universitatea de medicinĂ Şi facultatea de … doctorat/rezumat... · corelaţii în raport de...

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “GR. T. POPA” IAŞI FACULTATEA DE MEDICINĂ

CANCERUL COLORECTAL METASTAZAT HEPATIC:

FACTORI CLINICI, MORFOLOGICI ŞI IMUNOLOGICI

DE PROGNOSTIC

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC PROF. DR. EUGEN TÂRCOVEANU

DOCTORAND SIMONA ELIZA GIUŞCĂ

2010

Alese mulţumiri: Prof. dr. Eugen Târcoveanu, pentru provocarea de a trece de la contextul clinic chirurgical la cel tisular, celular şi molecular. Prof. dr. Eugen Carasevici, Şef lucrări dr. Florin Eloae Zugun, pentru provocarea de a trece de la contextul tisular, celular şi molecular static la cel dinamic, de dialog. Conf. dr. Bogdan Dragoş Grigoriu, pentru provocarea de a trece de la contextul tisular, celular şi molecular la cel matematic.

i

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT 1. EVENIMENTE BIOLOGICE ÎN CARCINOGENEZA COLORECTALĂ 1 1.1. IDENTIFICAREA ŞI CUANTIFICAREA MUTAŢIILOR – ALTERAREA SECVENŢEI ADN ÎN CANCERUL COLORECTAL 2

1.2. ANEUPLOIDIA 2 1.3. MECANISME PATOGENICE 2 1.3.1. INSTABILITATEA CROMOZOMIALA 3 1.3.2. INSTABILITATEA MICROSATELITILOR 5 1.3.3. GRADUL DE METILARE AL ADN-ULUI - FENOTIPUL METILATOR INSULAR CPG 6 1.4. CONSIDERAŢII FINALE 7 2. EVENIMENTE BIOLOGICE ÎN CASCADA METASTATICĂ ASOCIATĂ CANCERULUI COLORECTAL 8

2.1. ANGIOGENEZA 9 2.2. AFECTAREA ADEZIUNII CELULARE LA NIVELUL TUMORII PRIMARE 11 2.2.1. PIERDEREA EXPRESIEI E-CADHERINEI 11 2.2.2. BETA-CATENINA 12 2.2.3. VIMENTINA 12 2.2.4. FAMILIA FACTORILOR DE TRANSCRIPŢIE NUCLEARI SNAIL 12 2.2.5. INTEGRINELE 13 2.2.6. PROTEINE IMUNOGLOBULIN-LIKE 13 2.3. DISTRUGEREA MEMBRANEI BAZALE ŞI INIŢIEREA INVAZIEI TUMORALE 14 2.4. SECHESTRAREA ŞI ADEZIUNEA CELULELOR METASTATICE TUMORALE ÎN ORGANELE ŢINTĂ 16

2.5. PROLIFERAREA ÎN ORGANELE ŢINTĂ 17 2.6. CONSIDERAŢII FINALE 18 3. FACTORI DE PROGNOSTIC ÎN CANCERUL COLORECTAL 19 3.1. CONSENSUL COLEGIULUI AMERICAN AL PATOLOGILOR 19 3.2. O NOUĂ CLASIFICARE 20 3.3. FACTORI DE PROGNOSTIC BINE STABILIŢI ŞI ADIŢIONALI 20 3.3.1. CATEGORIA TNM 20 3.3.2. INVAZIA VENOASA SI LIMFATICA 21 3.3.3. GRADING-UL TUMORAL 21 3.3.4. ÎNMUGURIREA TUMORALA 22 3.3.5. CONFIGURATIA MARGINILOR TUMORALE 22 3.4. FACTORI MOLECULARI 22 3.4.1. INSTABILITATEA MICROSATELITA 22 3.4.2. 18QLOH ŞI PIERDEREA ALELICĂ A GENEI DCC 23 3.4.3. P53 23 3.4.4. PROFILUL EXPRESIEI GENICE 23 3.4.5. ANTIGENE ASOCIATE TUMORII 24 3.4.6. INDICI DE PROLIFERARE 24 3.4.7. IMUNITATEA TUMORALA 25 3.5. ALŢI FACTORI 25 3.5.1. FACTORI MORFOLOGICI 25 3.5.1.1. Aspectul macroscopic al tumorii 25 3.5.1.2. Tipul histopatologic 25 3.5.1.3. Invazia perineurală 25 3.5.1.4. Angiogeneza tumorală 26 3.5.1.5. Infiltraţia intratumorală cu mastocite 26 3.5.1.6. Tipul de reacţie din limfoganglionii loco-regionali 26 3.5.2. FACTORI CLINICI 26 3.5.2.1. Vârsta 26 3.5.2.2. Sexul 26 3.5.2.3. Obstrucţia şi perforaţia 26 3.5.2.4. Localizarea tumorii primare 26 3.5.2.5. Sindroamele genetice 26 3.5.2.6. Durata simptomatologiei 26 3.5.3. FACTORI LEGAŢI DE TERAPIE 27 3.5.3.1. Rezecţia completă a tumorii primare 27 3.5.3.2. Chimioterapia 27 3.5.3.3. Radioterapia 27 3.5.3.4. Transfuziile de sânge 27 3.6. CONSIDERAŢII FINALE 27 4. MARKERI MOLECULARI DE PROGNOSTIC ÎN METASTAZELE HEPATICE SECUNDARE CANCERULUI COLORECTAL 28

ii

4.1. ONCOGENELE 29 4.1.1. K-RAS 29 4.1.2. EGFR 30 4.2. GENELE SUPRESOR TUMORALE 30 4.2.1. P53 30 4.2.2. P21 31 4.2.3. DCC/SMAD4 31 4.3. INDICI DE PROLIFERARE 31 4.4. TELOMERAZA 32 4.5. TIMIDILAT SINTAZA 32 4.6. FACTORII DE REGLARE AI APOPTOZEI 32 4.7. INSTABILITATEA GENOMICĂ 32 4.7.1. ANEUPLOIDIA/INSTABILITATEA CROMOZOMIALĂ 32 4.7.2. INSTABILITATEA MICROSATELITILOR 33 4.7.3. EVALUAREA PROCENTUALĂ A ALTERĂRII GENOMICE 33 4.8. ANGIOGENEZA 33 4.8.1.DENSITATEA MICROVASCULARA 33 4.8.2. VEGF 34 4.8.3. TROMBOSPONDINA 1 34 4.9. INVAZIA TUMORALĂ 34 4.9.1. MOLECULELE DE ADEZIUNE 34 4.9.2. METALOPROTEINAZELE 34 4.10. MARKERI MOLECULARI PREDICTIVI 34 4.11. CONSIDERAŢII FINALE 34 5. TRATAMENTUL METASTAZELOR HEPATICE SECUNDARE CANCERULUI COLORECTAL 36

5.1. TRATAMENTUL CHIRURGICAL – REZECŢIA 36 5.1.1. EVALUAREA SI SELECTIA PACIENTILOR 36 5.1.2. INDICAŢIA PENTRU REZECŢIE – CRITERII ÎN SCHIMBARE 37 5.1.3. PRINCIPII GENERALE, TEHNICA 39 5.1.4. MANAGEMENTUL CHIRURGICAL AL MTS HEPATICE SINCRONE 40 5.2. TERAPII ABLATIVE (DE DISTRUCŢIE) 40 5.1.2. CRIOABLAŢIA 41 5.2.2. ABLATIA PRIN RADIOFRECVENTA 41 5.2.2.1. Principiul metodei 42 5.2.2.2. Strategii de creştere a dimensiunilor zonelor de ablaţie 43 5.2.2.3. Maniera de realizare 44 5.2.2.4. Controlul imagistic al rezultatelor 44 5.2.2.5. Limite, contraindicaţii 45 5.2.2.6. Eficacitate terapeutică 45 5.2.3. DISTRUCTIA TUMORALA (COAGULAREA) CU MICROUNDE 45 5.2.3.1. Principiul metodei 45 5.2.3.2. Aplicabilitate 46 5.2.3.3. Complicaţii 46 5.2.4. INJECTAREA PERCUTANATĂ DE ETANOL 46 5.2.4.1. Principiul metodei 46 5.2.4.2. Aplicabilitate 47 5.2.5. FOTOCOAGULAREA INTERSTITIALA PRIN LASER 47 5.2.5.1. Principiul metodei 47 5.2.5.2. Aplicabilitate 47 5.2.6. ULTRASUNETELE DE INTENSITATE INALTA 47 5.2.6.1. Principiul metodei 47 5.2.6.2. Aplicabilitate 48 5.2.7. RADIOTERAPIA 48 5.2.7.1. Principiul metodei 48 5.2.7.2. Aplicabilitate 48 5.3. ASOCIERI TERAPEUTICE 48 5.3.1. CHIMIOTERAPIE NEOADJUVANTA SISTEMICA SAU LOCOREGIONALA ASOCIATA REZECTIEI 49 5.3.2. EMBOLIZARE PORTALA PREOPERATORIE ASOCIATA REZECTIEI 49 5.3.3. REZECŢIE ASOCIATĂ CU EMBOLIZARE PORTALĂ 49 5.3.4. REZECTIE ASOCIATA CU CHIMIOTERAPIE 49 5.3.5. REZECTIE ASOCIATA CU TEHNICI DE ABLATIE 49 5.3.6. REZECŢIA REPETITIVĂ (RE-REZECŢIA), ASOCIATĂ CU TEHNICI DE ABLAŢIE 50 5.4. CONSIDERAŢII FINALE 50 6. MOTIVAŢIA ŞI OBIECTIVUL STUDIULUI DOCTORAL 51 7. ALGORITMUL GENERAL AL STUDIULUI METASTAZELOR HEPATICE SECUNDARE CANCERULUI COLORECTAL 53

8. METASTAZE HEPATICE SECUNDARE CANCERULUI COLORECTAL – STUDIU CLINICO-MORFOLOGIC 57

iii

8.1. INTRODUCERE 57 8.2. CARACTERISTICILE GENERALE ALE LOTULUI STUDIAT 57 8.3. PARTICULARITĂŢILE APLICĂRII PROCEDURII DE TERMONECROZĂ CU VAPORI DE APĂ 67 8.3.1. DATE TEHNICE ASUPRA DISPOZITIVULUI MEDICAL 67 8.3.2. BILANTUL PREOPERATOR 68 8.3.3. DESCRIEREA PROCEDURII DE TERMONECROZĂ CU VAPORI DE APĂ 68 8.3.4. CARACTERISTICILE LOTULUI STUDIAT 69 8.4. REZECŢIA CHIRURGICALĂ 74 8.4.1. REZECŢIA CHIRURGICALĂ CLASICĂ 74 8.4.2. CARACTERISTICILE LOTULUI STUDIAT 74 8.5. FACTORI PROGNOSTICI ÎN METASTAZELE HEPATICE 78 8.5.1. CORELAŢII CU SUPRAVIEŢUIREA POST-TRATAMENT METASTAZĂ HEPATICĂ 78 8.5.1.1. Corelaţii în raport de trăsăturile clinico-morfologice ale tumorii primare 78 8.5.1.2. Corelaţii în raport de trăsăturile clinico-biologice ale metastazelor hepatice 81 8.5.1.3. Corelaţii în raport de tratamentul MTS hepatice 83 8.5.2. CORELAŢII CU INTERVALUL DE TIMP DINTRE TRATAMENTUL METASTAZEI HEPATICE ŞI RELUAREA DE EVOLUŢIE 85 8.5.2.1. Corelaţii în raport de trăsăturile clinico-morfologice ale tumorii primare 85 8.5.2.2. Corelaţii în raport de trăsăturile clinico-biologice ale metastazelor hepatice 89 8.5.2.3. Corelaţii în raport de tratamentul metastazei hepatice 91 8.6. DISCUŢII 93 8.6.1. VALOAREA PROGNOSTICĂ A UNOR CARACTERISTICI CLINICO-MORFOLOGICE ALE TUMORII PRIMARE 94 8.6.1.1. Variabile corelate semnificativ statistic 94 8.6.1.2. Variabile necorelate semnificativ statistic 96 8.6.2. VALOAREA PROGNOSTICĂ A UNOR TRĂSĂTURI CLINICO-BIOLOGICE ALE METASTAZEI HEPATICE 98 8.6.2.1. Variabile corelate semnificativ statistic 98 8.6.3. VALOAREA PROGNOSTICĂ A TIPULUI DE TRATAMENT APLICAT METASTAZEI HEPATICE 100 8.6.3.1. Variabile corelate semnificativ statistic 100 8.6.3.2. Variabile necorelate semnificativ statistic 101 8.6.4. CLASIFICAREA TNM – CRITERII OPERAŢIONALE 2010 103 9. METASTAZELE HEPATICE SECUNDARE CANCERULUI COLORECTAL - STUDIU CELULAR ŞI MOLECULAR 105

9.1. INTRODUCERE 105 9.2. MATERIAL ŞI METODĂ 106 9.2.1. SUBLOTURI DE STUDIU - BOALĂ METASTATICĂ RECURENTĂ DUPĂ TERMONECROZĂ VERSUS METASTAZE REZECATE CHIRURGICAL 106

9.2.2. PRINCIPII GENERALE ŞI ETAPE ÎN EXAMENUL ANATOMOPATOLOGIC ŞI IMUNOHISTOCHIMIC 106 9.2.3. ANALIZA STATISTICĂ 109 9.3. EVALUAREA ACTIVITĂŢII PROLIFERATIVE 109 9.3.1 REPERE FUNDAMENTALE 109 9.3.2. OBIECTIVE SPECIFICE 109 9.3.3. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI DE CUANTIFICARE 110 9.3.4. REZULTATE 110 9.3.4.1. Analiză calitativă 110 9.3.4.2. Analiză cantitativă 112 9.3.4.3. Analiza statistică – corelaţii cu supravieţuirea post-tratament metastază şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie 116

9.3.5. DISCUŢII 117 9.4. EVALUAREA INFILTRATULUI IMUN ŞI INFLAMATOR 118 9.4.1. REPERE FUNDAMENTALE 118 9.4.2. OBIECTIVE SPECIFICE 119 9.4.3. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI DE CUANTIFICARE 119 9.4.4. REZULTATE 119 9.4.4.1. Analiză calitativă 119 9.4.4.2. Analiză cantitativă 127 9.4.4.3. Analiza statistică – corelaţii cu supravieţuirea post-tratament metastază şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie 133

9.4.5. DISCUŢII 134 9.5. EVALUAREA PROCESULUI DE ANGIOGENZĂ ŞI LIMFANGIOGENEZĂ 136 9.5.1. REPERE FUNDAMENTALE 136 9.5.2. OBIECTIVE SPECIFICE 137 9.5.3. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI DE CUANTIFICARE 137 9.5.4. REZULTATE 137 9.4.5.1. Analiză calitativă 137 9.4.5.2. Analiză cantitativă 146 9.4.5.3. Analiza statistică – corelaţii cu supravieţuirea post-tratament metastază şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie 163

9.5.5. DISCUŢII 164 9.6. EVALUAREA POTENŢIALULUI DE INVAZIE METASTATICĂ: METALOPROTEINAZE ŞI INHIBITORI SPECIFICI 173

iv

9.6.1. REPERE FUNDAMENTALE 173 9.6.2. OBIECTIVE SPECIFICE 173 9.6.3. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI DE CUANTIFICARE 174 9.6.4. REZULTATE 174 9.6.5.1. Analiză calitativă 174 9.6.5.2. Analiză cantitativă 176 9.6.5.3. Analiza statistică – corelaţii cu supravieţuirea post-tratament metastază şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie 190 9.6.5. DISCUŢII 192 10. CONCLUZII 196 REFERINŢE BIBLIOGRAFICE 199 ANEXĂ: CONSIMŢĂMÂNT INFORMAT 219 ABREVIERI UTILIZATE APC eng. Adenomatous Polyposis Coli array CGH eng. Comparative Genomic Hybridization tip array CCR carcinom colorectal / carcinoame colorectale CD / CDs eng. Clusters of Differentiation CEA eng. Carcinoembryonal Antigen – antigenul carcinoembrionar CIMP eng. CpG Island Methylator Phenotype CT eng. Computer Tomography – tomografie computerizată DCC eng. Deleted in Colorectal Cancer DPC4/Smad4 eng. Deleted in Pancreatic Cancer EGF eng. Epidermal Growth Factor – factorul de creştere epidermic EGFR eng. Epidermal Growth Factor Receptor – receptorul factorului de creştere epidermic FDA eng. Food and Drugs Administration FGF eng. Fibroblast Growth Factor – factorul de creştere fibroblastic FISH eng. Fluorescence in Situ Hybridisation Flt eng. fms-like tyrosine kinase FTK eng. Fetal Liver Kinase HE Hematoxilină – Eozină HGF eng. Hepatocyte Growth Factor – factorul de creştere hepatocitar HNPCC eng. Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer IC instabilitate cromozomială CAM(s) (ICAM, PECAM) eng. Cellular Adhesion Molecule(s) – moleculă / molecule de adeziune intercelulară IGF eng. Insulin Growth Factor – factorul de creştere insulinic IGFR eng. Insulin Growth Factor Receptor– receptorul factorului de creştere insulinic IHC Imunohistochimie LOH eng. Loss of Heterogeneity – LOH – pierderea heterogenităţii LVD eng. lymphatic vessel density – densitatea limfatică (microlimfatică) MMP / MMPs Metaloproteinaze MMR eng. Missmatch Repair MRI eng. Magnetic Resonance Imaging – rezonanţă magnetică MSI eng. Microsatellite Instability – instabilitate microsatelită MSI-H / MSI-L eng. Microsatellite Instability – High / Low – instabilitate microsatelită de grad înalt / scăzut MSS eng. Microsatellite Stability – stabilitate microsatelită MTS Metastaze MVD eng. Microvessel Density – densitate microvasculară PCNA eng. Proliferative Cellular Nuclear Antigen – antigenul nuclear de proliferare celulară PCR eng. Polimerase Chain Reaction – reacţie de polimerizare în lanţ PDGF eng. Platelet-Derived Growth Factor – factorul de creştere derivat plachetar PET eng. Positron Emision Tomography – tomografie cu emisie de pozitroni PLGD eng. Placentar-like Growth Factor - factorul de creştere placentar-like PTLs eng. Peritumoral Lymphocytes - limfocite peritumorale RER+ eng. Replication Error positive – erori de replicare RFA eng. Radiofrequency Ablation – ablaţie prin radiofrecvenţă TAMs eng. Tumour Associated Macrophages – macrofage asociate tumoral TEMs eng. Tumour Endothelial Markers – markeri endoteliali tumorali TGF eng. Transforming Growth Factor - factorul de transformare a creşterii TGFR eng. Transforming Growth Factor Receptor – receptorul pentru factorul de transformare a

creşterii TILs eng. T Infiltrating Lymphocytes – limfocite T infiltrative TIMP (TIMPs) eng. Tissue Inhibitors Metalloproteinase - inhibitorilor tisulari endogeni ai metaloproteinazelor VEGF eng. Vascular Endothelial Growth Factor – factorul de creştere endotelial vascular) VEGFR eng. Vascular Endothelial Growth Factor Receptor – receptorul pentru factorul de creştere

endotelial vascular

Cancerul colorectal metastazat hepatic: markeri clinici, morfologici şi imunologici de prognostic

1

CAPITOLUL 6. MOTIVAŢIA ŞI OBIECTIVUL STUDIULUI PERSONAL Cancerele primare colorectale, pancreatice, gastrice, ovariene, pulmonare şi ale glandei mamare evoluează, în

procent de peste 50%, prin metastazare hepatică unică sau în asociere cu alte situsuri. Neoplasmul hepatic secundar constituie o patologie cu prognostic nefavorabil, greu de diagnosticat în stadii incipiente şi dificil de tratat. În absenţa unui tratament curativ şi în condiţiile în care răspunsul la chimioterapia standard este adesea modest, speranţa de viaţă pentru cei mai mulţi dintre aceşti pacienţi este de doar 6-10 luni.

Prin incidenţa în creştere, CCR reprezintă principala cauză de apariţie, la nivel hepatic, a leziunilor maligne secundare. Mai mult, ficatul este considerat la ora actuală un organ imunologic particular, metastazarea la acest nivel având un potenţial crescut de tolerabilitate, prin acţiunea unei palete largi de factori imunologici.

Pornind de la aceste considerente generale, alegerea temei de cercetare pentru studiul doctoral a fost fundamentată în baza a trei argumente principale:

- în plan mondial este recunoscută necesitatea aprofundării nivelului de cunoaştere a bazei biologice de dezvoltare a procesului de metastazare hepatică în general, şi a celui secundar localizării primare colorectale în particular, mecanismele intrinseci ale carcinogenezei fiind incomplet elucidate;

- direcţiile de cercetare curente sunt orientate atât în domeniul clinic (prin eficientizarea diagnosticului precoce, monitorizarea grupelor de risc, optimizarea terapiilor existente şi validarea eficienţei practice a unor noi metode terapeutice), cât şi în cel fundamental (prin amplificarea caracterului descriptiv al studiilor de biologie moleculară şi elucidarea interrelaţiilor de comunicare celulară stabilite între ţesutul malign şi micromediul hepatic gazdă);

- eficienţa sistemelor terapeutice depinde de gradul în care identifică, includ şi controlează ţintele relevante prezente la nivel tisular, celular şi molecular, cu rezultat în posibilitatea introducerii de metode noi şi/sau de aplicare personalizată a tratamentului.

Consecutiv, tema stabilită constituie un subiect de actualitate ştiinţifică, cu rezultate potenţial recognoscibile şi validate prin raportare în fluxul principal de publicaţii. Mai mult, cercetarea realizată este caracterizată, prin prisma originalităţii, de un element terapeutic novator: termonecroza cu vapori de apă, metodă paliativă practicată în Clinica I Chirurgie a Spitalului Clinic „Sf. Spiridon” Iaşi printr-un parteneriat cu Centrul de Studii şi Cercetări Medicale (CERMA) din Archamps, Franţa.

În mod concret, obiectivul general urmărit a constat în validarea relevanţei de agresivitate şi de predicţie a unui panel de markeri moleculari, în asociere cu markerii uzuali, clinici şi morfologici. În construcţia tezei, în partea personală organizată în două studii distincte, sunt stabilite obiective specifice – în raport de tipul de investigaţie realizat şi, respectiv, de fiecare marker în parte.

Pentru îndeplinirea obiectivului general şi a obiectivelor specifice, studiul doctoral asupra MTS hepatice secundare CCR a impus o abordare complexă, interdisciplinară, care a reunit contextul clinic – chirurgical cu cel al biologiei tumorale, definit prin parametri de proliferare, răspuns imun specific, apărare nespecifică, angiogeneză/limfangiogeneză şi modelare matricială. Datele obţinute s-au concretizat în trasarea unui profil clinico-biologic evolutiv al MTS hepatice secundare CCR şi corelarea acestuia cu supravieţuirea. Derularea studiului doctoral a necesitat, complementar statutului de doctorand în specialitatea Chirurgie, integrarea mea în cadrul Platformei Interdisciplinare de Medicină Moleculară din cadrul U.M.F. „Gr. T. Popa” Iaşi şi pregătirea corespunzătoare pentru practicarea tehnicilor de histopatologie şi imunohistochimie, precum şi o instruire în domeniul statisticii biomedicale, pentru realizarea corelaţiilor statistice. Oportunitatea acestei pregătiri a fost posibilă prin participarea în echipa de cercetare a grantului CEEX 122 / 2006-2008 – Criterii de selecţie a metodelor terapeutice în cancerul hepatic secundar : fundamentare clinico-biologică şi moleculară. Formarea mea a avut ca rezultat concret, pentru teza de doctorat, generarea şi evaluarea datelor referitoare la evoluţie şi predicţie, utilizând puterea analitică a tehnicilor moderne de biologie pentru identificarea şi validarea unor factori prognostici moleculari, care surclasează viziunea tradiţională oferită de factorii prognostici clinici şi morfologici. Cu toate acestea, înţelegerea consistenţei funcţionalităţii factorilor moleculari în patogenia progresiei neoplazice este un subiect deschis pentru o lungă perspectivă. Natura lor redundantă, heterogenitatea în raport cu tipul histologic primar, interferenţele imunologice şi biochimice complică deopotrivă evoluţia şi răspunsul la terapie, astfel încât suntem departe de a avea răspunsuri cu valoare de adevăr ştiinţific absolut.

CAPITOLUL 7. ALGORITMUL GENERAL AL STUDIULUI METASTAZELOR HEPATICE

SECUNDARE CANCERULUI COLORECTAL

Cercetarea realizată, structurată ca şi prezentare în două capitole separate, primul dedicat studiului clinico-morfologic şi cel de al doilea – studiului celular şi molecular, a parcurs – în desfăşurarea efectivă – o serie de etape comune ambelor studii, completate cu etape individualizate pentru cele două tipuri de evaluări. Succesiunea acestor etape, stabilită în momentul începerii stagiului doctoral, a fost adaptată pe parcurs, în raport de particularităţile materialului şi metodelor utilizate. A rezultat, astfel, un algoritm general care a ghidat investigarea MTS hepatice secundare CCR. Prezentarea sa separată este justificată prin faptul că oferă o imagine de ansamblu asupra paşilor parcurşi şi face posibilă evitarea repetărilor şi suprapunerilor în cele două capitole principale care constituie contribuţia personală – în cadrul acestora fiind prezentate, detaliat, elemente specifice legate de material şi, mai ales, de metodele diferite utilizate.

În dinamică, etapele principale ale cercetării realizate au fost următoarele:


2

• Includerea pacienţilor în lotul de studiu Lotul a fost constituit din 61 pacienţi internaţi pentru diagnostic şi tratament în Clinica I Chirurgie, Spitalul

Sf. Spiridon Iaşi, în perioada 2004-2008. Subiecţii au fost incluşi în lotul investigat pe bază de voluntariat, fiind informaţi în mod clar şi complet asupra particularităţilor tratamentului, cu avantaje şi riscuri, şi completând un consimţământ informat (Anexa 1). Studiul a fost avizat de Ministerul Sănătăţii, de Comisia de Etică a U.M.F. „Gr. T. Popa” Iaşi şi de Comisia de Etică a Spitalului Universitar „Sf. Spiridon” Iaşi. • Tratamentul metastazelor

Au fost aplicate două metode diferite de tratament: termonecroza cu vapori de apă şi rezecţia chirurgicală. Pentru aplicarea termonecrozei cu vapori de apă, pacienţii au fost evaluaţi în conformitate cu un panel de criterii de

includere / respectiv excludere, stabilit de o echipă medicală formată din specialişti în chirurgie, oncologie, imagistică medicală, în baza unui protocol bine stabilit, cu respectarea principiilor de etică şi deontologie medicală. Numărul pacienţilor care au beneficiat de acest tratament paliativ a fost 40.

Criteriile operaţionale pentru indicaţia practicării termonecrozei cu vapori de apă au fost următoarele: - prezenţa a maximum 7 metastaze hepatice unice sau multiple inoperabile, secundare unui cancer colo-

rectal rezecat chirurgical; - absenţa metastazelor peritoneale sau cu alte localizări; - absenţa ascitei; - stare generală de sănătate satisfăcătoare care să permită anestezia generală şi o intervenţie clasică sau

laparoscopică (bilanţ preoperator: ecografie abdominală, examen CT, teste biologice de laborator). Criteriile de excludere au fost următoarele:

- prezenţa a peste 8 metastaze care interesează aproape în totalitate ficatul; - insuficienţă hepatică şi renală severă; - prezenţa de boli asociate care cresc riscurile pentru o intervenţie chirurgicală cu anestezie generală; - imposibilitatea de urmărire datorită contextului social.

Rezecţia chirurgicală a fost practicată pentru pacienţi cu MTS hepatice care nu au îndeplinit condiţiile de includere în lotul cu tratament prin termonecroză. Numărul pacienţilor care au beneficiat de tratamentul chirurgical prin rezecţie a fost 21. Intenţia terapeutică de radicabilitate (rezecţie R0) a vizat iniţial toate cazurile, dar marginea de securitate oncologică (2 cm) nu a putut fi respectată întotdeauna (rezecţie R1). Consecutiv, pentru 11 pacienţi a fost realizată rezecţie hepatică tip R0, iar pentru 10 pacienţi - tip R1. • Urmărirea pacienţilor

Postoperator, pacienţii au fost urmăriţi după protocolul obişnuit posthepatectomie, efectuându-se următoarele explorări paraclinice: probe biologice (hemo-leucogramă, trombocite, uree, creatinină, TGP, TGO, fosfatază alcalină, gamma-GT, PCR), ecografie abdominală, examen CT, CEA, examen anatomo-patologic din fragmente recoltate.

Pacienţii au fost internaţi pentru control iniţial la o lună, apoi la intervale de 6 luni, până la data încheierii studiului. Parametrii analizaţi la evaluările de control au fost următorii: evoluţia masei tumorale pe termen scurt şi lung; reapariţia tumorii; evoluţia constantelor biologice; evoluţia stării generale a pacientului; aprecierea calităţii vieţii pacientului pe perioada supravieţuirii. Monitorizarea a fost realizată, pentru toţi pacienţii, prin ecografie abdominală, cu urmărirea semnalului vascular în zonele tratate, iar în cazul suspiciunii de reluare de evoluţie investigaţiile au fost completate cu CT, IRM, PET scan.

• Investigarea profilului molecular al metastazelor hepatice Din totalul celor 61 de pacienţi componenţi ai lotului tratat prin termonecroză, respectiv rezecţie chirurgicală,

pentru 24 de pacienţi metastazele hepatice prelevate au fost investigate imunohistochimic. Cei 24 de pacienţi au fost încadraţi în două subloturi : sublotul 1 : 8 pacienţi cu MTS hepatice recurente post-

tratament anterior prin termonecroză (reluare de evoluţie), sublotul 2 : 16 pacienţi cu MTS hepatice per primam, tratate prin termonecroză şi rezecţie.

Examenul imunohistochimic a vizat caracterizarea unor parametri morfologici, celulari şi moleculari, asociaţi transformării maligne hepatice, care reflectă: indexul activităţii proliferative, componenta celulară de tip imun / inflamator asociată micromediului tumoral, profilul angiogenezei şi al limfangionezei, reacţia metaloproteinazelor şi a inhibitorilor specifici acestora.

• Organizarea bazei de date Baza de date a fost construită pentru a putea realiza o evaluare dinamică a profilului clinic, morfologic şi imunologic

al fiecărui pacient, din momentul includerii în studiu până la momentul ultimului contact. Această monitorizare a permis cunoaşterea datelor referitoare la supravieţuire.

• Analiza statistică a factorilor clinici, morfologici şi moleculari de prognostic Analiza statistică a utilizat programul SPSS – 17.00. Evaluarea pragului de semnificaţie a diferenţelor a fost

făcută după testul Log Rank cu interpretarea standard a semnificaţiei statistice pentru p<0,05. Capitolele 8 şi 9 sunt ilustrate prin 406 figuri şi 21 tabele. Rezumatul include un număr limitat din totalul acestora, menţinând numerotarea din teză.


3

CAPITOLUL 8. METASTAZE HEPATICE SECUNDARE CANCERULUI COLORECTAL – STUDIU CLINICO-MORFOLOGIC

8.1. INTRODUCERE

Pornind de la datele controversate existente în literatura de specialitate, referitoare la identificarea unor factori prognostici pozitivi şi negativi în relaţie cu evoluţia pacienţilor cu MTS hepatice, prezentul studiu a urmărit, pe un lot de pacienţi cu un profil clinico-morfologic particular, determinat de stadiul avansat, metastatic, al neoplaziei şi de aplicarea a două metode terapeutice, două obiective principale:

(i) evaluarea valorii prognostice a unor factori clinici, morfologici şi biologici operaţionali; (ii) introducerea şi evaluarea unor alţi factori, consideraţi factori prognostici potenţiali.

8.2. CARACTERISTICILE GENERALE ALE LOTULUI STUDIAT Lotul de studiu a fost format din 16 pacienţi de sex feminin (26,2%) şi 45 pacienţi de sex masculin (73,8%), cu

vârste între 36 şi, respectiv, 85 ani, vârsta medie la momentul diagnosticului metastazelor hepatice fiind 61,5 ± 10,58 ani (fig. 1). În analiza realizată, raportarea la tumora primară a fost esenţială, permiţând crearea unui fond de informaţii referitoare la momentul iniţial al diagnosticului şi tratamentului.

Stadializarea a fost realizată utilizând sistemul TNM elaborat de UICC-AJCC (eng. International Union Against Cancer - American Joint Committee on Cancer) (AJCC, 2002, Sobin, Wittekind, 2002), care coroborează informaţiile asupra gradului de invazie, existenţa şi numărul ganglionilor limfatici cu metastază şi existenţa metastazelor la distanţă.

Distribuţia cazurilor în raport de parametrii individuali T, N şi M este prezentată separat în figurile 2-4, cu rezultat în următoarea stadializare TNM: 4 cazuri (6,6%) - stadiul 2A, 1 caz (1,6%) - stadiul 2B, 2 cazuri (3,3) – stadiul 3A, 3 cazuri (4,9%) – stadiul 3B, 2 cazuri (3,3%) – stadiul 3C, 49 cazuri (80,3%)– stadiul 4 (fig. 5). Încadrarea majoritară în stadiul 4 atrage atenţia, constituind una dintre particularităţile lotului studiat – anume prezenţa sincronă, la momentul diagnosticului tumorii primare, a metastazelor hepatice, pentru 80,3% din cazuri.

Prezenţa metastazelor ganglionare, criteriu component al stadializării TNM şi AJCC, a fost completată cu date referitoare la procentul de limfoganglioni metastazaţi din numărul total de limfoganglioni prelevaţi – pentru 42 cazuri pentru care, în buletinul anatomo-patologic, a existat această informaţie. Analiza statistică descriptivă a relevat că prezenţa metastazelor ganglionare a interesat, în 12 cazuri (28,57%), sub 50% din ganglionii prelevaţi, în 8 cazuri (19,05%) – între 50-75% din ganglionii prelevaţi, iar în alte 8 cazuri (19,05%) –peste 75% din ganglionii prelevaţi; metastazele ganglionare au fost absente în 14 cazuri (33,33%) (fig. 6).

Din punct de vedere histopatologic, analiza statistică descriptivă a relevat următoarea distribuţie (fig. 7), în raport de variantele histologice standard: adenocarcinom slab diferenţiat – 15 cazuri (24,6%), adenocarcinom moderat diferenţiat – 43 cazuri (70,5%), adenocarcinom bine diferenţiat – 3 cazuri ( 4,9%). Sub raportul grading-ului tumoral, 41 cazuri (67,2%) au prezentat diferenţiere histologică moderată (G2), 17 cazuri (27,9%) au fost încadrate ca având un grading slab (G3), şi un număr foarte redus de cazuri (3 – 4,9%) au prezentat diferenţiere histologică înaltă (G1) (fig. 8).

Pentru evaluarea evoluţiei tumorii primare au fost analizate o serie de caracteristici clinico-morfologice clasice, care concentrează elemente de localizare, histopatologice şi biologice.

Tumora primară a avut, în ansamblul lotului studiat, următoarele localizări (fig. 9): 14 cazuri (23%) la nivelul colonului drept (cec, colon ascendent, unghi hepatic colon, jumătate dreaptă colon transvers), 21 cazuri (34%) la nivelul colonului stâng (jumătate stângă colon transvers, până la unghiul splenic al colonului, colon descendent, sigmoid), 26 cazuri (42,6%) la nivelul rectului (rect, joncţiune recto-sigmoidiană). Localizarea la nivelul colonului stâng şi a rectului, considerată, conform literaturii, factor de prognostic negativ, a fost prezentă la 47 cazuri (77%).

Examenul histopatologic a permis identificarea unor parametri care, conform datelor din literatură, au statut de factori de prognostic negativ. Emboliile tumorale vasculare au fost prezente în 49 cazuri (80,3%) (fig. 10), iar invazia perinervoasă în 24 cazuri (39,3%) (fig. 11). Suplimentar încadrării cazurilor în funcţie de diagnosticul anatomopatologic, am luat în considerare prezenţa ariilor de coloid (în mai puţin de 50% din masa tumorală) asociate tipurilor histologice adenocarcinom moderat şi, respectiv, bine diferenţiat. Din totalul celor 61 cazuri, 13 (21,3%) au asociat coloid (fig. 12), cu următoarea distribuţie: 8 cazuri diagnosticate ca adenocarcinom slab diferenţiat, 4 cazuri – adenocarcinom moderat diferenţiat şi 1 caz – adenocarcinom bine diferenţiat.

Sub raportul constantelor biologice, deoarece 44 pacienţi (72,1%) au avut valori scăzute ale hemoglobinei şi hematocritului, necesitând transfuzii perioperatorii, am introdus prezenţa / absenţa anemiei ca şi trăsătură biologică pentru caracterizarea lotului (fig. 13). Nivelul seric al antigenului carcino-embrionar a fost cuantificat pre-operator şi post-operator pentru 39 de pacienţi din cei 61, incluşi în lot. Valorile înregistrate au fost caracterizate printr-o variabilitate largă: pre-operator valoare minimă 7 ng/ml, valoare maximă 250 ng/ml, mediană 68 ng/ml; post-operator, datele au indicat clar scăderea nivelului CEA.

Sub raport terapeutic, 40 pacienţi (selectaţi în funcţie de criteriile protocolului implementat în Clinica I Chirurgie) au fost trataţi prin termonecroză cu vapori de apă, 8 din totalul acestora asociind şi rezecţie hepatică pentru biopsie sau rezecţie hepatică de reducere (eng. bulging), iar 21 pacienţi au fost trataţi exclusiv prin rezecţie hepatică (fig. 14). Din totalul de 61 de pacienţi, tratamentul chirurgical a fost realizat prin abord clasic pentru 51 cazuri (83,6%) şi abord celioscopic pentru 8 cazuri (13,1%), două cazuri necesitând conversie (3,3%).

Intervalul de timp la care s-a realizat tratamentul MTS hepatice a fost extrem de variabil, în raport de statutul sincron sau metacron al acestora şi de starea generală a pacienţilor. Pentru 31 cazuri cu metastaze hepatice sincrone (50,8%), intervenţia s-a făcut simultan cu tratamentul tumorii primare. Pentru celelalte 30 cazuri (49,2%), 18 cu metastaze hepatice sincrone şi 12 cu metastaze hepatice metacrone, intervenţia a avut loc la distanţă de tratamentul tumorii primare, cu un minimum de o lună şi un maximum de 71 luni. Pe ansamblul lotului, intervalul de timp dintre


4

tratamenul tumorii primare şi, respective, al MTS hepatice a avut o valoare mediană 0 şi o medie de 7,64 ± 14,26 luni. Numărul metastazelor a variat între una şi 12 (tabel 1), cu o mediană de 4 metastaze. Metastazele unice au fost în număr de 15, din care 11 au fost sincrone (3 termonecrozate în acelaşi timp operator cu rezecţia tumorii primare, 8 tratate prin rezecţie hepatică). Adenopatia hilară a fost identificată la 23 pacienţi (37,7%), fiind absentă la 38 pacienţi (62,3%).

Din punctul de vedere al chimioterapiei pre sau post-tratament chirurgical al MTS hepatice, pacienţii incluşi în lot au prezentat caracteristicile redate în tabelul 2, referitoare la asocierea cu terapia neoadjuvantă – inclusiv detalii asupra numărului de cure. În ansamblul lotului, pre-operator au asociat chimioterapie 17 pacienţi (27,87%), iar post-operator - 43 pacienţi (70,49%) (fig. 15, fig. 16).

Monitorizarea pacienţilor a permis, în raport de data controalelor periodice (respectiv data ultimului contact pentru pacienţii care supravieţuiesc, şi data decesului pentru ceilalţi), o apreciere exactă a supravieţuirii.

Pornind de la data diagnosticului / tratamentului tumorii primare, a MTS hepatice şi a reluării de evoluţie pentru MTS hepatice, profilul lotului a fost următorul:

- supravieţuirea de la data diagnosticului / tratamentului tumorii primare a avut valoarea mediană de 28 luni (între 16,68 şi 39,31 luni) (fig. 17);

- intervalul de timp până la progresia bolii (intervalul de timp dintre diagnosticul / tratamentul MTS hepatice şi reluarea de evoluţie) a avut valoarea mediană de 18 luni (între 14 şi 21,93 luni) (fig. 18);

- supravieţuirea de la data diagnosticului / tratamentului MTS hepatice a avut valoarea mediană de 22 luni (între 14,34 şi 29,65 luni) (fig. 19).

Fig. 17. Curba de supravieţuire KM în raport de diagnosticul tumorii primare

Fig. 18. Curba de supravieţuire KM în raport de intervalul de timp până la reluarea de evoluţie

Fig. 19. Curba de supravieţuire KM în raport de diagnosticul metastazei hepatice

8.3. PARTICULARITĂŢILE APLICĂRII PROCEDURII DE TERMONECROZĂ CU VAPORI DE APĂ Pornind de la conceptul tratamentului minim invaziv, Centrul de Studii şi Cercetări Medicale (CERMA) din

Archamps, Franţa a creat o tehnică nouă, care se bazează pe un principiu cunoscut, similar radiofrecvenţei, laserului, criochirurgiei, şi anume termonecroza metastazelor hepatice prin vapori de apă sub presiune. Această tehnică a fost introdusă în anul 2004 în Clinica I Chirurgie, Spitalul Universitar „Sf. Spiridon” Iaşi, printr-un acord de parteneriat ştiinţific stabilit cu grupul de lucru din Archamps. Tehnica nu exclude tratamentele cunoscute şi permite tratarea minim invazivă a tumorilor care nu sunt accesibile tehnicilor concurente datorită volumului şi/sau poziţionării anatomice.

Sunt prezentate: 8.3.1. Date tehnice asupra dispozitivului medical 8.3.2. Bilanţul preoperator 8.3.3. Descrierea procedurii de termonecroză cu vapori de apă

Pacienţii au fost pregătiţi după protocolul obişnuit pentru o hepatectomie, prin abord clasic (fig. 23, 24) sau laparoscopic (fig. 25, 26). Poziţionarea acului în centrul metastazei (fig. 27) s-a efectuat sub control ecografic intraoperator (fig. 28). Numărul de impulsuri şi volumul de apă au fost apreciate în funcţie de volumul tumoral. Distrugerea completă a tumorii a fost apreciată ecografic, prin apariţia unei arii hiperecogene care acoperă şi depăşeşte aria iniţială a tumorii. Intraoperator au fost urmărite numărul şi diametrul (volumul) formaţiunilor tumorale tratate, precizarea sediului pe segmente pe o cartogramă hepatică, numărul de aplicaţii, volumul de apă folosit, numărul de ţinte, energia aplicată. Toate aceste date au fost înregistrate în foaia de observaţie a pacientului. 8.3.4. Caracteristicile lotului studiat

Evaluarea momentului diagnosticului metastazelor hepatice, în raport de momentul diagnosticului tumorii primare, a permis încadrarea metastazelor ca sincrone în 32 cazuri şi, respectiv, metacrone în 8 cazuri. Termonecroza cu vapori de apă a fost practicată simultan cu rezecţia tumorii primare pentru 16 cazuri (40%) din cele 32 încadrate ca metastaze sincrone (fig. 29-33), şi la distanţă de tratamentul tumorii primare pentru celelalte 24 de cazuri (60%), în ansamblul cărora 16 cazuri au fost metastaze sincrone şi 8 cazuri – metastaze metacrone. Abordul chirurgical pentru realizarea termonecrozei cu vapori de apă a fost de tip clasic pentru 32 de cazuri (80%) şi laparoscopic pentru 8 cazuri (20%), cu menţiunea că în două din cele 8 cazuri a fost necesară conversia la tehnica clasică.

Localizarea metastazelor pe segmente hepatice nu este relavantă pentru caracterizarea în ansamblu a lotului, deoarece numărul acestora a fost extrem de variabil: între una şi 12, cu o mediană de 6 metastaze (tabel 3), fiecare pacient având o distribuţie particulară. Dimensiunea metastazelor a fost între 0,5 şi 10 cm. Metastazele unice au fost în număr de 5: 3 au fost sincrone şi tratate concomitent cu rezecţia tumorii primare, 2 au fost metacrone, fiind


5

termonecrozate la un interval de 20, respectiv 21 luni de la tratamentul chirurgical al tumorii primare. Pentru metastazele multiple, numărul de ţinte pentru termonecroză a fost stabilit în raport de dimensiunile şi localizarea fiecăreia, importantă fiind, în concordanţă cu afirmaţiile anterioare referitoare la localizare, adiacenţa faţă de structurile vasculo-biliare importante – care limitează accesul procedurii terapeutice (tabel 3).

În raport de dimensiunile particulare ale fiecărei formaţiuni metastatice, a fost înregistrată o variabilitate a numărului de puncţii şi au fost adaptate: timpul de aplicare a procedurii, cantitatea de vapori de apă utilizată şi cantitatea de energie necesară. Timpul de aplicare a variat între 12-13 minute, cu o mediană de 10,00 minute, fiind evaluat la jumătate din timpul de aplicare a radiofrecvenţei. Cantitatea de vapori de apă utilizată a fost de minim 4 ml şi maxim 80 ml, cu o mediană de 20,50 ml. Energia aplicată a avut valori cuprinse între 6700 J (minimum) şi 134000 J (maximum), cu o valoare mediană de 33500 J. Figurile 34-41 sunt relevante pentru ilustrarea tratamentului MTS hepatice prin termonecroză cu vapori de apă.

Fig. 35. Termonecroza unui conglomerat de metastaze dezvoltate în segmentul III hepatic

Fig. 46. Hepatectomie dreaptă după down-staging realizat prin termonecroză şi chimioterapie: aspectul tranşei de secţiune

Trebuie menţionat faptul că, pentru 8 cazuri din totalul celor tratate prin termonecroză cu vapori de apă,

procedura paliativă a urmărit reducerea volumului tumoral total (eng. down-stanging), în scopul de a permite, ulterior, rezecţia hepatică (fig. 42-49). 8.4. REZECŢIA CHIRURGICALĂ 8.4.1. Rezecţia chirurgicală clasică

Tehnica chirurgicală clasică (deschisă) este fundamentată prin protocoale standard (Popescu, 2004, Lupaşcu, Moldovanu, 2007). Conform experienţei operatorii a Clinicii I Chirurgie, practicarea rezecţiei chirurgicale în cazul MTS hepatice secundare CCR a inclus următoarea succesiune de timpi: 8.4.2. Caracteristicile lotului studiat

În conformitate cu criteriile pentru stabilirea rezecabilităţii, în raport de marginea chirurgicală asigurată în limite de siguranţă oncologică, cele 21 cazuri tratate prin rezecţie chirurgicală au fost încadrate în două categorii: (i) sublotul 1: rezecţie curativă (R0), în condiţiile în care rezecţia tumorală a fost completă, iar dimensiunea marginii chirurgicale de siguranţă de minimum 1 cm; (ii) sublotul 2: rezecţie paliativă (R1), în condiţiile în care rezecţia tumorală a fost incompletă, datorită numărului de metastaze existente, a dimensiunilor şi a localizării acestora marginea chirurgicală de siguranţă fiind sub 1 cm. Numărul de metastaze hepatice (între 1 şi 8, cu o valoare mediană de două metastaze) şi distribuţia pe cazuri sunt prezentate în tabelul 4.

Sublotul 1 a inclus 11 pacienţi, la 8 pacienţi metastazele hepatice fiind sincrone, iar la 3 pacienţi –metacrone. Pentru metastazele hepatice sincrone, 7 pacienţi au beneficiat de rezecţia concomitentă a metastazelor şi a

tumorii primare, la un singur pacient rezecţia hepatică fiind practicată după 6 luni de la tratamentul tumorii primare. Toate aceste cazuri au fost rezolvate chirurgical prin abord clasic (fig. 50-57). Pentru metastazele hepatice metacrone, în două cazuri rezecţia a fost practicată prin abord clasic şi într-un caz - prin laparoscopie. Tipurile de rezecţie chirurgicală efectuată sunt prezentate în tabelul 5.

Sublotul 2 a inclus 10 pacienţi, 9 dintre aceştia prezentând metastaze hepatice sincrone, un singur caz dezvoltând metastază hepatică metacronă. Cele 9 cazuri cu metastaze hepatice sincrone au beneficiat de rezecţia concomitentă a metastazelor şi a tumorii primare, prin abord clasic (fig. 58-61). Pentru pacientul cu metastază hepatică metacronă, rezecţia hepatică a fost efectuată pe cale laparoscopică. Tipurile de rezecţie chirurgicală efectuate sunt prezentate în tabelul 6. 8.5. FACTORI PROGNOSTICI ÎN METASTAZELE HEPATICE

Pornind de la particularităţile diagnostice şi terapeutice ale lotului investigat, am realizat o analiză statistică complexă care a urmărit prezenţa sau absenţa corelaţiilor cu semnificaţie statistică între caracteristici corespondente supravieţuirii şi caracteristici corespondente procesului tumoral.

Caracteristicile corespondente supravieţuirii au fost separate pe două direcţii: supravieţuirea post-tratament MTS şi supravieţuirea până la reluarea de evoluţie. Caracteristicile corespondente procesului tumoral au inclus 3 direcţii de diferenţiere, în raport de: (i) trăsăturile clinico-morfologice ale tumorii primare; (ii) tratamentul metastazei hepatice, (iii) trăsăturile clinico-morfologice ale metastazelor hepatice.


6

8.5.1. CORELAŢII CU SUPRAVIEŢUIREA POST-TRATAMENT METASTAZĂ HEPATICĂ 8.5.1.1. Corelaţii în raport de trăsăturile clinico-morfologice ale tumorii primare • Factorul prognostic grad de invazie tumorală (T)

Analiza de regresie Cox în relaţie cu supravieţuirea post-tratament MTS a relevat faptul că stadiul T4 are cea mai puternică influenţă negativă (p = 0,028). Comparând, prin analiza Kaplan-Meier, supravieţuirea post-tratament MTS în cazul tumorilor primare T4 versus tumori primare T2, T3, rezultatele au indicat o valoare semnificativ statistică pentru T4 (p = 0,005), cu o supravieţuire mediană de 16 luni (între 13,82 şi 18,17 luni), spre deosebire de supravieţuirea mediană pentru cazurile T2, T3, de 37 luni (între 18,34 şi 55,65 luni) (fig. 62). Datele indică faptul că stadiul T4 reduce supravieţuirea post-tratament MTS, comparativ cu stadiul T2 şi T3, cu 53,3%. • Factorul prognostic invazia în ganglionii limfatici (N)

Analiza de regresie Cox a pus în evidenţă o corelaţie semnificativ statistică (p = 0,012), cu menţiunea că stadiul N2 prezintă influenţa negativă cea mai puternică (p = 0,007). Datele obţinute pentru stadiul N2 au indicat o scădere a supravieţuirii cu 59%, comparativ cu stadiul N0 şi N1. Curbele de supravieţuire Kaplan-Meier au arătat o supravieţuire crescută în absenţa invaziei ganglionare, comparativ cu prezenţa, cu o valoare mediană de 14 luni (între 10,6 şi 17,39 luni) pentru stadiul N2, respectiv 28 luni (între 14,79 şi 41,20 luni) pentru stadiile N0 şi N1 (fig. 63, 64).

Fig. 62. Curba de supravieţuire KM în raport de gradul de invazie tumorală (T)

Fig. 63. Curba de supravieţuire KM în raport de prezenţa sau absenţa invaziei tumorale în ganglionii limfatici (N)

Fig. 64. Curba de supravieţuire KM, comparativ N2 versus N0, N1

Am considerat că parametrul implicare ganglionară influenţează nu numai prin stadiul N prezent, dar şi prin numărul efectiv de ganglioni metastazaţi. Am analizat supravieţuirea post-tratament MTS în funcţie de această variabilă, introducând un prag (eng. cut-off) de minimum 4 limfoganglioni. Analiza de regresie Cox a indicat o corelaţie semnificativă (p = 0,001), pentru fiecare ganglion metastazat supravieţuirea scăzând cu 15%. Analiza Kaplan-Meier a susţinut rezultatele analizei de regresie Cox printr-o valoare semnificativă statistic (p = 0,001), valoarea mediană a curbei de supravieţuire fiind 14 luni (între 11,82 şi 16,18 luni) în cazul pacienţilor cu minimum sau mai mult de 4 limfoganglioni metastazaţi, în timp ce pentru pacienţii cu mai puţin de 4 limfoganglioni implicaţi valoarea mediană a curbei a depăşit valoarea maximă a lotului (fig. 65). • Factorul prognostic embolii tumorale vasculare

În raport de prezenţa emboliilor tumorale vasculare, analiza de regresie Cox a pus în evidenţă o corelaţie semnificativ statistică (p = 0,025) cu supravieţuirea post-tratament MTS, care scade cu 70% în comparaţie cu cazurile fără embolii. Curbele Kaplan-Meier au relevat rezultate similare (p = 0,021), valoarea medianei în prezenţa embolilor tumorali fiind de 18 luni (între 15,47 şi 20,53 luni), comparativ cu valoarea medianei în absenţa embolilor – 41 luni (între 32,90 şi 49,09 luni) (fig. 66).

Fig. 65. Curba de supravieţuire KM în raport de valoarea prag 4 limfoganglioni invadaţi

Fig. 66. Curba de supravieţuire KM în raport de prezenţa sau absenţa emboliilor tumorale vasculare

Fig. 67. Curba de supravieţuire KM în raport de prezenţa sau absenţa coloidului

• Factorul prognostic coloid Cu raportare directă la caracteristicile diagnosticului histopatologic, a fost analizată existenţa coloidului asociat

în mai mult de 50% din ansamblul tumorii, indiferent de tipul de adenocarcinom. Conform analizei de regresie Cox, există o corelaţie semnificativ statistică între coloid şi supravieţuirea post-tratament MTS (p = 0,027), prezenţa ariilor de coloid scăzând supravieţuirea post-tratament MTS cu 54,4%. Conform curbelor Kaplan-Meier, care susţin corelaţia


7

semnificativ statistică (p = 0,033), cazurile care au asociat coloid au avut o valoare mediană a supravieţuirii post-tratament MTS de 16 luni (între 13,70 şi 18,29 luni), comparativ cu valoarea mediană a cazurilor în care coloidul a fost absent: 26 luni (între 13,36 şi 38,64 luni) (fig. 67). Se remarcă faptul că supravieţuirea nu este influenţată în prima perioadă, cele două curbe fiind divergente abia după 18 luni, cu detaşare evidentă spre final a curbei corespunzătoare cazurilor fără asociere de coloid. • În lotul studiat, supravieţuirea post-tratament MTS nu a prezentat corelaţii semnificative statistic cu următorii parametri caracteristici pentru tumora primară: - stadiul tumorii conform clasificării AICC: analiza Kaplan-Meier concentrată asupra parametrului stadiu IV versus

alte stadii a relevat absenţa unei corelaţii semnificative statistic (p = 0, 56), supravieţuirea post-tratament MTS la nivelul întregului lot (valoare mediană 22 luni (între 14,34 şi 29,61)) fiind puternic dependentă de supravieţuirea cazurilor în stadiul IV (valoare mediană 20 luni (între 10,47 şi 29,52));

- invazia perinervoasă (p = 0,21); - gradul de diferenţiere: G1, G2, G3 (p = 0,33); - localizarea (colon drept, colon stâng, rect) (p = 0,55); - tipul histopatologic adenocarcinom slab diferenţiat (p = 0,66). 8.5.1.2. Corelaţii în raport de trăsăturile clinico-biologice ale metastazelor hepatice • Factorul prognostic număr metastaze hepatice

Deoarece numărul de metastaze care a caracterizat fiecare caz în parte a fost extrem de variabil, în vederea stabilirii unui cutoff semnificativ în raport cu supravieţuirea post-tratament MTS, am aplicat analiza Kaplan-Meier pentru valori diferite ale numărului minim de MTS c. Datele obţinute au indicat absenţa unei corelaţii cu semnificaţie statistică în cazul unui posibil cutoff de 5 metastaze (p = 0,132), 4 metastaze (p = 0,255) şi, respectiv, 3 metastaze (p = 0,094). Am obţinut, în schimb, o corelaţie semnificativă statistic pentru un cutoff cu valoare de 2 (p = 0,037), curba de supravieţuire în cazul prezenţei a mai puţin sau egal cu două metastaze avînd o valoare mediană de 37 luni (între 16,03 şi 57,96 luni), spre deosebire de valoarea mediană pentru mai mult de două metastaze, de 16 luni (între 13,04 şi 18,95 luni) (fig. 68). • Factorul prognostic adenopatii hilare

Un alt parametru clinic analizat a fost reprezentat de existenţa adenopatiilor hilare. Analiza de regresie Cox a evidenţiat o corelaţie semnificativă statistic cu supravieţuirea post-tratament MTS (p = 0,008), prezenţa adenopatiilor în hilul hepatic scăzând supravieţuirea cu 58%. Analiza Kaplan-Meier a confirmat corelaţia semnificativă (p = 0,007), curba de supravieţuire pentru cazurile cu adenopatii absente având valoare mediană de 37 luni (între 18,48 şi 55,51 luni), iar pentru cazurile cu adenopatii prezente – 16 luni (între 13,70 şi 18,29 luni) (fig. 69).

Fig. 68. Curba de supravieţuire KM în raport de valoarea prag două metastaze hepatice

Fig. 69. Curba de supravieţuire KM în raport de prezenţa sau absenţa adenopatiilor hilare

Fig. 70. Curba de supravieţuire KM în raport de valoarea mediană a CEA

• Factorul prognostic anemie Anemia – ca şi caracteristică biologică pentru statusul pacienţilor, în corelaţie cu supravieţuirea post-tratament

MTS, a indicat prin analiza Cox de regresie o corelaţie semnificativă statistic (p = 0,003), un deficit de hemoglobină de 1 gram influenţând negativ evoluţia şi, respectiv, supravieţuirea post-tratament cu 27%. • Factorul prognostic CEA

Valoarea nivelului seric pre-operator al CEA a fost analizată în raport cu supravieţuirea post-tratament metastază, în baza unei distribuţii a cazurilor în două categorii, sub şi, respectiv, peste valoarea mediană a lotului (68 ng/ml), rezultatul fiind semnificativ statistic (p = 0,007). Curbele Kaplan-Meier au relevat o supravieţuire mediană de 28 luni (între 14,64 şi 41,35 luni) pentru cazurile cu valori CEA sub 68 ng/ml, şi de 16 luni (între 14,64 şi 17,35 luni) pentru cazurile cu valori CEA peste 68 ng/ml (fig. 70). 8.5.1.3. Corelaţii în raport de tratamentul MTS hepatice • Factorul prognostic tip de tratament chirurgical

Având în vedere cele două tratamente diferite aplicate, am realizat o analiză de regresie Cox pentru a putea evalua corelaţia existentă între tipul de tratament şi supravieţuirea post-tratament. Datele obţinute au indicat absenţa unei corelaţii semnificative statistic (p = 0,074) pentru termonecroza cu vapori de apă. Analiza Kaplan-Meier a relevat, în baza aceleiaşi necorelaţii (p= 0,063), scăderea importantă a supravieţuirii post-termonecroză, mediana având valoarea de 17 luni (între 14,34 şi 19,65 luni) (fig. 71). În mod evident, curba Kaplan-Meier pentru supravieţuirea post-rezecţie a indicat faptul că rezecţia hepatică influenţează puternic supravieţuirea, valoarea mediană depăşind durata maximă de observaţie (fig. 71). Cei mai mulţi pacienţi trataţi prin rezecţie chirurgicală sunt în viaţă la finalul studiului nostru.


8

Deoarece intervenţia chirurgicală tip rezecţie practicată a fost diferenţiată, în funcţie de particularităţile metastazelor existente, în rezecţie curativă (R0) şi rezecţie paliativă (R1), am realizat o comparaţie între supravieţuirea pacienţilor în funcţie de rezultatul rezecţiei (R0 versus R1). Analiza Kaplan-Meier a relevat o puternică corelaţie statistică (p = 0,000) între pacienţii care au beneficiat de rezecţie curativă, comparativ cu cei pentru care s-a intervenit paliativ. Curbele Kaplan-Meier au indicat o valoare mediană a supravieţuirii de 13 luni pentru cei cu rezecţie incompletă, pe când în grupul celor cu rezecţie completă mediana este superioară la 60 luni – durata maximă de urmărire / monitorizare a lotului (fig. 72). Consecutiv, rezultă că este de preferat ca rezecţia să se efectueze când este posibilă respectarea criteriilor pentru rezecţia curativă.

Fig. 71. Curba de supravieţuire KM în raport de tipul de tratament chirurgical: termonecroză versus rezecţie

Fig. 72. Curba de supravieţuire KM în raport de tipul de rezecţie hepatică: rezecţie curativă versus rezecţie paliativă

Fig. 73. Curba de supravieţuire KM în raport de asocierea chimioterapiei

În cadrul tratamentului tip termonecroză, am urmărit o serie de parametri caracteristici acestui tip de intervenţie în raport cu supravieţuirea post-tratament metastază hepatică, utilizând analiza de regresie Cox. S-a constat absenţa unei corelaţii semnificative statistic pentru următorii parametri: număr ţinte termonecrozate (p = 0,388), cantitate de vapori de apă utilizată (p = 0,720), energie aplicată (p = 0,850). Pentru ambele tipuri de tratament aplicat, analiza variabilelor tratament simultan, respectiv tratament la distanţă pentru tumora primară şi metastazele hepatice sincrone a relevat absenţa unei corelaţii semnificative statistic (p = 0,586). • Factorul prognostic chimioterapie

Chimioterapia neoadjuvantă, ca şi factor care influenţează supravieţuirea post-tratament a metastazelor hepatice, a relevat în urma analizei de regresie Cox o corelaţie semnificativă statistic (p = 0,013), pacienţii care nu au urmat tratament chimioterapic având o supravieţuire scăzută cu 37%. Prin analiza Kaplan-Meier am identificat o corelaţie semnificativă statistic (p = 0,011) între tratamentul chimioterapic şi supravieţuire, valoarea mediană în cazul asocierii chimioterapiei fiind de 26 luni (între 15,84 şi 36,15 luni), faţă de 14 luni (între 4,72 şi 23,28 luni) în absenţa acesteia (fig. 73). În cadrul tratamentului chimioterapic neoadjuvant, analiza de regresie Cox a relevat importanţa curelor de chimioterapie aplicate post-tratament chirurgical al metastazei hepatice. Astfel, există o corelaţie semnificativă statistic (p = 0,014), chimioterapia post-tratament chirurgical crescând supravieţuirea cu 14%. 8.5.2. CORELAŢII CU INTERVALUL DE TIMP DINTRE TRATAMENTUL METASTAZEI HEPATICE ŞI RELUAREA DE

EVOLUŢIE 8.5.2.1. Corelaţii în raport de trăsăturile clinico-morfologice ale tumorii primare • Factorul prognostic grad de invazie tumorală (T)

În ansamblu, gradul de invazie tumorală (T) a prezentat o posibilă corelaţie cu intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,059), dar din toate clasele T, T4 influenţează în mod semnificativ supravieţuirea (p = 0,017), scăzând-o cu 56% comparativ cu T2 şi T3. Influenţa parametrului T4 fiind semnificativă statistic, pentru o corelaţie mai precisă cu supravieţuirea până la recădere am considerat ca parametru T4 versus T2 şi T3. Analiza KM a relevat valoarea de factor prognostic negativ pentru T4 (p = 0,001), cu o mediană de 13 luni (între 10,88 şi 15,11 luni), spre deosebire de cazurile T2 şi T3, care au avut o mediană de 34 luni (între 15,9 şi 52 luni) (fig. 74). • Factorul prognostic invazie în ganglionii limfatici (N)

În ansamblu, invazia în ganglionii limfatici (N) este corelată negativ cu supravieţuirea (p = 0,01), cu următoarea detaliere: N2 are cea mai puternică valoare prognostică negativă (p = 0,005), scade supravieţuirea cu 75,2%, cu o mediană de 13 luni (între 10 şi 15,8 luni), faţă de N0 şi N1, care au o mediană a supravieţuirii de 21 luni (între 13 şi 28,86 luni) (fig. 75). Comparaţia N0 versus N1, N2 a indicat o supravieţuire medie de 44 luni, faţă de media 19 luni şi mediana de 15 luni (între 12 şi 17,7 luni) (fig. 76). Complementar parametrului N, am luat în discuţie influenţa numărului de limfoganglioni care au prezentat MTS, din totalul limfoganglionilor prelevaţi. Analiza de regresie Cox a relevat o semnificaţie statistică puternică a acestui parametru asupra intervalului de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,000). Pentru fiecare limfoganglion metastazat, intervalul de timp dintre MTS şi reluarea de evoluţie scade cu 16%.

Pentru o aprofundare a implicării prezenţei MTS limfoganglionare asupra acestui interval, am considerat numărul de 4 limfoganglioni ca valoare cutoff, analiza Kaplan-Meier punând în evidenţă următoarele rezultate: în condiţiile în care numărul de limfoganglioni metstazaţi a fost mai mic sau egal cu 4, supravieţuirea a fost în medie de 40 luni, cu o mediană de 28 luni; peste 4 limfoganglioni metastazaţi, supravieţuirea a fost în medie de 14 luni, cu o mediană de 13 luni (între 10 şi 15,77 luni) (fig. 77).


9

Fig. 74. Curba de supravieţuire KM în raport de gradul de invazie tumorală (T)

Fig. 75. Curba de supravieţuire KM, comparativ N2 versus N0, N1

Fig. 76. Curba de supravieţuire KM în raport de prezenţa sau absenţa invaziei tumorale în ganglionii limfatici (N)

• Factorul prognostic embolii tumorale vasculare Prezenţa emboliilor vasculare la nivelul tumorii primare a fost demonstrată ca factor de prognostic negativ

(p=0,013). Analiza Kaplan-Meier a indicat un interval mediu de timp până la reluarea de evoluţie de 23 luni, cu o mediana de 15 luni (între 12 şi 17,8 luni), iar cazurile în care emboliile vasculare au fost absente au avut un interval mediu de timp până la reluarea de evoluţie de 33,9 luni, cu o mediană de 41 luni (între 14,5 şi 67,4 luni) (fig. 78). • Factorul prognostic coloid

Conform analizei Kaplan-Meier, asocierea coloidului a influenţat negativ intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p=0,027), cazurile în care coloidul a fost prezent având o valoare medie de 14,9 luni, cu o mediană de 13 luni (între 9,4 şi 16,5 luni), în timp ce cazurile în care coloidul a fost absent au avut un interval de timp până la reluarea de evoluţie mult mai mare, cu o medie de 29,8 luni şi o mediană de 22 luni (între 16,7 şi 27 luni) (fig. 79).

Fig. 77. Curba de supravieţuire KM în raport de valoarea prag 4 limfoganglioni invadaţi

Fig. 78. Curba de supravieţuire KM în raport de prezenţa sau absenţa emboliilor tumorale

Fig. 79. Curba de supravieţuire KM în raport de prezenţa sau absenţa coloidului

• În lotul studiat, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie nu a prezentat corelaţii semnificative statistic cu următorii parametri caracteristici pentru tumora primară: - stadializarea conform AJCC-UICC (p = 0,07): stadiile IIIC şi IV au avut valori care susţin intervenţia lor ca factori

de prognostic negativi (p=0,004), dar pentru celelalte stadii, analizate individual, ca şi pentru stadiul IV_versus_alte stadii, valorile obţinute au fost nesemnificative statistic;

- invazia perinervoasă (p = 0,18); - gradul de diferenţiere: G1, G2, G3 (p = 0,44); - localizarea (colon drept, colon stâng, rect) (p = 0,79); - tipul histopatologic adenocarcinom slab diferenţiat (p = 0,39). 8.5.2.2. Corelaţii în raport de trăsăturile clinico-biologice ale metastazelor hepatice

O serie de trăsături clinico-biologice ale metastazelor au fost analizate prin prisma rolului lor, ca factori de prognostic negativ inclusiv în determinarea intervalului de timp până la reluarea de evoluţie. • Factorul prognostic număr metastaze hepatice

Raportat la numărul de metastaze hepatice, analiza de regresie Cox a evidenţiat o corelaţie semnificativă statistic (p = 0,022), fiecare metastază scăzând intervalul de timp până la reluarea de evoluţie cu 11,9%.

Numărul de metastaze hepatice care a caracterizat fiecare pacient din ansamblul lotului a fost extrem de variabil, motiv pentru care am aplicat, într-o analiză Kaplan-Meier, un cutoff de 5 metastaze (valoare statuată prin raportările din literatura de specialitate). Rezultatele au evidenţiat o corelaţie semnificativă statistic (p = 0,049), pentru cazurile cu mai puţin sau egal 5 metastaze, intervalul mediu de timp până la reluarea de evoluţie având o valoare medie de 32 luni cu o mediană de 19 luni (între 11,5 şi 26,4 luni), iar pentru cazurile cu mai mult de 5 metastaze hepatice – valoare medie de 16,7 luni şi mediană de 13 luni (între 6,8 şi 19,1 luni) (fig. 80). • Factorul prognostic adenopatii hilare

Analiza adenopatiei / adenopatiilor în hilul hepatic a pus în evidenţă o corelaţie semnificativă statistic (p = 0,004) între prezenţa acestora şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie, cu o valoare medie de 15,2 luni şi o mediană de 13 luni (între 9,8 şi 16,1 luni). Cazurile în care adenopatiile hilare au fost absente au avut un interval de timp până la reluarea de evoluţie cu valoare medie de 34,7 luni şi o mediană de 28 luni (între 11,3 şi 44,6 luni) (fig. 81).


10

Fig. 80. Curba de supravieţuire KM în raport de valoarea prag 5 metastaze hepatice

Fig. 81. Curba de supravieţuire KM în raport de prezenţa sau absenţa adenopatiilor hilare

Fig. 82. Curba de supravieţuire KM în raport de prezenţa sau absenţa anemiei

• Factorul prognostic anemie Asocierea anemiei cu intervalul de timp până la reluarea de evoluţie a relevat o corelaţie semnificativă statistic (p = 0,007), analiza de regresie Cox indicând că, pentru fiecare gram scăzut al hemoglobinei, evaluată post-operator, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie scade cu 24% (fig. 82). • Factorul prognostic CEA Valoarea nivelului seric pre-operator al CEA, considerată sub şi, respectiv, peste valoarea mediană a lotului (68 ng/ml), s-a corelat semnificativ statistic (p = 0,016) cu intervalul de timp până la reluarea de evoluţie. Curbele Kaplan Meier au pus în evidenţă o supravieţuire mediană de 28 luni (între 10,75 şi 45,24 luni) pentru cazurile cu valori CEA sub 68 ng/ml, şi de 13 luni (între 9,03 şi 16,96 luni) pentru cazurile cu valori CEA peste 68 ng/ml (fig. 83).

Fig. 83. Curba de supravieţuire KM în raport

de valoarea mediană a CEA 8.5.2.3. Corelaţii în raport de tratamentul metastazei hepatice • Factorul prognostic tip de tratament chirurgical

Asocierea variabilei tratament cu intervalul de timp până la reluarea de evoluţie a relevat o corelaţie semnificativă statistic (p = 0,019) cu termonecroza cu vapori de apă. Conform analizei Kaplan-Meier, pentru termonecroza cu vapori de apă acest interval a avut o valoare mediană de 16 luni (între 13,6 şi 18,3 luni), iar pentru rezecţie - o mediană care a depăşit valoarea maximă a intervalului de timp până la reluarea de evoluţie, care a caracterizat lotul de studiu (55,57 luni) (fig. 84).

Pentru ambele tipuri de tratament aplicat, analiza variabilelor tratament simultan, respectiv tratament la distanţă pentru tumora primară şi metastazele hepatice sincrone a relevat absenţa unei corelaţii semnificative statistic (p = 0, 719). În cadrul tratamentului prin termonecroză cu vapori de apă au existat o serie de variabile care au caracterizat procedura aplicată, fiecare dintre acestea fiind analizată separat. Nu a fost obţinută o semnificaţie statistică în cazul variabilelor număr de ţinte termonecrozate (p = 0,29), cantitate de vapori de apă utilizată (p = 0,59), energie aplicată (p = 0,68), în corelaţie cu intervalul de timp până la reluarea de evoluţie.

Fig. 84. Curba de supravieţuire KM în raport de tipul de tratament chirurgical: termonecroză versus rezecţie

Fig. 85. Curba de supravieţuire KM în raport de tipul de rezecţie hepatică: rezecţie curativă versus rezecţie paliativă

Fig. 86. Curba de supravieţuire KM în raport de asocierea chimioterapiei

Deoarece tratamentul tip rezecţie a implicat, în raport de particularitatea fiecărui caz în parte, practicarea unei rezecţii curative (R0) sau a unei rezecţii paliative (R1), au fost analizate separat cele două variabile (R0, R1). Analiza Kaplan-Meier a demonstrat o corelaţie semnificativă statistic puternică între rezecţia R0 şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,000), pacienţii care au beneficiat de rezecţie curativă evoluând fără recădere peste 60 de luni (durata maximă de urmărire a lotului). În schimb, pacienţii cu rezecţie R1 au avut o valoare mediană de 8 luni, pentru intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (fig. 85).


11

• Factorul prognostic chimioterapie Asocierea chimioterapiei ca şi tratament adjuvant a fost analizată în raport de intervalul de timp până la reluarea de

evoluţie. Analiza Kaplan-Meier a relevat o corelaţie semnificativă statistic în cazul pacienţilor care au urmat schemele de chimioterapie (p = 0,026), cu o mediană de 19 luni pentru intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (între 13,4 şi 24,5 luni) (fig. 86). În raport cu aplicarea schemelor de chimioterapie pre şi post-tratament pentru metastază, analiza de regresie Cox a demonstrat valoarea semnificativă statistic pentru chimioterapia post tratament (p = 0,024), fiecare cură de tratament crescând intervalul de timp până la reluarea de evoluţie cu 17%. Pentru cealaltă categorie de pacienţi, fără chimioterapie, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie a avut valoarea mediană de 12 luni (între 3,3 şi 20,6 luni). 8.6. DISCUŢII 8.6.1. VALOAREA PROGNOSTICĂ A UNOR CARACTERISTICI CLINICO-MORFOLOGICE ALE TUMORII PRIMARE 8.6.1.1. Variabile corelate semnificativ statistic • Invazia tumorală (pT)

Stadiul T al tumorii primare nu este inclus în mod uzual în studiile referitoare la factorii de prognostic pentru metastazele hepatice secundare cancerului colorectal, în literatură existând foarte puţine raportări la acest parametru, considerat nesemnificativ pentru supravieţuire (Nishio et al., 2007, Malik et al., 2007a). Datele obţinute susţin rolul de factor de prognostic negativ pentru stadiul T4, implicit mai puternic decât T3 şi, respectiv, T2, prin severitatea modificărilor de tip morfologic pe care le concentrează încă din momentul dezvoltării tumorii primare. Consecutiv, putem considera că gradul de invazie al tumorii primare influenţează nu numai procesul de metastazare per se, ci şi evoluţia pacienţilor cu metastaze. Această relaţie are, în esenţă, fundamentare biologică în secvenţa procesului de carcinogeneză şi metastazare. • Limfoganglionii metastatici (pN)

Analiza realizată în raport de supravieţuirea post-tratament metastază a demonstrat faptul că stadiul N2 are o influenţă negativă decisivă asupra supravieţuirii (p = 0,007), comparativ cu stadiul N0 şi N1. Stabilirea unui cut-off de minimum 4 poate fi considerat ca şi contribuţie personală originală, în contextul în care datele noastre au indicat diferenţe nete între supravieţuirea pacienţilor cu mai puţin de şi, respectiv, peste 4 limfoganglioni pozitivi, cu menţiunea că pentru fiecare ganglion metastazat, peste numărul 4, supravieţuirea scade cu 15%. Aceste date au fost concordante cu rezultatele obţinute în raport cu intervalul de timp până la reluarea de evoluţie, existând aceeaşi corelaţie cu variabila N analizată global (p = 0,01), cu variabila N2 versus N0, N1 (p = 0,005). Referitor la numărul de limfoganglioni pozitivi, corelaţia puternic semnificativă obţinută (p = 0,000) a fost completată prin introducerea aceluiaşi cut-off, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie pentru pacienţii cu sub 4 limfoganglioni pozitivi fiind de 2,8 ori mai mare decât în cazul pacienţilor cu peste 4 limfoganglioni pozitivi. • Invazia vasculară

Analiza statistică în raport de cele două evenimente timp-dependente, în evoluţia metastazelor hepatice, a pus în evidenţă prezenţa unei corelaţii semnificative (p = 0,025, respective p = 0,013). Astfel, prezenţa emboliei vasculare capătă valoare de factor de prognostic negativ. În studiul realizat, două elemente concrete au fost în favoarea acestei afirmaţii: scăderea cu 70%, respectiv cu 50%, a supravieţuirii post-tratament MTS, respectiv a intervalului până la reluarea de evoluţie, pentru pacienţii cu emboli vasculari, comparativ cu cei fără invazie vasculară. • Coloidul

Analiza statistică a evidenţiat existenţa unei corelaţii semnificative între prezenţa coloidului şi supravieţuirea post-tratament MTS (p = 0,027) şi, respectiv, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,027). Consecutiv, pentru lotul investigat putem considera prezenţa coloidului ca factor de prognostic negativ. O menţiune specială trebuie făcută având în vedere faptul că, aşa cum rezultă din analiza Kaplan Meier pentru supravieţuirea post-metastază, aceasta nu este influenţată în prima perioadă, cele două curbe separându-se abia ulterior, cu detaşare evidentă spre final a curbei corespunzătoare cazurilor fără asociere de coloid. Aceste evenimente pot fi interpretate în favoarea agresivităţii coloidului, inclusiv pentru profilul biologic al metastazelor hepatice secundare CCR. 8.6.1.2. Variabile necorelate semnificativ statistic

Comentarea rezultatelor negative obţinute este necesară, cu atât mai mult cu cât datele noastre sunt, pentru unele variabile, discordante faţă de raportările din literatură. • Stadiul tumorii stabilit în conformitate cu clasificarea AJCC-UICC

În lotul nostru de studiu, stadiul tumorii primare nu s-a corelat semnificat statistic cu supravieţuirea post-tratament MTS şi, respectiv, cu intervalul de timp până la reluarea de evoluţie. Rezultatele au fost negative şi în cazul evaluării globale a acestei variabile, şi în cazul introducerii parametrului stadiu IV versus alte stadii, date în concordanţă cu raportări recente din literatură (Aldrighetti et al., 2005, Arru et al., 2008). Explicaţia pentru absenţa corelaţiei este, în opinia noastră, dată de structura lotului, în cadrul căruia 80,3% din cazuri sunt în stadiul IV. • Invazia perinervoasă

Deşi invazia perinervoasă nu face parte din factorii de prognostic incluşi în consensul stabilit de College of American Pathologists (Compton, 2003), există raportări izolate asupra asocierii cu o rată crescută a recurenţelor şi o supravieţuire redusă, în mod independent de alţi factori (Bognel et al., 1995). Absenţa unei corelaţii semnificative statistic (p = 0,21) indică, în conformitate cu teoriile asupra mecanismului patogenic al carcinogenezei şi metastazării, neimplicarea structurilor nervoase în secvenţa acestor evenimente. • Tipul histopatologic adenocarcinom / gradul de diferenţiere

Cu referire strictă la metastazele hepatice, există date recente care susţin valoarea prognostică a gradului de diferenţiere, corelat cu supravieţuirea la 5 ani, analiza multivariată certificând statutul de factor de prognostic negativ independent (Aldrighetti et al., 2005, Arru et al., 2008), alături de rezultate care infirmă influenţa asupra prognosticului


12

(Wang et al., 2007, Wang et al., 2008, Nanashima et al., 2009). Absenţa corelaţiilor semnificative statistic pentru gradul de diferenţiere (p = 0,33) şi, suplimentar, pentru tipul adenocarcinom slab diferenţiat (p = 0,66) sunt explicate în principal prin structura lotului, în cadrul căruia cazurile diagnosticate ca adenocarcinom moderat diferenţiat au fost în număr de 43 (70,5%) şi cu grading moderat de diferenţiere - 41 (67,2%). Predominanţa tipului histopatologic moderat diferenţiat şi a gradingului G2 a influenţat semnificativ rezultatul final, comparaţia între tipuri şi grading-uri diferite fiind nerelevantă datorită numărului redus de cazuri existente în celelalte categorii. • Localizarea

În ceea ce priveşte evaluarea prognosticului metastazelor hepatice în raport de variabila localizare a tumorii primare, raportările recente din fluxul principal de publicaţii, deşi limitate numeric (Aldrighetti et al., 2005, Wang et al., 2007, Arru et al., 2008, Wang et al., 2008, Martin et al., 2009), nu validează semnificaţia prognostică a acesteia. În consens cu aceste raportări, prin absenţa unei corelaţii semnificative statistic între localizarea pe colonul drept, colonul stâng şi, respectiv, rect este infirmată ipoteza conform căreia localizarea pe colonul stâng ar avea valoare prognostică negativă datorită particularităţilor de vascularizaţie, cu repercutare directă asupra accelerării procesului de metastazare. 8.6.2. VALOAREA PROGNOSTICĂ A UNOR TRĂSĂTURI CLINICO-BIOLOGICE ALE METASTAZEI HEPATICE 8.6.2.1. Variabile corelate semnificativ statistic • Numărul de metastaze

Unul dintre parametrii operaţionali pentru prognosticului metastazelor hepatice (Adam, 2004, Tanaka et al., 2007, Wang et al., 2007, Wang, 2008, Arru et al., 2008, Nanashima et al., 2009, Marti et al., 2009) este numărul acestora, variabilă care influenţează inclusiv alegerea procedurii terapeutice, impunând restricţii. În lotul studiat, a existat o mare variabilitate a numărului de metastaze corespunzătoare fiecărui caz. Rezultatele obţinute au fost nesemnificative statistic pentru un cut-off de 5, 4 şi, respectiv 3 metastaze, o corelaţie semnificativă statistic fiind obţinută pentru un cutoff de 2 metastaze (p = 0,037). Datele sugerează că, în raport cu supravieţuirea, existenţa a mai mult de două metastaze este factor de prognostic negativ. Referitor intervalul până la recădere, analiza statistică a indicat o corelaţie semnificativă statistic cu numărul de metastaze, de data aceasta în condiţiile unui cutoff de 5. Diferenţa între cele două cutoff-uri reflectă relaţia dintre agresivitatea bolii şi numărul de metastaze, recăderea fiind relaţionată cu un cutoff de 5, în timp ce pentru supravieţuire post-tratament diferenţa este realizată în raport de cutoff-ul 2. • Adenopatia hilară

Extrem de puţine studii includ adenopatia hilară hepatică (Majeed, 2000, Hotta et al., 2006, Wang et al., 2007, Wang et al., 2008). Supravieţuirea post-tratament metastază, cât şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie s-au corelat semnificativ statistic cu această variabilă (p = 0,007, respectiv p = 0,004). Astfel, prezenţa adenopatiei hilare capătă valoare de factor prognostic negativ, curbele Kaplan-Meier indicând faptul că supravieţuirea post-tratament metastază sau intervalul de timp până la recădere, în absenţa adenopatiilor, este mai mare decât dublul perioadelor de timp corespunzătoare prezenţei adenopatiilor. • Anemia

Includerea variabilei anemie în relaţie cu supravieţuirea post-tratament metastază şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie a fost justificată în baza datelor contradictorii existente în studiile publicate în literatură (Adam, 2004, Marti et al., 2009, Martin et al., 2009, Aldrighetti et al., 2005, Nishio et al., 2007, Arru et al., 2008). Conform datelor noastre, un deficit de hemoglobină de 1 gram poate influenţa negativ supravieţuirea post-tratament cu 27%, şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie cu 24%. Deşi rezultatele noastre au confirmare statistică, considerăm că includerea anemiei post-operatorii ca factor de prognostic negativ trebuie înţeleasă în contextul în care este influenţată starea generală a pacientului, şi nu în relaţie strictă cu procesul de metastazare. • CEA

În fluxul principal de publicaţii se certifică valoarea sa ca factor prognostic independent negativ pentru reluarea de evoluţie în metastazele hepatice (Aldrighetti et al., 2005, Arru et al., 2008, Nanashima et al., 2009, Marti et al., 2009). Rezultatele noastre se individualizează prin stabilirea unei valori prag pentru CEA de 68 ng/ml – valoare care reprezintă mediana lotului studiat. Introducerea acestui prag pentru distribuţia cazurilor în două categorii a fost justificată prin faptul că numai 3 pacienţi, din totalul celor 39 monitorizaţi pentru nivelul CEA pre-operator şi, respectiv, post-operator, au avut CEA pre-operator peste 200 ng/ml. Consecutiv, o clasificare a cazurilor în raport de această valoare nu ar fi avut relevanţă. 8.6.3. VALOAREA PROGNOSTICĂ A TIPULUI DE TRATAMENT APLICAT METASTAZEI HEPATICE 8.6.3.1. Variabile corelate semnificativ statistic • Rezecţie versus termonecroză cu vapori de apă

Una dintre particularităţile lotului studiat, care susţine în esenţă caracterul original al cercetării, este reprezentată de abordarea terapeutică diferită a pacienţilor, prin practicarea a două metode destinate metastazelor hepatice secundare cancerului colorectal: termonecroza cu vapori de apă şi rezecţia hepatică. Pentru cele două tipuri diferite de tratament aplicate, rezultatele analizei statistice au relevat, în raport de supravieţuirea post-tratament metastază, absenţa unei corelaţii semnificative cu termonecroza p = 0,074), ceea ce înseamnă că aplicarea termonecrozei nu influenţează supravieţuirea post-tratament, chiar dacă rezecţia hepatică are o influenţă mult mai puternică asupra duratei de viaţă a pacienţilor. • Valoarea terapeutică a rezecţiei hepatice

Datele noastre sunt în conformitate cu literatura de specialitate, care statuează rezecţia ca şi standard de aur terapeutic pentru metastazele hepatice (Venook, 2005). În lotul studiat, rezecţia R0 a fost realizată pentru cazurile în care respectarea marginii chirurgicale a fost posibilă, iar rezecţia R1 – în contextul în care numărul, dimensiunile şi localizarea metastazelor nu a permis respectarea marginii libere. Supravieţuirea post-tratament a avut o valoare mediană


13

superioară la 60 luni – durata maximă de urmărire a lotului, în cazul rezecţiei curative, comparativ cu 13 luni pentru rezecţia paliativă, şi că pacienţii care au beneficiat de rezecţie curativă au evoluat fără recădere peste 60 de luni. • Valoarea chimioterapiei adjuvante

Conform datelor din literatură, chimioterapia modernă permite nu numai reducerea dimensiunilor tumorale (eng. down-stage) şi, consecutiv, reevaluarea tumorilor nerezecabile care pot deveni rezecabile (Tanaka et al., 2003, Adam, 2004, Adam et al., 2004, Galizia et al., 2008, Nordlinger et al., 2008, Martin et al., 2009), ci şi un tratament precoce al micrometastazelor neidentificate (Ribero et al., 2009). Datele noastre relevă influenţa curelor post-tratament metastază (p = 0,014, respectiv p = 0,024), valoarea lor, ca factor de prognostic pozitiv, rezultând din creşterea supravieţuirii cu 14% şi a intervalului de timp până la recădere cu 17%. Prin prisma elementelor de originalitate ale studiului nostru, aceste date concrete sunt importante, completând informaţia (relativ redusă) prezentă în literatură. 8.6.3.2. Variabile necorelate semnificativ statistic • Valoarea terapeutică a termonecrozei cu vapori de apă

În pofida beneficiilor unamin acceptate ale rezecţiei, acest tratament poate fi aplicat doar unui procent redus de pacienţi, deoarece majoritatea cazurilor sunt diagnosticate în stadii tardive, nerezecabile (Adam, 2004). Din acest motiv, introducerea tehnicilor ablative paliative este pe deplin motivată, rezultatele inferioare ca supravieţuire, în raport cu rezecţia, fiind privite ca rezultate superioare ca supravieţuire, în raport cu lipsa oricărui tip de tratament.

Deşi supravieţuirea a fost inferioară în cazul pacienţilor trataţi prin termonecroză, comparativ cu cei trataţi prin rezecţie, trebuie accentuat caracterul inovator al tehnicii, care permite o alternativă de abordare pentru cazurile în care orice tentativă chirurgicală clasică este contraindicată. Mecanismul prin care acţionează termonecroza cu vapori de apă conduce la „sigilarea” temporară a metastazelor necrozate, fapt confirmat de explorările imagistice şi de scăderea valorilor markerilor tumorali. Apariţia altor metastaze sau reluarea evoluţiei impune, însă, repetarea procedurii. • Tratament sincron versus tratament metacron

Modul de abordare al metastazelor hepatice sincrone cu tumora colorectală primară, simultan sau la distanţă, constituie subiect de controversă ştiinţifică. O trecere în revistă a principalelor studii publicate care susţin intervenţia etapizată şi, respectiv, cea sincronă (Moug, Horgan, 2007, Martin et al., 2009) oferă posibilitatea unei analize comparative, comentariul final accentuând necesitatea unor rezultate pe termen lung, ca urmare a organizării unor trialuri clinice randomizate, în cadrul cărora pacienţii cu metastaze sincrone cu tumora primară să fie trataţi fie simultan, fie etapizat. Rezultatele noastre, care au indicat absenţa corelaţiilor semnificative statistic între tratamentul simultan (sincron) şi la distanţă (etapizat) aplicat, şi cele două variabile timp dependente, susţin indicaţia de efectuare a intervenţiei concomitent pentru tumora primară şi metastaze, în acord cu datele din literatură. 8.6.4. CLASIFICAREA TNM – CRITERII OPERAŢIONALE 2010

La momentul redactării tezei, în decembrie 2009, a fost publicată a 7-a ediţie a Clasificării TNM pentru tumorile maligne (eng. TNM Classification of Malignant Tumours), sub egida International Union Against Cancer (Sobin et al., 2009). Modificările introduse prin această nouă ediţie au devenit operaţionale din ianuarie 2010, şi ele schimbă într-o măsură importantă criteriile de clasificare anterioare. Deoarece evaluarea cazurilor incluse în loturile de studiu era deja finalizată, în conformitate cu Clasificarea TNM – ediţia a 6-a, rezultatele obţinute nu au mai putut fi reevaluate prin prisma noii clasificări. Considerăm însă oportun să atragem atenţia asupra transformărilor majore care vizează modalitatea de încadrare a CCR, ca tumoră primară responsabilă de producerea MTS hepatice, şi anume eliminarea Mx şi introducerea Grupării în raport cu stadiul anatomic (eng. Anatomical Stage Grouping) şi a Grupării în raport cu prognosticul (eng. Prognostic Grouping).

CAPITOLUL 9. METASTAZELE HEPATICE SECUNDARE CANCERULUI COLORECTAL -

STUDIU CELULAR ŞI MOLECULAR 9.1. INTRODUCERE

Pornind de la datele existente în fluxul principal de publicaţii, referitoare la caracterizarea profilului molecular al MTS hepatice secundare CCR, studiul doctoral a vizat, în mod concret, investigarea unor markeri cu rol potenţial în invazivitatea tumorală în procesul de dezvoltare a metastazelor hepatice, inclusiv prin prisma valorii lor prognostice.

Organizarea studiului a impus două nivele distincte de analiză, cu corespondenţă în obiective specifice (detaliate ulterior, pe parcursul capitolului), şi anume:

(i) analiza calitativă şi cantitativă pentru evaluarea, prin descriere şi cuantificare, a următorilor parametri - activitatea proliferativă, relevată prin intermediul topoizomerazei 2-alfa; - componenta celulară imună prezentă în micromediul tumoral, relevată prin populaţia limfocitară; - componenta celulară inflamatorie prezentă în micromediul tumoral, relevată prin populaţia macrofagică; - procesul de angiogeneză şi limfangiogeneză, relevat prin intermediul MVD, LVD, a VEGF-A şi VEGF-R2; - potenţialul de invazie metastatică, relevat prin intermediul MMP2, MMP9 şi TIMP2, TIMP1; (ii) analiza statistică de corelaţie, pentru stabilirea valorii prognostice a parametrilor analizaţi calitativ şi cantitativ, în raport de supravieţuire.

9.2. MATERIAL ŞI METODĂ 9.2.1. SUBLOTURI DE STUDIU - BOALĂ METASTATICĂ RECURENTĂ DUPĂ TERMONECROZĂ VERSUS METASTAZE

REZECATE CHIRURGICAL Materialul a fost reprezentat de fragmente de metastaze hepatice prelevate de la 24 de pacienţi din totalul celor

61 care au fost incluşi în studiu. Sublotul 1 a fost format din cazuri cu metastaze hepatice secundare cancerului colorectal recurente. Mai precis, aceste metastaze s-au dezvoltat la distanţă de o ablaţie anterioară prin termonecroză,


14

efectuată ca alternativă de tratament în absenţa indicaţiei chirurgicale (sau în condiţiile în care aceasta a fost contraindicată). Ţinând cont de contextul biologic şi temporal al apariţiei lor, leziunile au fost definite ca boală metastatică recurentă. Sublotul 2 a fost format din cazuri cu metastaze hepatice secundare cancerului colorectal cu indicaţie de tratament chirurgical şi, consecutiv, rezecate. Ţinând cont de contextul biologic şi temporal al apariţiei lor, leziunile au fost denumite metastaze per primam. 9.2.2. PRINCIPII GENERALE ŞI ETAPE ÎN EXAMENUL ANATOMOPATOLOGIC ŞI IMUNOHISTOCHIMIC

Metodologia de lucru a inclus elementele specifice examenului anatomopatologic şi imunohistochimic, este prezentată în continuare. Pentru analiza cantitativă au fost utilizate sisteme de scor individualizate, în raport de particularităţile fiecărui marker. 9.2.3. ANALIZA STATISTICĂ

Analiza statistică a fost realizată utilizând programul SPSS – 17.00, efectuându-se următoarele teste specifice: analiza Cox de regresie, analiza de supravieţuire Kaplan Mayer şi testul t-student. Evaluarea pragului de semnificaţie a diferenţelor a fost făcută după testul Log Rank, cu interpretarea standard a semnificaţiei statistice pentru p<0,05. 9.3. EVALUAREA ACTIVITĂŢII PROLIFERATIVE 9.3.1 REPERE FUNDAMENTALE

Unul dintre markerii de proliferare este topoizomeraza, enzimă care controlează ADN-ul, fiind esenţială pentru procese celulare vitale ca replicarea, transcripţia, translaţia, recombinarea şi repararea (Chung et al, 1989). Există două tipuri majore de topoizomerază, denumite Topo I şi Topo II, cu funcţionalitate complet diferită: în timp ce Topo I cupează un singur lanţ ADN, Topo II acţionează asupra ambelor lanţuri, simultan, reacţia fiind ATP-dependentă. Studii recente indică posibila implicare a Topo II alfa în evenimentele proliferative din patogenia carcinogenezei şi sugerează posibila asociere cu rezistenţa la chimioterapie (Ferrandina et al., 2008, Tsavaris et al., 2009), modul concret în care acţionează în progesia bolii şi în răspunsul la tratament fiind încă necunoscut (Coss et al., 2009). 9.3.2. OBIECTIVE SPECIFICE

Obiectivele specifice asupra cărora ne-am concentrat au fost: - caracterizarea calitativă şi cantitativă a celulelor tumorale proliferante Topo II alfa pozitive; - stabilirea existenţei sau absenţei unor diferenţe cu semnificaţie statistică între metastazele hepatice per-primar

şi boala metastatică recurentă, prin prisma cuantificării Topo II alfa; - stabilirea valorii de factor prognostic Topo II alfa, în raport de profilul clinico-morfologic al tumorii primare

şi al MTS hepatice, cu accent pe supravieţuirea post-tratament MTS. 9.3.3. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI DE CUANTIFICARE

Pentru evaluarea expresiei Topo II alfa am utilizat procentul de celule pozitive (P), calculat ca număr de celule pozitive raportat la 100 celule pozitive şi negative, cuantificarea realizându-se pe 5 câmpuri microscopice, la magnificaţie x200. Cazurile au fost încadrate în 4 categorii: 1, cu mai puţin de 5% din celule pozitive, 2, între 6-25% celule pozitive, 3, între 26-75% celule pozitive, 4, peste 75% celule pozitive (Sandri et al., 1996). Scorul obţinut a fost evaluat prin valoare de prag (eng. cutoff) 25%, cazurile cu mai puţin de 25% celule pozitive fiind considerate negative, iar cele cu mai mult de 25% celule pozitive fiind considerate pozitive sub raportul activităţii proliferative. 9.3.4. REZULTATE 9.3.4.1. Analiza calitativă

Microscopic, analiza activităţii proliferative, prin prisma caracteristicilor de localizare şi intensitate, a relevat următoarele aspecte: pozitivitate nucleară pentru Topo II alfa (fig. 87), de intensitate predominant crescută (fig. 88), omogenă (fig. 89-92) sau heterogenă, cu o variabilitate semnificativă între diferite câmpuri tumorale sau în cadrul aceluiaşi câmp (fig. 93-96).

Fig. 87. Glandă tumorală: celule cu nuclei pozitivi şi negativi (IHC, anti-Topo II alfa, x 10)

Fig. 88. Intensitatea marcată a reacţiei IHC la nivel nuclear (IHC, anti-Topo II alfa, x 20)

Fig. 102. Glande tumorale cu 80% celule pozitive, intensitate medie (IHC, anti-Topo II alfa, x 10)

Fig. 114. Nodul tumoral f cu activitate proliferativă sub 5% (IHC, anti-Topo II alfa, x 4)

9.3.4.2. Analiza cantitativă Tabelul 11. Activitate proliferativă – sublot 1 Tabelul 12. Activitate proliferativă – sublot 1

Număr caz SCOR Topo II alfa

Procent celule pozitive

1. 3 35%

2. 3 45%

3. 3 50%

4. 2 25%

Număr caz SCOR Topo II alfa

Procent celule positive

1. 4 80%

2. 1 3%

3. 3 55%

4. 4 90%


15

6. 3 35%

7. 3 50%

8. 1 0

TOTAL 2,75 40 ± 22,99 TOTAL cazuri

pozitive 3 45,71 ± 17,66

6. 3 35%

7. 3 40%

8. 2 15%

9. 3 70%

10. 4 90%

11. 2 25%

12. 4 85%

13. 3 45%

14. 3 60%

15. 4 95%

16. 2 25%

TOTAL 3 53 ± 29,14

TOTAL cazuri 3,13 56,33 ± 26,82

Evaluarea statistică a procentului de celule Topo II alfa pozitive, comparativ sublot 1 versus sublot 2, a relevat absenţa oricăror diferenţe semnificative statistic (p = 0, 24) (fig. 97). Figurile 98-117 ilustrează procente diferite de celule tumorale pozitive Topo II alfa. 9.3.4.3. Analiza statistică – corelaţii cu supravieţuirea post-tratament metastază şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie

Analiza de corelaţie între activitatea proliferativă, exprimată prin procentul de celule Topo II alfa pozitive, şi cele două variabile timp-dependente urmărite a relevat valori nesemnificative statistic (p = 0,46, respectiv p = 0,85). Corelaţii semnificative au fost absente şi pentru analiza statistică realizată introducând un cutoff de 25%, considerând cazurile cu mai puţin de 25% celule tumorale Topo II alfa pozitive ca şi cazuri cu activitate proliferativă de nivel scăzut, iar cele cu procent de celule tumorale Topo II alfa pozitive mai mare de 25% - cu activitate proliferativă de nivel înalt. 9.3.5. DISCUŢII • Boală metastatică recurentă după termonecroză versus metastaze rezecate chirurgical

Ţinând cont de particularităţile evolutive ale celor două subloturi (boală metastatică recurentă post-termonecroză versus metastaze per primam, rezecate chirurgical), am pornit de la premiza că sublotul 1, caracterizat printr-o evoluţie clinică mai agresivă, ar trebui să prezinte o activitate proliferativă mai intensă, comparativ cu sublotul 2. Această asumpţie nu a fost confirmată. • Activitatea proliferativă relevată prin Topo II alfa – evaluare globală

Evaluarea globală a Topo II alfa a indicat prezenţa unei activităţi proliferative încadrate majoritar în intervalul 26-75%, cu corespondenţă într-o valoare de scor egală cu 3. În mod concret, datele obţinute au avut valorile medii de 45,71 ± 17,66 pentru sublotul 1, şi 56,33 ± 26,82 pentru sublotul 2, valori care reflectă că aproximativ jumătate din celulele tumorale care formează nodulii metastatici hepatici sunt deja intrate în succesiunea etapelor de diviziune specifice ciclului celular. Comparaţia sublot 1 versus sublot 2 a relevat absenţa oricăror diferenţe semnificative statistic (p = 0, 24). Acest fapt, în opinia noastră, este un argument puternic împotriva asumpţiei conform căreia reluarea de evoluţie este caracterizată printr-un comportament biologic al ansamblului celular şi molecular tumoral mult mai agresiv, mai dinamic (în sens negativ), comparativ cu profilul biologic al metastazelor per primam. Datele noastre susţin, din punctul de vedere al activităţii proliferative, un pattern de dezvoltare similar pentru cele două subloturi. Mai mult, atrag atenţia valorile individuale pe caz şi valoarea medie pe sublot în care se încadrează procentul de celule Topo II alfa pozitive, care semnalează că o activitate proliferativă de nivel mediu (între 26-75%) este suficientă pentru a susţine proliferarea tumorală în context metastatic. Pornind de la contextul clinic, aceste rezultate au fost surprinzătoare, deoarece nu au evidenţiat nivelul de proliferare maxim (peste 75%) intuit. Consecutiv, putem aprecia că un profil agresiv se conturează din momentul în care celulele tumorale proliferante depăşesc o pătrime din totalul celor prezente, iar valoarea de scor 3, acordată intervalului 26-75% celule tumorale pozitive, are o semnificaţie de agresivitate tumorală ridicată, mult mai apropiată de scorul maxim 4. Cu alte cuvinte, prognosticul pare a fi influenţat negativ în aceeaşi măsură dacă Topo II alfa este exprimată în 26% sau în 70% din celulele tumorale. • Activitatea proliferativă relevată prin Topo II alfa - corelaţii cu supravieţuirea

Trecerea în revistă a literaturii a făcut posibilă analiza rezultatelor raportate referitor la corelaţiile dintre Topo II alfa şi supravieţuire. Datele existente sunt limitate, iar studiile realizate au fost direcţionate prioritar spre cancerul de sân şi cel de ovar, pentru care a fost demonstrat rolul Topo II alfa ca factor de predicţie independent pentru supravieţuire (Fritz et al., 2005, Ferrandina et al., 2008), şi mai puţin spre patologia tumorală colorectală.

Analiză de corelaţie realizată a indicat absenţa unei corelaţii semnificative statistic între Topo II alfa şi cele două variabile timp-dependente urmărite, supravieţuirea post-tratament metastază, respectiv intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,46, respectiv p = 0,85). Pentru a verifica aceste rezultate negative, am introdus valoarea 25% ca valoare cutoff, dar şi pentru acest tip de evaluare corelaţiile au fost nesemnificative statistic. În mod cert, datele obţinute au fost puternic influenţate de statusul clinico-biologic al cazurilor incluse în subloturile de studiu. O posibilă explicaţie are ca punct de pornire stadiul avansat al bolii, reflectat în încadrarea uniformă a cazurilor ca având activitate proliferativă de grad înalt, astfel încât cutoff-ul introdus nu a putut opera cu un număr suficient de cazuri în două categorii distincte: cu proliferare marcată şi, respectiv, cu proliferare de grad scăzut.


16

9.4. EVALUAREA INFILTRATULUI IMUN ŞI INFLAMATOR 9.4.1. REPERE FUNDAMENTALE

Rolul infiltratului imun tumoral (Ropponen et al., 1997, Dolcetti et al., 1999, Guidoboni et al., 2001, Dunn et al., 2004, Galon et al., 2006, Galon et al., 2007, Ohtani, 2007) a fost investigat prioritar la nivelul CCR, comportamentul acestuia fiind comparat cu dualismul personajului Dr. Jekyll/Mr. Hyde (Talmadge et al., 2007). Literatura de specialitate susţine valoarea unui răspuns imun asociat, implicarea limfocitelor T fiind indubitabil mai importantă decât cea a limfocitelor B. În caracterizarea populaţiei limfocitare, atenţia a fost îndreptată spre studiul fenotipului, numărului şi dispoziţiei intratumorale versus peritumorale, fiind stabilite corelaţii care susţin valoarea prognostică, independent de clasificarea UICC-TNM (Galon et al., 2006). Infiltratul inflamator intervine, de asemenea, în carcinogeneza colorectală, prin macrofagele intra şi peritumorale care sintetizează factori stimulatori pentru angiogeneză, creştere şi invazie tumorală (Mantovani et al., 2004, Pollard, 2004, Kopfstein, Christofori, 2005, Mantovani et al., 2007). Analiza critică a literaturii relevă însă un număr limitat de studii legate de infiltratul imun şi inflamator la nivel hepatic, în context metastatic. 9.4.2. OBIECTIVE SPECIFICE

Obiectivele specifice asupra cărora ne-am concentrat au fost: - caracterizarea calitativă şi cantitativă a componentei imune şi inflamatorii; - stabilirea existenţei sau absenţei unor diferenţe cu semnificaţie statistică între metastazele hepatice per-

primam şi boala metastatică recurentă, prin prisma cuantificării populaţiei limfocitare şi macrofagice; - stabilirea valorii de factor prognostic pentru limfocitele T, B şi macrofage, în raport de profilul clinico-

morfologic al tumorii primare şi, respectiv, al MTS hepatice, cu accent pe supravieţuirea post-tratament MTS. 9.4.3. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI DE CUANTIFICARE

Evaluarea cantitativă a fost realizată prin numărarea celulelor CD3, CD20 şi, respectiv, CD68 pozitive. Pentru fiecare tip celular, valoarea medie raportată a rezultat ca urmare a cuantificării celulelor prezente în 10 câmpuri microscopice cu densitate celulară crescută, separat pentru ariile intratumorale şi peritumorale, la magnificaţie x200. 9.4.4. REZULTATE 9.4.4.1. Analiza calitativă

Analiza calitativă a infiltratului imun/inflamator a relevat predominanţa populaţiei limfocitare T, comparativ cu populaţia limfocitară B, şi prezenţa importantă a populaţiei macrofagice (fig. 118).

Fig. 118. Analiză comparativă a populaţiilor limfocitare asociate nodulilor tumorali hepatici, prin evaluarea interfeţei parenchim hepatic – tumoră pentru acelaşi caz:

(a) limfocite T prezente în număr important, peritumoral (IHC, anti-CD3, x 4); (b) detaliu pentru limfocitele T (IHC, anti-CD3, x 10); (c) limfocite B prezente în număr mic (IHC, anti-CD20, x 4); detaliu pentru limfocitele B (IHC, anti-CD20, x 10)

9.4.4.2. Analiza cantitativă Evaluarea statistică a populaţiei limfocitare T a relevat absenţa oricăror diferenţe semnificative statistic, în

comparaţia sublot 1 versus sublot 2, intratumoral (p = 0,763) şi peritumoral (p = 0,594) (fig. 184). Rezultate similare au fost obţinute pentru populaţia limfocitară B, sublot 1 versus sublot 2, intratumoral (p = 0,878) şi peritumoral (p = 0,811) (fig. 185). În schimb, analiza statistică a populaţiei macrofagice a evidenţiat prezenţa diferenţelor semnificative statistic între sublotul 1 şi sublotul 2, intratumoral (p = 0,006) şi peritumoral (p = 0,003) (fig. 186).

Tabelul 13. Populaţii celulare – date numerice – sublot 1

Limfocite T (CD3 pozitive) (medie, deviaţie medie standard)

Limfocite B (CD20 pozitive) (medie, deviaţie medie standard)

Macrofage (CD68 pozitive) (medie, deviaţie medie standard) Număr caz

Intra-tumoral Peri-tumoral Intra-tumoral Peri-tumoral Intra-tumoral Peri-tumoral 1. 39,20 ± 18,01 91,00 ± 30,06 8,20 ± 2,58 28,80 ± 9,20 13,40 ± 2,96 28,00 ± 5,29 2. 55,00 ± 10,27 49,20 ± 23,97 0 1,60 ± 1,50 31,40 ± 12,70 18,00 ± 4,47 3. 6,60 ± 2,79 7,60 ± 2,70 0 15,80 ± 7,94 4,80 ± 3,27 8,80 ± 3,80 4. 0 16,60 ± 8,84 0 16,80 ± 7,12 0 12,40 ± 2,50 5. 39,40 ± 9,28 81,60 ± 32,54 2,40 ± 2,07 13,20 ± 5,97 32,20 ± 9,67 51,60 ± 15,22 6. 13,60 ± 3,84 57,80 ± 20,24 0 21,60 ± 9,15 22,40 ± 9,30 18,20 ± 8,28 7. 15,00 ± 8,00 42,20 ± 9,52 0 49,40 ± 22,58 0 13,60 ± 6,22 8. 17,80 ± 9,12 95,20 ± 22,20 5,60 ± 2,40 12,40 ± 7,30 8,40 ± 3,43 15,40 ± 8,38

TOTAL 23,32 ± 19,01 55,15 ± 32,83 2,02 ± 3,19 19,95 ± 14,21 14,07 ± 13,16 20,75 ± 13,68 p

(intra vs. peri) 0,032 0,003 0,336


17

Tabelul 14. Populaţii celulare – date numerice – sublot 2

Limfocite T (CD3 pozitive) (medie, deviaţie medie standard)

Limfocite B (CD20 pozitive) (medie, deviaţie medie standard)

Macrofage (CD68 pozitive) (medie, deviaţie medie standard) Număr caz

Intra-tumoral Peri-tumoral Intra-tumoral Peri-tumoral Intra-tumoral Peri-tumoral

1. 6,00 ± 2,54 141,80 ± 46,01 3,40 ± 1,67 42,20 ± 13.42 40,00 ± 14.01 59,60 ± 23.26

2. 24,20 ± 11,88 102,20 ± 40.18 3,00 ± 2,91 15,40 ± 4.77 71,00 ± 35.02 131,40 ± 41.65

3. 15,80 ± 5,63 82,60 ± 34,95 0,00 4,40 ± 3,28 21,40 ± 10,96 50,40 ± 16,87

4. 45,40 ± 14,17 92,40 ± 23,89 3,00 ± 2,12 5,40 ± 3,64 145,80 ± 70,25 234,80 ± 66,12

5. 33,20 ± 11,16 96,20 ± 36,17 2,80 ± 2,16 57,00 ± 46,88 41,40 ± 19,76 54,80 ± 8,37

6. 11,80 ± 9,88 12,8 ± 4,32 0,00 12,60 ± 1,67 38,80 ± 13,33 65,60 ± 31,57

7. 18,00 ± 13,52 46,20 ± 30,44 0,00 7,60 ± 5,31 37,40 ± 21,09 41,20 ± 8,78

8. 4,20 ± 3,42 18,80 ± 11,73 0,00 0,00 15,00 ± 9,30 21,80 ± 12,31

9. 28,20 ± 12,27 110,40 ± 29,48 2,20 ± 0,83 28,20 ± 14,39 60,20 ± 16,45 134,00 ± 54,12

10. 15,20 ± 6,53 63,40 ± 19,32 4,80 ± 3,56 34,60 ± 15,82 27,40 ± 9,23 41,40 ± 13,04

11. 22,40 ± 7,98 87,60 ± 36,77 2,40 ± 2,30 12,40 ± 6,22 26,80 ± 10,00 44,20 ± 8,98

12. 9,20 ± 6,09 28,60 ± 9,44 2,00 ± 0,70 12,40 ± 6,10 18,80 ± 5,80 32,20 ± 15,60

13. 30,80 ± 15,08 40,40 ± 18,67 3,20 ± 1,30 19,20 ± 11,23 21,80 ± 7,39 21,20 ± 7,72

14. 27,00 ± 8,63 42,80 ± 16,61 3,80 ± 1,78 18,80 ± 9,75 25,20 ± 7,69 47,00 ± 8,00

15. 21,00 ± 9,79 64,60 ± 22,45 1,80 ± 1,92 11,20 ± 4,65 46,80 ± 14,70 117,20 ± 47,45

16. 24,80 ± 10,96 69,00 ± 19,64 3,00 ± 2,54 13,40 ± 8,20 33,40 ± 11,28 37,00 ± 22,72

TOTAL 19,82 ± 10,81 68,73 ± 35,88 2,21 ±1,49 18,42 ± 15,11 41,95 ± 31,52 70,86 ± 56,59

p (intra vs.

peri) < 0,0001 0,00018 0,0843

9.4.4.3. Analiza statistică – corelaţii cu supravieţuirea post-tratament metastază şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie

Analiza de corelaţie între limfocitele T, limfocitele B şi, respectiv, macrofage, evaluate intratumoral şi, respectiv peritumoral şi cele două variabile timp-dependente urmărite, supravieţuirea post-tratament metastază, respectiv intervalul de timp până la reluarea de evoluţie a relevat valori nesemnificative statistic. 9.4.5. DISCUŢII • Boală metastatică recurentă după termonecroză versus metastaze rezecate chirurgical

Ţinând cont de particularităţile evolutive ale celor două subloturi, am pornit de la premiza că sublotul 1, caracterizat printr-o evoluţie clinică mai agresivă, ar trebui să prezinte un profil al infiltratului imun/inflamator diferit de sublotul 2. Această asumpţie nu a fost confirmată în totalitate. • Populaţia limfocitară – evaluare globală

Compararea rezultatelor obţinute pentru cele două subloturi aduce argumente suplimentare pentru înţelegerea modului de acţiune a infiltratului imun/inflamator. Iniţial, în baza punctului de vedere clinic, metastazele recurente incluse în sublotul 1 au fost considerate leziuni cu profil biologic şi potenţial evolutiv mult mai sever. Totuşi, evaluarea cantitativă a relevat că nu există diferenţe semnificative statistic între valoarea medie a limfocitelor T intratumorale şi, respective, peritumorale, sublot 1 versus sublot 2 (p = 0,763, respectiv p = 0,594). Rezultate similare au fost înregistrate pentru limfocitele B (p = 0,878, respectiv p = 0,811). În consens cu datele publicate în literatură (Kopfstein, Christofori, 2006, Ohtani, 2007), studiul nostru atestă predominanţa limfocitelor T, precum şi dispoziţia lor masivă peritumoral, dar aduce un argument în favoarea ipotezei conform căreia infiltratul imun localizat la interfaţa ţesut tumoral – parenchim indică implicarea sa în dezvoltarea metastazelor hepatice, printr-un răspuns imun mediat celular care asigură în principal imunotoleranţă. Rolul infiltratului imun (în principal peritumoral) în creşterea metastazelor devenind evident, rezultă că semnificaţia sa, ca factor de prognostic pozitiv, trebuie reevaluată. Cu certitudine, limfocitele T sunt elementele celulare cele mai importante. Prin prisma “încărcăturii” limfocitare, studiul nostru relevă că metastazele per primam nu diferă de boala metastatică recurentă, fapt care sugerează că metastazele hepatice (indiferent de stadiul lor) se dezvoltă fără a induce fenomene evidente de rejet imunologic. Astfel, trebuie subliniat faptul că rezultatele noastre preliminare nu se suprapun cu teoria clasică, care consideră limfocitele T ca factor prognostic pozitiv. • Populaţia macrofagică – evaluare globală

Examenul imunohistochimic al macrofagelor a evidenţiat prezenţa unei populaţii bine reprezentate în sublotul 1 şi foarte bine reprezentate în sublotul 2, cu o distribuţie heterogenă de la caz la caz. Această constatare calitativă a fost confirmată de informaţiile numerice. Analiza statistică a atestat lipsa unei diferenţe semnificative statistic între numărul mediu al macrofagelor, comparativ intra şi peritumoral, atât pentru sublotul 1 (p = 0,336), cât şi pentru sublotul 2 (p = 0,084). Rezultatele obţinute susţin rolul acestora (mai puţin bine studiat) în metastazare, prin producerea unor factori care pot promova angiogeneza, creşterea tumorală şi invazia, precum şi “evadarea imunologică” (eng. immune escape)


18

(Mantovani et al., 2004, Pollard, 2004, Mantovani et al., 2007). În cele două tipuri de metastaze analizate, macrofagele urmează un scenariu cantitativ diferit de limfocitele T şi B. Diferenţele semnificative între valoarea medie intratumorală, respectiv peritumorală, sublot 1 versus sublot 2 (p = 0,006, respectiv p = 0,003) sugerează o participare activă a macrofagelor în formarea metastazelor per primam, potenţialul lor funcţional fiind parţial epuizat în boala metastatică recurentă. • Populaţia limfocitară, populaţia macrofagică - corelaţii cu supravieţuirea

Valoarea prognostică pozitivă a limfocitelor T este discutabilă, o nouă ipoteză sugerând un rol negativ (Kopfstein, Christofori, 2006). Rezultatele noastre au relevat absenţa corelaţiilor semnificative statistic între limfocitele T (intra şi peritumoral), limfocitele B (intra şi peritumoral) şi macrofage (intra şi peritumoral) şi cele două variabile timp-dependente. Absenţa acestor corelaţii are, în opinia noastră, următoarea explicaţie: profilul imun / inflamator al metastazelor hepatice diferă semnificativ de cel al tumorii primare, în principal prin parametrul cantitativ net superior. Astfel, răspunsul imun / inflamator benefic existent la nivelul tumorii primare, operaţional la marginea de invazie, este complet depăşit, iar activitatea TILs şi TAMs interferă cu alţi factori moleculari produşi de micromediul metastatic. Consecutiv, prezenţa celulelor imune şi/sau inflamatorii nu mai poate influenţa independent evoluţia tumorii în direcţia supravieţuirii. 9.5. EVALUAREA PROCESULUI DE ANGIOGENEZĂ ŞI LIMFANGIOGENEZĂ 9.5.1. REPERE FUNDAMENTALE

În 1971, Judah Folkman lansează ideea conform căreia creşterea tumorală şi metastazarea sunt dependente de angiogeneză, astfel încât blocarea factorilor angiogenici ar putea fi o alternativă de tratament, prin oprirea vascularizaţiei şi, consecutiv, a dezvoltării tumorale şi diseminării (Folkman, 1971). Corelaţia directă între angiogeneză şi progresia tumorală – ca risc de metastazare şi prognostic rezervat este demonstrată prin numeroase studii axate pe patologia tumorală mamară, prostatică, testiculară, urotelială, în teritoriul cap şi gât (Sharma et al., 2005), alături de CCR (Rmali et al, 2007). Analiza critică a literaturii relevă însă existenţa unui număr limitat de studii referitoare la procesul de angiogeneză şi limfangiogeneză dezvoltat la nivel hepatic, în context metastatic. 9.5.2. OBIECTIVE SPECIFICE

Obiectivele specifice asupra cărora ne-am concentrat au fost: - caracterizarea calitativă şi cantitativă a elementelor microvasculare sanguine şi limfatice; - caracterizarea calitativă şi cantitativă a expresiei VEGF-A şi VEGF-R2; - stabilirea existenţei sau absenţei unor diferenţe cu semnificaţie statistică între metastazele hepatice per-

primam şi boala metastatică recurentă, prin prisma MVD şi LVD; - stabilirea valorii de factor prognostic pentru MVD, LVD, VEGF-A şi VEGF-R2, în raport de profilul clinico-


Cuantificarea densităţii microvasculare / microlimfatice a fost realizată, pentru fiecare caz, pe 5 câmpuri vasculare considerate “hotspots”, identificate la o magnificaţie x40 (Weidner et al., 1991). Elementele vasculare CD31, respectiv D2-40 pozitive au fost apoi numărate la o magnificaţie mare (x200), pe fiecare câmp microscopic, media datelor reprezentând densitatea microvasculară. Pentru evaluarea expresiei VEGF-A şi VEGF-R2 au fost utilizate două criterii: procentul de celule pozitive (P) şi intensitatea coloraţiei imunohistochimice (I), cu rezultat final în obţinerea unui scor P x I (Aoyagi et al., 2005). 9.5.4. REZULTATE 9.5.4.1. Analiza calitativă

Fig. 187. Noduli tumorali cu organizare compactă, înconjuraţi de reţea microvasculară (IHC, anti-CD31, x 4)

Fig. 196. Distribuţie peritumorală a microvaselor: (IHC, anti-CD31, x 10)

Fig. 209. Microlimfatice în stroma tumorală, în infiltratul limfocitar (IHC, anti-D2-40, x 10)

Fig. 212. Microlimfatice intratumorale (IHC, anti-D2-40, x 10)

Fig. 220. Reacţie VEGF-A pozitivă, omogenă, în noduli tumorali metastatici (IHC, anti-VEGF-A, x 4)

Fig. 226. Reacţie VEGF-A pozitivă, omogenă, de intensitate medie (IHC, anti-VEGF-A, x 20)

Fig. 235. Reacţie VEGF-R2 pozitivă, omogenă, intensă (IHC, anti-VEGF-R2, x 20)

Fig. 236. Reacţie VEGF-R2 pozitivă, omogenă, de intensitate moderată (IHC, anti-VEGF-R2, x 20)


19

Examenul microscopic a relevat existenţa unei reţele microvasculare şi a vascularizaţiei microlimfatice dezvoltate predominant peritumoral şi mai puţin evidentă intratumoral, microvasele fiind identificabile prin pozitivitatea reacţiei imunohistochimice. Figurile 187-212 ilustrează aceste aspecte calitative. Analiza VEGF-A/VEGF-R2 a evidenţiat o mare variabilitate a pattern-urilor de colorare, de la omogen la heterogen, cu intensitate variabilă a reacţiei, acoperind cele 3 grade: crescut, mediu şi scăzut (fig. 220-239). 9.5.4.2. Analiza cantitativă

Tabelul 15. Densitatea microvasculară şi densitatea microlimfatică – date numerice - sublot 1

MVD LVD Număr caz

Intra-tumoral Peri-tumoral Intra-tumoral Peri-tumoral

1. 24,5 ± 10,01 78,40 ± 20,56 6,20 ± 3,55 18,8 ± 6,50

2. 50,7 ± 20,27 103,3 ± 53,45 4,50 ± 1,12 12,6 ± 1,5

3. 12,2 ± 6,79 30,6 ± 5,70 8,6 ± 3,45 14,8 ± 5,94

4. 32,5 ± 9,55 46,6 ± 28,24 6,17 ± 3,24 12,8 ± 4,12

5. 35,6 ± 9,28 41,6 ± 32,54 4,4 ± 2,85 18,2 ± 6,20

6. 15,5 ± 4,54 55,8 ± 18,24 4,70 ± 2,30 24,6 ± 10,15

7. 29,80 ± 18,4 65,2 ± 9,70 2,70 ± 1,24 19,4 ± 12,55

8. 43,9 ± 29,45 45,2 ± 22,20 3,3 ± 1,4 21,4 ± 10,50

TOTAL 30,58 ± 13,16 58,33 ± 23,41 5,07 ± 1,87 17,82 ± 4,20

p (intra vs. peri) p = 0,01 p < 0,0001

Tabelul 16. Densitatea microvasculară şi densitatea microlimfatică – date numerice - sublot 2

MVD MLD Număr caz

Intra-tumoral Peri-tumoral Intra-tumoral Peri-tumoral

1. 9 ± 3,25 130,5 ± 42,40 5,5 ± 2,80 39,8 ± 15,90

2. 15,6 ± 3,43 173,2 ± 28,22 4,8 ± 3,56 47,4 ± 15,32

3. 3,8 ± 2,58 63,8 ± 28,54 2,4 ± 1,51 7,4 ± 6,34

4. 30,5 ± 12,58 79,4 ± 30,20 3,9 ± 2,91 12,4 ± 4,77

5. 22,4 ± 10,17 98,7 ± 45,55 6,2 ± 3,83 33,7 ± 18,59

6. 17,7 ± 8,23 112,5 ± 27,32 6,5 ± 3,30 30,1± 12,12

7. 30,4 ± 9,2 92,3 ± 56,12 3,9 ± 1,3 21,5 ± 16,30

8. 19,5 ± 8,5 68,6 ± 23,44 9,15 ± 4,70 10,9 ± 4,5

9. 24,6 ± 12,20 48,4 ± 19,00 4,2 ± 2,45 25,8 ± 10,70

10. 34,3 ± 13,53 38,7 ± 10,30 2,8 ± 1,20 13,5 ± 6,55

11. 35,8 ± 18,25 55,3 ± 12,50 10,8 ± 4,92 19,2 ± 7,65

12. 14,8 ± 4,65 86,3 ± 41,24 5,44 ± 2,54 9,5 ± 5,5

13. 29,80 ± 12,02 110,5 ± 25,44 9,80 ± 3,11 32,30 ± 12,56 14. 22 ± 4,74 78,90 ± 32,60 9,20 ± 2,58 34,8 ±9,98 15. 16,80 ± 5,71 74,20 ± 12,23 7,20 ± 2,16 17,00 ± 7,31 16. 29,20 ± 14,51 49,20 ± 13,33 4,20 ± 1,78 21,60 ± 2,07

TOTAL 22,26 ± 9,12 85,03 ± 34,68 5,99 ± 2,58 23,55 ± 11,83 p

(intra vs. peri) p < 0,0001 p < 0,0001

Analiza statistică a MVD a relevat, pentru localizarea intratumorală, absenţa oricăror diferenţe semnificative sublot 1 versus sublot 2 (p = 0,13), iar pentru localizarea peritumorală, o diferenţă semnificativă statistic (p = 0,03) (fig. 279, 280). Pentru LVD, pentru ambele localizări (intra-tumoral, peri-tumoral) nu au fost înregistrate diferenţe semnificative statistic în comparaţia sublot 1 versus sublot 2 (p = 0,35, respectiv p = 0,09) (fig. 281). Figurile 282-303 ilustrează diferenţele, exprimate procentual prin analiză cantitativă, în pozitivitatea celulelor tumorale pentru VEGF-A, precum şi diferenţele în intensitatea reacţiei imunohistochimice.

Tabelul 17. Expresia VEGF-A şi VEGF-R2 – date numerice – sublot 1

VEGF-A VEGF-R2 Număr caz SCOR Procent

celule pozitive Intensitate reacţie IHC SCOR Procent

Celule pozitive Intensitate reacţie IHC

1. 8 100% ++ 0 0 (absent) 0 (absent)

2. 8 100% ++ 8 100% ++

3. 4 95-100% + 12 95% +++

4. 3 70% + 3 50% +


20

5. 4 90% + 4 90% +

6. 4 98% + 8 90% ++

7. 12 90-100% +++ 12 100% +++

8. 6 50% ++ 4 40% ++

Tabelul 18. Expresia VEGF-A şi VEGF-R2 – date numerice – sublot 2

VEGF-A VEGF-R2 Număr caz SCOR Procent

celule pozitive Intensitate

Reacţie IHC SCOR Procent Celule pozitive

Intensitate reacţie IHC

1. 1 15% + 4 30% ++ 2. 8 95% ++ 8 95% ++

3. 12 100% +++ 12 90 +++ 4. 8 90% ++ 8 90% ++ 5. 12 95-100% +++ 8 95% ++ 6. 6 50% ++ 6 70% ++ 7. 8 95-100% ++ 8 100% ++ 8. 12 100% +++ 12 100% +++ 9. 4 40% ++ 4 30% ++

10. 4 35% ++ 4 40% ++ 11. 4 45% ++ 4 35% ++ 12. 4 30% ++ 9 70% +++ 13. 1 20% + 1 15 + 14. 4 40% ++ 4 35% ++ 15. 9 65% +++ 4 30% ++ 16. 12 75% +++ 9 70% +++

În sistemul de scor utilizat, am considerat valoarea 6 ca valoare prag, cazurile cu scor egal sau mai mare ca 6 fiind incluse în categoria „scor înalt”, iar cele cu valoare mai mică decât 6 – în categoria „scor scăzut”. 9.5.4.3. Analiza statistică – corelaţii cu supravieţuirea post-tratament metastază şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie

Analiza de corelaţie între MVD (intra şi peritumoral) şi cele două variabile timp-dependente urmărite a relevat valori nesemnificative statistic (intratumoral: p = 0,35, p = 0,39, peritumoral: p = 0,80, p = 0,62). Rezultate similare au fost obţinute pentru LVD (intratumoral: p = 0,38, p = 0,25, peritumoral: p = 0,85 , p = 0,89). Analiza de corelaţie între scorurile VEGF-A, VEGF-R2 şi cele două variabile timp-dependente urmărite a relevat existenţa unei diferenţe semnificative statistic pentru supravieţuirea post-tratament metastază (p= 0,007, respectiv p = 0,011) (fig. 317, 318) şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,020, respectiv p = 0,019) (fig. 319, 320).

Fig. 317, 318 Curbele de supravieţuire KM în raport de VEGF-A, VEGF-R2 Fig. 319, 320. Curbele de supravieţuire KM până la reluarea de evoluţie în raport

de VEGF-A, VEGF-R2

9.5.5. DISCUŢII • Boală metastatică recurentă după termonecroză versus metastaze rezecate chirurgical

Ţinând cont de particularităţile evolutive ale celor două subloturi (boală metastatică recurentă post-termonecroză versus metastaze per primam, rezecate chirurgical), am pornit de la premiza că sublotul 1, caracterizat printr-o evoluţie clinică mai agresivă, ar trebui să prezinte un profil angiogenic şi limfangiogenic diferit de sublotul 2. Această asumpţie nu a fost confirmată în totalitate. • Densitatea microvasculară – evaluare globală

Examenul histopatologic calitativ a semnalat diferenţe evidente între MVD intratumorală şi cea peritumorală. În mod evident, angiogeneza intratumorală a fost mult mai limitată, şi două evenimente din cascada metastazării ar putea explica acest fapt, prin raportare concretă la aspecte care au caracterizat subloturile luate în studiu. În primul rând, rata de proliferare extrem de intensă, care a determinat o dezvoltare concentrică a celulelor tumorale, printre care sau în interiorul cărora stroma este foarte slab reprezentată – şi, consecutiv, teritoriul de apariţie şi extindere a microvascularizaţiei este limitat. În al doilea rând, asocierea necrozei tumorale, ca indicator suplimentar pentru agresivitate, cu rezultat în existenţa unor arii largi de necroză lipsite, evident, de microvascularizaţie. În schimb, la interfaţa cu parenchimul hepatic restant, zonă cu implicaţii directe în expansiunea tumorală metastatică, analiza elementelor microvasculare a relevat nu numai o „explozie” cantitativă, ci şi o arhitectonică caracterizată prin


21

orientarea lor în şiruri suprapuse, din care se desprind, spre interior, microvase care pătrund în structura tumorii constituite, şi care au tendinţa, spre exterior, de a converge spre capilarele sinusoide.

Deşi ficatul este situsul cel mai frecvent şi important pentru metastazare, în raport cu publicaţiile asupra valorii MVD în evoluţia tumorii primare, inclusiv colorectale, date concrete asupra metastazelor hepatice secundare CCR sunt relativ puţin numeroase. Prezenţa tumorii primare este corelată cu scăderea MVD în MTS la distanţă, şi că rezecţia tumorii primare conduce la creşterea vascularizaţiei în leziunile metastatice (Peeters et al., 2004), influenţând semnificativ prognosticul (Nanashima et al., 2001). Valorile medii MVD raportate pentru a caracteriza metastazele hepatice secundare CCR variază pe o scală foarte largă (între 15 (Cheng et al., 2004) şi 59 (Nanashima et al., 2001)), valorile MVD obţinute în cadrul studiului doctoral fiind înscrise în cadrul celor prezente în literatură.

Compararea rezultatelor care caracterizează cele două loturi aduce argumente suplimentare în înţelegerea angiogenezei şi, mai mult, constituie un element de originalitate, prin prisma evaluării microvascularizaţiei, ca aspecte comune şi diferite, în boala metastatică recurentă şi, respectiv, în metastazele per primam. Interpretarea datelor conduce la ideea unei “diminuări” a capacităţii invazive prin angiogeneză în cazul bolii metastatice recurente, comparativ cu procesul iniţial de dezvoltare a metastazelor. Mai mult, contextul tratamentului anterior prin termonecroză, practicat pentru sublotul 1, trebuie luat în considerare, putând interfera cu angiogeneza asociată reluării de evoluţie, posibil redusă datorită modificărilor biologice importante produse la nivelul micromediului hepatic. • Densitatea microvasculară - corelaţii cu supravieţuirea

Valoarea MVD, ca factor prognostic operaţional, poate fi certificată – inclusiv în metastazele hepatice CCR – prin raportarea la supravieţuire (Vermulen et al., 2001, Rajaganeshan et al., 2008). În studiul nostru, pentru ambele variabile timp-dependente, în raport cu MVD, nu au fost obţinute diferenţe semnificative statistic (intratumoral: p = 0,35, p = 0,39, peritumoral: p = 0,80, p = 0,62), fapt care a condus la imposibilitatea includerii MVD ca factor de prognostic negativ, pentru seria investigată. • Densitatea microvasculară - probleme legate de metodologie

Cunoscând problemele care pot să apară în evaluarea MVD, am avut în vedere următoarele elemente concrete, legate de metodologie: (i) dentificarea elementelor vasculare a respectat criteriul general acceptat pentru a defini microvascularizaţia (Sharma et al., 2005), (ii) cuantificarea a fost repetată de două ori, la un interval de timp de 3-4 luni, cu diferenţe minore, fără semnificaţie statistică. Rezultatele susţin opinia conform căreia respectarea protocoalelor de lucru, selectarea atentă a hotspoturilor şi experienţa în evaluare determină şi susţin reproductibilitatea metodei. • Densitatea vasculară limfatică (LVD) – evaluare globală

Examenul histopatologic calitativ a pus în evidenţă un pattern al LVD similar cu cel al MVD. Analiza statistică a confirmat aspectul macroscopic, în ambele loturi fiind înregistrate diferenţe puternic semnificative statistic, intratumotal versus peritumoral (p < 0,0001). MVD intratumorală scăzută este explicată prin faptul că acest tip de vase sunt mai uşor distruse, comprimate sau colabate datorită celulelor proliferante şi presiunii ridicate existente la acest nivel. MVD semnificativ ridicată peritumoral susţine implicarea limfangiogenezei în diseminarea celulelor tumorale, dezvoltarea fiind realizată printr-un proces de înmugurire, sub influenţa lichidului interstiţial şi al VEGF-C secretat de celulele tumorale (Alitalo et al., 2005, Schoppmann et al., 2005, Ji, 2006).

Un accent trebuie pus pe faptul că valorile numerice obţinute de noi în cuantificarea LVD au fost mult mai mici, comparativ cu cele care au caracterizat MVD, ceea ce sugerează că limfangiogeneza şi angiogeneza sunt procese care se desfăşoară independent, fără corelaţie, fiind coordonate prin evenimente celulare şi moleculare distincte. Diferenţele între aceste valori pot fi explicate pornind de la statusul de normalitate tisulară extrapolat ulterior la micromediul tumoral şi apreciind că, în concordanţă cu funcţionalitatea celulară şi tisulară, potenţialul limfangiogenic este mult mai scăzut faţă de cel angiogenic. Tot în suportul afirmaţiilor de mai sus pot fi incluse şi rezultatele obţinute din compararea celor două subloturi – concret, a bolii metastatice recurente cu metastazele per primam. Analiza statistică a indicat absenţa diferenţelor semnificative statistic între sublotul 1 şi sublotul 2 atât pentru LVD intratumorală (p = 0,35), cât şi pentru cea peritumorală (p = 0,09). Datele noastre au indicat faptul că nu există diferenţe majore între metastazele iniţiale şi boala metastatică recurentă. • Densitatea vasculară limfatică (LVD) – corelaţia cu supravieţuirea

Raportările prezente în literatura de specialitate asociază LVD crescută cu riscul ridicat de metastazare limfatică şi se corelează cu o supravieţuire redusă în diferite tipuri de tumori (Stacker et al., 2004, Ji, 2006). Analiza de corelaţie între LVD (intra şi peri-tumoral) şi cele două variabile timp-dependente urmărite a relevat diferenţe nesemnificative statistic (intratumoral: p = 0,38, p = 0,25, peritumoral: p = 0,85, p = 0,89). Astfel, în condiţiile lotului investigat, LVD, alături de MVD, nu au putut asocia valoarea de factor prognostic. • Densitatea vasculară limfatică (LVD) - probleme legate de metodologie, tendiţe actuale

În baza documentării solide şi a experienţei practice, considerăm că ansamblul comentariilor şi detaliilor realizate în subsecţiunea corespondentă, dedicată MVD, pot fi extrapolate şi pentru LVD. • VEGF – VEGF-R – evaluare globală

Elementele de originalitate ale prezentului studiu sunt susţinute de analiza corelaţiei dintre expresia VEGF-A şi expresia VEGF-R2 bazată pe aceste scoruri şi interpretată ca şi corelaţie directă în condiţiile în care scorul VEGF-R2 a fost identic sau mai mare decât scorul VEGF-A. În favoarea corespondenţei existente între expresia VEGF-A şi a receptorului său specific pledează valorile medii ale scorurilor VEGF-A şi VEGF-R2 obţinute pentru ambele subloturi, între care nu există diferenţe semnificative statistic. Datele noastre indică faptul că intervenţia VEGF în procesul de angiogeneză nu depinde numai de exprimarea sa la nivelul celulelor tumorale, ci şi de exprimarea VEGF-R la nivelul acestora. Implicit, acesta este un argument care reafirmă dependenţa angiogenezei de factorii de creştere vasculari şi de receptorii specifici acestora, celulele tumorale fiind, concomitent, producători şi ţinte pentru familia VEGF.


22

Un comentariu aparte trebuie făcut pentru pattern-ul de colorare. Deşi această caracteristică nu este inclusă în definirea scorurilor, ea reprezintă, în opinia noastră, un indicator relevant pentru gradul de implicare a celulelor tumorale în angiogeneză, prin producţie de factori angiogenici sau recepţionarea acestora. Astfel, un pattern omogen, caracterizat prin reacţie uniformă în toate celulele tumorale, poate indica un grad ridicat de răspuns favorabil angiogenezei, iar un pattern heterogen, care relevă o reacţie neuniformă– o responsivitate parcelară, scăzută.

Diferenţele de exprimare a VEGF-A şi VEGF-R2 au fost marcate, cele 24 de cazuri investigate au prezentat o variabilitate extrem de mare, reflectând în esenţă particularitatea de reacţie favorabilă angiogenezei a fiecărui micromediu hepatic în contact cu expansiunea tumorală metastatică, primară sau secundară. Cu toate acestea, tentativa de descriere a ansamblului, prin valoarea medie a scorului VEGF-A şi, respectiv, VEGF-R2 (situată în jurul cifrei 6), a relevat nu numai un profil comun pentru cei doi markeri, dar şi un profil comun pentru cele două subloturi, reprezentând două momente diferite în evoluţia procesului metastatic (metastaza per-primam şi reluarea de evoluţie). • VEGF-A – VEGF-R2 – corelaţii cu supravieţuirea

Informaţiile referitoare la valoarea prognostică a VEGF în contextul strict al metastazelor hepatice sunt însă extrem de reduse (Bruns et al., 2000, Cheng et al., 2004, Nakamoto et al., 2007). Analiza de corelaţie între scorurile VEGF-A, VEGF-R2 şi cele două variabile timp-dependente urmărite a evidenţiat existenţa unei diferenţe semnificative statistic pentru supravieţuirea post-tratament metastază (p= 0,007, respectiv p = 0,011) şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,020, respectiv p = 0,019).

Rezultatele semnificative statistic obţinute şi din evaluarea separată a procentului de celule pozitive şi, respectiv, a imunomarcajului, pentru fiecare dintre cei doi markeri confirmă, în opinia noastră, valoarea fiecărei componente a scorului, care poate fi utilizată şi independent. Astfel, în condiţiile lotului investigat, VEGF-A şi VEGF-R2 au valoare de factor prognostic. 9.6. EVALUAREA POTENŢIALULUI DE INVAZIE METASTATICĂ: METALOPROTEINAZE ŞI INHIBITORI SPECIFICI 9.6.1. REPERE FUNDAMENTALE

Literatura de specialitate raportează expresii crescute ale MMPs în diferite tipuri de tumori, inclusiv CCR (Zucker, Vacirca, 2004), cu diferenţe evidente între formele metastatice şi cele non-metastatice. Studii recente evaluează, în paralel cu MMPs, inhibitorii tisulari specifici. Consecutiv, expresiile MMP şi TIMP pot fi interpretate în contextul evaluării evoluţiei, ca potenţiali factori prognostici. În schimb, puţine studii sunt dedicate profilului şi valorii prognostice a MMPs şi TIMPs în MTS hepatice secundare CCR (Waas et al., 2003). 9.6.2. OBIECTIVE SPECIFICE

Obiectivele specifice asupra cărora ne-am concentrat au fost: - caracterizarea calitativă şi cantitativă a profilului MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2; - stabilirea existenţei sau absenţei unor diferenţe cu semnificaţie statistică între metastazele hepatice per-

primam şi boala metastatică recurentă, prin prisma MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2; - stabilirea valorii de factor prognostic pentru MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2, în raport de profilul clinico-


Pentru evaluarea expresiei MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 am utilizat un scor propriu, bazat pe combinarea unor elemente de evaluare semi-cantitativă şi cantitativă prezente în alte scoruri descrise în literatură (Trudel et al., 2003, Curran et al., 2004, Zucker, Vacirca, 2004, Gu et al., 2005; Lyall et al., 2006, Gao et al., 2009). Pentru evaluarea expresiei MMP şi TIMP au fost utilizate două criterii: procentul de celule tumorale pozitive (P) şi intensitatea coloraţiei imunohistochimice (I), cu rezultat final în obţinerea unui scor P x I (Lyall et al., 2006). 9.6.4. REZULTATE 9.6.4.1. Analiza calitativă

Microscopic, evaluarea MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2, prin prisma caracteristicilor de colorare imunohistochimică (fig. 327-338), a relevat, pentru celulele tumorale, marcarea predominant citoplasmatică; pattern-ul de colorare definit în ansamblu a fost de tip omogen şi heterogen, intensitatea reacţiei imunohistochimice a fost variată de la caz la caz, fiind observate toate cele 3 grade: crescut, mediu şi scăzut. Celulele stromale au fost pozitive în principal în interiorul nodulilor tumorali, şi mai puţin evidente la interfaţa tumoră – parenchim.

Fig. 327. Reacţie MMP2 heterogenă, de intensitate ridicată (IHC, anti-MMP2, x 20)

Fig. 328. Reacţie TIMP2 omogenă, de intensitate ridicată, (IHC, anti-TIMP2, x 20)

Fig. 333. Reacţie MMP9 omogenă, de intensitate ridicată (IHC, anti-MMP9, x 20)

Fig. 334. Reacţie TIMP1 omogenă, de intensitate ridicată (IHC, anti-TIMP1, x 20)

9.6.4.2. Analiza cantitativă Evaluarea MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 a relevat următoarele aspecte cantitative:


23

Tabelul 19. Expresia MMP2 şi TIMP2 – date numerice – sublotul 1

MMP2 TIMP2 Număr caz

SCOR Procent celule pozitive

Intensitate reacţie IHC SCOR Procent

celule pozitive Intensitate reacţie IHC

1. 0 0 (absent) 0 (absent) 0 0 (absent) 0 (absent) 2. 4 40% ++ 9 100% +++ 3. 0 0 (absent) 0 (absent) 9 90% +++ 4. 1 5% + 4 45% ++ 5. 6 60% ++ 6 90% ++ 6. 4 30% ++ 4 40% ++ 7. 4 25% ++ 9 100% +++ 8. 0 0 (absent) 0 (absent) 0 0 (absent) 0 (absent)





celule positive Intensitate reacţie IHC

1. 0 0 (absent) 0 (absent) 0 0 (absent) 0 (absent) 2. 1 5% + 6 60% ++ 3. 0 0 (absent) 0 (absent) 6 100% ++ 4. 2 30% + 6 70% ++ 5. 0 0 (absent) 0 (absent) 0 0 (absent) 0 (absent) 6. 2 20% + 9 90% +++ 7. 9 90% +++ 9 80% +++ 8. 0 0 (absent) 0 (absent) 0 0 (absent) 0 (absent)






1. 0 0 (absent) 0 (absent) 9 100% +++

2. 0 0 (absent) 0 (absent) 9 100% +++

3. 0 0 (absent) 0 (absent) 9 90% +++

4. 0 0 (absent) 0 (absent) 0 0 (absent) 0 (absent)

5. 2 20% + 6 100% ++

6. 4 45% ++ 6 70% ++

7. 0 0 (absent) 0 (absent) 9 100% +++

8. 0 0 (absent) 0 (absent) 9 100% +++

9. 0 0 (absent) 0 (absent) 3 50% +

10. 0 0 (absent) 0 (absent) 9 90% +++

11. 0 0 (absent) 0 (absent) 9 90% +++

12. 4 35% ++ 6 75% ++

13. 0 0 (absent) 0 (absent) 6 55% ++

14. 0 0 (absent) 0 (absent) 9 100% +++

15. 2 30% + 6 70% ++

16. 2 25% + 9 85% +++







2. 9 100% +++ 9 100% +++

3. 9 100% +++ 9 100% +++


5. 2 30% + 2 10% +

6. 0 0 (absent) 0 (absent) 3 75% +

7. 2 10% + 6 90% ++

8. 6 85% ++ 0 0 (absent) 0 (absent)

9. 0 0 (absent) 0 (absent) 2 30% +

10. 3 60% + 3 80% +

11. 2 20% + 0 0 (absent) 0 (absent)


24

12. 6 50% ++ 6 70% ++

13. 1 5% + 9 90% +++

14. 2 10% + 9 100% +++

15. 2 20% + 6 70% ++

16. 4 25% ++ 9 90% +++

Figurile 339-403 ilustrează diferenţele în pozitivitatea celulelor tumorale pentru MMPs şi TIMPs. 9.6.4.3. Analiza statistică – corelaţii cu supravieţuirea post-tratament metastază şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie

Analiza de corelaţie între MMP2, respectiv TIMP2 şi cele două variabile timp-dependente urmărite a relevat valori nesemnificative statistic (p = 0,31, p = 0,15, respectiv p = 0,059, p = 0,37).

Suplimentar analizei statistice axată pe scorurile MMP2 şi TIMP2, am evaluat separat corelaţia dintre procentul de celule pozitive, respectiv intensitatea imunomarcajului pentru fiecare marker şi supravieţuirea post-tratament, respectiv intervalul de timp până la reluarea de evoluţie. În toate situaţiile am înregistrat corelaţii nesemnificative statistic cu cele două variabile timp-dependente, cu următoarele valori: p = 0,23, respectiv p = 0,11 pentru procentul de celule MMP2 pozitive, p = 0,13, respectiv p = 0,16 pentru procentul de celule TIMP2 pozitive; p = 0,40, respectiv p = 0,35 pentru intensitatea imunomarcajului MMP2, p = 0,06, respectiv p = 0,08 pentru intensitatea imunomarcajului TIMP2.

Ulterior, am introdus în aprecierea scorurilor un prag cu valoarea 4, rezultând astfel, pentru ambii markeri, două categorii de încadrare a cazurilor: cu scor „scăzut” – sub 4 şi, respectiv, cu scor „înalt” – mai mare sau egal cu 4. Analiza statistică realizată a indicat o corelaţie semnificativă statistic pentru TIMP2 (p = 0,002), în raport cu supravieţuirea post-tratament MTS (fig. 404). Celelalte corelaţii au avut valori nesemnificative statistic.

Fig. 404. Curbele KM de supravieţuire în raport

de valoarea prag 4 pentru TIMP2 Fig. 405. Curbele KM de supravieţuire în raport

de valoarea prag 4 pentru MMP9 Fig. 406. Curbele KM de supravieţuire în raport

de valoarea prag 4 pentru TIMP1

Analiza de corelaţie între MMP9 şi cele două variabile timp-dependente urmărite a relevat valori semnificative statistic (p = 0,041, respectiv p = 0,030). Analiza de corelaţie între TIMP1 şi cele două variabile timp-dependente urmărite a relevat valori semnificative statistic pentru supravieţuirea post-tratament MTS (p = 0,05) şi nesemnificative statistic pentru intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,22).

Am evaluat separat corelaţia dintre procentul de celule pozitive, respectiv intensitatea imunomarcajului pentru fiecare marker şi supravieţuirea post-tratament, respectiv intervalul de timp până la reluarea de evoluţie. Pentru MMP9, au fost obţinute corelaţii semnificative statistic cu cele două variabile timp-dependente (p = 0,050, respectiv p = 0,035 pentru procentul de celule MMP9 pozitive, şi p = 0,02, respectiv p = 0,01 pentru intensitatea imunomarcajului). Pentru TIMP1, corelaţiile au fost semnificative statistic în raport cu supravieţuirea: p = 0,040 pentru procentul de celule pozitive şi p = 0,046 pentru intensitate, dar nesemnificative în raport cu intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,22 pentru procentul de celule şi p = 0,058 pentru intensitatea imunomarcajului). Ulterior, am introdus în aprecierea scorurilor un prag cu valoarea 4, rezultând astfel, pentru ambii markeri, două categorii de încadrare a cazurilor: cu scor „scăzut” – sub 4 şi, respectiv, cu scor „înalt” – mai mare sau egal cu 4. Analiza statistică realizată a indicat o corelaţie semnificativă statistic pentru MMP9 în raport cu supravieţuirea post-tratament MTS (p = 0,041) (fig. 405) şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,049). Valori semnificative statistic au fost obţinute, de asemenea, şi pentru TIMP1 în raport cu supravieţuirea (p = 0,046) (fig. 406), corelaţia fiind nesemnificativă în raport cu intervalul de timp până la reluarea de evoluţie (p = 0,07). 9.6.5. DISCUŢII • Boală metastatică recurentă după termonecroză versus metastaze rezecate chirurgical

Ţinând cont de particularităţile evolutive ale celor două subloturi (boală metastatică recurentă post-termonecroză versus metastaze per primam, rezecate chirurgical), am pornit de la premiza că sublotul 1, caracterizat printr-o evoluţie clinică mai agresivă, ar trebui să prezinte un profil al metaloproteinazelor şi inhibitorilor specifici diferit de sublotul 2. Această asumpţie nu a fost confirmată în totalitate. • MMP2, TIMP2, MMP9, TIMP1 în celulele tumorale – evaluare globală

Ca şi pentru alţi factori de prognostic moleculari, pentru o evaluare a MMPs/TIMPs sunt necesare sisteme de scor – în aplicarea cărora apare o mare variabilitate datorită factorului subiectiv uman implicat. Pentru studiul nostru am utilizat un scor propriu, care are ca punct de plecare scoruri descrise în literatură şi care include nu numai informaţii


25

referitoare la procentul celulelor pozitive imunohistochimic şi la intensitatea marcajului, ci şi un prag stabilit la valoarea 4, care diferenţiază cazurile prin încadrare în două categorii: cu scor „înalt” şi, respectiv, cu scor „scăzut”.

Potenţialul de exprimare a MMPs/TIMPs de către celulele tumoral nu a permis stabilirea unui pattern uniform la nivelul celor două subloturi, şi nici stabilirea unor corelaţii cu cele două tipuri diferite de metastaze investigate. Compararea valorilor medii ale scorurilor pentru MMP2/TIMP2, respectiv MMP9/TIMP1 între sublotul 1 şi sublotul 2 a relevat ideea că expresiile distincte identificate reflectă indubitabil intervenţia fiecărui micromediu hepatic asociat, MMPs şi TIMPs neputând avea valoare de markeri prognostici independenţi. Analizând distribuţia cazurilor pozitive în raport de markeri şi subloturi, am putut stabili un profil general al expresiei markerilor investigaţi care indică, în ansamblu, o asociere scor MMP scăzut, scor TIMP înalt. În mod cert, se confirmă relaţia inversă între exprimarea unei metaloproteinaze şi a inhibitorului tisular corespondent. Mai mult, fiind vorba de subloturi caracterizate prin statutul lor de metastaze hepatice, expresia redusă a MMPs şi expresia mai puternică a TIMPs coincide cu teoria conform căreia intervenţia balanţei MMPs/TIMPs presupune prioritar un efect inhibitor asupra capacităţilor invazive. • Celulele stromale MMP2 şi/sau TIMP2, MMP9 şi/sau TIMP1 pozitive

Deşi am identificat prezenţa celulelor stromale pozitive MMP2 şi/sau TIMP2, respectiv MMP9 şi/sau TIMP1, obiectivul nostru nu a fost de a le evalua semi-cantitativ sau cantitativ, deoarece rolul lor este clar definit în procesul carcinogenetic şi metastatic. De aceea, subliniem doar particularităţile lor de distribuţie, cu o bună reprezentare în interiorul nodulilor tumorali, şi dispersate la interfaţa tumoră – parenchim, în ţesutul conjunctiv intens colagenizat, organizat sub formă de bandă. • MMP2, TIMP2, MMP9, TIMP1 în celulele tumorale – corelaţii cu supravieţuirea

Studii recente au fost orientate asupra procesului metastatic hepatic, pentru care MMPs şi TIMPs sunt consideraţi markeri prognostici utili (Zeng et al., 2002, Howell et al., 2002, Barozzi et al., 2002); de exemplu, nivelele crescute de MMP2 au indicat o rată de predicţie de 99% pentru dezvoltarea MTS hepatice (Barozzi et al., 2002). Consecutiv, MMPs şi TIMPs par a avea o contribuţie importantă în dezvoltarea unui fenotip agresiv, cu impact negativ asupra supravieţuirii (Lyall et al., 2006). Cu toate acestea, există încă lacune în înţelegerea contextului de acţiune a MMPs / TIMPs, opinii recente (Zucker, Varcica, 2004) punctând asupra persistenţei dilemei celulă stromală versus celulă tumorală, ca element esenţial în producerea acestor molecule.

Datele noastre au indicat corelaţii cu semnificaţie statistică între nivelul TIMP2, MMP9 şi, respectiv, TIMP1, şi supravieţuirea post-tratament metastază. Considerăm că aceste rezultate reflectă, în fapt, caracterul mult mai puternic al expresiei MMP9 – confirmat prin raportările din literatură. În acelaşi timp, trebuie luat în considerare stadiul tumoral avansat, metastatic al cazurilor, evoluţia acestora fiind indubitabil influenţată de o multitudine de factori, astfel încât nu putem discuta de valoarea independentă a unuia dintre aceştia. Acest fapt a fost susţinut şi prin analizele de corelaţie fără semnificaţie statistică, realizate separat pentru procentul de celule pozitive şi, respectiv, intensitatea de colorare a fiecărui dintre markeri în parte.

În contextul valorii prognostice a MMPs / TIMPs şi a celor două variabile timp-dependente pentru supravieţuire, absenţa diferenţelor dintre cele două subloturi este încă un argument pentru utilizarea termonecrozei cu vapori de apă ca metodă terapeutică în cazuri depăşite chirurgical.

CAPITOLUL 10. CONCLUZII • Evoluţia MTS hepatice este influenţată semnificativ de profilul clinico-biologic al tumorii colorectale

primare. MTS hepatice au însă un comportament diferit de cel al tumorii primare, datorită particularităţilor biologice ale micromediului hepatic.

• Factorii clinico-morfologici de prognostic operaţionali pentru cancerul colorectal nu pot fi extrapolaţi în stabilirea prognosticului metastazelor hepatice tratate. Evoluţia pacienţilor cu leziuni hepatice secundare decelate simultan cu tumora colorectală primară impune o evaluare dublă, în raport de factorii de prognostic ai tumorii primare şi factorii de prognostic ai metastazei.

• În lotul studiat, supravieţuirea post-tratament metastază şi, respectiv, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie a fost corelat semnificativ statistic cu următoarele caracteristici clinico-morfologice ale tumorii primare: invazia tumorală T4, peste 4 limfoganglioni pozitivi, invazia vasculară şi prezenţa coloidului. Consecutiv, aceste caracteristici au fost definite ca factori prognostici negativi.

• În lotul studiat, următoarele caracteristici clinico-morfologice ale tumorii primare nu au influenţat supravieţuirea post-tratament metastază şi, respectiv, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie: stadiul tumorii, invazia perinervoasă, gradul de diferenţiere, localizarea şi tipul histopatologic - valoarea lor prognostică nefiind confirmată.

• În lotul studiat, supravieţuirea post-tratament metastază şi, respectiv, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie a fost corelat semnificativ statistic cu următoarele caracteristici clinico-biologice ale metastazei: numărul de leziuni hepatice secundare, prezenţa adenopatiei hilare, prezenţa anemiei, nivelul CEA. Consecutiv, aceste caracteristici au fost definite ca factori prognostici negativi. Datele personale indică, cu diferenţe faţă de raportările din literatură, o valoare prognostică negativă în raport cu supravieţuirea pentru mai mult de doi noduli metastatici şi, respectiv, în raport cu intervalul de timp până la recădere, pentru mai mult de 5 leziuni. Nivelul seric al CEA cu semnificaţie prognostică negativă a fost stabilit la 68 ng/ml (valoare care reprezintă mediana lotului).

• Tipul de tratament chirurgical aplicat metastazei hepatice influenţează decisiv supravieţuirea şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie, rezecţia hepatică – în condiţiile în care poate fi practicată – reprezentând standardul de aur terapeutic. În mod concret, supravieţuirea post-tratament metastază prin termonecroză a avut valoarea mediană de 17 luni, în timp ce supravieţuirea post-tratament metastază prin rezecţie a avut o valoare care


26

depăşeşte maximum de urmărire a pacienţilor (60 luni). În raport cu intervalul de timp până la reluarea de evoluţie diferenţele au fost însă mai mici: 16 luni pentru cazurile tratate prin termonecroză cu vapori de apă şi, respectiv, 22 luni pentru cazurile tratate prin rezecţie. Rezecţia curativă (R0) are valoare de factor prognostiv pozitiv.

• În lotul studiat, supravieţuirea post-tratament metastază şi, respectiv, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie au fost corelate semnificativ statistic cu chimioterapia post-tratament chirurgical, care are valoare de factor prognostic pozitiv.

• Termonecroza cu vapori de apă constituie un procedeu original, a cărui implementare permite o alternativă de tratament paliativ în cazurile depăşite, pentru care orice tentativă chirurgicală clasică este contraindicată.

• În lotul studiat, parametrii care caracterizează termonecroza cu vapori de apă (numărul de ţinte termonecrozate, cantitatea de vapori de apă utilizată şi energia aplicată) nu au influenţat semnificativ statistic supravieţuirea post-tratament metastază şi intervalul de timp până la reluarea de evoluţie. Acest fapt a certificat valabilitatea procedeului, care se derulează în conformitate cu un protocol standard stabilit, fiind definite avantaje în raport de alte procedee ablative paliative.

• În lotul studiat, pentru ambele tipuri de tratamente aplicate, nu au existat diferenţe semnificative statistic între cazurile care au beneficiat de intervenţie simultană (sincronă) pentru tumora primară şi metastaza hepatică şi cazurile la care intervenţia pentru metastază a fost realizată la distanţă de cea pentru tumora primară, în raport cu supravieţuirea şi intervalul de timp pînă la reluarea de evoluţie. Consecutiv, datele personale susţin indicaţia de efectuare a intervenţiei concomitent pentru tumora primară şi metastaze.

• Analiza profilului molecular al MTS hepatice secundare CCR, prin studiu imunohistochimic, a fost concretizată în date calitative şi cantitative asupra activităţii proliferative, componentei celulare imune şi inflamatorii, procesului de angiogeneză şi limfangiogeneză şi potenţialului de invazie metastatică, care definesc un tablou complex al biologiei tumorale în relaţie cu micromediul organului gazdă.

• Analiza profilului molecular al MTS hepatice secundare CCR, prin studiu imunohistochimic, a relevat absenţa unor diferenţe marcante între metastazele per primam şi boala metastatică recurentă. Acest fapt deschide perspective importante legate de tratamentul paliativ prin termonecroză cu vapori de apă, urmat frecvent de apariţia unor leziuni noi – care, sub raport celular şi molecular, nu prezintă un fenotip mai agresiv decât metastazele tratate anterior.

• În lotul studiat, supravieţuirea post-tratament metastază şi, respectiv, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie a fost corelat semnificativ statistic cu următorii markeri moleculari: VEGF-A, VEGF-R2, TIMP2, MMP9, TIMP1. Consecutiv, aceste caracteristici au fost definite ca factori prognostici negativi.

• În lotul studiat, următorii markeri celulari şi moleculari nu au influenţat supravieţuirea post-tratament metastază şi, respectiv, intervalul de timp până la reluarea de evoluţie: indicele proliferativ Topo II alfa, numărul de limfocite T, numărul de limfocite B, numărul de macrofage, densitatea microvasculară, densitatea microlimfatică, MMP2 - valoarea lor prognostică nefiind confirmată.

• În lotul studiat, rezultatele evaluării indexului proliferativ Topo II alfa indică faptul că o activitate proliferativă de nivel mediu (peste 25%) este suficientă pentru a susţine proliferarea tumorală în context metastatic. Proliferarea accelerată a celulelor tumorale poate fi luată în considerare pentru a explica incapacitatea micromediului hepatic de a reacţiona optim la tentativa de supraveghere imunologică a gazdei, iniţiată şi dezvoltată atât pentru metastaza per primam, cât şi pentru recurenţa bolii.

• În lotul studiat, rezultatele evaluării populaţiei limfocitare şi macrofagice indică evidenta dispoziţie peritumorală şi predominanţa netă a limfocitelor T, comparativ cu limfocitele B şi macrofagele. Absenţa corelaţiilor semnificative statistic cu supravieţuirea şi intervalul de timp pînă la reluarea de evoluţie poate semnala faptul că răspunsul imun / inflamator, teoretic benefic şi operaţional la marginea de invazie tumorală, este complet depăşit, iar activitatea TILs şi TAMs este diminuată sau contracarată de alţi factori moleculari produşi de micromediul metastatic.

• În lotul studiat, rezultatele evaluării densităţii microvasculare şi a densităţii microlimfatice indică dezvoltarea marcată a reţelelor microvasculare şi microlimfatice peritumoral, aceste zone având implicaţii directe în expansiunea metastatică. Problemele legate de metodologia de cuantificare impun o uniformizare în analiza cantitativă, tehnicile de morfometrie computerizată oferind criterii obiective prin diminuarea intervenţiei observatorilor umani.

• În lotul studiat, rezultatele evaluării VEGF-A şi VEGF-R2 indică implicarea certă a transmisiei de semnale între micromediu şi celulele tumorale, în definirea profilului biologic care caracterizează procesul de metastazare.

• În lotul studiat, rezultatele evaluării MMPs şi TIMPs indică potenţialul net de invazie metastatică al acestui sistem enzimatic complex, care presupune comunicare între componenta celulară stromală şi cea tumorală.

• Identificarea şi validarea factorilor prognostici moleculari pentru MTS hepatice secundare CCR constituie o arie deschisă cercetărilor, datele personale obţinute constituind contribuţii reale la fondul de informaţie existentă, care urmăreşte – în perspectivă – posibilitatea de definire a unui prognostic individual. BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ Adam R, Delvart V, Pascal G et al. Rescue surgery for unresectable colorectal liver metastases downstaged by chemotherapy: a

model to predict long-term survival. Ann Surg 2004; 240(4) 644-657. Adam R, Pascal G, Castaing D et al. Tumor progression while on chemotherapy: a contraindication to liver resection for multiple

colorectal metastases? Ann Surg 2004; 240: 1052–1061. Adam R. Current surgical strategies for the treatment of colorectal cancer liver metastases. EJC 2004; 2(7): 21–26.


27

AJCC. Staging Manual, 6th ed. New York: Springer 2002. Aldrighetti L, Castoldi R, Di Palo S et al. Prognostic factors for long-term outcome of hepatic resection for colorectal liver

metastases. Chir Ital 2005; 57(5): 555-70. Alitalo K, Tammela T, Petrova TV. Lymphangiogenesis in development and human disease. Nature Insight 2005; 438: 946-953. Aoyagi K, Kouhuji K, Yano S et al. VEGF significance in peritoneal recurrence from gastric cancer. Gastric Cancer 2005; 8: 155–163. Arru M, Aldrighetti L, Castoldi R et al. Analysis of prognostic factors influencing long-term survival after hepatic resection for

metastatic colorectal cancer. World J Surg 2008; 32(1): 93–103. Bacac M, Stamenkovic I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol 2008; 3: 221-247. Backus HH, Van Groeningen CJ, Vos W et al. Differential expression of cell cycle and apoptosis related proteins in colorectal

mucosa, primary colon tumours, and liver metastases. J Clin Pathol 2002; 55: 206–211. Barozzi C, Ravaioli M, D’Errico A et al. Relevance of biological markers in colorectal carcinoma. A comparative study of a broad

panel. Cancer 2002; 94; 647–657. Berman RS, Portera CA Jr, Ellis LM. Biology of liver metastases. Cancer Treat Res 2001; 109: 183-206. Bognel C, Rekacewicz C, Mankarios H. Prognostic value of neural invasion in rectal carcinoma: A multivariant analysis on 339

patients with curative resection. Eur J Cancer 1995; 31A: 894-900. Bruns CJ, Lin W, Davis DW et al. Vascular endothelial growth factor is an in vivo survival factor for tumor endothelium in a murine

model of colorectal carcinoma liver metastases. Cancer 2000; 89: 488–499. Canning C, O’Brian M, Hegarty J, O’Farrelly C. Liver immunity and tumour surveillance. Immunol Lett 2006; 107: 83-88. Cheng J, Slavin RE, Gallagher JA et al. Expression of vascular endothelial growth factor and receptor flk-1 in colon cancer liver

metastases. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2004; 11: 164–170. Choti MA, Sitzmann JV, Tiburi MF et al Trends in long-term survival following liver resection for hepatic colorectal metastases. Ann

Surg 2002; 235: 759–766. Chung TD, Drake FH, Tan KB et al. Characterization and immunological identification of cDNA clones encoding two human DNA

topoisomerase II isoenzymes. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 9431– 9435. Compton CC, Fielding LP, Burgart LJ et al. Prognostic factors in colorectal cancer. College of American Pathologists Consensus

Statement 1999. Arch Pathol Lab Med 2000; 124: 979-994. Compton CC. Colorectal carcinoma: diagnostic, prognostic, and molecular features. Mod Pathol 2003; 16: 376-388. Compton CC. Optimal Pathologic Staging: Defining Stage II Disease. Clin Cancer Res 2007; 13: 6862s-6870s. Coss A, Tosetto M, Fox EJ et al. Increased topoisomerase IIα expression in colorectal cancer is associated with advanced disease and

chemotherapeutic resistance via inhibition of apoptosis. Cancer Lett 2009; 276: 228-238. Crowe PJ, Yang JL, Berney CR et al. Genetic markers of survival and liver recurrence after resection of liver metastases from

colorectal cancer. World J Surg 2001; 25: 996–1001. Cummings LC, Payes JD, Cooper GS. Survival after hepatic resection in metastatic colorectal cancer: a population-based study.

Cancer 2007; 4: 718–726 Curran S, Dundas SR, Buxton J et al. Matrix metalloproteinase (MMP/TIMP) phenotype identifies poor prognosis colorectal cancers.

Clin Cancer Res 2004; 10: 8229-8234. Des Guetz G, Uzzan B, Nicolas P et al. Microvessel density and VEGF expression are prognostic factors in colorectal cancer. Meta-

analysis of the literature. Br J Cancer 2006; 94: 1823–1832. Dolcetti R, Viel A, Doglioni C et al. High prevalence of activated intraepithelial cytotoxic T lymphocytes and increased neoplastic

cell apoptosis in colorectal carcinomas with microsatellite instability. Am J Pathol 1999; 154: 1805-1813. Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity 2004; 21: 137-148. Elias D, De Baere T, Smayra T et al. Percutaneous radiofrequency thermoablation as an alternative to surgery for treatment of liver

tumour recurrence after hepatectomy. Br J Surg. 2002; 89(6): 752-756. Elias D, Liberale G, Vernerey D et al. Hepatic and extrahepatic colorectal metastases: When resectable, their localisation does not

matter, but their total number has a prognostic effect. Ann Surg Oncol 2005; 12(11): 900-909. Elias D. Radiofrequence: Avis de tempête sur la chirurgie hépatique. Ann Chir 2000; 125: 815-817. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 1990; 61: 759-767. Fearon ER. DCC: is there a connection between tumorigenesis and cell guidance molecules? Biochim Biophys Acta 1996; 1288: 17–23. Ferrandina G, Petrillo M, Carbone A et al. Prognostic role of topoisomerase-IIa in advanced ovarian cancer patients. Brit J Cancer

2008; 98: 1910 – 1915. Finch RJ, Malik HZ, Hamady ZZ et al. Effect of type of resection on outcome of hepatic resection for colorectal metastases. Br J

Surg 2007; 94(10): 1242–128. Folkman J, Klagsbrun M. Angiogenic factors. Science 1987; 235: 442–447. Folkman J, Long Jr. DM, Becker FF. Growth and metastasis of tumor in organ culture. Cancer 1963; 16: 453–467. Folkman J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumours. Ann Surg 1972; 175: 409–416. Folkman J. Carcinoma of the Colon and Antecedent Epithelium. Cancer Res 1970; 113–127. Folkman J. Endogenous angiogenesis inhibitors. APMIS 2004; 112(7-8): 496-507. Folkman J. Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. Clinical applications of research on angiogenesis. N Engl J

Med 1995; 333(26): 1757-1763. Folkman J. The role of angiogenesis in tumour growth. Semin Cancer Biol 1992; 3: 65–71. Folkman J. Tumor angiogenesis and tissue factor. Nat Med 1996; 2: 167–168. Folkman J. Tumour angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971; 285: 1182–1186. Frich L, Bjørnland K, Pettersen S, Clausen OP, Gladhaug IP. Increased activity of matrix metalloproteinase 2 and 9 after hepatic

radiofrequency ablation. J Surg Res 2006; 135: 297–304. Fritz P, Cabrera CM, Dippon J et al. c-erbB2 and topoisomerase II alfa protein expression independently predict poor survival in

primary human breast cancer: a retrospective study. Breast Cancer Res 2005; 7: R374-R384. Fukushima T, Takenoshita S. Colorectal carcinogenesis. J Med Sci 2001; 47: 1-11. Galizia G, Lieto E,Orditura M et al. First-line chemotherapy vs bowel tumor resection plus chemotherapy for patients with

unresectable synchronous colorectal hepatic metastases. Arch Surg 2008; 143: 352–358. Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical

outcome. Science 2006; 313: 1960-1964.


28

Galon J, Fridman WH, Pages F. The adaptative immunologic microenvironment in colorectal cancer: a novel perspective. Cancer Res 2007; 67(5): 1883-1886.

Gannon CJ, Cur1ey SA. The role of focal liver ablation in the treatment of unresectable primary and secondary malignant liver tumors, Semin Radiat Oncol. 2005; 15(4): 265-72.

Gao J, Knutsen A, Arbman G et al. Clinical and biological significance of angiogenesis and lymphangiogenesis in colorectal cancer. Dig Liv Dis 2009; 41: 116–122.

Gu ZD, Chen KN, Li M, Gu J, Li JY. Clinical significance of matrix metalloproteinase-9 expression in esophageal squamous cell carcinoma. World J Gastroenterol 2005; 11(6): 871-874.

Guidoboni M, Gafa R, Viel A et al. Microsatellite instability and high content of activated cytotoxic lymphocytes identify colon cancer patients with a favorable prognosis. Am J Pathol 2001; 159: 297-304.

Hotta T, Takifuji K, Arii K et al. Potential predictors of long-term survival after surgery for patients with stage IV colorectal cancer. Anticancer Res 2006; 26(2B): 1377–1383.

Howell R, Roche W, Rees M, Blaydes J, Primrose J. TIMP-1 expression in colorectal cancer liver metastases is associated with poor outcome. Proc Am Soc Clin Oncol 2002; 21: 1758.

Illemann M, Bird N, Majeed A et al. MMP-9 is differentially expressed in primary human colorectal adenocarcinomas and their metastases. Mol Cancer Res 2006; 4(5): 293-302.

Jewell AP. Is the liver an important site for the development of immune tolerance to tumours? Med Hypotheses 2005; 64: 751-754. Ji RC, Eshita Y, Kato S. Investigation of intratumoral and peritumoral lymphatics expressed by podoplanin and LYVE-1 in the

hybridoma-induced tumours. Int J Exp Path 2007; 88: 257-270. Ji RC. Lymphatic endothelial cells, tumor lymphangiogenesis and metastasis: new insights into intratumoral and peritumoral

lymphatics. Cancer Metastasis Rev 2006; 25: 677-694. Joosten J, Jager G, Oyen W et al. Cryosurgery and radiofrequency ablation for unresectable colorectal liver metastases. Eur J Surg

Oncol 2005; 31(10): 1152-1159. Kahlenberg MS, Sullivan JM, Witmer DD, Petrelli NJ. Molecular prognostics in colorectal cancer. Surg Oncol 2003; 12: 173–186. Khosravi Shahi P, Fernández Pineda I. Tumoral angiogenesis: review of the literature. Cancer Invest 2008; 26(1): 104-108. Kinzler KW, Vogelstein B. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers. Nature 1997; 386: 761–768. Kobayashi H, Boelte KC, Lin PC. Endothelial cell adhesion molecules and cancer progression. Curr Med Chem 2007; 14(4): 377-386. Kokudo N, Imamura H, Sugawara Y et al. Surgery for multiple hepatic colorectal metastases. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2004;

11(2): 84-91. Kondo Y, Issa JP. Epigenetic changes in colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev 2004; 23(1–2): 29–39. Kopfstein L, Christofori G. Metastasis: cell-autonomous mechanisms versus contributions by the tumor microenvironment. Cell Mol

Life Sci 2006; 63: 449–468. Leslie A, Carey FA, Pratt MR, Steele RJC. The colorectal adenoma-carcinoma sequence. Br J Surg 2002; 89: 845-860. Liekens S, De Clercq E, Neyts J. Angiogenesis: regulators and clinical applications. Biochem Pharmacol 2001; 61(3): 253-270. Ludeman L, Shepherd NA. Macroscopic assessment and dissection of colorectal cancer resection specimens. Curr Diag Pathol 2006;

12(3): 220-230. Lupascu C, Moldovanu R. Rezecţii hepatice. În: Târcoveanu E (ed). Patologie chirurgicală hepatică. Tumori hepatice. Ed. Gr. T.

Popa, Iaşi, 2007, 47-72. Lyall MS, Dundas SR, Curran S, Murray GI. Profiling markers of prognosis in colorectal cancer. Clin Cancer Res 2006; 12(4): 1184-1191. Lynch JP, Hoops TC. The genetic pathogenesis of colorectal cancer. Hematol Oncol Clin N Am 2002; 16: 775-810. Majeed AW. Surgery for colorectal liver metastases with hepatic lymph node involvement: a systematic review. Br J Surg 2000; 87: 1737. Malik HZ, Hamady WWR, Adair R et al. Prognostic influence of multiple hepatic metastases from colorectal cancer. EJSO 2007a;

33: 468-473. Mantovani A, Sica A, Locati M. New vistas on macrophage differentiation and activation. Eur J Immunol 2007; 37: 14–16. Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for

polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol 2004; 23: 549–555. Marti J, Modolo MM, Fuster J et al. Prognostic factors and time-related changes influence results of colorectal liver metastases surgical

treatment: A single-center analysis. World J Gastroenterol 2009; 15(21): 2587-2594. Martin II RCG, Augenstein V, Reuter NP, Scoggins CR, McMasters KM. Simultaneous versus staged resection for synchronous

colorectal cancer liver metastases. J Am Coll Surg 2009; 208(5): 842-850. McCawley LJ, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: They're not just for matrix anymore! Curr Opin Cell Biol 2001; 13(5): 534-540. McShane LM, Altman DG, Sauerbrei W et al. Reporting recommendations for tumor marker prognostic studies (REMARK). J Natl

Cancer Inst 2005; 97: 1180-1184. Menon AG, Janssen-van Rhijn CM, Morreau H et al. Immune system and prognosis in colorectal cancer: a detailed

immunohistochemical analysis. Lab Invest 2004; 84: 493-501. Moug SJ, Horgan PG. The role of synchronous procedures in the treatment of colorectal liver metastases. Surg Oncol 2007; 16: 53–58. Nadal C, Maurel J, Gascon P. Is there a genetic signature for liver metastasis in colorectal cancer? World J Gastroenterol 2007;

13(44): 5832-5844. Nakamoto RH, Uetake H, Iida S et al. Correlations between cyclooxygenase-2 expression and angiogenic factors in primary tumors

and liver metastases in colorectal cancer. Jpn J Clin Oncol 2007; 37(9): 679-685. Nanashima A, Araki M, Tobinaga S et al. Relationship between period of survival and clinicopathological characteristics in patients

with colorectal liver metastasis. EJSO 2009; 35: 504-509. Nanashima A, Yamaguchi H, Sawai T et al. Prognostic factors in hepatic metastases of colorectal carcinoma: immunohistochemical

analysis of tumor biological factors. Dig Dis Sci 2001; 46: 1623–1628. Neal CP, Garcea G, Doucas H et al. Molecular prognostic markers in resectable colorectal liver metastases: a systematic review. Eur

J Cancer 2006; 42(12): 1728–1743. Nishio H, Hamady ZZR, Malik HZ et al. Outcome following repeat liver resection for colorectal liver metastases. EJSO 2007; 33:

729-734. Nordlinger B, Sorbye H, Glimelius B et al. Perioperative chemotherapy with FOLFOX4 and surgery versus surgery alone for

resectable liver metastases from colorectal cancer (EORTC Intergroup trial 40983): a randomised controlled trial. Lancet 2008; 371: 1007–1016.


29

Ohtani H. Focus on TILs: prognostic significance of tumor infiltrating lymphocytes in human colorectal cancer. Cancer Immun 2007; 7: 1-9.

Peeters CF, Westphal JR, de Waal RM et al. Vascular density in colorectal liver metastases increases after removal of the primary tumour in human cancer patients. Int J Cancer 2004; 112: 554–559.

Pollard JW. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nat Rev Cancer 2004; 4: 71–78. Poon RT. Current role of laparoscopic surgery for liver malignancies. Surg Technol Int 2007; 16: 73-81. Popat S, Hubner R, Houlston RS. Systematic review of microsatellite instability and colorectal cancer prognosis. J Clin Oncol 2005;

23: 609-618. Popescu I. Rezectia hepatic. În: Popescu I (ed.). Chirurgia ficatului. Ed. Universitară "Carol Davila", Bucureşti 2004, 537-656. Portera CA Jr, Berman RS, Ellis LM. Molecular determinants of colon cancer metastasis. Surg Oncol 1998; 7: 183-195. Prall F, Gringmuth U, Nizze H, Barten M. Microvessel densities and microvascular architecture in colorectal carcinomas and their

liver metastases: significant correlation of high microvessel densities with better survival. Histopathology 2003; 42: 482–491. Prall F. Tumour budding in colorectal carcinoma. Histopathology 2007; 50: 151-162. Radinsky R, Ellis LM. Molecular determinants in the biology of liver metastasis. Surg Oncol Clin N Am 1996; 5(2): 215-229. Rajaganeshan R, Jayne DG, Malik HZ et al. Biological characteristics and behaviour of putatively curatively resected colorectal liver

metastases. EJSO 2008; 34: 439-444. Rasheed S, McDonald PJ, Northover JM, Guenther T. Angiogenesis and hypoxic factors in colorectal cancer. Pathol Res Pract 2008;

204: 501–510. Ribero D, Chun YS, Vauthey JN. Surgery for colorectal metastases. In: Vauthey JN, Hoff PMG, Audisio RA, Poston GJ (eds.). Liver

Metastases, Springer, London, 2009, 25-38. Rmali KA, Puntis MCA, Jiang WG. Tumour-associated angiogenesis in human colorectal cancer. Colorectal Dis 2007; 9: 3–14. Ropponen KM, Eskelinen MJ, Lipponen PK, Alhava E, Kosma VM. Prognostic value of tumourinfiltrating lymphocytes (TILs) in

colorectal cancer. J Pathol 1997; 182: 318-324. Rossi S, Garbagnati F, De Francesco I et al. Relationship between the shape and size of radiofrequency induced thermal lesions and

hepatic vascularization. Tumori 1999; 85: 128-132. Roux C, Rauber N, Hiltbrand E et al. Experimental study on a large animal model of a new thermoablation technique. Anticancer Res

2006; 26(1A): 1-8. Rudmik LR, Magliocco AM. Molecular mechanisms of hepatic metastasis in colorectal cancer. J Surg Oncol 2005; 92(4): 347-359. Rupnarain C, Dlamini Z, Naicker S, Bhoola K. Colon cancer: genomics and apoptotic events. Biol Chem 2004; 385(6): 449-464. Schoppmann SF, Fenzl A, Laengle F. Surgical oncology: impact of lymphangiogenesis for metastasis formation. Eur Surg 2005; 37:

153-158. Seifert JK, Junginger T. Cryotherapy for liver tumors: current status, perspectives, clinical results, and review of literature. Technol

Cancer Res Treat 2004; 3(2): 151-163. Sharma S, Sharma MC, Sarkar C. Morphology of angiogenesis in human cancer: a conceptual overview, histoprognostic perspective

and significance of neoangiogenesis. Histopathology 2005; 46(5): 481-489. Shih IM, Zhou W, Goodman SN et al. Evidence that genetic instability occurs at an early stage of colorectal tumorigenesis. Cancer

Res 2001; 61: 818–822. Sobin L, Wittekind C. TNM Classification of Malignant Tumours. New York: Wiley-Liss, Inc; 2002. Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind C. TNM Classification of Malignant Tumours. 7th Ed, Wiley-Blackwell, New Jersey, 2009. Stacker SA, Williams RA, Achen MG. Lymphangiogenic growth factors as markers of tumor metastasis. APMIS 2004; 112: 539-549. Sternlicht MD, Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior. Annu Rev Cell Dev Biol 2001; 17: 463-516. Stoeltzing O, Liu W, Reinmuth N et al. Angiogenesis and antiangiogenic therapy of colon cancer liver metastasis. Ann Surg Oncol

2003; 10(7): 722-733. Strasberg SM, Dehdashti F, Siegel BA et al. Survival of patients evaluated by FDG-PET before hepatic resection for metastatic

colorectal carcinoma: a prospective database study. Ann Surg 2001; 233: 293-299. Sugawara Y, Yamamoto J, Yamasaki Set al. Estimating the prognosis of hepatic resection în patients with metastatic liver tumors

from colorectal cancer with special concern for the timing of hepatectomy. Surgery 2001; 129: 408. Takayama T, Miyanishi K, Hayashi T, Sato Y, Niitsu Y. Colorectal cancer: genetics of development and metastasis. J Gastroenterol

2006; 4: 185-192. Takeda A, Stoeltzing O, Ahmad SA et al. Role of angiogenesis in the development and growth of liver metastasis. Ann Surg Oncol

2002; 9(7): 610-616. Talmadge JE, Donkor M, Scholar E. Inflammatory cell infiltration of tumors: Jekyll or Hyde. Cancer Metastasis Rev 2007; 26: 373-400. Tanabe KK, Choti MA. Radiofrequency ablation of colon and rectal carcinoma liver metastases. In: Ellis LM, Curley SA, Tanabe

KK. (eds.). Radiofrequency Ablation for Cancer: Current Indications, Techniques, and Outcomes. Springer, New York, 2004, 31-46.

Tanaka K, Adam R, Shimada H et al. Role of neoadjuvant chemotherapy in the treatment of multiple colorectal metastases to the liver. Br J Surg 2003; 90: 963–969.

Tanaka K, Shimada H, Matsuo K et al. Outcome after simultaneous colorectal and hepatic resection for colorectal cancer with synchronous metastases. Surgery 2004; 136(3): 650-659.

Tanaka K, Shimada H, Ueda M et al. Long-term characteristics of 5-year survivors after liver resection for colorectal metastases. Ann Surg Oncol 2007; 14(4): 1336–1346.

Tang R, Changchien CR, Wu MC et al. Colorectal cancer without high microsatellite instability and chromosomal instability – an alternative genetic pathway to human colorectal cancer. Carcinogenesis 2004; 25: 841–846.

Trudel D, Fradet Y, Meyer F, Harel F, Tetu B. Significance of MMP-2 Expression in Prostate Cancer: an Immunohistochemical Study. Cancer Res 2003; 63: 8511–8515.

Tsavaris N, Lazaris A, Kosmas C et al. Topoisomerase I and IIα protein expression in primary colorectal cancer and recurrences following 5-fluorouracil-based adjuvant chemotherapy. Cancer Chemother Pharmacol 2009; 64(2): 391–398.

Ueno H, Murphy J, Jass JR, Mochizuki H, Talbot IC. Tumour 'budding' as an index to estimate the potential of aggressiveness in rectal cancer. Histopathology 2002; 40: 127-132.

Vauthey JN. Colorectal liver metastases: Treat effectively up front and consider the borderline resectable. J Clin Oncol 2007; 25(29): 4524-4525.


30

Venook A. Critical evaluation of current treatments in metastatic colorectal cancer. Oncologist 2005; 10(4): 250-261. Vermulen P, Colpaert C, Salgado R et al. Liver metastases from colorectal adenocarcinomas grow in three patterns with different

angiogenesis and desmoplasia. J Pathol 2001; 195: 336–342. Vibert E, Perniceni T, Levard H et al. Laparoscopic liver resection. Br J Surg 2006; 93(1): 67-72. Vogelstein B, Kinzler KW. Cancer genes and the pathways they control. Nat Med 2004; 10(8): 789–799. Waas ET, Wobbes T, Lomme RM et al. Matrix metalloproteinase 2 and 9 activity in patients with colorectal cancer liver metastasis.

Br J Surg 2003; 90: 1556-1564. Wagenaar-Miller RA, Gorden L, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases in colorectal cancer: is it worth talking about? Cancer

Metastasis Rev 2004; 23(1-2): 119-135. Wang Z, Hershman DL, Abrams JA et al. Predictors of survival after hepatic resection among patients with colorectal liver

metastasis. Br J Cancer 2007; 97(12): 1606–1612. Wang Z, Zhou ZX, Liang JW, Bai XF, Bi JJ. Prognostic factors of colorectal cancer patients with synchronous liver metastasis

treated with simultaneous liver and colorectal resection: Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 2008; 30(5): 372-375. Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis – correlation in invasive breast carcinoma. N

Engl J Med 1991; 324: 1–8. Weitz J, Koch M, Debus J et al. Colorectal cancer. Lancet 2005; 365: 153-165. Wray CJ, Shah AN, Berman RS, Ahmad SA. Biology of colorectal cancer liver metastases. In: Vauthey JN, Hoff PMG, Audisio RA,

Poston GJ (eds.). Liver Metastases. Springer, London, 2009, 15-24. Zeng ZS, Shu WP, Cohen AM, Guillem JG. Matrix metalloproteinase-7 expression in colorectal cancer liver metastases: evidence for

involvement of MMP-7 activation in human cancer metastases. Clin Cancer Res 2002; 8(1): 144-148. Zlobec I, Lugli A. Prognostic and predictive factors in colorectal cancer: A critical review. J Clin Pathol 2008; 1-23. Zlobec I, Steele R, Terracciano L, Jass JR, Lugli A. Selecting immunohistochemical cut-off scores for novel biomarkers of

progression and survival in colorectal cancer. J Clin Pathol 2007a; 60: 1112-1116. Zlobec I, Terracciano L, Jass JR, Lugli A. Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor

markers in colorectal cancer. Virchows Arch 2007b; 451: 763-769. Zorzi D, Mullen JT, Abdalla EK et al. Comparison between hepatic wedge resection and anatomic resection for colorectal liver

metastases. J Gastrointest Surg 2006; 10(1): 86-94. Zucker S, Vacirca J. Role of matrix metalloproteinases (MMPs) in colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev 2004; 23(1-2): 101-117.

universitatea de medicinĂ Şi facultatea de … doctorat/rezumat... · corelaţii în raport de...

Documents