SUBCULTURA CELULARA SERIALA ŞI CONTROLUL DE CREŞTERE A

CULTURILOR

Multiplicarea celulelor este unul din scopurile principale ale metodei culturilor celulare.

Prin multiplicare se obtine un numar de celule necesar scopurilor propuse, se asigura o rezerva

permanenta de celule (pastrate prin inghetare) si de asemenea, se obtine omogenitatea celulara

in culturile primare.

Ca urmare a multiplicarii continui, celulele, care initial au fost inseminate la o densitate

mica, in cateva zile vor ocupa intreaga suprafata de cultura, ceea ce in cazul celulelor normale

(netransformate) va duce la inhibarea cresterii, insotita si de diferentiere, in cazul celulelor de

tip nediferentiat. Pentru a mentine procesul de multiplicare continuu, la obtinerea unei densitati

optime, celulele sunt diluate, in raport de 1/4 - 1/8 (in functie de rata de multiplicare celulara).

Tehnica se numeste „Subcultura celulara”, iar fiecare procedeu de subcultivare este denumit

„pasaj” si este insotit de un numar, egal cu numarul proceselor de subcultivare celulara, prin

care a trecut cultura respectiva, din momentul initierii acesteia.

Pe baza datelor obtinute la fiecare pasaj celular, se realizeazacurba de crestere a celulelor,

dupa modelul prezentat in figura de mai jos.

Daca la fiecare pasaj celular, noua cultura va fi initiata cu acelasi numar de celule, dupa o

serie de pasaje celulare realizate, se obtin date, care permit determinarea exacta a numarului de

zile de cultura necesare pana la efectuarea unui nou pasaj, fara a fi necesara verificarea zilnica a

culturilor. In figura de mai jos, este data o reprezentare grafica a unei subculturi seriale si

semnificatia valorilor inscrise pe acesta.

Material, soluţii şi medii de cultură:

1.Pipete serologice de 5ml si 10 ml; pipete automate si varfuri pentru pipete automate;

flacone de centrifuga, de 15 ml; flacoane de cultura (toate sterile)

2. Solutie tripsina/EDTA 0,25%/0,02%

3.PBS steril

4.Mediu de cultură MEM complet (cu 10% ser fetal de vitel si 1% amestec de penicilina,

streptomicina si neomicina)

5.Soluţie albastru de tripan 0,3%

Tehnica de lucru:

1.Se pregateste un flacon pentru culturi, cu suprafata de cultura de 75 cm2, in care se

toarna 10 - 12 ml mediu complet si 2 eprubete de centrifuga, de 15 ml, fiecare cu cate 10 ml

mediu complet. Se lasa la incubatorul cu CO2 si temperatura de 37oC pentru echilibrare, timp de

2-3 ore. Flaconul se pune in pozitie orizontala, pentru ca mediul sa acopere suprafata de cultura.

2.Flaconul cu monostrat celular, 80% confluenta, vasul de cultură (flaconul cu suprafata

de cultura de 175 cm2) este scos din incubator si pus in hota cu flux laminar.

3.Se colecteaza mediul de cultură cu ajutorul unei pipete serologice, ataşată liniei de

aspiraţie prin vacuum sau pipetor automat.

4.Se spală de două ori suprafaţa culturii cu PBS adusă la +370C. Se clăteşte uşor vasul

pentru a antrena lichidul de spălare in coltul inferior al flaconului, de unde lichidul este aspirat cu

pipeta si aruncat in vasul de decantare.

5.Peste cultura spalata cu PBS se adaugă 3,5 ml de amestec tripsină 0,25% şi EDTA

0,02%, adusa la temperatura de +370C. Se fac câteva mişcări de antrenare a soluţiei pe suprafaţa

care conţine cultura, apoi se lasa la incubator, la 37oC pentru maxim 1 min. Desprinderea

celulelor se verifica la microscop dupa fiecare 30 sec de incubare.

6. Dupa desprinderea vizibila a celulelor, se adauga o cantitate de 5 ml mediu de creştere

complet in flaconul cu celule, pentru inactivarea actiunii enzimatice a tripsinei. Se aspira repetat

cu pipeta serologica, pentru omogenizarea suspensiei, iar apoi intreaga cantitate de suspensie se

transfera intr-o eprubeta de centrifuga, de 15 ml.

7.Se centrifugeaza cu 350 G, timp de 5 min.

8.Se inlatura supernatantul, iar sedimentul cu celule se resuspenda in 10 ml de mediu

proaspat. Se omogenizeaza suspensia prin aspirarea repetata cu o pipeta serologica.

9.Se determina numarul celulelor si viabilitatea, prin metoda cu albastru tripan, descris

mai josa in continuare

Determinarea numărului de celule:

- Într-un tub eppendorf, de 2 ml se iau 0,1 ml de suspensie celulară, la care se adauga

un volum egal de Albastru de tripan 0,3% (colorant vital, care patrunde doar in

celulele moarte si nu poate trece prin membrana celulelor vii).

- Se omogenizeaza bine amestecul.

- Se incarca camera de numarat celule Neubauer cu amestecul obtinut.

- Cu ajutorul obiectivul 10x se numara celulele din patratele externe ale camerei,

fiecare compus din cate 16 patrate mai mici (vezi imaginea atasata). Se noteaza

separat celulele colorate (moarte) si cele necolorate (vii)

- Se calculeaza numarul de celule / ml, aplicand urmatoarea formula:

Numar celule/ml = nr celule in cele 4 patrate externe / 4 x 10 000

- Se determina numarului total de celule din suspensie, inmultind numarul de celule

intr-un mililitru cu volumul final al suspensiei obtinute.

- Se calculeaza viabilitatea celulara, aplicand formula:

:

10.Dupa determinarea numarului de celule din suspensie, se calculeaza numarul de celule

necesar popularii unui nou flacon de cultura, astfel incat suprafata de cultura sa fie populata cu

3000 – 3500 celule vii/cm2.

11..Se adauga volumul de suspensie calculata intr-un vas de cultură nou, cu mediu de

cultura proaspat, echilibrat la 37 oC in prealabil (vezi punctul 1 al tehnicii de lucru).

12.Vasul de cultură se pune in incubator, la +370C si 5% CO2, pana la obtinerea unui nou

monostrat confluent. Pe perioada incubarii mediul de cultura se schimba dupa primele 24 ore de

cultura, apoi la fiecare 2-3 zile.