greit la 109 nucleotide corecte, 3-5 erori pe ADNul unei celule. Daca se pornete de la numrul total de celule din organismul uman, 1013, numrul de erori generate prin replicare devine uria. n plus se mai adaug modificrile ADN induse de factori interni sau externi, ceea ce ridic foarte mult riscul modificrilor patologice ale ADN ului celular.n cazul eucariotelor, pe lng polimerazele i care sintetizeaz i repar n acelai timp catena conductoare respectiv catena n ntrziere, exist polimeraze specializate n procesul de reparare cum este de exemplu polimeraza .

Mutaii ADNschimbrile transmisibile ereditar ale materialului genetic. pot afecta att celulele somatice ct i celulele germinale. mutaiile nereparate pot conduce la apariia de diverse boli, cancer, senescen, apoptoz celular. De aceea, procesele de reparare sunt continue i indispensabile.organismele vii posed mecanisme de reparare ale modificrilor intervenite n structura ADN. Unele leziuni sunt direct reparate, dar cele mai multe sunt ndeprtate. Cheia acestor procese de reparare este natura dublu-catenar a ADN, ce conine informaia genetic n duplicat, ceea ce permite restaurarea secvenelor alterate folosind ca model informaia de la nivelul celeilalte catene. Mutaiile pot fi spontane sau consecutive unor modificri la nivelul bazelor azotate se pierd, se adaug sau se modific unele baze azotate:izomerizarea bazelor azotate (forma ceto-enol, amino-imino)dimerizarea timinei sub aciunea radiaiilor UV dezaminarea unor baze (citozinauracil, adenina hipoxantina, guanina xantina ) De asemenea pot fi produse de disfuncionaliti ale procesului de replicare sau de reparare a ADN.

Din punct de vedere al amplitudinii se mpart n dou categorii:

a) Macroleziuni ale ADNDeleiile (amputri ale materialului genetic de dimensiuni variabile)Duplicri i amplificri ale materialului geneticFuziuni de geneInversiuni ce constau n inversarea sensului unui segmentInserii de secvene ADN de lungimi variabile.

Din punct de vedere terapeutic macroleziunile ADN sunt dificil de reparat, n majoritatea cazurilor avnd loc moartea celular.

b) Microleziunile ADN (mutaii punctiforme )Rezult prin modificarea unei singure perechi de baze. n funcie de tipul modificrii avem:Tranziionale (cnd o nucleotid purinic este nlocuit tot cu o nucleotid purinic sau o nucleotid pirimidinic este nlocuit tot cu o nucleotid pirimidinic)Transversale (cnd o nucleotid purinic este nlocuit cu o nucleotid pirimidinic sau invers)Mutaii non-sens ce au loc prin nlocuirea unei perechi de baze cu alta, proces n urma cruia rezult un codon stop, care va bloca sinteza proteinei codificate.Mutaii missens n care o pereche de nucleotide este nlocuit cu alta, proces n urma cruia rezult un alt codon, ce va genera un alt aminoacid n proteina codificat de gen, acest lucru modificnd structura primar i funcia biologic a proteinei respective.Mutaii ale cadrului de citire n care se adaug sau se elimina o pereche de nucleotide. n acest caz se modific complet secvena nucleotidic organizat n codoni, anulndu-se sinteza ARN transcripionat de gena respectiv.Mutaii mute apar atunci cnd nlocuirea unei nucleotide cu alta nu afecteaz secvena de aminoacizi a proteinei codificate.n general efectele micromutaiilor sunt mai reduse dect cele ale macroleziunilor.Cele mai comune mutaii sunt produse prin substituia unei perechi de baze cu alta.

Cauze ale mutaiilorCauze interne:procesul spontan de tautomerizare al bazelor azotate formele ceto enol sau amino imino. Dei formele predominante sunt amino i ceto, totui circa 104 din baze adopt tranzitoriu celelalte forme tautomere, perioad de timp n care aceste forme vor produce mperecheri greite cum ar fi imino adenina cu citozina n loc de timin. Acest lucru va genera la replicare un ADN fiic cu o pereche de baze greit C-G n loc de T-A .Cauzele externe se datoreaz agenilor chimici i radiaiilor ultraviolete. Ageni chimici:HNO2 modific prin dezaminare bazele azotate ce conin grupare amino. adenina hipoxantin, guanina xantin, citozina uracil. Hipoxantina se va mperechea cu citozina, uracilul cu adenina, producndu-se astfel mutaii de tip tranziie A -T C-G. compuii aromatici policiclici, de exemplu acridinele, se pot insera ntre cele dou catene ale helixului ADN, producnd mutaii ale cadrului de citire, prin inseria sau deleia uneia sau a mai multor perechi de baze.Radiaiile ultraviolete reprezint cel mai comun agent de lezare al ADN. produc legarea covalent a dou baze pirimidinice adiacente n catena ADN, formndu-se un dimer de pirimidin. Acest dimer blocheaz la nivelul su procesele de replicare sau transcripie, procese ce pot avea loc doar dup repararea leziunii.

Repararea mutaiilor ADN

Repararea direct, n care modificrile sunt nlturate fr a ntrerupe (a tia) catenaRepararea prin excizia bazelor azotate Repararea prin excizia nucleotidelor modificateRepararea in cursul proceselor de replicare sau transcripie. Cuplarea reparrii cu transcripia este o form de reparare prin excizie declanat de complexul ARN polimerazei blocat i direcioneaz repararea spre catena matri a regiunii transcrise, astfel c aceste leziuni sunt mult mai repede reparate.

Patologia reparrii ADNCuprinde o serie de boli a cror cauz o constituie defecte ale enzimelor implicate n repararea ADN. Xeroderma pigmentosum defect n repararea prin excizie a mutaiilor datorate razelor ultraviolete n fibroblastele umane dimerii de timin fotosensibilitate, cancer de piele, tulburri neurologice, uneori ntrziere a creterii i retardare mental.

Cockaines syndrome - maladie cauzat de defect n repararea noilor catene.- retardare mintal, degenerare neurologic,retinopatie, cataract, nas mare.

Bloom syndrome, anemia Fanconi, ataxia, telangiectasia - maladii datorate defectului n repararea rupturilor (ADN ligaza) la nivelul ADN.

Cancerul de colon ereditar nonpolipozic (sindromul Lynch) - datorat defectelor n repararea postreplicativ a mutaiilor de mperechere nepotrivit a bazelor. - Incidena bolii este de 1 : 200, - defectele sunt localizate la nivelul genelor enzimelor de reparare.

Ageni chemoterapeutici implicai n replicare

tratament bazat pe intervenia in procesele de replicare. Antibiotice n cazul infeciilor bacteriene blocarea multiplicrii celulare a agentului bacterian poate fi realizat prin utilizarea unor substane ce inhib activitatea unor componente ale procesului de replicare.Fluoroquinolonele (norfloxacin, lomefloxacin, fleroxacin, ciprofloxacin, enoxacin, trovafloxacin, novobiocina, acidul nalidixic) sunt inhibitori ai topoizomerazelor legndu-se la complexul enzim-ADN. Metronidazolul realizeaz rupturi la nivelul catenelor ADN microbiene.

Agenii anticancerigeniinhib replicarea ADN din celulele canceroase, blocnd astfel dezvoltarea procesului tumoral. n funcie de tipul componentei afectate n cursul replicrii avem mai multe categorii:

1. Ageni de alchilare cum ar fi ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar), clorambucil (Leukeran), procarbazine (Matulane, Natulan). Majoritatea acestor substane deriv din gazul mutar folosit ca gaz de lupt n primul rzboi mondial.

2. Ageni ce blocheaz topoizomerazele - antraciclinele (Doxorubicina, Daunorubicina, adriamicina) topoizomeraza II, fiind utilizate n tratamentul neoplasmelor hematologice

- camptotecinele (Irinotecan, Topotecan) topoizomeraza I

- etopozide (Vepesid).

Topoizomerazele inte terapeutice pentru ageni antitumorali, acioneaz prin interferarea enzimelor ce catalizeaz reasamblarea celor dou catene, inhibnd astfel una dintre treptele de aciune a topoizomerazelor. acioneaz prin inhibarea parial a activitii enzimei. 3. Ageni ce blocheaz formarea fusului mitotic (Vincristina, Vinblastina, etc).

4. Ageni ce hiperstabilizeaz microtubulii, blocnd astfel diviziunea celular cum ar fi paclitaxel (Taxol) sau docetaxel (Taxotere).

Biosinteza ARN (transcripia) ADN conine uniti funcionale numite gene. Gena = segmentul ADN ce codific un produs funcional de tip ARN. Dac ARN produs este ARNm: informaia transferat va fi tradus n sinteza unei polipeptide sau proteine. gena codific sinteza unei proteine. Sinteza proteinei va trebui s parcurg astfel 2 etape:Transcripia procesul de copiere a informaiei din gen sub forma ARNm.Translaie procesul de traducere a informaiei transferate de ARNm n secvena de aminoacizi a proteinei codificate.Procesul de transcripie urmeaz n linii mari procesul de replicare a ADN, dar la o scal mult mai mic.catenele ADN se desfac, una dintre ele constituie pe o poriune limitat, matria pentru aciunea unei polimeraze se sintetizeaz un segment polinucleotidic complementar, utiliznd: ribonucleotide trifosfat (ATP; GTP; UTP; CTP), ioni de Mg2+ i Mn2+. legtur fosfo-diesteric, energia necesar - hidroliza a 2 legturi fosfat macroergice.

Exist diferene ntre procariote i eucariote, diferene date de complexitatea procesului de reglare a expresiei genelor la eucariote.ARNm este o copie polirobonucleotidic complementar a unui fragment ADNComplementaritatea se realizeaz la nivelul perechilor de baze azotate A-U i G-C.Catalizator: ARN polimeraze ADN dependenteiniiaz transcripia, sintetizeaz catena ARN prin ataarea de ribonucleotidetermin transcripia. Ele sunt polienzime formate din mai multe subuniti, fiecare subunitate ndeplinind cte un rol distinct (ex. de recunoatere, catalitic, de identificare a situsurilor de terminare a transcripiei).Produii de transcripieDoar 3-5% din totalul ARN este reprezentat de ARNm ce va codifica proteine, restul fiind format de ARNt, ARNr, sno-ARN, snARN, microARN, ARN antisens. ARNt i ARNr particip alturi de ARNm la sinteza proteic restul tipurilor de ARN sunt implicai n reglarea expresiei genelor intervenind n special la nivelul proceselor posttranscripionale ale ARNm, ARNt, i ARNr.

Transcripia la procariote

o singur ARN polimeraz o holoenzim cu 4 subuniti (2, , , ). ARN polimeraza caut gena ce va fi copiat. Toate genele au nainte de secvena ce urmeaz a fi copiat un segment de recunoatere pentru fixarea ARN polimerazei, numit segment promotor.Promotorul trebuie s conin obligatoriu dou tipuri de segmente: TTGAAT i TTAAAT (cutie TATA)ARN polimeraza formeaz cu promotorul un complex de iniiere al transcripiei numit complex nchis. Este necesar participarea unor factori de transcripie, situai n amonte de segmentul promotor:Factorii de reglare cis sunt secvene specifice ale unui anumit cromozom i acioneaz doar pe genele adiacente (secvene ADN). Factorii de reglare trans sunt molecule solubile (inclusiv proteine i ARN) care interacioneaz cu gene de pe acelai cromozom sau chiar de pe ali cromozomia) Factori de reglare din nucleu, n lipsa crora ataarea enzimei se face la ntmplare. 5 proteine nucleare care sunt necesare n transcrierea corect cu ajutorul ARN polimerazei IIb) Factori de reglare trans care trebuie s interacioneze direct sau indirect cu secvena de iniiere a transcripiei TATA.

CoactivatorTBPFactori de transcripieARNpolimerazaTAFADNTFII BElemente de control

Elemente amplificatoareTATAComplex nchis al transcripiei

Complexul complex deschis n momentul n care enzima desface cele dou catene ADN intervine subunitatea care apoi se detaeaz (din ARN polimeraza), marcnd astfel limita dintre etapa de start i cea de alungire din cadrul transcripiei.catena ADN cu sensul 3 5 va constitui matria pentru sinteza ARN. cea de-a doua caten se numete caten non-codant (non-matri).ARN se va sintetiza n sensul 5 3 prin ataarea de ribonucleotide. n spatele ei ADN-ul va reforma dubla caten. Procesul continu pn cnd se ajunge la secvene complementare de tip GC i care se continu cu o poli adenin. Copierea acestor secvene va produce o secven ARN cu fragmente complementare care vor putea hibridiza pe poriuni limitate, formnd structuri spaiale n form de ac de pr.Apariia structurii n ac de pr detaeaz ARN polimeraza. n acelai timp un factor (protein) recunoate segmentul poli U favoriznd n plus procesul de disociere al complexului ADN + ARN polimeraza, de desprindere al ARN polimerazei i de terminare a transcripiei.

Structura terminal ARN n form de ac de pr Conformaia ARN polimerazei factor

Transcripia la eucariote proces mult mai complex datorat att diferenelor structurale ct mai ales funcionale ale materialului genetic la eucariote. transcripia la procariote se desfoar n citoplasm, la eucariote - n nucleu.Expresia genei la eucariote depinde de foarte muli factori, externi i interni.

Iniierea transcripieiADN-ul eucariot cromatin (elementul de baz nucleozomul). mpiedic procesul de transcripie iniierea transcripiei este remodelarea cromatinei. desprinderea ADN de corpul histonic al nucleozomilor, pentru a putea fi expus aciunii ARN polimerazei. aciunea unor factori proteici de transcripie ce fixeaz o molecul de coactivator cu activitate histon acetil transferazic i care acetileaz histonele din nucleozomi la nivelul resturilor de aminoacizi bazici din constituia acestora. se neutralizeaz gruprile bazice ale histonelor (de exemplu -NH2 din lizin), eliminnd astfel atracia electrostatic histone ADN; molecula ADN se detaeaz de histone. Regiunea promotor este eliberat - va lega, la nivelul cutiei TATA, complexul de transcripie, iar acesta la rndul sau ARN polimeraza.Procesul depinde de gradul de metilare al resturilor de citozin din regiunea promotor, n special n zona cutiei GC. Un grad ridicat de metilare, inhib transcripia. Procesul de metilare se realizeaz n decursul existenei, iar metilarea GC se poate transmite prin celule germinale, fenomen epigenic numit genomic imprinting.

Genele eucariote conin o regiune promotor foarte extins, uneori pe zeci de mii de pb, de cteva zeci de ori mai mare dect sectorul codant al genei. n cadrul acestei regiuni distingem situsuri de legare pentru :- elemente de control : cutii TATA, secvene GC, secvena CAAT- elemente de reglare activatoare (amplificatoare) inhibitoare

Factori cis i trans reglatori ai transcripieielemente cis-reglatoare - secvene nucleotidice dispersate n structura regiunii reglatoare a geneifixeaz factori proteici specifici de reglare numii trans-reglatori. Cnd un factor reglator se fixeaz pe o secven cis-reglatoare de ADN, cantitatea de ARNm sintetizat scade brusc (factor trans inhibitor)crete brusc (factor trans activator). Factorii trans reglatori sunt proteine produse de alte gene i posed obligatoriu:un domeniu de fixare la ADN (motive structurale de tip deget de zinc, fermoar de leucin)domeniul de activare a transcripieidomeniul de fixare al unui alt element, coreglator (ex. la receptorii nucleari pentru hormonii steroidici, tiroidieni)Factori de reglare cis:promotorii - localizai naintea locusului de iniiere a transcripiei. Rolul acestora este n ataarea ARN polimerazei 2 i n corecta iniiere a transcripiei. Sunt localizai doar spre captul 5 amplificatorii activeaz promotorii controlnd eficacitatea i rata de transcripie, pot fi localizate i la captul 3 sau chiar n introni. acioneaz doar asupra promotorilor situai pe acelai cromozom, uneori la distane mari (chiar de 50 kb de promotor).

Tipuri diferite de polimeraze specializate pe sinteza anumitor tipuri de ARN:ARN polimeraza I (acioneaz n nucleol) sintetizeaz ARN ribozomal (70% din total);ARN polimeraza II (n nucleoplasm) - este responsabil de sinteza ARNm i ARNsn (ARN nuclear scurt este singura inhibat de AMANITINA);ARN polimeraza III (n nucleoplasm) - este responsabil de sinteza ARNt i ARNr cu masa 5S.

Terminarea transcripiei la eucarioteimplic mai muli factori proteici de recunoatere i reglare a regiunilor terminale din gena transcripionat.regiune terminal principal este secvena 5-AA-T-A-A-A-3 n catena ADN matri, numit semnal de poliadenilare. genereaz modificarea posttranscripional de ataare, la nivelul moleculei ARN, a unei secvene terminale poli A.secven terminal complementar format de un segment poliUo regiune lung bogat n GC, care, datorit numrului mare de legturi de hidrogen, este greu de desfcut de ARN polimeraza. Acest segment GGGGGCCCCC este recunoscut de un factor ce favorizeaz detaarea ARN polimerazei i terminarea transcripiei.

Maturarea ARNm la eucarioteLa procariote molecula ARN nou sintetizat trece direct n citoplasm unde informaia transferat prin ARNm va fi n ntregime utilizat la sinteza proteic. La eucariote, unde sinteza ARN are loc n nucleu molecula ARNm sufer o serie de transformri maturare ARNm - modificri posttranscripionale. Modificrile posttranscripionale se mpart n 3 categorii:1. Protejarea moleculei de ARNm fa de aciunea nucleazelor din citoplasm2. Selectarea informaiei din ARNm prin procesul de splicing3. Controlul cantitii de ARNm care va trece n citoplasm

Procesele de protecie de aciunea nucleazelor citoplasmatice. n citoplasm exist nucleaze ce au rolul de a distruge ARN-ul strin sau ARN-ul propriu degradat. protejarea ARN-ului este un proces de marcare prin care s fie recunoscut ca o molecul proprie.Protecia la captul 5 dup transcripie - ataarea unui rest de 7-metilguanozin, sub aciunea unei guaniltransferaze i cu GTP:Gppp + pppApNpNp... GpppApNpNp...+ pp + p.Procesul de protecie la captul 5 poate fi completat prin metilarea n poziia 2 a ribozelor urmtoarelor nucleotide (10-30 de resturi de nucleotide) de la captul 5.

Protecia la captul 3 . la captul 3, ARNm sunt scindate la 20 de nucleotide n aval de secvena specific AAUAAA, care este un marker c acest ARN trebuie adenilat. Apoi enzima poliadenilat polimeraz ataeaz un numr variabil de resturi de adenozin monofosfat, constituind coada 3 poliadenin [poli(A)] = 200-250. PoliA este considerat ca fiind ceasul biologic al ARNm, timpul de via al acestuia depinznd de mrimea segmentului de poliadenin. ARNm pentru histone, fr poliA, timpul de via - minutePoliA maxim - timpul de via crete la 30 ore. n timp segmentul poliA se scurteaz, cnd dispare n ntregime ARNm va fi degradat de nucleaze.

Selectarea informaiei codante din ARNm (splicing)La procariote toat secvena de ARNm nou sintetizat se regsete n secvena proteinei codate, la eucariote acest lucru se realizeaz doar parial. n secvena ARNm se gsesc:poriuni codante, numite exoni, poriuni necodante, numite introni. n cursul procesului de matisare (splicing) segmentele necodante, intronii, sunt scindate i ndeprtate, iar cele codante, exonii, sunt legate ntre ele formnd molecula de ARNm matur, a crei secven se va regsi n secvena de aminoacizi a proteinei codate.Procesul este catalizat de molecule ribonucleice mici (ARNsn) Fiecare ARNsn este asociat cu factori proteici de control cu care constituie RNPsn (ribonuleoproteine nucleare mici). Aceste complexe se fixeaz la nivelul intronilor din molecula ARNm imatur constituind un agregat numit spliceozom care va cataliza procesul de excizie intron - nndire exoni. n unele cazuri procesul de splicing este realizat autocatalitic, chiar de ARNm imatur ribozime.

- n cadrul ARNm, mrimea intronilor depete cu mult pe cea a exonilor. Astfel n timp ce un exon are o secven medie de 1000 nucleotide, unii introni pot depi 480.000 nucleotide. - In general numrul de introni este de 2-500/gen cu o mrime medie de 2000-10000 nucleotide.

Splicing tisular alternativProcesul de splicing este diferit n funcie de tipul celular i de intervenia unor factori interni sau externi.Astfel n esuturi diferite, aceeai gen produce acelai ARNm imatur, dar procesarea acestuia genereaz diferite tipuri de ARNm matur, ce vor constitui matrie pentru proteine diferite.n unele esuturi intronii sunt tratai ca exoni i invers. De asemenea modul de asamblare al exonilor ntre ei poate s difere. Ambele variante de splicing alternativ au ca rezultat formarea de ARNm, respectiv de proteine diferite pornind de la o singur gen.Acest lucru explic, printre altele, de ce, avnd acelai genom celular, esuturile exprim proteine diferite, element de baz n diferenierea celular. n plus, acest fapt explic cum un numr de 30 000 de gene umane produc cel puin de 10 ori mai multe tipuri de proteine. S-a constatat c peste 50% din genele umane produc ARNm imatur ce este procesat alternativ.

Calcitonina este un peptid (32 aminoacizi) cu rolul de hormon n reglarea calcemiei, secretat de celulele parafoliculare de pe tiroid. Peptidul CGRP (peptid nrudit cu calcitonina) de 37 de aminoacizi, cu rol de agent cardiovascular

Rolul intronilorLa vertebrate intronii sunt precursorii moleculelor ARN mici din nucleol (sno RNA). Acestea particip la maturarea ARN ribozomal sau servesc ca elemente matri n sinteza telomerilor.n cazul rearanjrii cromozomilor, segmentele codante (exonii) trebuie transferate intacte, astfel c locurile de contact i rupere dintre cromozomi trebuie s fie n regiuni necodante (introni) care se afl pe ambele laturi ale segmentelor codante. Din acest motiv mrimea intronilor este mult mai mare dect cea a exonilor.La origini fiecare exon a fost o gen ce codifica o protein mic, caracterizat printr-un singur domeniu proteic sudarea mai multor gene mici ntr-o gen mare protein mare cu mai multe domenii. exonii reprezint segmentul codant al genelor ce s-au unit, iar intronii secvenele necodante de la capetele 3 si 5.Tulburrile procesului de splicing patologii diverse. Ex. + -talasemia - etiologia se poate datora unor mutaii ale genelor ce codific ribonucleoproteine ce recunosc intronii din gena -globinei. + Pacienii cu lupus eritematos prezint autoanticorpi ce recunosc snoRNA de tip U1.Modificrile bazelor azotate La sfritul procesului de maturare au loc modificri ale bazelor azotate componente prin reacii de transfer de grupri metil, hidroximetil, acetil sau baze modificate noi ca de exemplu pseudouridin, acid ribotidilic.

Maturarea ARNrGenele ARNr sunt localizate n nucleol Exist sute de copii ale fiecrui tip de ARNr organizate n tandemuri repetitive. Fiecare unitate repetitiv conine o copie din fiecare tip de ARNr i anume 28 S; 18 S; 5,8 S, desprite ntre ele de regiuni necodante. Fiecare unitate repetitiv este transcris unitar asigurndu-se astfel sinteza echimolecular a celor trei tipuri de ARNr. Dup transcripie i maturare un singur ARN cu masa 45s. Acesta se leag de complexe mici nucleare ribonucleoproteice (snoRNPs) care l fragmenteaz n segmente de 28S, 18S i 5,8S. Acestea vor fi transportate n citoplasm unde cu proteinele ribozomale vor constitui cele 2 subuniti ribozomale:subunitatea mic 40S: ARNr 18S + 34 tipuri de proteinesubunitate mare 60S: ARNr 5,8S; 28S; 5S + 50 proteine

Maturarea ARNt o molecul mare nefuncional ce conine extensii la ambele capete i introni. Extensiile sunt ndeprtate de nucleaze. La captul 3 obinut se adaug trinucleotidul CCA. Intronii sunt ndeprtai prin aciunea cuplat a unei endonucleaze i a unei ligaze. Urmeaz modificri chimice < circa 1/3 din bazele azotate > 60 de tipuri de modificri, realizate de peste 100 de enzime.Modificrile (reduceri, izomerizri, atari de grupri funcionale) se produc la nivelul bazelor azotateExemple de baze modificate: baze metilate, pseudouridin, 4 sulf-tiouridin, timin, etc.

Activitatea de corectare a transcripieiNu exist sisteme de corectare ale erorilor produse la sinteza ARN, rata de erori a transcripiei fiind de o ribonucleotid incorporat greit la 104 ribonucleotide incorporate n molecula ARN. Acest grad ridicat de eroare este tolerat, deoarece molecula ARN are un timp de via scurt iar mutaiile produse la nivelul ARN nu sunt transmisibile. Timpul de via pentru ARNm este variabil, fiind de maxim 30 ore, n timp ce pentru ARNt ajunge la 5 zile.

Blocarea transcripieiCunoaterea mecanismelor transcripiei a fcut posibil punerea la punct a unor mijloace terapeutice. De exemplu o serie de ageni chemoterapeutici, de tip antibiotic, funcioneaz pe baza inhibrii transcripiei la microorganisme, blocndu-le procesele vitale i implicit dezvoltarea i multiplicarea. De exemplu:Rifampicina - acioneaz prin blocarea subunitii a ARN polimerazei bacteriene, fr a afecta ARN polimeraza de la eucariote.Actinomicina D - se intercaleaz ntre perechile G - C din segmentul promotor al genelor, blocnd astfel, att la eucariote ct procariote iniierea transcripiei.