Mendel (1865) a fost primul care a intuit existena unor factori ereditari (numii mai trziu gene) ce determin formarea caracterelor fenotipice ereditare. Aforismul "o gen un caracter a dominat genetica clasic pn cnd s-a stabilit c genele sunt alctuite din ADN iar substratul molecular al oricrui caracter este o protein structural sau o enzim. Conceptul clasic "o gen un caracter" a devenit "o gen (ADN) o protein", postulnd c informaia ereditar coninut n ADN se exprim prin sinteza unor proteine specifice, care stau la baza caracterelor. Acest proces, care reprezint n fond funcia genei, este precis coordonat i reglat n raport cu programul dezvoltrii ontogenetice a organismului sau de ctre necesitile sale n anumite condiii metabolice, impuse de mediu.

A. CONCEPIA CLASIC DESPRE FUNCIA GENEI1. GENA UNITATE DE FUNCIE I MUTAIE.

Relaia "o gen un caracter" este axioma fundamental a geneticii clasice. Aceast "dogm" poate fi demonstrat prin studiul mutaiilor: modificarea genei va produce o modificare ereditar a caracterului determinat de gen. Exemplele sunt numeroase i cunoscute. S reamintim c pe cromosomul X exist o gen care determin prezena pigmentului melanic n iris i retin; mutaia ei are drept consecin absena melaninei i albinismul ocular.

Orict ar prea de paradoxal la prima vedere, mutaia "developeaz" existena unei gene normale i d informaii privind modul ei de aciune i de transmitere. Geneticianul depinde de apariia mutaiilor pentru "a nva" cum se produce i se transmite un caracter normal. De aceea, deseori denumirea unei gene normale s-a fcut printr-o abreviere de 2-3 litere a efectului genei mutante (denumit n limba englez) iar numele locusului, dup prima mutaie detectat1. De ex:

- CF de la "cystic fibrosis" (sau mucoviscidoz);- FH de la "familial hypercolesterolemia";- PKU de la "phenylketonuria";- NF1 de la "neurfibromatosis" tip I;- DMD de la Duchenne muscular dystrophy;- PKD de la polycystic kidney disease, .aGena normal evideniat prin mutaie (denumit uneori "gen de tip slbatic", pentru a

sublinia forma "standard" sub care se gsete deobicei n natur), se noteaz cu semnul + dup denumirea efectului fenotipic al mutaiei; n funcie de modul de transmitere genele dominante se scriu cu majuscule, iar cele recesive cu litere mici. n prezent, aciunile de "descifrare" a genomului uman au impus utilizarea unei terminologii i nomenclaturi unice (internaionale) a genelor (care se regsete n "GENATLAS", accesibil n linie la adresa http://www.infobiogen.fr).

1

De ex., la Drosophila, locusul pentru gena normal (de tip slbatic) ce d obinuit culoarea roie a ochilor a fost numit "white" (prescurtat w+) deoarece prima mutant descris produca ochi de culoare alb.

1

EXPRESIA INFORMAIEI EREDITARE (FUNCIA GENEI)

Se poate concluziona c n toate studiile de genetic clasic se pleca de la caracter la gen iar gena era considerat unitatea de functie i de mutaie. Relaia "o gen un caracter", care reflect n esen relaia "genotip fenotip", (vezi capitolul 1.B.3), este ns mult mai complex, deoarece: alturi de caracterele "monofactoriale" sau monogenice, produse de o singur pereche de gene

alele, exist numeroase caractere poligenice sau "multifactoriale", determinate prin aciunea mai multor gene nealele i influenate de factori de mediu; de obicei caracterele monogenice sunt caractere calitative, iar cele poligenice / multifactoriale sunt cantitative;

n unele cazuri o gen poate avea efecte multiple i poate determina mai multe caractere; acest fenomen se numete pleiotropie; n alte cazuri dou sau mai multe gene particip la realizarea unui caracter;

exist numeroase interaciuni alelice, nonalelice i cu mediul - care influeneaz efectul genei, momentul sau tipul celular n care se exprim o gen;

mutaii ale unor gene diferite se pot manifesta fenotipic identic sau asemntor; acest fenomen se numete heterogenitate genetic.

2. POLIGENIA

Anumite caractere fenotipice complexe, normale sau anormale) sunt produse prin aciunea mai multor gene nealele (situate n loci diferii) care au efecte cantitative, mici i aditive (cumulative). Acest fenomen se numete poligenie. n acest caz "abaterea" de la regula "o gen un caracter" este aparent, deoarece fiecare gen determin o parte din caracter. Numrul de gene care particip la realizarea caracterului este necunoscut; el variaz la persoane diferite i de aceea distribuia caracterului respectiv n populaie va corespunde unei curbe normale, de tip Gaussian (distribuie continu). n figura 4.1 sunt prezentate dou caractere normale - talia i tensiunea arterial sistolic care prezint, ntr-o populaie neselecionat, o distribuie continu.

Trebuie s subliniem dou caracteristici eseniale ale poligeniei: genele care produc caracterul acioneaz independent unele de altele; ntre ele nu exist

relaii de dominan-recesivitate sau epistazie; expresia fenotipic a genelor poate fi frecvent influenat de factori de mediu; de aceea

caracterele produse prin aciunea combinat a mai multor factori genetici i factori negenetici se numesc curent caractere multifactoriale. Acest termen este mai larg i nu trebuie echivalat cu cel de poligenie; acesta are un sens mai restrictiv i nu implic o component de mediu.

Caracterele multifactoriale normale (talia, tensiunea arterial, culoarea pielii, inteligena .a.) sau anormale (numeroase boli comune, malformaii congenitale izolate / unice, unele forme de cancere etc.) sunt frecvente i ele vor fi discutate pe larg ntr-un capitol distinct. Vom sublinia totui aici c n aceste caractere multifactoriale componenta genetic este deseori reprezentat totui de un numr mic de gene, ce prezint mai multe variante alelice n populaie (unele dintre ele avnd efecte calitative, majore); n acest caz se vorbete de oligogenie.

3. PLEIOTROPIA

Prin pleiotropie (sau polifenie) definete fenomenul n care o singur gen (dominant) sau o pereche de gene (recesive) produc efecte fenotipice diverse n mai multe sisteme de organe i funcii. n genetica clinic se ntlnesc numeroase cazuri de pleiotropie, ce reprezint diferite sindroame2. Un frumos exemplu l reprezint sindromul Marfan (vezi i caseta 4.1). Acesta se caracterizeaz prin trei categorii de semne:

2

Prin sindrom se nelege un ansamblu de semne / simptome care definesc o anumit entitate clinic sau un anumit mecanism patogenic.

2

modificri scheletice: membre lungi, degete lungi i fine (arahnodactilie), hiperlaxitate articular (ce produce frecvent luxaii), deformaii ale coloanei vertebrale (cifoz, scolioz) sau ale sternului (pectus carinatus sau excavatum) etc;

modificri oculare: subluxaie/ectopie de cristalin, miopie sau hipermetropie forte, megalocornee etc.;

modificri cardiovasculare: anevrisme (dilataii) ale aortei, prolaps de valv mitral etc.

CASETA 4.1 OMIM 154700

Sindromul Marfan

Definiie: Afeciune a esutului conjunctiv transmis autosomal dominant, cu expre-sivitate variabil, i manifestat sub form de anomalii oculare, articulare i cardio- vasculare.

Inciden: 1/10.000, fr predilecie geografic sau etnic.Manifestri clinice: Boala se manifest cu anomalii n trei sisteme major: scheletic, ocular,

cardio-vascular; mai rar se ntlnesc afectri cutanate, pulmonare i durale. Anomaliile scheletice includ: talie nalt disproporionat (pe seama membrelor), arahnodactilie, deformri ale sternului, scolioz, laxitate i hipermobilitate articular. Anomaliile oculare sunt reprezentate de miopie, subluxaie de cristalin, cornee plat, hipoplazie irian. Malformaiile cardio-vasculare includ: prolaps de valv mitral, insuficien aortic, dilataia i ruptura aortei ascendente.

Multe semne ale sindromului Marfan se dezvolt cu vrstaPatogenie: n sindromul Marfan se produce prin mutaia genei FBN1 - o alterare a

structurii esutului conjunctiv, care explic manifestrile sale clinice. Gena FBN1 codific fibrilina 1, o glicoprotein extracelular ce formeaz microfibrile n structura esutului conjunctiv. Mutaiile FBN1 sunt foarte variate i produc boala printr-un fenomen de dominan negativ (la heterozigoii An, fibrilina modificat produs de gena A, inhib formarea de microfibrile dei gena n codific o fibrilin normal). Circa 20 % din cazuri sunt produse de mutaii noi. Interesant de subliniat c unele mutaii produc sindroame nrudite cu sindromul Marfan: arahnodactilia familial, fenotipul MASS (de la mitral, aorta, skeletal, skin), ectopia de cristalin AD.

Genetic: gena FBN1 este localizat pe 15q15 i se transmite autosomal dominant. Bolnavii au risc de 50% de a avea un copil afectat cu sindrom Marfan.

Diagnostic: Pentru afirmarea diagnosticului de Sindrom Marfan este necesar ndeplinirea urmtoarelor condiii: Cazul index: criterii majore n cel puin dou sisteme diferite i implicarea unui al treilea; Membri ai familiei: prezena unui criteriu major i anamneza familial pozitiv

Diagnostic prenatal, screening neonatal: posibil n cazurile cu risc, prin analiza mutaiei sau studii de nlnuire. Nu se folosete pe scar larg.

Prognostic: rezervat datorit afectrii cardio- vasculare.Tratament: medical (beta blocante, pentru a ncetini progresia dilataiei aortice; profilaxie

cu antibiotice, pentru profilaxia unei endocardite) i chirurgical pentru complicaiile cardio- vasculare i osteo- articulare.

Toate modificrile fenotipice din sindromul Marfan sunt rezultatul unei singure mutaii genice, ce se transmite autosomal dominant. Aparent, n acest caz exist o abatere de la regula "o gen un caracter" dar explicaia efectelor multiple produse de o singur gen este (astzi) simpl: mutaia genic determin un defect n structura primar a fibrilinei, component major a esutului conjunctiv. Manifestrile multiple, produse prin alterarea esutului conjunctiv n diferite teritorii, au o legtur patogenic (un mecanism comun). n acest caz pleiotropia este relaional. ntr-un alt sindrom pleiotrop, sindromul Treacher-Collins, perturbarea dezvoltrii fetale a celui de al doilea arc branhial va produce modificri regionale corelate n structurile ce se

3

dezvolt din acest arc: ureche, maxilar superior i mandibul; pleiotropia este evident relaional3.

Pentru numeroase afeciuni pleiotrope conexiunea dintre diferite manifestri nu este nici evident i nici bine neleas. n aceste cazuri se vorbete de o pleiotropie nerelaional. De ex., n sindromul Bardet-Biedl nu exist (nc) o legtur patogenic evident ntre diferitele sale semne: polidactilie, obezitate, surditate, hipogonadism, retinit pigmentar i retard mintal. Aceast "secven" natural de modificri (care apar succesiv, la vrste diferite) este produs ns de o singur cauz: o mutaie recesiv a unei perechi de gene alele (homozigot). Progresul posibilitilor actuale de explorare i analiz va elucida probabil mecanismul comun al manifestrilor multiple n pleiotropia nerelaional. Recent, n unele sindroame considerate pleiotrope s-au evideniat microdeleii cromosomice (vezi capitolul 10.C.3); de ex. sindromul WAGR (Wilms tumor-aniridia-genital defects-retardation syndrom produs de o microdeleie n regiunea 11p13). Pierderea mai multor gene diferite dar vecine, situate n aceiai regiune cromosomic, ar explica diversitatea i lipsa de corelaie a manifestrilor clinice. Aceste cazuri numite i "sindroame ale genelor contigue" (sau nvecinate) ies ns din "sfera" pleiotropiei, care se refer, prin definiie, la efectele multiple ale unei singure gene.

Trebuie s subliniem faptul c n practica medical sindroamele pleiotrope ridic probleme dificile de diagnostic pentru c semnele (care n ansamblu lor pun diagnosticul de sindrom) nu sunt prezente totdeauna n totalitatea lor (fie c unele nu se manifest dect la anumite vrste, fie c pur i simplu nu apar, datorit unei expresiviti variabile).

4. INTERACIUNILE GENEI

Expresia fenotipic a unei gene poate depinde de: interaciunile cu gena alel (situat n acelai locus pe cromosomul omolog), influena altor gene i/sau aciunea mediului.

4.1. INTERACIUNILE ALELICE

Genele alele, situate n loci omologi, pot fi identice (la homozigoi) sau diferite (la heterozigoi). n stare heterozigot (A/a)4 manifestarea genelor alele depinde de relaiile "de for" care se stabilesc ntre ele. Uneori se manifest fenotipic numai una din genele alele i atunci gena i caracterul corespunztor (A) sunt numite dominante. Gena (a) care nu se exprim n aceast situaie se numete recesiv; ea se manifest numai n stare homozigot (a/a) sau la hemizigoi XaY). Alteori, la heterozigoi se manifest fenotipic ambele gene alele; n aceast situaie genele sunt codominante. De ex., intre alelele A1, A2, B i 0 ale locusului grup sanguin AB0 se stabilesc urmtoarele relaii de dominan i recesivitate: genele A1, A2 i B sunt dominante fa de gena 0. De aceea, genotipurile A1/o, A2/o i B/o vor corespunde grupelor A1, A2 i respectiv B; fenotipul 0 va fi determinat de genele recesive o/o; gena A1 este dominant fa de A2 i genotipil A1/A2 va determina fenotipul A1; genele A1, A2 i B sunt codominante ntre ele, producnd fenotipul A1B sau A2B.

Este important de precizat c noiunile de dominan i recesivitate sunt valabile pentru caracter, se refer deci la fenotip: genele sunt clasificate ca dominante sau recesive pe baza expresiei lor fenotipice. Totui, aa cum vom vedea mai departe (Capitolul 4.B.1), la nivel molecular sau biochimic nu se poate face nici o distincie ntre genele "dominante" sau "recesive", deoarece de cele mai multe ori ambele tipuri de gene se manifest, codific o protein.

3 Vom vedea mai trziu c exist i alte explicaii patogenice ale sindroamelor cu pleiotropie; de ex. interferena unor ci metabolice interconectate, ramificate.4 La scrierea concis a unui genotip (de ex. A/a; AB/ab) linia ce separ simbolurile genelor ne arat c acestea sunt dispuse, separate, pe cromosomi omologi distinci.

4

n sfrit, vom meniona c dominana poate fi complet, atunci cnd fenotipul heterozigotului A/a este identic cu cel al homozigotului A/A (de ex., n sindromul Marfan) sau incomplet (parial)5, cnd fenotipul heterozigotului A/a este intermediar ntre cel al homozigoilor A/A i a/a; deaceea n unele boli cu transmitere dominant (de ex., hipercolesterolemia familial (vezi capitolul 11.E.1) homozigoii A/A sunt mult mai grav afectai dect heterozigoii A/a.

4.2. INTERACIUNILE NEALELICE Expresia fenotipic a unei gene nu depinde ntotdeauna numai de gena nsi, fiind

deseori influenat de aciunea altei/altor gene (nealele), deci de "fondul genetic" al organismului, la care se poate aduga i efectul unor factori de mediu. Aceste aciuni determin gradul de penetran i expresivitate a unei gene sau sunt implicate n fenomenul de epistazie.

a. Penetrana definete probabilitatea unei gene mutante de a se manifesta fenotipic (indiferent de intensitate). Este o noiune cantitativ (de tipul "tot sau nimic") valabil n special pentru genele dominante6, n stare heterozigot. Multe gene au o penetran complet, puternic, i se manifest ori de cte ori exist n genotip. Exist ns gene mutante care au o penetran incomplet, redus. n aceste cazuri, unele persoane (de ex. III.3 din figura 4.2) posed gena anormal, ce produce camptodactilia, care nu se poate manifesta fenotipic ("nonpenetran") dar se transmite la urmai, unde se exprim mai mult sau mai puin complet; se realizeaz astfel "un salt" peste o generaie.

Cauzele penetranei incomplete, reduse, nu sunt clare dar se discut efectul antagonic al unor gene (supresoare sau epistatice) i/sau al unor factori de mediu. Asupra fenomenului de penetran vom reveni mai pe larg ulterior (vezi capitolul 5.D.5); vom preciza ns c penetrana este un termen clinic ce poate fi influenat de vrst i sex, precum i de capacitatea de explorare a fenotipului pacientului.

b. Expresivitatea reprezint gradul (intensitatea sau severitatea) de manifestare clinic (fenotipic) a unei gene mutante i penetrante la bolnavii din aceeai familie (figura 4.2) sau din familii diferite. Expresivitatea, spre deosebire de penetran, este o noiune calitativ.

Deseori genele dominante cu efecte multiple (pleiotrope) se manifest diferit la persoane cu acelai genotip (A/n). n aceste cazuri expresivitatea variabil poate interesa: spectrul semnelor (anomaliilor) manifeste, severitatea, vrsta de debut a bolii sau a unor elemente componente. La bolnavii diferii din aceeai familie se pot ntlni forme complete de boal, forme pariale sau fruste (oligo- / monosimptomatice). De ex., la bolnavii cu sindrom Marfan pot s nu apar toate anomaliile celor trei sisteme afectate (schelet, ochi, aparat cardiovascular) sau severitatea clinic poate s fie diferit. De menionat c expresivitatea variabil este frecvent n bolile dominante autosomale pleiotrope, dar se poate ntlni la toate bolile ereditare, indiferent de modul de transmitere.

Cauzele expresivitii variabile nu sunt deobicei cunoscute (vezi i 5.D.5). Se invoc factori de mediu ce influenteaz intensitatea de manifestare a bolii, interaciunea genei boal cu alte gene, numite modificatoare i n final mutaii diferite (ca localizare si efecte) n aceiai gen (heterogenitate alelic). O dovad indirect a existenei genelor modificatoare o reprezint expresia mai frecvent sau exclusiv a unor caractere (determinate de gene autosomale) la un anumit sex. De ex: calviia frontal, guta i keratoza palmoplantar - mai frecvente la brbai i aplazia malului dentar sau cderea precoce a dinilor - mai frecvente la femei.

Aa cum am precizat, penetrana i expresivitatea unor gene mutante sunt termeni clinici. Cunoaterea lor are o deosebit importan practic deoarece poate influena calitatea

5

Dominana incomplet se mai numete semidominan.6

Se consider c fenomenul de penetran poate interesa i gene recesive; n aceast situaie pacientul homozigot (aa) care ar trebui s manifeste boala este sntos i greu de deosebit de heterozigotul (Na) normal.

5

diagnosticului i, funcie de aceasta, corectitudinea sfatului genetic: neindentificarea prezenei unei gene mutante (nonpenetran sau manifestare oligo / monosimptomatic) la o persoan purttoare va duce la o evaluare greit a riscului de recuren la urmai.

Un alt fenomen de interaciune genic se refer la situaiile n care dou sau mai multe gene interacioneaz n realizarea normal a unui caracter; dac una din gene sufer o mutaie ea suprim efectul celeilalte / celorlalte gene. Fenomenul n care o gen interfereaz / suprim expresia fenotipic a unei alte gene nealele se numete epistazie. De exemplu, dezvoltarea i funcia normal a aparatului auditiv este dependent de implicarea a dou perechi de gene: una (D/D) controleaz formarea normal a cohleei, iar cealalt (E/E) - dezvoltarea nervului auditiv. Mutaia uneia din aceste gene (d/d sau e/e) produce surditate chiar dac cealalt pereche de gene este normal; o cohlee normal (D/D) nu poate funciona dac nu se dezvolt nervul acustic (e/e) i invers nedezvoltarea cohleei (d/d) determin surditate (de percepie) chiar dac nervul este integru (E/E). Un alt exemplu de epistazie l reprezint statusul secretor, definit prin capacitatea unor indivizi ("secretori") de a elimina / secreta antigenele de grup sanguin ABO n secreii (saliv, lacrimi, lichid spermatic etc.). Aceast proprietate este determinat de o gen dominant Se/- ; n stare recesiv (se/se) nu se produc aceste antigene si indivizii sunt "nesecretori", chiar dac exist genele AB0.

Epistazia poate fi realizat fie de prezena unei gene supresoare (epistatice) n stare recesiv (aa), fie de prezena unei gene dominante (An) i de aceea exist o epistazie recesiv, n primul caz, sau o epistazie dominant, n al doilea caz. Indiferent de tip se pune firesc ntrebarea: cum poate o gen s afecteze expresia altor gene? n exemplul surditii rezult evident c dezvoltarea anormal a caracterului (aparat auditiv, n acest caz) depinde de dezvoltarea /realizarea ordonat a unor pri anatomice componente (cohlee; nerv acustic), fiecare controlat de o gen distinct. n alte cazuri de interaciune genic este vorba de o cale metabolic simpl sau ramificat, n care fiecare etap este controlat de o enzim distinct, codificat de o anumit gen; mutaia unei gene i absena unei enzime blocheaz calea metabolic i mpiedic apariia produsului final, chiar dac celelalte gene i enzime sunt normale. n cazul caracterului secretor gena Se/- i genele ABO acioneaz n diferite etape ale formrii antigenelor de grup sanguin ntr-o form hidrosolubil (vezi 4.B.5).

4.3. INTERACIUNILE GENELOR CU MEDIUL Nu trebuie s uitm c activitile tuturor genelor au loc n mediul celular, care la rndul

lui este influenat de factori ai mediului extern. De aceea, gradul de penetran i expresivitate a multor gene depinde, ntr-o oarecare msur, de factorii de mediu (fizici sau chimici). La Drosophila, variaiile de temperatur pot reduce penetrana unor gene de la 100% la zero sau pot influena intensitatea lor de expresivitate. La om, expresivitatea variabil a polidactiliei este foarte probabil condiionat de mediu: faptul c o persoan poate avea un deget suplimentar complet la o mn i nici unul sau numai un rudiment la cealalt mn sau la picior pledeaz pentru aciunea unui factor de mediu uterin care a interferat expresivitatea genei.

S ne reamintim c efectele nocive ale fenilcetonuriei (PKU) se manifest numai atunci cnd se acumuleaz fenilalamin prin aport alimentar (vezi capitolul 1.B.2.1.c); eliminarea acestui aminoacid din alimentaie previne retardul mintal pe care-l poate cauza expresia complet a genei pentru PKU. Rspunsul variabil al diferitelor persoane la anumite medicamente (farmacogenetica), reprezint un alt exemplu convingtor al interaciunii dintre gene i factorii de mediu. Este deja cunoscut (vezi capitolul 1.B.2.3.b) efectul antimalaricelor, sulfamidelor sau al consumului de bob la persoanele cu deficien n G6PD: absena enzimei, de obicei nemanifest, devine evident (printr-o criz de anemie hemolitic) dup aciunea acestor factori de mediu.

5. HETEROGENITATEA GENETIC

6

Numeroase boli ereditare umane, indiferent de modul lor de transmitere, prezint o heterogenitate genetic. Termenul se refer de regul la situaia n care mutaii genice (genotipuri) diferite determin un fenotip identic sau asemntor. Heterogenitatea poate fi produs de mutaii n loci diferii (heterogenitate de locus sau nonalelic) sau mutaii diferite n acelai locus (heterogenitate alelic) sau de ambele.

a. Heterogenitatea de locus / nonalelic poate fi uor demonstrat prin analiza arborilor genealogici ai diferitelor familii n care o boal genetic se manifest identic; aceast analiz genealogic va evidenia modaliti diferite de transmitere ale aceleiai afeciuni, dovedind existena unor mutaii diferite n loci diferii. Ele vor fi apoi confirmate prin studiul ADNDe ex., retinita pigmentar - o cauz frecvent de afectare i pierdere a vederii, datorat degenerrii retiniene nsoit de o distribuie anormal a pigmentului n retin - se prezint sub forme de transmitere ereditar diferite: autosomal dominante (12 forme), autosomal recesive (5 forme) i legat de X (trei forme). Au fost localizate peste 20 de regiuni cromosomice7 ce conin loci care produc retinita pigmentar (dintre acetia 8 au fost deja identificai).

Exist multe alte exemple de heterogenitate de locus: albinismul, surditatea congenital, hipotiroidia congenital etc. n prezent, analiza genotipic molecular (la nivel ADN) a demonstrat c multe afeciuni cu un mod unic de transmitere pot fi heterogene. De exemplu, nanismul hipofizar, osteogenesis imperfecta, rinichiul polichistic etc. pot fi produse de mutaii n loci diferii (tabelul 4.1). Evident, n aceeai familie toi bolnavii vor avea acelai genotip sau, mai exact, aceeai mutaie.

Tabel 4.1 Exemple de boli n care exist heterogenitate de locus

Boala Descriere Cromosomii pe care sunt localizai locii-

boal

Boala Alzheimer Demen progresiv 1, 4, 19, 21Boala Charcot-Marie-Tooth Neuropatie periferic 1, 5, 8, 11, 17, XBoala polichistic renal a adultului (ADPKD)

Acumulare de chisti renali ducnd la insuficien renal cronic

16, 4

Cancerul colorectal nonpolipozic ereditar (AD)

Cancer colorectal 2p, 2q, 3, 7

Cancer de sn ereditar (AD) Predispoziie la cancer de sn sau ovar aparut precoce

13, 17

Melanomul familial Cancer piele 1, 9Osteogenesis imperfecta Boala oaselor de sticl 7 i 17Retinita pigmentar Retinopatie progresiv i pierderea vederii > 20 regiuni

cromosomice Scleroza tuberoas Convulsii, angiofibroame faciale, macule

hipopigmentate pe piele, retard mintal9, 16

b. Heterogenitatea alelic este reprezentat de mutaii diferite n acelai locus (aceeai gen) care produc fenotipuri asemntoare clinic, deosebite doar prin intensitatea de manifestare a bolii. Un exemplu caracteristic l reprezint distrofia muscular Duchenne i boala Becker - afeciuni caracterizate prin atrofie muscular progresiv i inexorabil; ele sunt determinate de mutaii diferite ale aceleiai gene (locus), situat pe cromosomul X. Dei efectele fenotipice sunt asemntoare, boala Becker este o form moderat de distrofie muscular. Explicaia acestui fenomen este c unele alele nu abolesc complet sinteza i deci funcia unei proteine.

7 Dac adugm i formele sindromice de retinit pigmentar (asociat cu alte anomalii / manifestri) exist peste 30 de boli diferite ce se manifest cu retinit pigmentar

7

Exist numeroase alte exemple de heterogenitate alelic: mucoviscidoza (forme cu sau fr insuficien pancreatic), hemofilia A, beta-talasemia, neurofibromatoza, surditatea, boala Tay-Sachs etc. Se spune c heterogenitatea alelic este o regul n bolile mendeliene la om. De aceea n multe boli recesive persoanele afectate nu au genotipuri pur homozigote; ele sunt heterozigoi compui deoarece au dou alele mutante diferite (a1/a2).

n unele afeciuni genetice (de exemplu, mucopolizaharidozele, homocistinuria, osteogenesis imperfecta, surditatea congenital etc.) se ntlnesc ambele forme de heterogenitate, alelic i nonalelic (de locus). Un exemplu sugestiv l reprezint sindromul Ehlers-Danlos (SED.) (vezi capitolul 11.B.5), o afeciune a esutului conjunctiv (produs printr-un defect n structura colagenului) caracterizat prin hiperelasticitate cutanat, hiperlaxitate articular i fragilitate tisular crescut. SED prezint mai multe subtipuri clinice definite i prin alte semne clinice, care le difereniaz. n familii diferite SED se transmite diferit - autosomal dominant sau recesiv, legat de X - demonstrnd o veritabil heterogenitate de locus. Analiza clinic i molecular relev cel puin 10 tipuri distincte de SED i o ampl heterogenitate alelic; exist, spre exemplu, ase forme autosomal dominante, din care cel puin o parte sunt produse de mutaii diferite ale aceluiai locus (variante alelice).

c. Heterogenitatea clinic. Trebuie s menionm c heterogenitatea alelic nu produce totdeauna fenotipuri asemntoare. Din contra, mutaii diferite ce intereseaz aceeai gen (n exoni diferii) pot avea un aspect clinic variat, producnd uneori chiar boli diferite; acest fenomen se numete heterogenitate clinic sau fenotipic. De exemplu, mutaii diferite n gena pentru globin produc sicklemia (AR), talassemia (AR), hemoglobina instabil (AD) i methemoglobinemia (AD). Sindromul Hurler i sindromul Scheie sunt dou forme diferite de mucopolizaharidoz (boal de stocaj a mucopolizaharidelor n lizozomi) dei sunt produse de variante alelice ale aceleiai gene (care afecteaz aceiai enzim, alfa-L-iduronidaza) distinte. Un alt exemplu: unele mutaii n gena RET (11q12) (ce codific un receptor tirozinkinazic, implicat n migrarea celulelor din creasta neural) care se nsoesc de pierderea funciei genei, produc o insuficient dezvoltare a ganglionilor colonici i secundar distensia colonului, tulburri de motilitate i constipaie sever cronic (boala Hirschprung); alte mutaii n aceiai gen, care se nsoesc de ctig de funcie, produc trei forme de cancer ereditar al glandelor tiroid i suprarenal (neoplaziile endocrine multiple MEN2A i MEN2B precum i cancer medular tiroidian); un al treilea grup de mutaii n gena RET produc ambele boli la acelai individ. Din exemplele prezentate mai sus rezult c heterogenitatea clinic este frecvent i important; explicaia cea mai simpl a acestui fenomen este c exoni i, implicit, domenii distincte ale unei proteine pot ndeplini funcii diferite, iar prin mutaii variate n aceeai gen sunt afectate aceste funcii, rezultnd boli diferite.

d. Importana practic a fenomenului de heterogenitate genetic i clinic. Fenomenul de heterogenitate genetic, frecvent intlnit n eredopatologie, are o deosebit

importan practic pentru acurateea diagnosticului clinic i etiologic, tratamentul difereniat al unei manifestri clinice produs de genotipuri diferite i, bineneles, pentru realizarea unui sfat genetic corect (n funcie de modul diferit de transmitere). Iat succint cteva exemple i deci argumente care demonstreaz importana practic a cunoaterii acestui fenomen. Tratamentul. n cazul unei afeciuni cu heterogenitate genetic (de ex., hemofilia A i B;

hiperfenilalaninemie) diagnosticul va fi incomplet dac nu se precizeaz tipul etiopatogenic i acest lucru poate avea consecine negative n tratament; aplicarea unei terapii identice unor boli genotipic diferite, dar cu aceeai manifestare clinic, risc s fie deseori fr succes. De exemplu, hiperfenilalaninemia, care produce secundar debilitate mintal, poate fi cauzat de o deficien a enzimei fenilalaninhidroxilaza (n PKU, forma clasic) sau de unele anomalii ale metabolismului biopterinei; PKU poate fi tratat cu succes prin restricia dietetic a fenilalaninei n timp ce n a doua situaie acelai tratament este ineficace.

8

Prognosticul bolilor cu heterogenitate alelic (de ex., distrofie muscular Duchenne i distrofie muscular Becker) este deasemeni diferit.

Sfatul genetic. Riscul de recuren a retinitei pigmentare este 50% n formele autosomal dominante, 25% n cazurile autosomal recesive i 50% la biei n formele recesive legate de X; fr precizarea modului de transmitere, deci a diagnosticului etiologic, sfatul genetic n retinita pigmentar nu poate fi corect realizat.

B. CONCEPIA ACTUAL DESPRE FUNCIA GENEI1. GENELE CONTROLEAZ SINTEZA PROTEINELOR

Explicnd funcia genei prin relaia "o gen un caracter", genetica clasic nu a putut rspunde la ntrebarea: "cum acioneaz genele n formarea, dezvoltarea i funcia organismului?".

Prima formulare a unui rspuns corect aparine unui medic englez sir Archibald Garrod, care postuleaz o legtur specific ntre gene i proteine. n 1902, Garrod descrie alcaptonuria, o boal ereditar care se transmite n succesiunea generaiilor n concordan cu legile lui Mendel. Bolnavii sufer de artrit i urina lor devine neagr dup expunerea la aer. Garrod a presupus c boala este determinat de un bloc biochimic produs de lipsa enzimei care metabolizeaz acidul homogentizic (figura 4.3). Simptomatologia bolii este rezultatul acumulrii acidului homogentizic n organism ca urmare a "barajului" cii metabolice. Prin acelai mecanism el explic mecanismul altor trei boli ereditare, inclusiv albinismul unde a descris un bloc metabolic pe calea de transformare a tirozinei n melanin. Garrod a stabilit astfel o relaie clar ntre gene i enzime i a introdus n medicin conceptul de "erori nnscute de metabolism" (prefigurnd era patologiei molecuare).

Din pcate, ca i n cazul lui Mendel, importana remarcabilelor cercetri de genetic ale lui Garrod n-a fost perceput nici de medici i nici de biologi. Abia peste 40 de ani, experienele efectuate de Beadle i Tatum la Neurospora crasa au demonstrat fr echivoc relaia "o gen o enzim", aducndu-le autorilor un binemeritat Premiu Nobel (1958). Beadle i Tatum (1944) au studiat metabolismul triptofanului i argininei la Neurospora crasa (mucegaiul alb). Ei au stabilit etapele biosintezei triptofanului din arginin i au demonstrat c fiecare etap este catalizat de o enzim diferit. Apoi, au iradiat sporii ciupercii i cultivndu-i pe medii nutritive au obinut mai multe variante (mutante); ele nu puteau sintetiza triptofanul deoarece una din etape era blocat, fie prin lipsa enzimei, fie prin inactivarea ei, produs de modificarea structurii sale. Toate aceste modificri erau ereditare, reprezentnd consecine ale mutaiilor produse prin iradiere. Rezult evident c genele i exercit efectul lor fenotipic prin controlul sintezei unor enzime (proteine).

Numeroase alte dovezi obinute la microorganisme, plante, animale i om au demonstrat incontestabil c genele i exercit controlul asupra organismului prin influena lor asupra formrii proteinelor. Prin enorma lor diversitate i complexitate structural, ca i prin rolul lor structural, catalitic (enzime) sau reglator, proteinele determina aproape toate caracterele organismului. Relaia "o gen o enzima (protein)" a devenit n scurt timp "o gen un polipeptid", deoarece unele proteine formate din dou sau mai multe polipeptide (de ex., hemoglobina) sunt codificate de gene distincte, care controleaz fiecare sinteza unui polipeptid.

Relaia "o gen - un polipeptid" nu este general valabil deoarece unele gene codific diferite tipuri de ARN; de aceea gena a fost definit ca un segment de ADN ce determin sinteza unui produs funcional. Genele care codific proteine sunt numite i gene structurale.

2. STRUCTURA PROTEINELOR

ntruct proteinele reprezint "suportul" biochimic al caracterelor noastre fenotipice i sinteza lor este determinat genetic, pentru a nelege mecanismul complex al relaiei "o gen

9

o protein" sunt utile cteva noiuni sintetice despre stuctura acestor compui organici, cu rol vital n organism.

Proteinele sunt alctuite din una sau mai multe catene polipeptidice, formate prin polimerizarea a 20 de tipuri de aminoacizi. Dei diferii n complexitatea lor, ei au la baz o structur comun de tipul:

HH2N C COOH

RRadicalul R difer de la un aminoacid la altul si determin structura i proprietile aminoacidului. Aminoacizii se unesc ntre ei prin legturi peptidice (figura 4.4) formnd o caten liniar polipeptidic; aceasta are "o coloan vertebral" (n zig-zag) alctuit din CN, pe care se fixeaz lateral i n mod alternativ gruparea R (figura 4.5). Numrul, tipul i secvena aminoacizilor n lanul polipeptidic alctuiesc structura primar a polipeptidului (proteinei).

Secvena aminoacizilor dintr-o protein reprezint elementul esenial al structurii sale, deoarece: este unic, constant, specific fiecrei proteine i este determinat genetic. Secvena aminoacizilor determin funcia proteinei i antigenicitatea ei deoarece prin interaciunile dintre aminoacizii situai n diferite situsuri din structura polipeptidului se realizeaz structurile spaiale, tridimensionale, ce determin activitatea sa biologic.

Prin legturi de hidrogen ntre aminoacizii nvecinai se formeaz, n anumite poriuni/zone ale proteinei structuri secundare de tip alfa (n elice) sau beta (foaie pliat) (figura 4.6). Prin interaciuni ntre aminoacizi din diferite poziii ale catenei aceasta capt spontan o configuraie tridimensional, spaial, ce reprezint structura teriar a polipeptidului (figura 4.7).. Unele proteine au dou sau mai multe catene identice sau diferite, ce formeaz singure sau mpreun cu alte molecule neproteice complexe macromoleculare (structura cuaternar) Configuraia spaial caracteristic a unei proteine determin activitatea ei funcional8. De notat c proteinele funcionale nu sunt totdeauna sintetizate n forma lor activ. Ele sufer modificri post-translaionale care determin activarea proteinei.

Aminoacizii care interacioneaz ntre ei pentru a forma structura tridimensional, biologic activ, sau care alctuiesc aa numitele "situsuri funcionale ale proteinei sunt deosebit de importani; nlocuirea lor, n urma unor mutaii, duce la o protein anormal (cu o structur spaial modificat) i la pierderea activitii proteinei. nlocuirea altor aminoacizi, neimplicai n legturile spaiale sau n situsul funcional este mai puin important i poate produce variante proteice normale.

3. GENELE STRUCTURALE DETERMIN SECVENA AMINOACIZILOR N PROTEIN

Genele care codific proteine conin mesajul codificat necesar pentru asamblarea specific (ntr-o anumit ordine) a aminoacizilor n protein. Aceast relaie a fost elegant demonstrat prin studiul mutaiilor care produc diferite tipuri de hemoglobin anormal i, n special, prin cercetarea drepanocitozei sau sicklemiei, o anemie hemolitic cu hematii n form de secer ("falciforme").

Drepanocitoza (sicklemia) este o boal genetic, cu transmitere autosomal recesiv, frecvent n populaia originar din Africa tropical (1:500 n.n), precum i n bazinul Mediteranean, Orientul Mijlociu i India. Aceast distribuie geografic caracteristic se explic prin avantajul selectiv fa de malarie pe care l au heterozigoii sntoi (1 : 25 n.n) protejai de formele grave de paludism.

Boala se manifest la homozigoi (a/a) printr-o anemie hemolitic sever, produs prin distrugerea hematiilor cu form anormal "n secer" (figura 4.8.a); aceste hematii se formeaz

8 Prin diverse tratamente fizico-chimice legturile dintre diferii aminoacizi ce formeaz structura teriar se pot rupe i proteina "denaturat" i pierde activitatea biologic.

10

n condiiile scderii tensiunii (concentraiei) oxigenului n anumite teritorii capilare. Formele acute se nsoesc de dureri n mini / picioare sau alte organe (splin, mezenter, rinichi etc.), produse de microinfarcte prin ocluzia capilarelor de ctre hematiile n secer, care au o deformabilitate redus. Hemoliza se asociaz cu splenomegalie i infarcte splenice recurente care determin pierderea funciei ei imune i cu susceptibilitatea crescut la unele infecii bacteriene (pulmonare), cauza principal de deces. Heterozigoii (N/a) prezint "trstura sicklemic"; obinuit ei sunt sntoi, dar scderea brutal a concentraiei O2 (altitudine) poate produce prin "sicklizarea" hematiilor, o anemie hemolitic acut i infarcte splenice.

n 1949, Pauling i colaboratorii si au demonstrat existena unei anomalii a hemoglobinei din eritrocitele "n secer", numit HbS, care se deosebete electroforetic de HbA (normal) deoarece, datorit unei mutaii genice, moleculele lor de beta-globin sunt diferite (figura 4.8.b). Cercettorii au stabilit c la persoanele heterozigote (N/a), cu trstur sicklemic, exist un amestec de HbA i HbS. Ulterior (1956), Ingram a descoperit c HbS are unul din cei 146 de aminoacizi ai catenei beta, i anume cel din poziia 6 nlocuit cu un alt aminoacid (beta 6 acid glutamicvalin). Aceast unic schimbare a moleculei de Hb produce modificarea formei eritrocitului i toate manifestrile clinice ale bolii. Pauling i Ingram au demonstrat astfel pentru prima dat c mutaia unei gene strcturale poate produce o substituie a unui aminoacid n proteina corespunztoare i au postulat c drepanocitoza sau sicklemia reprezint prototipul de boal molecular".

Dup 1975, identificarea, localizarea i secvenarea genei normale pentru beta-globin i a alelei sale mutante (S) au stabilit cu precizie tipul de mutaie: n codonul 6 (GAG) al genei beta-globinei, adenina este nlocuit cu timina, formnd codonul GTG care semnific valina. Iat deci, c modificarea unui singur nucleotid din cele trei miliarde de nucleotide care alctuiesc genomul uman este cauza modificrilor patologice observate la bolnavii cu drepanocitoz. Explicaia patogenic a acestei boli moleculare este acum simpl (figura 4.8.c): moleculele de HbS coninnd subunitatea beta mutant fixeaz n mod normal O2 dar n sngele deoxigenat ele sunt relativ insolubile, comparativ cu HbA normal; aceast proprietate fizic st la baza fenomenului de sicklizare. n condiiile scderii concentraiei de oxigen molecula de HbS agreg i formeaz polimeri avnd forma unor fibre care distorsioneaz eritrocitul i-l fac mai puin deformabil ca n mod normal; el nu mai este capabil s traverseze prin capilarele fine (cu un diametru inferior celui al hematiei), blocheaz fluxul sanguin i produce hipoxie local (micro-infarcte dureroase). Eritrocitele n secer se hemolizeaz (n splin) genernd o anemie cronic.

Studii ulterioare au evideniat numeroase alte tipuri de hemoglobinopatii ereditare n care schimbarea structurii Hb era rezultatul substituiei unui singur aminoacid. De exemplu, HbC rezult printr-o substituie nucleotidic n acelai codon 6 al genei bet-globinei, care duce la nlocuirea acidului glutamic cu lizina. A devenit astfel evident i unanim acceptat c genele determin secvena primar a aminoacizilor dintr-o protein specific.

Descrierea ampl a defectului molecular n drepanocitoz permite cteva concluzii importante privind concepia actual despre funcia genei:(1) Genele care codific proteine conin (sub forma unei secvene de nucleotide) informaia genetic necesar pentru asamblarea specific (ntr-o anumit ordine) a aminoacizilor ntr-o protein specific; mutaiile genice produc o schimbare (substituie) a secvenei unui/unor codon(i) i secundar o modificare a structurii proteinei, care poate genera o boal molecular;(2) n aciunea genei se pot identifica trei categorii de efecte corelate: efectul primar, la nivel molecular (protein); efectul secundar, la nivel celular i efectele teriare multiple (pleiotropie), la nivel fenotipic, de organ / organism (semne i simptome). n practica medical se recunosc clinic sau paraclinic efectele teriare ale genei mutante adic boala ereditar cu diversele sale manifestri; efectele primare (proteina anormal) nu sunt cunoscute n multe boli monogenice dar tehnicile recente de analiz a structurii i funciei genei vor rezolva enigma acestor "pete albe";

11

(3). La heterozigoi (N/a) se manifest (exprim) la nivel molecular ambele gene i persoanele heterozigote cu trstura sicklemic (genotip A/S) produc i HbA i HbS. Rezult c noiunile de dominant i recesiv NU sunt valabile la nivel molecular, cu numai la nivel fenotipic (de organism);(4). Expresia ambelor gene alele la heterozigoi permite identificarea lor, prin studiul efectelor primare i uneori secundare (la nivel celular). Depistarea heteozigoilor sntoi purttori de gen mutant are o deosebit valoare practic n prevenirea naterii unor homozigoi bolnavi (doi prini heterozigoi, N/a, au un risc de 25% de a avea un copil a/a homozigot, bolnav).(5). Cunoaterea modificrii nucleotidice n gena mutant care produce o boal molecular permite, prin metodele actuale de analiz a ADN, diagnosticul genotipic precoce al bolii, fie prenatal fie postnatal, n stadiile asimptomatice. Se deschide, de asemenea, perspectivele unei terapii genice, prin inseria unei gene normale pentru beta-globin n celulele unui pacient la care boala este consecina mutaiei acestei gene.

4. RELAIA "O GEN UN POLIPEPTID" ESTE MULT MAI COMPLEX

Evoluia cunotinelor despre structura molecular a genei, bazat pe posibilitatea analizei ei directe, a evideniat o serie de fenomene care se abat de la relaia fundamental "o gen (de structur) un polipeptid". n esen este vorba de situaiile n care o gen poate produce mai multe polipeptide asemnatoare sau diferite sau invers, mai multe gene distincte, situate uneori la distan una de alta. O astfel de gen particip la sinteza unui singur polipeptid sau a unei proteine multipeptidice .

Primul fenomen, "o gen mai multe polipeptide", se realizeaz prin mecanisme diverse ce intervin n diferite etape ale expresiei genei (transcripie, maturare, translaie, procesarea postranslaional a proteinelor). Fr a intra n detalii vom preciza c cel mai frecvent mecanism este matisarea alternativ. Dup cum tim deja (capitolul 3.B.1), marea majoritate a genelor umane au o structur discontinu, fiind alctuite din exoni i introni; n procesul de formare a ARNm matur din preARNm, intronii sunt excizai iar exonii sunt unii / legai unul de altul (matisare). Unele celule "decid" s foloseasc ns numai anumii exoni si astfel dintr-un mesager primar unic se pot produce (printr-o "selecie" a exonilor i "matisare alternativ"), n acelai esut sau n esuturi diferite, fie proteine nrudite, cu funcie analog numite isoforme - (de ex: cele patru tipuri de baz ale mielinei, troponinei C, distrofinei etc) sau chiar proteine complet diferite ca funcie (figura 4.9.). De exemplu, gena calcitoninei produce un transcript primar din care n celulele C ale tiroidei se formeaz ARNm pentru calcitonin iar n neuroni (creier), printr-o maturare diferit, se formeaz un mesager pentru un "polipeptid nnrudit" cu funcie de tip neuromeditor. Fenomenul de matisare alternativ a jucat, foarte probabil, un rol important n evoluie deoarece prin rearanjarea diferitelor segmente codante (exoni) din structura genei s-au produs proteine cu funcii noi.

Asa cum vom vedea (vezi capitolul 4.B.) exist i alte mecanisme prin care o gen (ca unitate de transcripie) poate produce o varietate de produse. Alturi de matisarea alternativ vom mai meniona acum folosirea alternativ a unuia dintre promotorii multipli prin care rezult isoforme cu diferite proprieti: expresia n diferite perioade ontogenetice, specificitatea tisular, localizarea subcelular, capacitatea funcional. Un alt mecanism este clivarea posttranslaional prin care dintr-un singur polipeptid gigant se produc, prin secionarea, mai multe polipeptide mici; acest mecanism se ntlnete n cazul sintezei unor hormoni dintr-un prohormon (de ex., pro-opiomelanocortina din care rezult ACTH, MSH, MSH, LPH, -endorfina)

Al doilea fenomen, "mai multe geneun polipeptid" se observ n cazul polipeptidelor alctuite din regiuni diferite. De ex., lanurile uoare (L) i grele (H) ale imunoglobinelor prezint o regiune variabil (V) - care alctuiete situsul de recunoatere si

12

fixare al antigenului - i o regiune constant (C); ele sunt specificate de gene distincte, situate la distan pe acelai cromosom. n limfocitele B care produc anticorpi se produce o rearanjare (recombinare somatic) a genomului (vezi capitolul 15) i o anumit gen V este asociat cu o gena C, formnd o secven complet funcional ce codific lanul respectiv al imunoglobinei (figura 4.10).

5. INTERACIUNILE GENICE N CONCEPIA ACTUAL

Concepia clasic despre funcia genei postuleaz c expresia fenotipic a unei gene este influenat de alte gene alele sau nealele, precum i de aciunea mediului. Aceste interaciuni sunt mult mai evidente la nivel molecular.

Interaciunile alelice exprimate prin relaiile de dominan-recesivitate dintre genele alele sunt valabile la nivel fenotipic, influennd expresia unui caracter. La nivel molecular se manifest de obicei ambele gene alele, producnd o protein normal sau anormal, n cazul genelor mutante. Uneori anumite gene nu au nici un efect primar (gene amorfe / silenioase). De ex., gena 0 a sistemului de grup sanguin AB0 sau genele mutante recesive pentru agamaglobulinemie sau afibrinogenemie. La heterozigoii N/a, gena mutant a poate codifica o protein (enzim) nefuncional; cantitatea total de protein / enzim normal se reduce la jumtate fiind totui suficient, n condiii bazale, pentru a asigura o funcie normal i ca atare individul s fie (aparent) sntos (vezi trstura sicklemic).

Interaciunile nealelice i n special fenomenul de epistazie pot fi demonstrate mai convingtor la nivel molecular, prin aciunea coordonat a mai multor gene ce intervin n producerea unui compus final. Un frumos exemplu l reprezint formarea antigenelor ABH pe suprafaa hematiilor i n secreii.

Antigenele A, B i H sunt macromolecule complexe prezente sub form alcool-solubil (glicosfingolipide) pe suprafaa hematiilor i hidrosolubil (glicoproteine) n secreii, dar numai la persoanele "secretoare". Antigenele ABH eritrocitare sunt glicosfingolipide complexe care au o parte central fixat cu un capt n membrana eritrocitului; pe acest "miez" se leag lateral, n zona extramembranar, mai multe catene glucidice. Specificitatea antigenic este determinat de glucidul terminal. Formarea antigenelor A, B, H este determinat de aciunea coordonat a genelor H, Se i A,B,O9 care, prin intermediul unor enzime (glicoziltransferaze), fixeaz diferite tipuri de glucide la axul sfingolipidic sau glicoproteic (figura 4.11). Gena dominant H codific o enzim (fucoziltransferaz) care acioneaz asupra unui

precursor i adaug o molecul de fucoz, formnd substana H. Genele dominante A i B acioneaz asupra substanei H i, prin intermediul unor transferaze

specifice, fixeaz o molecul de acetilgalactozamin (antigenul A) i, respectiv, galactoz (antigenul B). Gena recesiv 0 este inactiv, nu modific substana H, care se va regsi ca atare la persoanele de grup sanguin 0.

S-a nregistrat i situaia foarte rar de homozigoi (h/h) pentru gena H la care precursorul nu este transformat n substan H; genele A sau B, dei exist n stare normal nu au efect i fenotipul (numit Bombay) corespunde grupei 0 (dar fr substan H).

La secretori, alturi de gena H/ , acioneaz i gena dominant Se/ care va determina sinteza i excreia antigenelor A, B i H; la nesecretori (se/se) efectul genei H este "anulat" prin aciunea genelor se/se iar precursorul rmne netransformat. Gena Se/ are deci aciune epistatic asupra genei H.

Efectul mediului asupra expresiei genelor se manifest n reglajul cantitativ (i uneori calitativ) al sintezei proteinelor.

9 Analiza molecular a genelor A, B, 0 a fot recent realizat. ntre alelele A i B exist o diferen de secven de numai patru nucleotide. Alela 0 prezint o deleie a unui nucleotid care (fiind o mutaie "frameshift") determin pierderea activitii transferazice

13

C. MECANISMELE MOLECULARE ALE EXPRESIEI GENICE

Expresia informaiei genetice se realizeaz n toate celulele pe baza unui flux informaional, unidirecional i universal10, care se conformeaz dogmei centrale a geneticii: ADN ARNm polipeptid (protein) (figura 4.12). Prima etap a expresiei informaiei ereditare este sinteza ARN (cu ajutorul unei ARN polimeraze ADN-dependente11), prin copierea informaiei din ADN; aceast etap are loc n nucleu i mitocondrii i se numete transcripie. A doua etap este sinteza unui polipetid, prin decodificarea ("traducerea") informaiei ARNm ntr-o secven caracteristic de aminoacizi; acest proces are loc n citoplasm, pe ribosomi, i este denumit translaie. Realizarea acestor etape se bazeaz pe principiul coliniaritii: o secven liniar de nucleotide din ADN este copiat (complementar) ntr-o secven liniar de nucleotide n ARN; apoi ea este decodificat (prin citire n grupe de trei nucleotide numite codoni) ntr-o secven, de asemenea, liniar de aminoacizi ce formeaz un polipeptid.

nainte de a descrie mecanismele moleculare ale expresiei genice sunt utile urmtoarele precizri: Numai o mic proporie din ADN al celulelor eucariote este exprimat i determin o

protein. Este vorba de ADN genic codant (vezi capitolul 2.C.2.3.), iar din acesta diferite tipuri de celule difereniate transcriu numai anumite segmente de ADN (uniti de transcripie).

ntregul proces al exprimrii informaiei genetice este supus unui riguros control care regleaz tipul de celul n care se produce sinteza proteinei, precum i momentul, cantitatea i ritmul acestui proces.

Erorile mecanismelor moleculare ale exprimrii informaiei genetice vor genera, firesc, o serie de boli; descifrarea acestor mecanisme va crete posibilitile de diagnostic i tratament.

1. TRANSCRIPIA

1.1 DATE GENERALETranscipia este procesul de copiere a informaiei genetice a unei gene, sub form

codificat, complementar i antiparalel, ntr-o molecula de ARN. Acest proces are loc n nucleu.

ARN este format din ribonucleotide, cu structura general [P-R-N]n , n care P = acid fosforic, R = riboza12 iar N = baza azotat (Adenina, Guanina, Citozina i U racilul ). Prin polimerizarea ribonucelotidelor (n sensul 5'3') rezult o monocaten, de obicei scurt. Se deosebesc mai multe tipuri de ARN, cu funcii diferite: ARNm sau mesager este codant deoarece prin translaie va determina sinteza unui polipeptid; ARNr sau ribosomal (mai multe tipuri) va participa la formarea ribosomilor, iar ARNt sau de transfer intervine direct n transportul aminoacizilor la ribosomi; alte tipuri sunt ARNsn i ARNsno (ce intervin n procesarea intronilor sau a ARNr). In cele ce urmeaz vom discuta mai ales transcripia ARNm realizat de ARN polimeraza II ADN dependent.

Pentru a se sintetiza in vivo un ARNm sunt necesare: ADN ca model sau matri, enzima ARN polimeraz II, factori de transcripie necesari pentru ghidarea i activarea ARN 10 n realitate fluxul informaional nu este exclusiv unidirecional i universal: unele secvene de ADN (retrotransposoni) sunt transcrise n ARN i apoi sub aciunea unei transcriptaze inverse sunt retrocopiate i integrate aleatoriu n ADN; prin acelai mecanism unele retrovirusuri (de ex., HIV) care au ca material genetic ARN se pot insera n ADN-ul celulelor eucariote prin retrotranscripie.11 Exist trei tipuri de ARN polimeraza: I - pentru ARNr; II -pentru pre-ARNm; III - pentru ARNt.12 Riboza este "oza" (glucidul) descoperit la "Rockefeller Institut of Biochemistry" din New York.

14

polimerazei i ribonucleotide activate. Numai una din cele dou catene ale ADN (3'5') este transcris i servete ca "matri" pentru sinteza unei molecule complementare i antiparalele (5'3') de ARNm; dar aceasta nu este, la diferite gene, aceiai caten care este copiat n lungul moleculei ADN, la diferite gene (figura 4.13). Alegerea catenei transcrise depinde n mare parte de localizarea i orientarea promotorului, locul unde se fixeaz prin intermediul factorilor de transcripie, ARN polimeraza.

Cele dou catene ale ADN-ului, catena transcris (35) i catena de referin (53), au o nomenclatur diferit. ARNm, care se formeaz prin transcripie, va avea aceeai secven de nucleotide (exceptnd nlocuirea T cu U) i acelai sens (5'3') ca i catena ADN netranscris motiv pentru care aceasta se numete caten sens iar catena transcris este numit adesea antisens13. Raportul dintre secvena i polaritatea ARNm pe de o parte i cele dou catene ale ADN pe de alt parte, precum i unii termeni prin care se definesc aceste catene sunt prezentai mai jos:

5'...ATGTTACGACGT... 3' catena ADN "sens" (netranscris, de referin) 3'...TACAATGCTGCA... 5' catena ADN "antisens" (transcris)

Transcripie

5'...AUGUUACGACGU... 3' ARNmnainte de a descrie procesul de transcripie este necesar s precizm un element

important. ADN este identic n toate celulele somatice (rezultate prin mitoze succesive din celula zigot); diferenierea lor structural i funcional implic expresia anumitor gene specifice de esut, care funcioneaz mpreun cu genele constitutive (domestice sau menajere de la housekeeping genes deoarece sunt active n toate celulele) ce controleaz metabolismul celular (vezi capitolul 3.B.3). De aceea, expresia genelor specific tisulare implic activarea selectiv a acestor gene (prin intervenia unor molecule specific tisulare), recunoaterea lor de ctre ARN polimeraz i modularea expresiei lor ca moment, cantitate i ritm. Fr a intra n detalii, vom preciza c aceste procese se realizeaz prin:(1) realizarea unei configuraii deschise active a cromatinei n anumite teritorii prin relaxarea structurii sale (decondensare) i acetilarea histonelor nucleosomale (vezi capitolul 2.D.2.3);(2) intervenia secvenelor sau elementelor cis-reglatoare din regiunea 5 situat n amonte de zona central, transcris, a genei: promotorul (cu casetele TATA sau GC i CAAT) reprezint semnalul de start al transcripiei, ce stabilete localizarea i direcia de aciune a ARN polimerazei; secvenele specifice de esut; activatorii etc (vezi structura genei, capitolul 3.B.1.2). Toate aceste elemente sunt inta unor proteine trans-reglatoare numite generic factori de transcripie (TF); fixarea lor este determinant att pentru demarajul transcripiei ct i pentru intensitatea ei. Fiecare gen posed o combinaie particular de elemente cis-reglatoare (figura 4.14).

Procesul de transcripie la eucariote se desfsoar n dou mari etape, determinate de structura "discontinu" ("fragmentat") a genelor eucariote. Acestea sunt: formarea ARN mesager precursor (pre-ARNm) sau transcriptul primar14, prin transcripia

integral a genei (exoni i introni); maturarea pre-ARNm, printr-o serie de modificri din care rezult ARNm matur, ce va

trece n citoplasm.

1.2. FORMAREA ARNm PRECURSORFormarea pre-ARNm ncepe prin decondensarea zonei din ADN care conine gena

sau genele ce vor fi transcrise. Acest proces implic intervenia unor factori de transcripie 13 Referirile la structura genei se fac ntotdeauna la catena sens (de ex., secvenele reglatoare de la captul 5' al genei se refer la secvenele situate la captul 5' al catenei sens i nu al catenei transcris, unde de fapt ele exist i acioneaz !!!).14Moleculele de transcript primar au fost denumite iniial ARN nuclear heterogen (hnARN).

15

de clas I (TF I), modificarea chimic a histonelor (acetilare, deplasarea H1 etc) care va reduce gradul de compactare a filamentelor cu nucleosomi i deplasarea (printr-un mecanism nc necunoscut) a nucleosomilor din zona de ADN transcris ntr-un anumit moment.

Formarea pre-ARNm se realizeaz n trei etape.(1) Iniierea transcripiei. Prin convenie primul nucleotid din ADN cu care se ncepe transcripia reprezint "situsul de iniiere al transcripiei" (SIT sau INR)15 i este numit +1 iar nucleotidul care l precede -1. Primul "pas" al transcripiei este fixarea ARN polimerazei n regiunea promotor, situat spre captul 5' al genei, n amonte de S.I.T. n aceast regiune, de circa 100 pb, se gsesc secvene nucleotidice speciale, identice la majoritatea genelor (secvene "consensus"), numite TATA box, CCAAT box i GC box. Trebuie spus foarte clar c ARN polimeraza nu poate recunoate direct promotorul i nici nu poate iniia singur transcripia. Pentru aceasta sunt necesari o serie de factori de transcripie (TF II sau de clas II) care se fixeaz pe secvenele promotorului pentru a ghida i activa ARN polimeraza. Enzima i factorii de transcripie formeaz un complex multiproteic de iniializare16. ARN polimeraza este poziionat i activat pentru a ncepe transcripia la SIT, cu nucleotidul +1.(2) Transcripia propriuzis (elongaia). Dup fixarea ARN polimerazei, cele dou catene ale ADN sunt separate (prin aciunea TF IIF, cu aciune de helicaz), eliberndu-se catena transcris 3'5', care servete drept matri (tipar) pentru aezarea secvenial i complementar a ribonucleotidelor activate; ele vor fi apoi polimerizate de ctre ARN polimeraz17, formndu-se ARNm; Transcripia se face numai n sensul 5'3' (deci ARNm este antiparalel fa de catena transcris), fapt ce asigur marea fidelitate a citirii informaiei genetice. ARNm se desprinde treptat de pe catena transcris (rmnd fixat temporar numai la captul 3), iar cele dou catene ale ADN se reunesc treptat, sub aciunea unei topoisomeraze, i refac dublul helix. Trebuie subliniat un fapt important: n molecula de ARNm precursor care se formeaz - numit i transcriptul primar18 - sunt copiai att exonii ct i intronii. (3) Terminarea transcripiei se face cnd ARN polimeraza ntlnete situsul de terminare a transcripiei; aici se afl secvena AATAAA (citit pe catena netranscris) care semnaleaz clivarea 3' a transcriptului primar"; ea va corespunde n preARNm secvenei AAUAAA.. Secionarea ARNm sintetizat are loc (sub aciunea unei nucleaze) la 15-30 nucleotide n aval de secvena AAUAAA din ARN, n dreptul "situsului de poliadenilare".

Transcripia unei gene poate fi realizat de mai multe molecule de ARN polimeraz, formndu-se mai multe copii de ARNm ce conin aceeai informaie genetic (aceast "amplificare" va crete considerabil n cursul translaiei i astfel o gen va determina mii de molecule proteice identice).

1.3. MATURAREA ARNm PRECURSOR Maturarea nuclear a pre-ARNm cuprinde dou procese distincte, destinate s fac

ARNm mai "disponibil i mai util" translaiei (figura 4.15).a. Modificarea extremitilor ARNm determin creterea stabilitii sale (protecie

la degradarea de ctre endonucleaze) si faciliteaz transportul n citoplasm, recunoaterea i fixarea sa la subunitatea 40S ribosomal. La captul 5' se adaug, la primul nucleotid al transcriptului primar, o molecul de 7-metil-

guanozin, ce formeaz o structur special, numit n l. englez "cap" (bonet);

15Orice abatere de la "SIT" va determina sinteza unui mesager diferit de cel normal.16 TF IID se fixeaz pe secvena TATA iar TF IIB i E fixeaz ARN polimeraza; complexul este stabilizat de TF IIA; la acetia se adaug TF IIF, cu activitate de helicaz, care desface cele dou catene ale ADN.17ARN polimeraza se deplaseaz ca "un cursor pe un fermoar"18Moleculele de pre-m ARN sunt cunoscute i sub numele de "ARN heterogen' (hnARN).

16

La extremitatea 3' se adaug19 o serie de 50-200 de nucleotide cu adenin, formnd o coad poliadenilic. Aceast operaie de poliadenilare este caracteristic ARNm (exist o singur excepie: ARNm pentru histone nu este poliadenilat).

b. Procesarea ARN precursor. Aa cum am precizat, transcriptul primar ARN conine secvene complementare cu ntreaga regiune transcris din gen (zona central sau cadrul de lectur) ce conine exoni (regiuni exprimate, codante) i introni (regiuni intercalare, necodante). Dup sintez, transcriptul ARN primar sufer o procesare complex ce const n decuparea precis i eliminarea ARN intronic urmat de reunirea/legarea "cap la cap" a ARN exonic, care va forma ARNm matur, alctuit dintr-o serie continu i contigu de exoni (cineva spunea foarte plastic c n aceast operaie "se separ grul de neghin"). Aceste fenomene sunt denumite "splicing" n limba englez, "epissage" n limba francez; termenii corespund cuvntului romnesc "matisare", termen tehnic care se refer la "ndirea a doua capete". Excizia i reunirea sunt operaii foarte delicate care trebuie s fie deosebit de precise: o eroare de decupare cu un singur nucleotid modific "cadrul de lectur" i, dup translaie, va produce o protein anormal.

Procesul este dependent de existena unor secvene nucleotidice-semnal situate la grania exoni-introni: 5GT(GU n ARN) sau situs donor i 3AG sau situs acceptor; o alt secven important este branch site (ce poate fi tradus ca situs de branare, de legtur), ce conine nucleotidul A, situat foarte aproape de captul 3 al intronului. Mecanismul de decupare (figura 4.16) se deruleaz n trei etape: (1) secionare la jonciunea 5GU; (2) ataarea nucleotidului terminal G la nucleotidul A al situsului de branare i formarea unei lasou/bucl; (3) secionarea intronului la jonciunea 3AG, ndeprtarea lui i unirea segmentelor de ARN exonic. Reaciile sunt mediate de un complex ARN-proteine (spliceosome) ce cuprinde cinci tipuri dr ARNsn (small nuclear), numite U1-U6, dotate cu activitate enzimatic (ribozime) i peste 50 de proteine

Ordinea exonilor n ADN i transcriptul primar este pstrat n ARNm matur. Dar exist o anumit flexibilitate n utilizarea exonilor, n sensul c (sub aciunea unor factori nc necunoscui) n celule diferite, vor fi reinui n ARNm matur numai o parte din exoni, alii putnd fi ndeprtai o dat cu intronii. Acest proces denumit matisarea alternativ a exonilor (figura 4.9) explic producerea n esuturi diferite a unor mesageri i deci a unor proteine diferite (asemntoare dar nu identice) pe baza informaiei unei singure gene (vezi capitolul 4.B.4).

2. TRANSLAIA

A doua etap a expresiei genice este translaia20 - procesul de decodificare a informaiei genetice din mARN care permite aranjarea secvenial specific a amino acizilor i polimerizarea lor ntr-o caten polipeptidic.

Procesul de translaie necesit, firesc, "un dicionar" reprezentat de codul genetic i un aparat de translaie care trebuie s includ, printre alte componente, i "traductorul", reprezentat de moleculele de ARN de transfer (ARNt).

2.1. CODUL GENETIC.Informaia din structura unei gene este scris sub forma unei anumite secvene a

celor patru tipuri de nucleotide: A,G,T,C. Ea este copiat (transcris) complementar (U,C,A,G) n ARNm i apoi tradus ntr-o anumit secven de aminoacizi, care vor forma

19Prin aciunea unei poli-A polimeraze20Denumirea de translaie semnific traducerea informaiei scris n "limbajul" nucleotidelor n ARNm n "limbajul" de aminoacizi al peptidelor.

17

o caten polipeptidic; aceast translaie se face cu ajutorul unui fel de dicionar bilingv care este codul genetic.

Codul genetic reprezint "un sistem de corespondene" ntre o anumit secven de trei nucleotide numit codon i un anumit aminoacid (tabelul 4.2). Cu cele patru litereale alfabetului genetic se pot scrie cuvinte alctuite din trei litere; gena ar fi deci o fraz format dintr-o niruire de codoni, ce determin o anumit secven a aminoacizilor ntr-un polipeptid. Descifrarea21 codului genetic (1965) a fost o descoperire extraordinar, "mai fantastic dect descifrarea hieroglifelor", deoarece a marcat decisiv debutul erei biologiei moleculare; de aceea Khorana i Nirenberg au primit premiul Nobel (1968).

Tabelul 4.2 Codul genetic

PRIMABAZ

A DOUA BAZ A TREIA BAZ

U C A G

UUUU phe UCU ser UAU tyr UGU cys UUUC phe UCC ser UAC tyr UGC cys CUUA leu UCA ser UAA stop UGA* stop AUUG leu UCG ser CAU stop UGG trp G

CCUU leu CCU pro CAG his CGU arg UCUG leu CCC pro CAA his CGC arg CCUA leu CCA pro CAG gln CGA arg ACUG leu CCG pro CAG gln CGG arg G

AAUU ile ACU thr AAU asn AGU ser UAUC ile ACC thr AAC asn AGC ser CAUA ile ACA thr AAA lys AGA arg AAUG met ACG thr AAG lys AGG arg G

GGUU val GCU ala GAU asp GGU gly UGUC val GCC ala GAC asp GGC gly CGUA val GCA ala GAA glu GGA gly AGUG val GCG ala GAG glu GGG gly G

Abrevieri pentru aminoaciziala (A) - alanina gly (G) - glicina pro (P) - prolinaarg (R) - arginina his (H) - histidina ser (S) - serinaasn (N) - asparagina ile (I) - isoleucina thr (T) - treoninaasp (D) - acidul aspartic leu (L) - leucina trp (W) - triptofanulcys (C) - cisteina lys (K) - lizina tyr (Y) - tirozinagln (Q) - glutamina met (M) - metionina val (V) - valinaglu (E) - acidul glutamic phe (F) - fenilalanina X - stop

* n anumite condiii UGA poate specifica selenocisteina (al 21-lea aminoacid)

Fr a intra n detalii vom meniona succint proprietile codului genetic.(1). Codul genetic este triplet pentru motivul logic c 3 este prima putere a lui 4 (cele patru tipuri de nucleotide) care formeaz 64 de combinaii, suficiente pentru cei 20 de amino acizi care se gsesc n structura proteinelor.(2). Codul genetic are un codon iniiator (AUG) i trei codoni stop (UAA, UAG, UGA), veritabile semne de punctuaie cu care se ncepe i se termin sinteza polipeptidului. Codonii stop sunt numii i "codoni nonsens" deoarece nu semnific nici un aminoacid. Ceilali 61 de codoni sunt "codoni sens" ce semnific 20 de amino acizi (tabelul 4.1).

21Codul genetic a fost descifrat experimental folosind drept ARNm polinucelotide sintetice cu o secven cunoscut i analiznd secvena de aminoacizi a proteinei sintetizate artificial. De exemplu, ARNm sintetic poliuracil a produs un polipeptid alctuit exclusiv din fenilalanin; astfel s-a stabilit c tripletul UUU codific fenilalanin.

18

(3). Codul genetic este degenerat (redundant) deoarece mai muli codoni semnific un acelai amino acid (de aceea ei se numesc "codoni sinonimi"). Exceptnd metionina i triptofanul, codificai de un singur codon, ceilali 18 amino acizi sunt codificai de 2-6 codoni (deseori deosebii prin al treilea nucleotid). Degenerescena nu s-a stabilit la ntmplare deoarece aminoacizii cei mai reprezentai n proteine sunt cei care posed cei mai muli codoni. Cu toat conotaia sa peiorativ, caracterul degenerat al codului genetic este un avantaj pentru celul deoarece unele mutaii genice ce produc codoni sinonimi nu modific proteina codificat de gen (mutaii silenioase sau iso-semantice). Se poate afirma c degenerescena codului genetic este un veritabil sistem de protecie contra efectelor mutaiilor.(4). Codul genetic este nesuperpozabil (deoarece codonii vecini nu au un nucleotid comun) i fr virgule (ntruct codonii sunt adiaceni, neseparai printr-un nucleotid cu rol de "virgul"); codonii sunt definii prin simpla grupare de cte trei22. Dac, printr-o mutaie, ntr-unul dintre codon se suprim (deleie) sau se inser (adiie) 1-2 nucleotide (sau un alt numr care nu este un multiplu de trei) se produce o decalare a cadrului de lectur al genei, rezultnd (printr-o nou grupare cte trei, ali codoni; n proteina sintetizat se modific toi aminoacizii ncepnd cu locul n care s-a produs mutaia (numit frame-shift).(5). Codul genetic este lipsit de ambiguitate ntruct un codon semnific ntotdeauna un anumit aminoacid, totdeauna acelai.(6). Codul genetic este universal , acelai la toate organismele, bacterie, plant, animal sau om. Totui codul genetic mitocondrial are cteva mici diferene fa de cel nuclear (codoni cu sensuri diferite); unele au fost gsite i la levuri, paramecii i la unele arheobacterii. Cu toate aceste foarte mici excepii caracterul universal al codului genetic este evident. Acest lucru este foarte important n "ingineria genetic" deoarece bacteriile recombinante, n care s-a introdus o gen uman, fabric proteina uman folosind codul genetic bacterian care, n fond, este acelai ca i la om.

nainte de a ncheia, vom sublinia importana cunoaterii codului genetic i pentru nelegerea mecanismului i consecinelor unor mutaii genice (punctiforme) ce produc nlocuirea sau inseria/adiia unui nucleotid (tabelul 4.3) (vezi capitolul 6.B.2).

Tabelul 4.3. Consecinele unor mutaii genice prin substituia, inseria sau adiia unui nucleotid ntr-un codon

Substituia unui nucleotidAUG UGU AAA CCA

Met cis lys proMutaie silenioas Mutaie missens

(cu sens greit)Mutaie nonsens

AUG UGC AAA CCAMet cis lys pro

AUG UGG AAA CCAMet trp lys pro

AUG UGA AAA CCA Met Stop

Inseria sau deleia unui nucleotidAUG UUU AAA GUU UCG

Met Phe Lys Val SerMutaii frameshift

(mutaii cu decalarea cadrului)AUG UUU GAA AGU UUC G MetPhe Glu Ser Phe

AUG UUU AA-G UUU CGA Met Phe Lys Leu Arg

2.2. APARATUL DE TRANSLAIE .

22Orice deleie sau adiie a unui nucleotid va schimba "cadrul de lectur al genei" deci practic toi codonii (formai prin gruparea cte trei) ce urmeaz dup locul deleiei/adiiei nucleotidice.

19

Aparatul de translaie este alctuit din numeroase componente: ARNm, ribosomii, ARNt, aminoacizi, factori de iniiere, factori de elongaie, enzime, surse de energie etc. n sintez, ARNm furnizeaz informaia (secvena de codoni) care va fi translat ntr-o secven de amino acizi n protein; el se fixeaz pe ribosom (o particul alctuit din ARNr i proteine) i care reprezint platforma de sintez a polipeptidului. ARNt fixeaz un aminoacid specific i apoi amplaseaz acest aminoacid n polipeptid, folosind informaia din ARNm

a). Ribosomii sunt organite citoplasmatice (descrise de George Emil Palade, premiul Nobel, n 1974), veritabile "platforme de asamblare a aminoacizilor n proteine" pe baza instruciunilor ARNm. Ribosomii eucariotelor sunt alctuii din dou subuniti inegale, [deosebite prin constanta de sedimentare (S): 40S i 60S], care sunt de obicei disociate i libere n citoplasm; ele se reunesc la nceputul translaiei pentru a forma ribosomul activ. Fiecare subunitate este alctuit din ARN ribosomal i proteine23, care au rol structural i funcional/catalitic (faciliteaz: fixarea moleculelor de ARNm i ARNt la ribosom; deplasarea ribosomului, .a.). Ribosomii prezint patru situsuri funcionale: pe subunitatea mic se afl situsul de fixare al extremitii 5 a ARNm iar pe subunitatea mare: situsul P (peptidil) i A (aminoacil) unde se fixeaz moleculele de ARNt cuplate cu aminoacizii lor specifici, precum i situsul de fixare al peptidil-transferazei, enzima ce polimerizeaz aminoacizii ntr-un polipeptid. n procesul de translaie, ribosomii se deplaseaz n lungul moleculei de ARNm, spre captul 3. Pe msura deplasrii, ali ribosomi pot ncepe translaia aceleiai molecule de ARNm, alctuind mpreun un poliribosom.

b). ARN de transfer (ARNt) transport aminoacizii din citoplasm la ribosomi, locul sintezei proteice. Aici ARNt recunoate codonul din ARNm corespunztor aminoacidului respectiv, pe care l poziioneaz n dreptul acestui codon; deci ARNt are rolul de "translator".

ARNt este un micropolimer de ribonucleotide (75-100 nucleotide), monocatenar, cu o structur secundar i teriar "n trefl" (figura 4.17) , relativ identic la toate tipurile de ARNt. El posed dou situsuri importante): extremitatea 3'OH este terminat prin nucleotidele CCA, iar la poziia 3 a ribozei adeninei

se fixeaz aminoacidul transportat, cu ajutorul unei enzime aminoacil-ARNt-sintetaza; anticodonul, un grup de trei nucleotide situat n bucla opus extremitii 3'OH; el

recunoate, prin complementaritate, codonul din ARNm corespunztor aminoacidului24. c). Enzimele i cofactorii proteici ai translaiei sunt, deasemeeai elemente

importante. n procesul de translaie sunt implicate amino-acil-ARNt-sintetazele i peptidil-transferaza. Aminoacil-ARNt-sintetazele sunt 20 de enzime cu o dubl specificitate: recunosc fiecare un anumit aminoacid (foarte probabil pe baza configuraiei sale spaiale) precum i ARNt corespunztor. n acest proces de ncrcare, mecanismul de recunoatere ntre o anumit enzim i ARNt specific a fost recent descifrat: enzima recunoate specific fie anticodonul unor molecule de ARNt fie o pereche de nucleotide (de exemplu, UG pentru E+alanin) situate spre extremitile terminale 5' i 3' ale ARNt (figura 4.17); ele formeaz un veritabil al doilea cod genetic. Peptidil-transferaza catalizeaz formarea legturii peptidice ntre doi aminoacizi.

23La eucariote subunitatea mic are un tip de ARNr (18S) i 33 proteine ribosomale iar cea mare trei tipuri de ARNr (5S, 5,8S, 28S) i 45 proteine ribosomale. Moleculele de ARNr sunt codificate de gene prezente n mii de copii pe braele scurte ale cromosomilor acrocentrici, care formeaz "regiunile organizatoare de nucleoli". Structura ARNr i a proteinelor ribosomilor la procariote este diferit de cea de la eucariote i acest lucru are o importan deosebit deoarece unele amtibiotice (de ex., streptomicina) care acioneaz la nivelul ribosomilor sunt active la bacterii i fr efect asupra ribosomilor i sintezei proteice la om.24Teoretic ar trebui s existe n celul 61 de molecule diferite de ARNt pentru cei 61 de codoni sens. In realitate numrul lor este mai mic (~40) dar superior celor 20 de aminoacizi; deci un acelai tip de aminoacid va fi purtat de mai muli ARNt specifici (iso-acceptori), diferii prin anticodonul lor prin al treilea nucleotid; aceast flexibilitate este denumit n limba englez wobble (a ovi).

20

Cofactorii proteici intervin n diferite etape ale translaiei. Ei sunt reprezentai de factorii de iniiere (IF 1-6), factorii de elongaie (EF 1-2) i un factor de terminare (RF). Inactivarea lor (prin diferite toxine microbiene) blocheaz procesul de translaie i produce moartea celular.

2.3. PROCESUL DE TRANSLAIE.Translaia se realizeaz n trei etape succesive: iniierea, elongaia i terminarea

translaiei (figura 4.18); fiecare etap implic molecule diferite i necesit energie (furnizat de ATP sau GTP).

Iniierea translaiei este o etap complex care, n esen, va plasa primul aminoacid (AA) al proteinei (de la extremitatea sa NH2-terminal) n dreptul codonului iniiator AUG din ARNm, ce corespunde metioninei, i va asambla n aceast poziie cele dou subuniti ce vor forma ribosomul activ.

ntr-un prim timp, ARNm se fixeaz (cu Cap i secvena 5.CCACCAUGC-3) pe subunitatea mic a ribosomului25; apoi, se formeaz un complex de iniiere ntre ARNm, ARNt-1 "ncrcat" cu AA-1 (metionin) i diferii factori de iniiere ai translaiei (IF2, IF3) cu rol catalizator; anticodonul ARNt-iniiator este n contact cu codonul AUG al ARNm. Apoi, prin aciunea unui alt IF, se fixeaz subunitatea mare 60S i ribosomul devine activ, deci capabil de a participa la sinteza polipeptidic. ARNt-iniiator se va palsa direct n situsul P al subunitii mari a ribosomului (figura 4.18).

Elongaia este o etap relativ simpl i repetat succesiv n cursul crie se formeaz legturi peptidice ntre AA aezai secvenial pe baza ordinii codonilor din ARNm.

Dup plasarea ARNt1 n poziia P a ribosomului n situsul A (amino-acil) liber vine i se plaseaz ARNt-2 ncrcat26 cu AA-2, codificat de al doilea codon din ARNm. In acest momen, sub aciunea enzimei peptidil-transferaza se realizeaz legtura peptidic ntre primii doi aminoacizi, formndu-se un dipeptid (legat la ARNt2). Dup formarea dipeptidului, sub influena factorului de elongaie EF2, GTP i a unei translocaze, ribosomul se deplaseaz cu trei nucleotide n lungul ARNm, n direcia 5'3'. Astfel ARNt-1 este scos din situsul P care va fi ocupat de ARNt-2, care poart dipeptidul27. n situsul A eliberat se fixeaz ARNt-3 cu AA-3 i, printr-o nou legtur peptidic, AA-3 este fixat la la dipeptid.

Ciclul celor trei faze (acroarea AA~ARNt la ribosom, formarea legturii peptidice, translocarea ribosomului) se repet i astfel catena polipeptidic crete la fiecare ciclu cu un amino acid. De subliniat c pe msur ce un ribosom avanseaz n lungul catenei de mARN ali ribosomi28 pot ncepe "lectura" acestei catene formndu-se astfel sute sau mii de molecule proteice identice ("amplificare"). Desigur n procesul de sintez a polipeptidului se pot produce erori dar ele sunt corectate prin diferite mecanisme, ce implic diferite enzime i factori de elongaie.

Terminarea. Elongaia polipeptidului se oprete cnd ribosomul ajunge la un codon stop, situsul de terminare a translaiei. n acest moment se produce dezasamblarea complexului ribosom-ARNm-polipeptid (prin intervenia unui factor proteic, RF) i polipeptidul este eliberat din ribosom. Ribosomul poate fi reciclat pentru o nou sintez iar polipeptidul sufer o serie de modificri posttranslaionale i capt forma tridimensional specific

25Asociere ARNm la aceast subunitate i potrivirea exact a codonului AUG se face printr-o secven purinic special, situat chiar naintea codonului iniiator i complementar unei secvene pirimidinice din ARNr subunitii mici. Un rol cert dar nc neclar are i structura "cap" de la extremitatea 5' a ribosomului26Fixarea este favorizat de un factor de elongaie, EF1.27Trecerea ARNt din situsul P n A se numete translocaie.28Ribosomii fixai la aceeai molecul de ARNm formeaz "un polisom" (sau poliribosom).

21

3. LOCALIZAREA PROTEINELOR

Fiecare protein, sintetizat pe baza informaiilor unei gene, funcioneaz ntr-un anumit compartiment celular; de ex., tubulina-n citosol; histonele-n nucleu; succinat coenzima A reductaza-n mitocondrii; glicozil-transferazele-n aparatul Golgi; receptorii hormonilor peptidici-pe membrana celular; colagenul-n spaiul extracelular etc. Orice protein cu o localizare special posed n structura ei una sau mai multe secvene-semnal care vor determina, ca un veritabil cod potal, adresa sa de destinaie.

O prim sortare a polipeptidelor nou sintetizate separ proteinele care vor ramne n interiorul celulei de cele care vor fi exportate/excretate la exteriorul celulei. Aceast decizie iniial este determinat de prezena unei secvene de 15-30 aminoacizi (hidrofobi), situat la captul N terminal al proteinelor care vor fi excretate; ea se numete peptid signal (semnal peptidic) i lipsete la proteinele cu destinaie intracitoplasmatic. Dup ce s-au ncorporat circa 70 de AA dintr-o protein excretat, secvena semnal devine vizibil din canalul ribosomic i pe ea se fixeaz o particul numit SRP (Signal Recognition Particule)29, care oprete translaia. Complexul SRP-semnal peptidic recunoate i se fixeaz pe un receptor (docking protein) situat pe suprafaa citosolic a reticulului endoplasmic (RE) (figura 4.19). Dup fixare, semnalul peptidic traverseaz membrana RE iar ribosomii ce efectueaz translaia se fixeaz la RE; apoi particula SRP este eliberat i translaia se reia dar polipeptidul sintetizat este dirijat n lumenul RE (unde secvena peptidic care "i-a fcut datoria" a fost deja clivat), fiind apoi transportat la exteriorul celulei.

Printr-un mecanism asemntor se realizeaz transportul proteinelor nucleare sau mitocondriale sau celor destinate aparatului Golgi. n cazul proteinelor lizozomale i membranare mecanismele sunt diferite. Proteinele (proteazele) destinate lizozomilor au o secven de aminoacizi care determin adiia posttranslaional a manozei-6-fosfat; aceast modificare determin dirijarea acestor glicoproteine din RE sau aparatul Golgi n interiorul lizozomilor. Dac accidental modificare nu se produce transportul proteazele lizozomale neprocesate va fi anormal (n mucolipidoze i boala celulei I). Proteinele ataate la membran se fixeaz prin secvene peptidice i SRP la un receptor din vecintatea unui por membranar; ele ncep s traverseze membrana prin acest por pn cnd se ajunge la o secven ce oprete transferul i determin inseria proteinei n ptura lipidic a mebranei.

4. MODIFICRILE POST-TRANSLAIONALE ALE PROTEINELOR.

Pe msur ce un polipeptid se sintetizeaz, n anumite zone se formeaz prin repliere structuri secundare ( -elice n proteinele fibrilare sau -pliere, n proteinele globulare) (figura 4.6) prin interaciuni (puni de hidrogen, puni disulfidice) ntre diferii aminoacizi nvecinai sau situai mai la distan; n felul acesta, la sfritul sintezei, polipeptidul ia configuraia spaial, tridimensional, specific, care i determin activitatea.

Structura tridimensional a proteinelor este rezultatul interactiunilor fizice care se stabilesc ntre aminoacizii constituieni. Cu toate acestea s-a constatat c plicaturarea iniial a moleculelor proteice este un proces mediat de o serie de proteine numite "chaperones" (Hsp60, Hsp70 si Hsp90). Ele se cupleaz la nivelul lanului polipeptidic nascent i previn mai nti iniierea plicaturrii extremitaii N-terminale pn cnd ntregul proces de translaie nu este finalizat. De asemeni, proteinele chaperones au un rol important n cazul proteinelor care trebuiesc transportate n diferite compartimente celulare, precum mitocondriile sau reticulul endoplasmatic, prevenind plicaturarea acestora pn la atingerea destinaiei.

n afara modificrilor conformaionale, polipeptidele pot suferi i alte modificri calitative, permanente sau reversibile care, n esen, fac ca o protein s devin activ.

29 SRP este alctuit din 6 proteine i o mic molecul de ARN 7SL,

22

Modificrile reversibile ale proteinelor sunt reprezentate n special de acetilarea Lys (n cazul histonelor) sau fosforilarea Ser (n cazul kinazelor); aceste modificri pot influena, uneori decisiv, activitatea proteinei.

Modificrile permanente pot fi de asemenea numeroase i importante. Clivarea proteolitic a catenei peptidice. Dup sinteza catenelor polipeptidice are loc cel

mai adesea clivarea metioninei iniiale i, la unele proteine, a mai multor aciziaminai de la extremitatea NH2 (secvena "peptid signal"). Numeroase proteine sunt sintetizate sub forma unui precursor inactiv (pro-hormon, proferment) care nu poate aciona asupra substratului; dup sintez, precursorul este clivat proteolitic i rezult o protein matur, activ funcional. Un exemplu sugestiv este reprezentat de sinteza insulinei (figura 4.20). Alteori dintr-un singur precursor proteic(de exemplu., proopiomelanocortina) se pot produce mai multe polipeptide cu funcie diferit

Hidroxilarea unor aminoacizi, de exemplu prolina i lizina n cazul colagenului, asigur stabilitatea unor complexe proteice (tripla elice de colagen).

Glicozilarea este un proces ntlnit n cazul glicoproteinelor, care sunt de regula fie secretate, fie localizate la suprafata celulelor. Glicozilarea poate fi iniat la nivelul RE (N-glicozilarea unei asparagine prin adugarea unui oligozaharid comun alctuit din 14 reziduuri glucidice care va fi procesat ulterior) sau n interiorul aparatului Golgi (O-glicozilarea unei serine prin ataarea unui rest de N-acetilglucozamin sau a unei treonine).

Adugarea de lipide este caracteristic proteinelor care vor fi ancorate n membrana plasmatic. n cazul proteinelor care se vor localiza la faa intern a membranei plasmatice pot fi ntlnite trei tipuri principale de adiii lipidice: N-miristoilarea (la nivelul glicinei situate la extremitatea amino a proteinelor), prenilarea (la nivelul lanurilor laterale ale aminoacizilor ramificai: cisteina, serina si treonina) i palmitoilarea (la nivelul atomului de sulf al cisteinei). n cazul proteinelor care se localizeaz la faa extern a membranei plasmatice sunt ataate grupri glicolipidice, de regul la captul C-terminal al lanului peptidic.

Proteinele pot fi compuse din unul sau mai multe polipeptide (formnd o protein multimeric; de exemplu, hemoglobina, fibrele de colagen etc), fiecare fiind supuse unor modificri posttranslaionale. Astfel, ele pot intraciona cu o serie de cofactori specifici (de exemplu, cationi bivaleni Ca+2, Fe+2, Cu+2, Zn+2 sau molecule mici necesare activitii enzimatice, cum ar fi NAD+) sau liganzi. Toate acestea vor influena puternic conformaia i deci activitatea proteinei.

5. SINTEZA PROTEINELOR , ORIGINEA I EVOLUIA VIEII .

Originea acizilor nucleici i a proteinelor, a codului genetic, a aparatului i mecanismului de translaie sunt probleme interesante i actuale, deoarece ele reprezint, n esen, substratul biochimic al originii vieii. Faptele certe sunt puine iar ipotezele numeroase i divergente. Dogma central a geneticii: ADN ARN proteine implic existena unor molecule informaionale dar i a unor proteine catalitice care s realizeze diferitele etape ale transferului informaiei genetice. Se pune firesc ntrebarea: cine a aprut mai nti pe Pmnt, proteinele sau acizii nucleici; dac se acord prioritate acizilor nucleici atunci nimeni nu poate rspunde la ntrebarea: cum a fost posibil replicarea, transcripia sau translaia acizilor nucleici n absena unor proteine catalitice. Astfel, la nivel molecular, clasica dilem "oul sau gina" se traduce printr-o nou dilem "acizii nucleici sau proteinele".

ADN nu poate fi "molecula originar" deoarece este lipsit de activiti catalitice. Recent s-au descoperit ns ribozimele, molecule de ARN dotate cu activitate catalitic i s-a presupus c ARN ar putea fi n acelai timp o molecul informaional i enzimatic, putnd s realizeze singur stocarea, conservarea i expresia informaiei ereditare. S-ar putea deci

23

prezuma c viaa a nceput "n supa prebiotic" prin formarea spontan a moleculelor de ARN, amino acizi i polipeptide care, acionnd n simbioz, ar fi realizat complexe ribonucleoproteice capabile de "proliferare i perenizare". Foarte probabil, ARN a aprut naintea ADN. Caracterul chimio-reactiv al sistemului determin ns instabilitatea sa i riscul de auto-distrugere. Pentru a evita acest lucru