VIRUSOLOGIE GENERALA

Caractere generale ale virusurilor 1. Sunt considerate forme acelulare de viaţă fiind în afara organismelor vii, lipsite de

capacitatea de creştere şi multiplicare. Ele sunt replicate (multiplicate) de celula gazdă pe care o parazitează.

2. Sunt lipsite de aparat enzimatic şi metabolism propriu fiind obligatoriu parazite a celulelor animale, vegetale sau bacteriene.

3. Au o structură simplă formate din genomul viral şi un înveliş protector care se numeşte capsidă.

4. Genomul viral conţine un singur acid nucleic ADN sau ARN şi niciodată ambii acizi. 5. Virusurile care conţin ARN pot depozita şi transmite informaţia genetică, caz unic în

biologie, rolul de purtător al informaţiei genetice fiind ADN, pentru restul vieţuitoarelor. 6. In natură virusurile se găsesc sub trei forme biologice:

- virus complet sau virion dotat cu infecţiozitate şi capabil de a supravieţui un timp limitat în afara celulei gazdă

- virus vegetativ prezent numai în celula parazitară şi neinfecţios - virus integrat (provirus) integrat în genomul celulei gazdă unde rămâne un timp

nelimitat replicându-se odată cu acesta. In esenţă virusurile sunt sisteme bioide care se comportă ca fiinţe vii în interiorul celulei parazitate şi ca o subatanţă organică complexă în afara acesteia.

CONSTANTELE VIRIONULUI Virionii pot avea forme variate. La examenul cu un microscop electronic cu o mică putere de rezoluţie se pot distinge 3 tipuri principale de forme:

- alungită - corpusculară - spermatozoidică

La examenul electronooptic, la un aparat cu mare putere de erzoluţie care permite observarea tuturor detaliilor ultrastructurale, virionii se pot înfăţişa într-o gamă mai variată de forme, ca de exemplu:

- bastonaş drept - filament pliat - icozaedru - corpuscul sferic - cărămidă cu colţurile rotunjite - ghiluea - spermatozoid (alţi termeni de comparaţie pentru aceeaşi formă: cireaşă cu

coadă, ac cu gămălie mare, mormoloc) Determinant pentru forma vironului la majoritatea virurusirlor este tipul de simetrie al

capsidei, iar la unele virusuri prezenţa învelişului pericapsidal.

Dimensiunile

Dimensiunile virusurilor variază între limite cuprinse între 8-10 nm până la 300-350 nm. Virusurile cele mai mici, ca de exemplu Picorna şi Parvovirusurile se apropie de dimensiunile unor macromolecule organice, în timp ce virusurile cele mai mari, ca de exemplu Poxvirusurile au dimensiuni identice cu cele mai mici bacterii. Volumul virusurilor reprezentative ale celor două extreme este de 0,00001 microni3 pentru virusul poliomielitei (un Picornavirus) şi de 0,01 microni3 pentru Poxvirus.

2

STRUCTURA VIRIONULUI

Virionul este constituit dintr-un înveliş şi un conţinut. La toate viruruile, învelişul este format din unităţi proteice numite capsomere aşezate după un tip de simetrie bine definit, constituind în ansamblul lor capsida virală. La unele virusuri, exterior capsisei, se găseşte un al doilea strat al învelişului numit pericapsidă (anvelopă, peplos). Din punct de vedere al prezenţei învelişului pericapsidal, virusurile se împart în două categorii: nude şi învelite în pelos. Conţinutul virionului este un genom format dintr-un singur tip de acid nucleic fie ADN, fie ARN. Nici un virus nu conţine ambii acizi nucleici. Unitatea constituită din genom + capsidă poartă şi numele de nucleocapsidă.

Capsida virală

Termenul de capsidă derivă de la cuvântul grecesc “kapsa-cutie”. El desemnează

învelişul extern al virionului prezentat în forma sa cea mai simplă de un strat unic de unităţi identice numite capsomere (meros –parte) aşezate în mod regulat după un tip de simetrie bine definit. Puţine virusuri au capsida constituită din două sau mai multe straturi concentrice.

Compoziţia chimică a capsidei este exclusiv proteică. Proteinele constituiente ale capsidei sunt antigenice, fiind responsabile pentru structura antigenică specifică fiecărui virus. La majoritatea virusurilor, cu excepţia virusurilor helicoidale prevăzute cu înveliş pericapsidal, capsida este determinantă pentru forma virionului.

Rolul capsidei este de a proteja genomul viral de acţiunea factorilor de mediu. La adăpostul capsidei, acidul nucleic viral este vehiculat de la o gazdă receptivă la alta. Cu toate că, în condiţii experimentale au putut fi reproduse numeroase infecţii virale numai cu acizii nucleici ai virusurilor respective nu s-a semnalata încă un fenomen similar în condiţii naturale, protecţia capsidei fiind indispensabilă conservării şi circuitului virusurilor în natură. Subunităţile componente ale capsidei, sunt formate din una sau mai multe molecule proteice constituite la rândul lor din lanţuri polipeptidice. In funcţie de numărul moleculelor din care sunt formate, capsomerele pot fi de două feluri:

- monomere constituite dintr-o singură moleculă proteică, având o masă moleculară în jurul a 20 000-30 000 daltoni; ele sunt caracteristice pentru virusurile de formă alungită, iar asamblarea lor în arhitectura capsidei este după tipul de simetrie helicoidal

- oligomere constituite din mai multe monomere, dispuse circular, formând un inel sau buton; oligomerele sunt aranjate în cadrul capsidei după tipul de simetrie icozaedral sau cubic. In funcţie de numărul monomerelor componente, oligomerele sunt de două feluri:

- hexamere sau hexoni formate din şase monomere; ele alcătuiesc feţele triunghiulare şi laturile (muchiile) capsidelor icozaedrale

- pentamere sau pentoni formate din 5 monomere; ele sunt aşezate la colţurile (vârfurile) capsidelor icozaedrale.

Numărul capsomerelor este constant pentru un virus, mai ales la virusurile icozaedrale. Simetria capsomerelor poate fi de trei feluri: icozaedrală sau cubică, helicoidală, binară sau dublă.

Capsida helicoidală (helicală) are forma unui tub cilindric. Unităţile ei structurale sunt molecule identice de formă ovoidă sau puţin alungită. Aranjamentul lor este în formă de spirală helicoidală regulată, asemănătoare cu al unui resort în stare comprimată. Spirala capsomerelor delimitează pe faţă internă a tubului un şanţ în care este aşezat, tot helicoidal, într-un perfect paralelism cu capsida, genomul (acidul nucleic) viral. Extremităţile interne ale capsomerelor nu se ating, fiind despărţite de fragmentul de acid nucleici care se interpune. Numărul capsomerelor variază în funcţie de lungimea virionului. Capsidele helicoidale pot fi de două feluri: rigide şi flexibile.

Capsida rigidă este de regulă caracteristică virusurilor fitopatogene. Un exemplu de virus care poate fi considerat de referinţă, fiind studiat în cele mai mici detalii, este virusul

3

mozaicului tutunului. El se prezintă sub forma unui bastonaş rigid de 300 nm lungime, 17 nm lăţime cu un diametru interior de 4 nm. Genomul lui este constituit dintr-un filament de ARN, lung de 2 microni. având masa moleculară de 2x106 daltoni, aşezat în şanţul delimitat de o spirală helicoidală formată din 130 de capsomere. Fiecare capsomeră este o moleculă proteică, compusă din 158 de aminoacizi.

Capsida flexibilă se întâlneşte la unele virusuri zoopatogene. Forma ei este tot tubulară, dar se poate plia sub forma unui ghem. In această stare se dispun nucleocapsidele helicoidale la interiorul învelişului pericapsidal care are o formă aproximativ sferică. Exemple de virusuri pentru care este caracteristică o astfel de structură sunt Orthomyxovirusurile, din care fac parte virusurile influenţelor şi Paramyxovirusurile în care se încadrează virusul pseudopestei aviare. Ele au o formă sferică cu un diametru de 80-120 nm. La interiorul unei pericapside groase de 8-10 nm se găseşte nucleocapsida helicoidală, de lungimi varibile, cu diametrul transversal de 9-10 nm.

La Myxovirusuri există o corelaţie între forma globală a virionului (sferică) şi cea a nucleocapsidei (alungită, filamentoasă). Determinantă pentru tipul de simetrie al oricărui virus este însă nucleocapsida.

Capsida icozaedrală (izometrică, cu simetrie cubică) rezultă din asamblarea într-o formă geometrică regulată a unui număr fix de hexa şi pentamere care alternează după un plan de organizare foarte precis. Icozaedrul este un poliedru constituit din 20 feţe, fiecare având forma unui triunghi echilateral. Ca orice structură geometrică regulată, el are trei tipuri de axe de simetrie (p).

O rotaţie 2π/p în jurul axei aduce structura respectivă într-o poziţie identică cu cea inţială. Icozaedrul are 12 vârfuri (unghiuri sau colţuri) şi 6 axe de simetrie de tip 5 care traveresează fiecare 2 unghiuri opuse, 20 feţe şi 10 axe de simetrie de tip 3 care trec prin punctele centrale a 2 feţe triunghiulare opuse, 30 laturi şi 15 axe de simetrie de tip 2 care unesc 2 laturi opuse exact la jumătatea acestora.

Succesiunea capsomerelor în structura capsidei icozaesrale este următoarea: feţele şi laturile sunt formate din hexamere, iar colţurile sau vârfurile din pentamere. Alternanţa suprafeţelor hexagonale cu cele pentagonale într-o anumită succesiune în structura unei figuri geometrice care poate fi înscrisă într-o sferă este o condiţie obligatorie pentru stabilirea acestei structuri. In domeniul arhitecurii, această regulă s-a confirmat pentru construcţia domului geodezic de către Fuller şi, mai recent, a pavilionului american de la expoziţia universală de la Montreal în 1967 (după Zarnea, 1974). Klug şi Caspar (1962) explică primii structura capsidelor virale icozaedrale pe baza îndeplinirii aceluiaşi deziderat. Numărul total de capsomere (N) al unui virion icozaedral este dat de formula:

N = 10 (n-1)2 + 2 În care este egal cu numărul de capsomere al unei laturi. In tabelul nr. 2 este redat

numărul capsomerelor obţinute pe baza acestei formule la 4 grupe de virusuri. In cazul unor virusuri foarte mici, ca de exemplu virusul poliomielitei în care n=2 (o

faţă triunghiulară este formată din laturi a câte 2 capsomere care încadrează o capsomeră centrală) formula se modifică astfel:

N + 30 (n-1)2 + 2 Capsida icozaedrală este forma cea mai economică de organizare arhitectonică a unor

unităţi proteice identice prin care se asigură învelişul protector genomului viral. Numărul capsomerelor la 2 grupe de virusuri

Grupa n N Bacteriofag mic 2 12 Reovirus 4 92

Două virusuri având masele moleculare ale virionilor egale, dar cu tipuri de simetrie a

capsidelor, unul helicoidal şi altul icozaedral, diferă sensibil şi în ceea ce priveşte numărul

4

capsomerelor. Astfel, virusul mozaicului galben al napului, cu aceeaşi masă moleculară, dar cu capsida icozaedrală, este alcătuit din numai 180 molecule (după Zarnea G., 1974).

Capsida cu simetrie binară Capsida cu simetrie binară sau dublă este caracteristică bacteriofagilor cu cap şi

coadă. Capsida capului este de tip icozaedral, în timp ce capsida cozii este organizată după tipul de simetrie helicoidal. Ea va fi descrisă mai amănunţit la virusurile bacteriofagice. Pericapsida (anvelopa, peplosul) Pericapsida, pentru desemnarea căreia se folosesc la fel de frecvent şi termenii de anvelopă sau peplos (manta în limba greacă) este un înveliş suplimentar, întâlnit numai la unele virusuri, aşezat exterior capsidei. In funcţie de prezenţa sau absenţa pericapsidei, corelată cu tipul de simetrie al pericapsidei, virionii sunt de 4 feluri :

- virion helicoidal nud - virion icozaedral nud - virion helicoidal învelit de pericapsidă - virion icozaedral învelit de pericapsidă

Virionii înveli ţi de pericapsidă au totdeauna o formă globuloasă, aproximativ sferică, indiferent de tipul de simetrie al nucleocapsdei (virionii helicoidali sunt pliaţi în interiorul pericapsidei sub forma unui ghem). Grosimea pericapsidei este în jur de 100-150 Å. Analog capsidei, ea este constituită din unităţi structurale numite peplomere (peplos-manta). Peplomerele sunt însă puţin conturate electronooptic, comparativ cu capsomerele şi nu sunt aranjate după un tip precis de simetrie. Comparativ cu capsida, pericapsida este o formă mai puţin regulată, este mai puţin rigidă având un anumit grad de flexibilitate şi elasticitate.

Pe suprafaţa pericapsidei se găsesc de obicei protuberanţe sub forma unor spiculi sau antene de aproximativ 100 Å lungime. Ele sunt aşezate la distanţe de 70-80 Å una de alta şi constituie hemaglutiniele sau neuraminidazele.

Compoziţia chimică a pericapsidei, predominant proteică, este caracterizată şi prin

prezenţa altor compuşi organici glucide, dar mai ales lipide, care împreună cu proteinele formează complexe glico sau lipidoproteice. Lipidele, compuşii chimici ai pericapsidei concură şi ei la determinarea structurii antigenice a virusului.

Originea componentelor poate fi proprie sau derivată din membrana celulei gazdă în care a fost sintetizat virionul. Partea proprie este numită şi homeopeplos, iar cea provenită din componenţii celulei gazdă heteropeplos. Acestea sunt considerate ca făcând parte din cadrul proprietăţilor virusurilor caracterizate ca induse de celula gazdă. Constituirea heteropeplosului are loc cu prilejul eliberării virionilor nou formaţi din celuelă prin procesul de înmugurire (burjeonare).

Rol: pericapsida concură, împreună cu capsida la protejarea genomului viral la factorii de mediu şi asigură fixarea virionului pe celula gazdă. Prezenţa ei conferă însă virusurilor anumite însuşiri, absente la virusurile nude. Acestea sunt sensibilitatea la eter şi cloroform datorată componentelor lipidice din structura peplomerelor, capacitatea de absorbţie pe diferite substraturi celulare şi activitatea hemaglutinantă de care sunt responsabili spiculii (antenele) de pe suprafaţa capsidei numiţi de aceea hemaglutinine. La Myxovirisuri, pericapsida conţine enzime numite neuraminidaze care înlesnesc pătrunderea virusului în celula sensibiliă.

Genomul viral

Genomul viral este reprezentat de acidul nucleic viral. Următoarele însuşiri ale

acidului nucleic trebuie considerate esenţiale pentru caracterizarea unui virus: tipul de acid nucleic, structura, masa moleculară în strânsă relaţie cu capacitatea de codificare, proporţia

5

de acid nucleic raportat la masa virionului, compoziţia în baze azotate, configuraţia şi modul de dispunere în interiorul capsidei.

Tipul de acid nucleic poate fi ARN sau ADN. In funcţie de natura acidului nucleic, virusurile se împart în ribovirusuri cu ARN şi

dezoxiribovirusuri cu ADN. La virusurile fitopatogene, acidul nucleci este totdeauna ARN, în timp ce la virusurile zoopatogene şi bacteriofagice poate fi unul sau celălalt.

Structura acidului nucleic poate fi în funcţie de numărul lanţurilor din care este constituită molecula monocatenară sau dublucatenară. Ca regulă generală, dezoxiribovirusurile au ADN dublu catenar, cu excepţia parvovirusurilor şi a fagului X 174 al căror ADN este monocatenar. Ribovirusurile au ARN monocatenar, cu excepţia reovirusurilor, al căror ARN este dublu catenar.

Masa moleculară a acidului nucleic este corelată cu mărimea şi masa virionului. Masa moleculară este în funcţie de lungimea şi masa virionului. Masa moleculară este în funcţie de lungimea lanţurilor şi implicit de numărul nucleotidelor componente care la rândul lor sunt determinante pentru informaţia genetică, respectiv capacitatea de codificare a genomului, Cel mai mic genom este acela al virusului necrozei tutunului, format dintr-o moleculă de ARN constituită din aproximativ 10000 nucleotide, capabil să codifice sinteza unui singur tip de proteină. Simplitatea genomului acestui virus îi determină defectivitatea, sinteza lui nefiind posibilă în celula vegetală decât în prezenţa unui virus helper al cărui genom conţine circa 6000 de nucleotide. Genomul celui mai mic virus ADN (virusul poliomei) are masa moleculară de 3x108 şi este format din aproximativ 5 000 perechi de nucleotide.

Masa moleculară a ARN constituient al genomului virusului febrei aftoase, cel mai mic virus zoopatogen, este de 2,4 x106 daltoni. Masa moleculară maximă a proteinelor a căror sinteză este capabil să o codifice acest genom este de 240 000 daltoni. Virusurile complexe, ca de exemplu colifagul T, au şi genomul mult mai complex. In cazul bacteriofagului amintit, genomul are în structura sa în jurul a 100 de gene ale căror responsabilităţi sunt bine cunoscute în procesul complex de biosinteză şi morfogeneză al acestui virus.

Proporţia acidului nucleic raportat la masa virionului este un raport adoptat de mai mulţi ani de Comitetul Internaţional de Clasificare şi Nomenclatură a Virusurilor ca şi criteriu taxonomic.

Masa moleculară a genomului este, în general, mult mai mică, reprezentând 5-30% din masa totală a virionului. Astfel, în cazul virusului febrei aftoase, masa genomului este de 2,4x106 daltoni, în timp ce aceea a întregului virion este de 7,2x106.

Compoziţia genomului în baze azotate. In cazul majorităţii virusurilor, acizii nucleici virali nu diferă biochimic de restul acizilor nucleici prezenţi în celula animală sau vegetală. Unii bacteriofagi au însă în compoziţia genomului viral o bază azotată –5 hidroximetilcitozina – inexistentă în compoziţia acizilor nucleici ai celulei bacteriene, vegetale sau animale.

Configuraţia (topologia) acizilor nucleici poate fi de 3 feluri: - lineară întâlnită mai ales la acizii nucleici monocatenari şi o parte din cei

bicatenari - ciclică simplă sau circulară ciclică evidenţiată la ADN constituient al unor

Papovavirursuri (virusul poliomei şi ale papilomatozelor) - ciclică superăsucită evidenţiată tot la viruisurile poliomei, această

topologie rezultă din împletirea între ele a două lanţuri dublu catenare de ADN.

Genomul virusului poliomei se poate de altfel prezenta în oricare din cele 3 tipuri de configuraţie, în funcţie de viteza de turaţie la ultracentrifugare. La 20 S ADN se depune prezentnd o configuraţie ciclică superrăsucită, la 16 S una ciclică simplă, iar la 14 S una lineară. Acest mod de comportare al genomului virusului poliomei a determinat emiterea

6

ipotezei, deocamdată nedemonstrată, a caracterului general al configuraţiei ciclice a genomurilor virale, linearitatea fiind considerată rezultatul unui artefact.

Genomurile constituite din mai multe fragmente legate între ele prin punţi de hidrogen au fost evidenţiate mai ales la unele virusuri ARN, dar cu acelaşi grad de incertitudine privind realitatea acestui mod de existenţă.

Dispunerea acidului nucleic în interiorul capsidei diferă în funcţie de simetria acesteia. La virusurile helicale există un paralelism perfect între spirala helicală a capsomerelor şi dispunerea helicală între şirurile de nucleotide a lanţului de acid nucleic. La virusurile icozaedrale, acidul nucleic este pliat sub forma unui ghem. La aceste virusuri nu există un paralelism în raporturile dintre capsidă şi acidul nucleic viral.

Proprietăţile antigenice ale acizilor nucleici sunt slabe în comparaţie cu proteinele; de aceea, genomul viral are un rol minor în detrminismul structurii antigenice a virusurilor, comparativ cu capsida şi peplosul. Genomul viral este componenta esenţială a virusului care poartă informaţia genetică necesară devierii metabolsimului celulei gazdă, în sensul sintezei constituienţilor virali. Ribovirusurile reprezintă un unicat în biologie, în ceea ce priveşte posibilitatea păstrării informaţiei genetice de către ARN.

Particularitati structurale ale unor virusuri zoopa togene complexe Unele virusuri zoopatogene se abat de la modelul clasic descris anterior prin structura mai complexă a învelişului particulei virale. Poxvirusurile au următoarele componente structurale de la interior spre exterior:

- genomul viral (inima sau smburele) asemănătoare unui dusc biconcav, în formă de haltere pe secţiune, este constituit din ADN cu o masă moleculară de 150x106/ particulă

- o membrană proteică netedă cu grosimea de 50 Å, un strat compus din unităţi proteice de formă cilindrică de 50 Å lăţime şi 100 Å înălţime, analoage capsomerelor

- doi corpi proteici şi corpi laterali, cu diametrul de 600 –800 Å situaţi în depresiunile rezultate din forma biconcavă a sâmburelui

- o membrană externă formată dintr-o împletitură de structuri tubulare, asemănătoare cu nişte capside helicoidale goale

Rhabdovirusurile având ca reprezentant de referinţă virusul stomatitei veziciuloase, au formă de ghiulea şi următoarele componente structurale de la interior spre exterior:

- genomul viral constituit din ARN monocatenar, dispus helicoidal, diametral spiralelor este de150-180 Å

- o capsidă constituită din capsomere dispuse în dublu strat helicoidal cu diametrul spiralelor externe de 500 Å

- un peplos format din peplomere de 100 Å asimetrice având ca formă comparabilă cu un buton pară sau bec regulat aşezate cu extremitatea mai îngustă ataşată de membrana netedă

PARTICULARITATI STRUCTURALE ALE BACTERIOFAGILOR

Bacteriofagii (virusuri parazite pentru bacterii) au genomul constituit în majoritatea

cazurilor din ADN şi mai rar din ARN. Genomul viral este dispus în interiorul capsidei ca la virusurile icozaedrale. Capsida virală poate avea diferite forme şi grade de complexitate structurală. Majoritatea bacteriofagilor, la examenul electronooptic, cu o putere de rezoluţie mai mică, au aspect de spermatozoid, cireaşă cu coadă, mormoloc distingADNu-se ca părţi componente ale virionului un cap şi o coadă.

7

Studiile de fineţe din ultimii ani au permis observarea mai multor tipuri morfologice. BRADLEY (1971) deosebeşte 6 tipuri morfologice principale (fig. 14):

- fagi cu coada lungă şi contractilă - fagi cu coada lungă necontractilă - fagi cu coada scurtă - fagi fără coadă, cu capsomere mari la colţuri - fagi fără coadă, numai cu capsomere mici, la colţuri - fagi filamentoşi, fără cap

Fagii cu coadă lungă şi contractilă reprezintă tipul cel mai complex al cărui reprezentat cunoscut şi descris în cele mai fine detalii este colifagul T2 (fig. 15). Părţile lui structurale sunt următoarele:

- capul fagului constituit dintr-un poliedru hexagonal, bipiramidal cu o lungime de 950-1050 Å şi o masă moleculară de 8,5x106 este format din:

- genomul viral reprezentat de o moleculă de ADN dublu catenar cu masa moleculară de 120x106 format din 200 perechi de nucleotide avADN o lungime de 49± 4 microni

- capsida capului este un icozaedru alungit format din două piramide de cate 5 feţe triunghiulare între care se interpun două benzi ecuatoriale constituite fiecare din 10 feţe triunghiulare

- structura capsomerelor nu diferă de cea a virusurilor icozaedrale zoopatogene - coada fagului, formată la rADNul ei din: - sâmburele cozii sau cilindrul axial cu o compoziţie proteică şi diametrul de 70 Å - teaca cozii formată dintr-un cilindru cu o lungime de 800 Å în stare necontractată,

diametrul tecii este de 160 Å, structura tecii cozii este identică cu cea a capsidelor helicoidale, în timpul contracţiei, coada se scurtează cu 50% prin alunecarea una peste alta a spiralelor constituiente ale capsidei helicoidale a acesteia

- gulerul fagului, interpus între cap şi coadă, de forma unui disc hexagonal subţire cu diametrul de 306 Å

- placa terminală este un disc hexagonal similar gulerului la extremitatea cozii - croşetele sunt în număr de 6, aşezate la unghiurile plăcii terminale - fibrilele cozii sunt formaţiuni filamentoase proteice cu lungimea de 1300 Å

diametrul de 20 Å şi masa moleculară 400 000, formADN o reţea în jurul tecii cozii Placa terminală, împreună cu croşetele şi fibrele cozii formează aparatul de fixare al

bacteriofagului la nivelul căruia se găseşte enzima numită lizozim fagic, capabilă să permeabilizeze peretele celulei gazdă.

TROPISMUL VIRUSURILOR

Tropismul virusurilor constă în afinitatea acestora faţă de gazdă, ţesut, celulă. Genotropismul sau afinitatea pentru specia biologică pe care o parazitează permite împărţirea virusurilor, în funcţie de numărul speciilor receptive în monopatogene şi patogene pentru 2,3 sau mai multe specii (virusuri cu spectru larg), după apartenenţa de reegn a speciilor receptive, se împart în zoopatogene, fitopatogene, bacteriofagi şi micofagi. Histotropismul sau afinitatea pentru anumite ţesuturi permite împărţirea virusurilor în următoarele categorii:

- virusuri epiteliotrope (dermotrope) cu afinitate pentru celulele epiteliale ale pielii şi mucoaselor ex. virusurile din grupa Pox, virusul febrei aftoase etc

- virusuri neurotrope cu afinitate pentru celula nervoasă ex. virusul rabic, virusul poliomeileitei, alte virusuri encefalitice etc.

- virusuri organotrope (viscerotrope) cu afinitate pentru anumite organe interne, la rândul lor acestea pot fi clasificate, după organul afectat, în:

- pneumotrope ex. virusul jigodiei, virusurile influenţelor

8

- enterotrope ex. virusurile enterocitopatogene, virusul diareei virotice, bolii mucoaselor

- virusuri mezenchimotrope (pantrope) cu afinitate pentru celula mezenchimală, indiferent de locul ei în organism ex. virusurile pestelor la diferite specii animale

Histotropismul nu se manifestă totdeauna foarte strict, unul şi acelaşi virus având posibiulitatea ca în decursul infecţiei să se localizeze în ţesuturi diferite. In astfel de situaţii, se ia în considerare tropismul pentru ţesutul în care virusul se localizează în faza iniţială şi din partea căruia se produc simptomele şi leziunile cele mai caracteristice ale bolii.

Citotropismul reprezintă afinitatea virusurilor pentru anumite tipuri de celule din cadrul aceluiaşi ţesut. Ex. virusul ravic este neurotrop, dar se multiplică de preferinţă în celulele piramidale de tip Betz din coarnele lui Ammon, virusul poliomielitei, tot neurotrop, are afinitate pentru neuronii motori din coarnele anterioare ale măduvei.

Tropismul virusurilor este determinat pe de o parte de complementarităţile de ordin stereochimic, electronostatic şi geometric dintre învelişul particulei virale şi membrana celulei gazdă, complementarităţi datorită cărora are loc fixarea (adsorbţia) virusului pe celulă, iar pe de altă parte de capacitatea genomului viral de a substitui informaţia genetică a genomului celular şi de a determina astfel biosinteza de material viral în locul compuşilor specifici celulei.

MULTIPLICAREA VIRUSURILOR Pentru virusuri, termenul de multiplicare nu reflectă de fapt realitatea fenomenelor care au loc în celula gazdă, în înteriorul căreia virusurile nu se multiplică, ci sunt sintetizate de celulă prin activitatea metabolică a acesteia, deviată de la normal în urma substituirii informaţiei genetice a celulei cu cea a virusului. Ţinând seama de faptul că nu s-a găsit un termen cu o semnificaţie semantică mai adecvată pentru reflectarea realităţii fenomenelor care au loc în cursul producerii de către celulă a materialului viral e menţine deocamdată în uz termenul de multiplicare. Multiplicarea virusurilor implică patru etapoe principale:

1. adsorbţia sau fixarea virionului pe celula gazdă 2. pătrunderea în celulă a virionului (la virusurile zoopatogene) sau numai a

genomului viral (la virusurile bacteriofagice) 3. multiplicarea intracelulară propriu-zisă a virusului în cadrul căreia se pot

deosebi trei categorii de procese: - replicarea aicidului nucleic viral - biosinteza materialului viral - asamblarea (morfogeneza) noilor virioni

4. eliberarea virionilor nou formaţi din celulă In desfăşurarea acestor etape se constată unele diferenţe între virusurile zoopatogene şi bacteriofagi care se referă mai ales la primele două şi la ultima, multiplicarea intracelulară prorpiu-zisă realizându-se în esenţă identic la toate categoriile de virusuri.

MULTIPLICAREA VIRUSURILOR ZOOPATOGENE Prima etapă a multiplicării virusurilor se caracterizează printr-un grad relativ redus de specificitate. Responsabilitatea fixării o poartă complementarităţile de tip stereo, de natură chimică, electrostatică şi geometrică dintre capsida sau pericapsida virionului şi membrana celulei gazdă. Grupările chimice de pe suprafaţa membranei celulare care intervin în determinismul afinităţii dintre celulă şi virion, poartă numele de receptori. In general, receptorii acţionează complementar pro grupările lor fosfat faţă de grupările aminice ale capsidei virale. La unele virusuri, ca de exemplu virusurile gripale, au fost identificate cu precizie proteinele receptor de pe suprafaţa celulelor. Acestea sunt de natură glicoproteică,

9

complementare neuraminidazei - enzima din pericapsida virusurilor gripale care, din punct de vedere al activităţii ei biologice este o glucidază. Datorită specificităţii relativ reduse a atracţiei dintre majoritatea virusurilor zoopatogene şi celulele animale, fixarea virionilor este de cele mai multe ori precedată de un număr mai mic sau mai mare de ciocniri întâmplătoare dintre virus şi celulă. De aceea, dintr-o multitudine de particule virale care pătrund în organism, un număr mult mai redus ajung să se fixeze şi apoi să străbată învelişul celulei gazdă. Rata de fixare a fost stabilită în cazxul unor virusuri zoopatogene, ca fiind 3-5x109. Pătrunderea virionilor în celulă In cazul virusurilor zoopatogene, spre deosebire de bacteriofagi, virionul pătrunde în întregime în celula sensibilă printr-un proces activ întrucâtva asemănător cu fenomele de fagocitoză sau pinocitoză. Membrana celulară se invaginează şi se adânceşte progresiv în dreptul virionului până când acesta este complet înglobat în celulă. Fenomenul poartă şi numele de viropexie. După înglobare, marginile opuse ale membranei celulare invaginate fuzionează, restabilindu-se astfel integritatea suprafeţei celulare. Virusul pătruns în celulă este inclus într-o vacuolă ai cărei pereţi se dezintegrează treptat. Decapsidarea Decapsidarea este un proces specific numai virusurilor zoo şi fitopatogene, absent la bacteriofagii a căror capsidă nu pătrunde în celulă. Ea constă în liza capsidei sub acţiunea enzimelor de tip lizozomal numite decapsidaze produse de celula gazdă. Pentru desemnarea fenomenului de decapsidare mai sunt utilizaţi şi termenii deproteinare sau dezbrăcare, acesta din urmă împrumutat din literatura engleză de specialitate (uncoating). Sinteza decapsidazelor este sub determinismul genetic al genomului viral. La poxvirusuri s-a emis ipoteza că ADN viral, chiar înainte de decapsidare, este capabil să codifice şi să transcrie pe ARNm o secvenţă responsabilă de sinteza decapsidazei. Această ipoteză îşi găseşte confirmarea într-o experienţă cunoscută sub numele de fenomenul Berry-Dedrick:

- în celulele infectate cu un poxvirus A încălzit la 560C nu are loc sinteza materialului viral

- acelaşi lucru este valabil şi pentru o populaţie de celule infectate cu un virus B iradiat cu ultraviolete

- în celulele infectate însă, simultan cu virusul încălzit A şi virusul iradiat B, se constată sinteza de material viral

Explicaţia fenomenului este următoarea: virusul A, a cărui ARN polimerază este inactivată nu este decapsidat, în timp ce genomul virusului B decapsidat nu se poate replica datorită alterărilor produse de radiaţiile ultraviolete; dacă cele două virusuri se amestecă, ATN polimeraza eliberată din virusul B nealterată cu ultraviolete va determina sinteza ARNm precoce, din care un segment este responsabil de sinteza decapsidazei, acesta va decapsida virusul B care se va replica declanşând multiplicarea normală a virusului.

Momentul decapsidării diferă la diferitele grupe de virusuri . In cazul virusurilor picorna, el începe din momentul contactului cu membrana celulară. La altele, decapsidarea poate să nu aibe loc, fără ca aceasta să împiedice replicarea acidului nucleici şi transcrierea informaţiei genetice. Cu privire la dinamica procesului decapsidării s-a putut stabili, în cazul adenovirusurilor, că ruperea capsidei are loc la nivelul pentamerelor constituiente ale colţurilor icozaedrului care reprezintă punctele cele mai fragile ale acestuia. O dată cu decapsidarea, virusul pierde infectivitatea în condiţii naturale şi trece din forma de virion în cea de virus vegetativ, dependenţa sa de celulă devenind totală.

Multiplicarea propriu-zis ă Multiplicarea propriu-zisă este un proces complex bazat pe substituirea informaţiei genetice a genomului celular cu cea a genomului viral. Acesta prin mecanisme care încă nu sunt pe deplin clarificate, scoate din funcţie ADN celular în momentul copierii informaţiei de pe ADN pe ARNm de o calitate nouă transcris de pe genomul viral care va transmite la

10

nivelul ribozomilor un mesaj genetic nou care va obliga celula ca în locul enzimelor şi a celorlalte proteine proprii să sintetizeze material viral. Paralel cu replicarea acidului nucleic viral are loc inhibarea sintezei proteinelor celulare. In cazul mai multor virusuri ARN se constată încetinirea sintezei proteinelor celulare în proporţie de 70-90% încă din prima oră de la pătrunderea virusului în celulă. Un alt fenomen caracteristic celulelor infectate cu virus constă în înlocuireea treptată a poliribozomilor celulari de tip 200 S cu poliribozomi virali de tip 350 S. Aceştia din urmă sunt incapabili să recepţioneze informaţia genetică de la ARNm celulari recepţionând informaţia genetică numai de la ARN virali. In transmiterea informaţiei genetice înscrise în programul viral se pot deosebi mecanisme diferite determinate de acidul nucleic, constituient al genomului viral (ADN sau ARN) structura acestuia (mono sau dublu catenară) capacitatea şi modul de codificare al diferiţilor acizi ribonucleici şi de unele particularităţi ale complexului virus- celulă. In funcţie de aceşti factori au putut fi identificate până în prezent, la virusurile animalelor, mai multe scheme sau strategii de multiplicare. Indiferent de detaliile schemei de multiplicare, acesta implică totdeauna trei procese:

- replicarea genomului viral - biosinteza materiualului viral - asamblarea sau morfogeneza noilor virioni

Replicarea genomului viral

Acest proces are loc în mod diferit, în funcţie de structura mono sau bicatenară a acidului nucleic, după cum urmează: ADN dublu catenar prezent la majoritatea virusurilor ADN se replică semiconservativ, cele două catene despletindu-se după modelul clasic al fermoarului (literei Y). La Adenovirusuri s-a demonstrat că replicarea începe de regulă la extremitatea catenei care este mai bogată în perechi de baze Adenină-Timină. ADN monocatenar caracteristic Parvovirusurilor îşi construieşte sub acţiunea unei enzime (replicază) lanţul complementar, devine astfel ADN dublu catenar replicativ, după care se replică conform modelului menţionat mai sus, caracteristic pentru ADN dublu catenar. Unele Parvovirusuri sunt defective, genomul fiind incapabil de replicare. Ele se multiplică numai cu ajutorul unui Adenovirus helper al cărui genom este ADN dublu catenar din replicarea căreia rezultă şi lanţurile necesare Parvovirusurilor adenoasociate. ARN monocatenar care constituie genomul majorităţii virusurilor ARN determină prin enzime (replicaze) sinteza de noi lanţuri de ARN prin două feluri (tipruri) de mecanisme de replicare:

- Tipul semisonservativ, precedat de transformarea ARN monocatenar în bicatenar prin sinteza unei catene complementare. Transformat în bicatenar, ARN devine replicativ şi se replică după modelul semisconservativ clasic prin despletirea celor două catene în formă de fermoar sau litera Y. Cele două catene fiice sunt una + şi alte -.

- Tipul asimetric caracterizat prin replicarea de pe aceeaşi catenă paralelă devenită matrice a mai multor catene complementare; catenelor noi care se formează treptat pe măsura deplasării catenei parentale rămân ataşate câtva timp de aceasta. In acest fel se formează o moleculă mare numită intermediar de replicare, ramificată în formă de brad, cu un număr de ramuri care variază de la 1 la 7 şi sunt catene +. Formarea intermediarilor de replicare este totdeauna precedată de replicarea de tip semiconservativ.

Indiferent de tipul de replicarea, catenele + devin viitoare genomuri virale sau dirijează sinteza de material viral, în timp ce catenele, după ce şi-au îndeplinit rolul de suport (matrice) pentru procesul de replicare, se dezagregă.

11

ARN bicatenar constituie o excepţie în cadrul virusurilor ARN, fiind prezent numai la Reovirusuri. In celulele infectate cu Reovirusuri au putut fi evidenţiate trei categorii de ARN monocatenari: mari de 24 S, mijlocii de 18 S şi mici de 14 S. Fiecare ARN monocatenar este o copie fidelă transcrisă de pe un ARN bicatenar. In multiplicarea reovirusurilor intervin două feluri de enzime: una responsabilă de transcrierea ARN monocatenar de pe ARN bicatenar, iar a doua respondabilă de replicarea ARN bicatenar. Prima este o proteină virus specifică, fiind identificată în interiorul capsidei virionilor. Această enzimă este activată în cursul decapsidării. In nucleocapsida Reovirusurilor au fost identificate şi lanţuri de ARN monocatenar, reprezentând a 10-a parte din genom, dar rolul acestuia n-a putut fi stabilit.

In cursul replicării semiconservative a acidului nucleic viral se produce substituirea totală sau parţială a ADN din genomul celular, începând transcrierea informaţiei genetice înscrise în genomul viral de ARN mesager care urmează să transmită informaţia pentru sinteza constitienţilor virali la nivelul ribozomilor celulei gazdă. In acest fel se iniţiază cel de-al doilea proces esenţial al multiplicării virusurilor – biosinteza de material viral.

Biosinteza materialului viral

In biosinteza materialului viral se disting două faze. Studiul acestora la virusurile ARN a permis stabilirea următoarei dinamici de desfăşurare a următoarelor caracteristici pentru fiecare fază:

Faza exponenţială de sinteză începe la 30 minute de la pătrunderea virusului în celulă şi durează 2,5-3 ore, timpul de dublarea a cantităţii de ARN din celulă este de aproximativ 15 minute

Faza lineară de sinteză se caracterizează printr-un ritm constant de acumulare de ARN viral; în celulă se sintetizează în jur de 3000 molecule de ARN pe minut, menţinându-se în stare activă 500-800 de matrici. O moleculă de ARN se sintetizează în 50 secunde, ritmul de polimerizare al nucleotidelor fiind de 130 pe secundă. In această fază începe şi se desfăşoară cu o viteză crescândă morfogeneza noilor virioni prin încapsidarea genomurilor. Biosinteza materialului viral decurge la diferitele grupe de virusuri după următoarea schemă:

Virusurile ADN sunt sintetizate de celula gazdă în două faze: Faza precoce: ADN viral determină, în cursul replicării, prin intermediul unei ARN

polimeraze ADN dependente sinteza unui ARNm precoce. Originea ARN polimerazelor variază de la o grupă (familie) de virusuri la alta. La unele grupe de virusuri ARN polimeraza preexistă în interiorul virionului, fiind o proteină virus specifică. Majoritatea virusurilor ADN codifică însă utilizând ARN polimeraze celulare. In virionul Poxvirusurilor, pe lângă ARN polimerază, se găseşte şi o dezoxiribonuclează şi o nucleotidfosfohidrolază. Acestea intervin în biosinteza materialului viral ca enzime tardive. ARNm precoce codifică sinteza de genomuri virale progene şi de proteine virale precoce, majoritatea de natură enzimatică. Genomurile progene au aceeaşi capacitate de codificare ca genomul viral parental. Proteinele precoce produc inhibarea replicării ADN, ARN şi a proteinelor specifice celulei gazdă şi catalizează sinteza unor precursori ai proteinelor virale structurale.

Faza tardivă. In momentul când în urma replicării ADN viral s-a ajuns la un anumit număr de genomuri virale patogene este inhibată sinteza proteinelor precoce, declanşându-se prin intermediul unui ARNm tardiv sinteza proteinelor tardive în marea lor majoritate proteine structurale, virus specifice care urmează să fie asamblate în procesul de morfogeneză a noilor virioni.

Echipamentul enzimatic evidenţiat în celulele în care are loc biosinteza virusurilor ADN este reprezentat cu precădere de enzime corelate cu metabolismul ADN. Astfel, în celule care multiplică un Herpesvirus au fost identificate următoarele enzime: timidinkinaza, timidinmonofosfatkinaza, ADN polimeraza şi deoxiribonucleaza. Timpul în care decurg cele două etape ale biosintezei este în funcţie de grupa (familia) de virusuri. La Adenovirusuri, faza precoce durează 6-8 ore, sinteza proteinelor tardive începând din a 8-a oră.

12

Virusurile ARN determină biosinteza metabolismului viral de către celula gazdă prin mecanisme variate, dar încadrabile în trei scheme (strategii) mai importnate. a) ARN viral îndeplineşte direct rolul de ARNm precoce şi poate transmite informaţia genetică direct la nivelul ribozomilor printr-un proces de substituire directă sau scurtcircuitare a ARNm celular, acest mecanism este caracteristic pentru Picornavirusuri

b)ARN viral nu poate fi citit la nivelul ribozomilor celulei şi nu poate deci transmite direct informaţia înscrisă în genomul viral. De aceea, el va determina sinteza unui ARNm precoce de neoformaţie care va declanşa sinteza proteinelor virale precoce, după care procesul continuă ca la celelalte grupe de virusuri. Unele virusuri ARN care se multiplică în acest mod pot conţine în virion transcriptaze structurale. După această schemă se sintetizează Mixo şi Rhabdovirusurile.

c) ARN viral, printr-un proces de transcriere inversă cu ajutorul unor enzime numite invers sau reverstranscriptaze determină formarea unui ADN proviral. Invers transcriptaza pare a nu fi o singură enzimă, ci un complex format din 3 enzime: o ADN polimerază ARN instruită, o ADN polimerază hibrid instruită şi o ADN polimeraza ADN instruită. Separarea celor trei enzime nu a reuşit până în prezent. Transcrierea inversă este un fenomen unic în biologie. Prin acest proces enzimatic se formează un ADN proviral care preia conducerea sintezelor celulare după modelul descris la virusurile ADN. Prin intermediul unui ARN polimeraze ADN dependente el determină sinteza proteinelor virale precoce, restul proceselor fiind aproximativ identice cu ale celorlalte scheme de biosinteză. ADN proviral se poate, în unele cazuri, integra în genomul celular sub formă de provirus. Multiplicarea după acest mecanism a fost identificată la unele virusuri tumorale ARN.

Asamblarea (morfogeneza) virionului

La sfârşitul fazei de biosinteză, după ce în celulă s-au acumulat cantităţi mari de acid nucleic şi proteine virale, are loc asamblarea noilor virioni.

La virusurile mici, aşezarea componentelor în jurul genomurilor virale, fenomen numit şi încapsidare, se petrece spontan printr-un proces de autoasmblare. La cele mai multe virusuri, asamblarea implică însă intervenţia unor enzime. La virusurile complexe intervin şi gene morfogenetice care codifică arhitectura proteinelor structurale ale virionului.

Incapsidarea se realizează prin asocierea unor proteine precursoare în unităţi formate mai întâi din 3 subunităţi, constituind o proteină 5 S, iar apoi din subunităţi rezultând o pentameră 14 S.

Din asamblarea a 12 pentamere rezultă o procapsidă 80 S constituită din 60 subunităţi aranjate după tipul de simetrie icozaedral. Asamblarea capsidelor are loc independent de prezenţa genomurilor virale, fenomenul demonstrat prin experienţa lui Jacobson şi Baltimore (1967) care, în urma inhibării replicării ARN a virusului poliomielitei în prezenţa guanidinei au constatat acumularea în celulă de capside goale.

Incorporarea acidului nucleic are loc prin sciziunea într-un anumit punct a unei proteine gigante precapsidale. Proteina gigant are masa moleculară 40x103, iar proteinele care rezultă din scindarea ei în momentul adiţionării ARN au masele moleculare de 28x103 şi respectiv 12x103.

Timpul de încapsidare a unui genom ARN este de două minute. Intre sinteza proteinelor capsidale şi apariţia lor în structura virionilor nou formaţi există însă un interval de 20 minute. Aceasta pledează pentru admiterea formării unui depozit (Pool) intracelular de proteine capsidale care creşte cu timpul în volum, depozit din care emisia de proteine capsidale pare a avea loc la întâmplare pe parcursul morfogenezei virionilor.

Morfogeneza, ca regulă generală, are loc pentru virusurile ARN intracitoplasmatic, iar pentru virusurile ADN intranuclear. Materialul viral, după sinteza lui în citoplasmă, migrează în cazul virusurilor ADN în nucleul celulei gazdă asamblându-se aici. Excepţii de la această caracteristică generală o reprezintă poxvirusurile care, fiind virusuri ADN, se asamblează în citoplasmă şi myxovirusurile care, fiind virusuri ARN, se încapsidează în nucleu. Diferenţe între grupele (familiile) de virusuri există şi în ce priveşte locul şi structurile intracelulare din

13

citoplasmă şi nucleu unde are loc asamblarea lor. Astfel, poxvirusurile şi picornavirusurile se pot asambla în diverse zone ale citoplasmei, rhabdovirusurile de obicei pe membranele marginale ale vacuolelor intracitoplasmatice, iar myxovirusurile după încapsidarea lor în nucleu îşi desăvârşesc faza de maturare la periferia celulei, limitrof membranei.

Eliberarea virionilor din celul ă Virionii nou formaţi pot fi eliberaţi din celulă prin mai multe procese după cum

urmează: Inmugurirea sau burjonarea este modul cel mai frecvent de eliberare a virusurilor din celulă. El a fost observat şi studiat mai întâi la virusurile a căror maturare are loc curent în apropierea membranei celulare, mai târziu s-a constatat că este în realitate mult mai extins.

Modelul general se caracterizează prin includerea într-o primă fază a virionilor nou asamblaţi în vezicule (cisterne) care se ataşează de faţa internă a membranei celulare la suprafaţa căreia proemină şi o bombează asemănătoare unor muguri. Apoi, aceştia se detaşează de celulă prin mici aperturi care apar în membrană. Intensitatea fenomenului şi aspectul poate îmbrăca o gamă destul de variată de forme. Uneori, eliberarea virionilor are loc exploziv sub formă de vacuole care se degajă la suprafaţa celulei simultan şi asincron. Alteori, la suprafaţa celulelor se formează nişte vilozităţi, iar virionii ies în mediul extracelular prin extremităţile acestora. In urma procesului de înmugurire virusul păstrează în componenţa învelişului sau mai ales al pericapsidei anumiţi compuşi specific celulei care l-a sintetizat, provenind din membrana internă a cisternei (veziculei) în care fusese inclus în cursul înmuguririi, fapt care determină prezenţa la aceşti virioni a două categorii de proteine:

- proteine virus specifice elaborate de celulă conform informaţiei genetice a acidului nucleic viral

- proteine cu specificitate de gazdă care fac parte din compuşii obişnuiţi ai celulei şi care sunt antrenaţi în structura învelişului particulei virale (a pericapsidei) în cursul eliberării virusului din celulă

Liza celulei gazdă sub acţiunea unor enzime produse în celulă în ultima fază a morfogenezei, acest mecanism caracteristic bacteriofagilor se întâlneşte rar la virusurile animale.

Eliberarea virionilor consecutiv morţii celulei şi dezintegrării acesteia, aceste virusuri apar cel mai târziu, iar punerea lor în libertate se caracterizează printr-o frecvenţă moderată.

Trecerea virionilor direct la celula adiacentă celei în care a avut loc multiplicarea prin porii membranei celulare.

CARACTERIZAREA TIPURILOR DE COMPLEX VIRUS CELULA

Din toate posibilităţile de interacţiune virus celulă prezentate anterior rezultă următoarele tipuri de stări sau complexe virus celulă. - Starea independentă (complex virus celulă independent) care corespunde situaţiei în care virusul se multiplică rezultând în final noi virioni (ciclul productiv). Termenul de “independent” nu reflectă întocmai realitatea întrucât însăşi existenţa virusurilor este indisolubil legată de dependenţa acestora de celula vie. El corespunde realităţii numai în sensul că pentru un timp limitat virusul poate fi conservat şi vehiculat în afara celulei până în momentul când reuşeşte să infecteze o nouă celulă sensibiliă. Starea independentă poate fi la rândul ei de două feluri, în funcţie de procesele pe care le suferă gazda:

- starea independentă cu efect citocid caracterizată prin moartea celulei consecutiv producerii virusului; în acest caz, biosinteza de material viral duce la blocarea totală a sintezei proteinelor celulare

- starea independentă echilibrată corespunzând infecţiei endosimbiotice în care procesele de biosinteză a materialului viral nu deranjează sintezele

14

compuşilor celulari proprii, iar producţia şi eliberarea noilor virioni este compatibilă cu continuarea vieţii celulei gazde

- Starea dependentă (complexul dependent) care corespunde formei de virus integrat (ciclul reductiv).

In funcţie de starea virusului din celulă, celulele se împart în două categorii: - celule permisive în care se desfăşoară ciclul productiv finalizat prin

eliberarea de noi virioni - celule nepermisive în care nu are loc producţia de noi virioni (ciclul

reductiv) Modificarile morfologice ale celulelor infectate cu virusuri Multiplicarea virusurilor într-o celulă provoacă o gamă largă de modificări morfologice şi fiziologice ale acesteia. Efectul citopatic Termenul de efect citopatic este utilizat în virusologie cu două semnificaţii semantice:

- în sens larg, efectul citopatic este orice modificare morfologică a unei celule datorită prezenţei unui virus

- într-un sens mai îngust care vizează în mod concret practica cultivării virusurilor în culturi celulare, prin efect citopatic se înţelege dezorganizarea şi modificarea morfologică pe care o suferă celulele dintr-o cultură, consecutiv multiplicării virusului. Efectul citopatic este cel mai uşor de observat în cazul cultivării virusurilor prin tehnica Dulbecco a monostratului (monolayer). In cazul relaţiei virus-celulă cu efect citopatic se constată de obicei pierderea continuităţii monostratului, tendinţa celulelor de a devia de la forma lor normală spre forme sferice, ştergerea treptată în mase amorfe. In unele cazuri, efectul citopatic este caracteristic pentru un virus într-o cultură cu un anumit tip de celule şi poate constitui un criteriu pentru identificarea virusului respectiv.

Potenţarea efectului citopatic constă în apariţia mai rapidă şi mai accentuată a efectului citopatic în cazul unor asociaţii virale. De exemplu, virusul pseudopestei aviare produce un efect citopatic în 5-6 zile, virusul pestei porcine nu produce efect citopatic. Dacă o cultură celulară cu virusul pestei porcine se suprainfectează cu virusul pseudopestei aviare, efectul citopatic apare mult mai rapid.

Efectul litic Este o formă particulară a efectului citopatic caracterizat prin liza celulelor. Zonele de

liză produse de virusurile zoopatogene în monostraturile de celule animale, cât şi cele produse de bacteriofagi în culturi bacteriene pe medii solide poartă numele de plaje. Ele sunt date de un virus cu efect litic, plajele sunt foarte dese, se întrepătrund rezultând o liză confluentă. La virusurile animale producătoare de plaje în monostraturi şi la bacteriofagi se pot face aprecieri cantitative asupra numărului de virioni dintr-un material ce conţine virus pe baza determinării unităţilor formatoare de plaje notate prescurtat PFU (plaque forming units). Intrucâtva, analog cu numărătoarea coloniilor bacteriene, determinarea cantitativă a virionilor pe baza numărului de PFU se bazează pe premiza că o plajă este generată de prezenţa iniţială a unui singur virion.

Fuziunea celulară Unele paramyxovirusuri produc în culturile celulare în care se cultivă sinciţii rezultate din fuzionarea celulelor care conţin virusul. Fuziunea poate avea loc între celule de acelaşi fel şi în unele cazuri şi între celule din ţesuturi cu origini diferite (heterocarioni). Astfel, în urma cultivării virusului parainfluenţei s-a putut determina apariţia unor sinciţii hibride rezultate din fuzionarea de celule umane cu celule de şoarece.

15

Fuziunea celulară poate fi provocată şi cu virusuri iradiate (ex. virusul Sendai). Mecanismul fuziunii pare a se realiza sub acţiunea concomitentă a neuraminidazei aceluiaşi virion fixat la nivelul zonei de contact între cele două alăturate creându-se astfel o punte celulară între ele. Fuziunea celulară sub acţiunea virusurilor este utiliă experimentelor de biologie celulară oferind posibilitatea unor studii de hibridare intracelulară în cele mai diverse combinaţii. Hemaglutinarea şi hemadsorbţia Unele virusuri, mai ales cele învelite de pericapsidă, au capacitatea de a aglutina globulele roşii ale diferitelor specii animale. Acest fenomen a fost observat prima oară de Hirst (1940) şi îi poartă numele. Acţiunea hemaglutinantă este condiţionată de prezenţa pe suprafaţa virionului a unor protuberanţe cu aspect de spiculi sau antene numite hemaglutinante. Hemaglutinarea este consecinţa adsorbţiei virionilor pe suprafaţa hematiilor sau a eritrocitelor la nivelul căreia se produc modificări de natură electrostatică. Proprietăţile hemaglutinante constituie un criteriu de evidenţiere a virusurilor. Hemaglutinarea nu este un fenoimen specific, neexisteând deosebiri nici de aspect al reacţiei şi nici de mecanism între diferitele virusuri hemaglutinante. Reacţia poate fi utilizată în schimb pentru determinarea cantitativă a concentraţiei de virioni dintr-un material prin executarea ei în diluţii seriate în tuburi sau plăci cu godeuri. Concentraţia de virus se deduce după diluţia maximă la care are loc hemaglutinarea. Hemaglutinarea poate fi utilizată ca reacţie indicatoare în cadrul unei reacţii serologice cu grad înalt de specificitate şi anume inhibarea hemaglutinării. Aceasta se bazează pe pierderea capacităţii hemaglutinante a virusului după neutralizarea acestuia cu anticorpi specific. Anticorpii fixaţi pe virioni împiedică adsorbţia acestora pe suprafaţa globulelor roşii. Hemadsorbţia este o variantă a hemaglutinării aplicată în cazul cultivării virusurilor în monostraturi celulare. Ea se bazează pe aglutinarea şi adsorbţia hematiilor sau eritrocitelor pe suprafaţa celulelor din monostrat în care s-a multiplicat virusul. Efectul incluziogen In celulele în care se multiplică virusul, apar frecvent structuri corpusculare de dimensiuni variabile între 1-30 microni diametru cu afinităţi tinstoriale în majoritatea cazurilor, oxifilie numite incluzii virale. Ca leziune microscopică, incluziile au fost descrise cu mult înainte de descoperirea virusurilor. Ele poartă numele diferiţilor autori care le-au observat şi descris pentru prima oară. De exemplu, incluziile Babeş Negri în turbare, Bollinger în variola aviară, Guarnieri în infecţiile cu virusul vaccinal. Mult mai târziu s-a stabilit relaţia constantă între prezenţa acestor leziuni celulare microscopice şi infecţia virală. Sediul incluziilor este în general în citopalsmă, în cazul virusurilor ARN şi în nucleu în cazul virusurilor ADN. Poxvirusurile constituie o excepţie, în sensul localizării în citoplasmă a incluziilor Bollinger. Incluziile la diferite virusuri pot avea o natură şi un mecanism de formare diferit:

- la adenovirusuri, incluziile sunt constituite din material viral în diferite faze ale procesului de biosinteză sau morfogeneză

- la reovirusuri sunt modificări la nivelul unor organite celulare provocate de multiplicarea viurusului

- la herpesvirusuri ele reprezintă locul unde a fost sintetizat materialul viral înlocuit ulterior cu o substanţă oxifil ă

Incluziile virale pot fi puse în evidenţă în amprente sau secţiuni histiologice prin diferite metode, dintre care cele mai importante sunt:

16

- colorarea prin metode speciale (Sellers pentru amprente, Mann, Lentz pentru secţiuni)

- imunofluorescenţa cu seruri specifice faţă de virusul respectiv, marcate cu substanţe fluorocrome

- autoradiograma cu izotopi radioactivi Punerea în evidenţă a incluziilor reprezintă o metodă frecvent utilizată în practica

diagnosticului într-un număr mare de viroze. Specificitatea lor pentru un anumit virus este detrminată de prezenţă lor în ţesutul pentru care virusul manifestă histotropism şi de poziţia lor în celulă, citoplasmă sau nucleu. La noi în ţară, la nivelul laboratoarelor veterinare judeţene evidenţierea incluziilor Babeş Negri în neuronii piramidali din cormul lui Ammon constituie o metodă curentă pentru diagnosticul turbării. Producerea de aberaţii cromozomiale

Diferite virusuri din grupurile paramyxo, adeno, papova sunt capabile să producă în celulele în care se multiplică aberaţii cromozomiale. Acestea pot fi: fragmentări de cromozomi ajungând la pulverizări, translocări (mutarea unor segmente de ADN de pe un cromozom pe altul) şi fuzionări de cromozomi. Consecinţele cele mai grave ale acestor efecte ale virusurilor se manifestă la femelele gestante, cu umări pentru viitorii produşi. Asemenea situaţii fac ca întreruperea sarcinii să fie permisă la femei care în cursul gravidităţii au suferit de unele viroze. Efectul transformant (oncogen) Din aproximativ 600 virusuri identificate până în prezent la animale, la aproximativ ¼ (150) s-a demonstrat un potenţial oncogen. Tranformarea tumorală este caracteristică pentru unele virusuri la specia natural receptivă în condiţiile infecţiei naturale. Prezenţa tumorilor este, în astfel de cazuri, şi principala manifestare anatomoclinică din virozele respective. Aşa este cazul leucozelor aviare, a leucozei taurinelor, al sarcomului lui Rous la păsări. O altă categorie de virusuri nu produc transformarea tumorală la speciile natural receptive, ci numai în condiţiile experimentale pe animale de laborator; aşa este cazul virusului SV 40 (Simlan vacuolizant 40) care, în condiţii naturale se găseşte în stare latentă în rinichiul de maimuţă unde nu produce nici o infecţie aparentă, dar inoculat la hamster are prorpietăţi oncogene. Efectul oncolitic Unele virusuri, consecutiv multiplicării lor în celulele tumorale sunt capabile să oprească evoluţia sau chiar să provoace regresul şi liza tumorii. Efectul oncolitic s-ar explica prin necesitatea pentru biosinteza virală a unor compuşi celulari, indispensabili în acelaşi timp şi pentru dezvoltarea celulelor tumorale. Degradarea celulelor tumorale le face accesibile fagocitozei, ceea ce crează premizele ramolismentului tumorii. Utilizarea virusurilor oncolitice în terapia anticanceroasă nu s-a putut realiza datorită faptului că aceste virusuri, pe lângă efectul lor antitumoral, au şi acţiune nocivă pentru sistemul nervos.

17

PRIONII

Prionii sunt agenţi patogeni care generează un grup de boli neurovegetative printr-un mecanism complet nou. Bolile prionice se pot caracteriza ca dereglări genetice, sporadice sau infecţioase cauzate de dereglări ale proteinei prionice (PrP). (de la acronomul şi anagrama din limba engleză Proteinaceous infectious particle). Primul este o particulă infecţioasă proteică care rezistă la tratamente draconice (formol, sterilizare clasică, iradiaţii). Americanul Stanley Prusiner (premiant Nobel în medicină, 1997) a descoperit în 1997 acest germene “neconvenţional” care provoacă encefalopatii spongiforme transmisibile (EST), boli cunoscute la oaie încă din 1732 (scrapie) şi la om din 1920 (boala Creutzfeld Jacob). Encefalopatiile spongiforme transmisibile (EST) sunt boli ale omului şi ale mamiferelor caracterizate prin:

- perioada de incubaţie lungă, de ordinul anilor - simptomatologie exclusiv nervoasă şi evoluţie clinică lentă ce durează săptămâni, cel

mai adesea luni, uneori ani, întotdeauna cu sfârşit letal - transmisibilitatea pe cale parenterală sau digestivă la aceeaşi specie sau la alte specii,

atunci când se foloseşte ca material infectant ţesutul nervos, uneori şi alte ţesuturi recoltate din cazuri de boală

- absenţa oricărui răspuns imun faţă de agentul transmisibil, deşi gazdă îşi păstrează nealterată competenţa imunologică faţă de alte antigene

- leziuni degenerative ale encefaului, reprezentate prin vacuolizări ale pericarionilor şi ale neuropilului, necrobioză neuronală, proliferări gliale (astrocitoza) şi uneori formarea de plăci amiloide, frecvenţa şi localizarea acestor modificări variază în mare măsură în funcţie de specia şi rasa animalului gazdă şi de tulpina agentului transmisibil.