studiul efectelor de are a alimentelor cu micotoxine

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

UNIVERSITATEA DUNREA DE JOS DIN GALAI FACULTATEA:TIINA I INGINERIA PRODUSELOR ALIMENTARE SPECIALIZARE :C.E.P.A

PROIECT DE DIPLOM STUDIUL EFECTELOR DE CONTAMINARE A ALIMENTELOR CU MICOTOXINE

Coordonator tiinific, Prof. dr. ing. Clemansa Tofan

2008

1


CUPRINSCuprins..1 Justificarea alegerii temei de licen.5 Introducere....6 Partea nti - PARTEA DOCUMENTAR Capitolul 1- Micotoxinele....................................................................................71.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.2.6

Ce sunt micotoxinele?..................................................................................7 Principalele tipuri de micotoxine de importan economic........................8 Aflatoxinele...........................................................................................9 Ochratoxina A.....................................................................................13 Patulina................................................................................................17 Zearalenon.........................................................................................18 Fumonisinele.......................................................................................20 Tricotecinele........................................................................................21 1.3 Prezena micotoxinelor n diverse produse alimentare...............................24 Capitolul 2- Factori care influeneaz producerea micotoxinelor.....................30 2.1 Biogeneza micotoxinelor............................................................................30 2.2 Formarea micotoxinelor..............................................................................32 2.3 Influena factorilor extrinseci asupra apariiei micotoxinelor.....................34 2.3.1 Temperatura...........................................................................................34 2.3.2 Umiditatea..............................................................................................37 2.3.3 Tensiunea superficial...........................................................................39 2.3.4 Presiunea osmotic................................................................................39 2.3.5 Lumina...................................................................................................40 2.3.6 Integritatea fizic a boabelor i a nveliului produselor vegetale.............................................................................................40 2.4 Influena factorilor intrinseci asupra apariiei micotoxinelor.....................41 2.4.1 Natura substratului................................................................................ 412


2.4.2 Influena pH-ului asupra dezvoltrii mucegaiurilor..............................42 2.4.3 Nutrieni minerali..................................................................................43 2.4.4 Potenialul de oxido- reducere..............................................................46 2.4.5 Bacterii..................................................................................................47 2.4.6 Microflora..............................................................................................47 2.4.7 Insectele ................................................................................................48 2.5 Descrierea mucegaiurilor cu potenial toxicogen...................49 2.5.1 Principalele genuri de mucegaiuri din industria alimentar..48 2.5.2 Caracterizarea principalelor specii de mucegaiuri cu potenial toxicogen.....50 2.5.2.1 Aspergillus flavus52 2.5.2.2 Aspergillus nidulans53 2.5.2.3 Aspergillus versicolor..54 2.5.2.4 Aspergillus candidus............55 2.5.2.5 Aspergillus ochraceus..........56 2.5.2.6 Aspergillus tereus............57 2.5.2.7 Aspergillus fumigatus..............58 2.5.2.8 Fusarium graminearum....59 2.5.2.9 Penicilium expansum...60 2.5.2.10 Trichotecium roseum.61 Capitolul 3 - Metode de limitare i reducere a coninutului n micotoxine a unor produse alimentare de origine vegetal......................................................62 3.1 Strategii preventive: limitarea contaminanilor......................................62 3.1.1 Practici recomandate naintea recoltrii............................................66 3.1.2 Practici recomandate n timpul recoltrii..........................................68 3.1.3 Practici privind uscarea cerealelor....................................................69 3.1.4 Practici recomandate la depozitarea cerealelor.................................70 3.1.5 Practici recomandate n timpul transportului produselor..................713


3.1.6 Evitarea ptrunderii insectelor, psrilor i roztoarelor n timpul transportului........................................................................................................71 3.2 Strategii curative: decontaminarea..........................................................71 3.2.1 Metode fizice.....................................................................................72 3.2.1.1 Eliminarea fraciunilor alterate.................................................72 3.2.1.2 Denaturarea toxinelor...............................................................74 3.2.2 Denaturarea chimic..........................................................................75 3.2.3 Adsorbia toxinelor............................................................................78 3.2.4 Metode biologice de decontaminare..................................................85 Capitolul 4 - Metode de determinare a micotoxinelor....................................88 4.1 Pregtirea preliminar a probelor............................................................88 4.1.1 Eantionarea......................................................................................90 4.2 Metode calitative.....................................................................................95 4.2.1 Metode imunologice.........................................................................96 4.2.1.1 Testele RIA...............................................................97 4.2.1.2 Testele ELISA...........................................................................97 4.2.2 Metode de imunoafinitate................................................................99 4.2.2.1 Minicoloanele...........................................................................99 4.2.2.2 Coloane de imunopurificare......................................................99 4.3 Metode cantitative................................................................................100 4.3.1 Teste kit..........................................................................................100 4.3.2 Cromatografie n strat subire (TLC).............................................100 4.3.3 HPLC(high performance liquid chromatographycromatografie cu lichid de nalt performan).................................................101

4


Partea a doua PARTEA EXPERIMENTAL1.

Analiza microbiologic a cerealelor..........................................................103 1.1 Evaluarea calitativ.................................................................................103 Evidenierea mucegaiurilor productoare de aflatoxine............................106 Analiza calitativ a aflatoxinelor...............................................................108

2. 3.

3.1 Pregtire inocul......................................................................................108 3.2 Inoculare i incubare..............................................................................109 3.3 Extracie.................................................................................................109 Concluzii..........................................................................................................115 Bibliografie......................................................................................................118

5


Justificarea alegerii temei de cercetareMicotoxinele prezente n mod natural n diverse produse alimentare constituie o problem serioas de siguran alimentar, mai ales n anumite regiuni ale globului n care condiiile climatice sau standardele din agricultur sunt precare. Exist dovezi convingtoare care arat o asociere ntre expunerea la aflatoxine i cancerul primar de ficat. Micotoxinele produc pagube importante i n zootehnie. Organizaia pentru Alimente i Agricultur (FAO) estimeaz c pe plan mondial pn la 25 % din culturile alimentare sunt semnificativ contaminate cu micotoxine. Cele mai importante micotoxine care prezint riscuri semnificative pentru sntatea omului sunt sintetizate de mucegaiurile care cresc pe cereale, n special porumb, dar i gru, orz, ovz i orez. Consecinele consumului de alimente contaminate cu aflatoxin asupra sntii omului sunt estimate indirect pe baza efectului observat la animale. Susceptibilitatea omului la aflatoxin nu este foarte bine cunoscut datorit raritii cazurilor. Date cu privire la doza de risc pentru oameni au fost obinute cu ocazia unor intoxicaii colective izbucnite, una n India n 1974 n cursul creia au fost afectate aproape 400 de persoane din care o treime au murit i alta n Kenia n 1982, unde au fost spitalizate 20 de persoane dintre care au decedat 12. Investigaiile din care aceste focare de aflatoxicoz au dus la concluzia c ele s-au datorat ingestiei repetate a unei cantiti de 38-55 micrograme de aflatoxin/kg corp mai multe zile la rnd. Cercetrile fcute de veterinari americani, sugereaz c unii aditivi alimentari cum este BHT (butil-hidroxitoluen, sau E 321) ar putea fi folosii n viitor ca msur de protecie fa de efectele nedorite ale alimentelor contaminate cu aflatoxin. Vivacitatea i viteza de rspndire n condiiile naturale este uimitoare. De exemplu: dintr-un spor de Penicillium aflat pe un mediu nutritiv, must de mal cu agar, dup a doua zi de la germinarea acestuia s-au format 100.000 spori i n urmtoarele 24 ore nc 2 10 spori. Pe un bob de gru mucegit cu Penicillium verrucosum var. Cyclopium s-au numrat 25 milioane spori. O portocal mucegit este purttoare a aproximativ 15 miliarde de spori.6

6


INTRODUCEREDintotdeauna consumatorul a fost preocupat ca alimentele puse la dispoziia lui s fie sigure din punct de vedere igienico-sanitar, s nu i provoace mbolnviri. Astzi, aceast cerin a devenit tot mai insistent, ntruct consumul de alimente pregtite pe scara industrial a crescut foarte mult i deoarece, tot mai des, consumatorul afl c alimentele sunt cauza multor mbolnviri, uneori a unor decese, consumatorul este aadar vizat c nu n toate cazurile, alimentele consumate sunt de o calitate igienico-sanitar corespunzatoare. Contaminarea produselor cu mucegaiuri, ridic aspecte importante legate de pierderea inocuitii alimentului. Atenia deosebit acordat mucegaiurilor este datorat caracteristicilor anumitor specii de fungi de a elabora i elibera n aliment metabolii secundari numii micotoxine, care au o structur chimic mai mult sau mai puin cunoscut, dar i capacitatea dovedit de a modifica structuri normal biologice. Micotoxinele, ca metabolii ai anumitor tipuri de mucegaiuri au astfel efecte nocive att asupra sntaii omului, ct i asupra animalului care consum alimente contaminate cu acestea. Evoluia tehnicilor de recoltare i transformare a produselor agricole, transportul alimentelor pe distane lungi i prezentarea consumatorilor prin stocarea prelungit constituie condiii care dac sunt realizate necorespunztor, devin favorabile dezvoltrii microorganismelor nedorite i n particular, a mucegaiurilor. Micotoxinele sunt metabolii ai mucegaiurilor cu o structur chimic mai mult sau mai puin cunoscut care au capacitatea de a modifica structuri biologice anormale, cu efecte degradante att la om,ct i la animale. Aceste toxine pot fi coninute n sporii de mucegai sau de cele mai multe ori eliminate n substratul de cretere (aliment). Oamenii de tiin le-au descoperit la nceputul anilor 1960 odat cu izbucnirea bolii curcanilor x din Anglia. Aproape 100.000 de curcani au fost ucii deoarece alunele pe care le-au consumat erau contaminate cu Aspergillus flavus, un mucegai ce produce micotoxine.

7


PARTEA DOCUMENTAR CAPITOLUL 1 Micotoxinele1.1 Ce sunt micotoxinele? Termenul de micotoxin vine de la cuvntul grecesc mycos care inseamn ciuperc i de la cuvntul latin toxicum care nseamn otrav. Ele desemneaz metabolii secundari secretai de mucegaiurile care aparin n principal genurilor Aspergillus, Penicillium i Fusarium, prezente n mod natural n aerul ambient, pe pmnt i pe culturi. Micotoxinele sunt considerate ca fiind parte din contaminani alimentari cei mai semnificativi n ceea ce privete impactul asupra sntii publice, securitii alimentare i asupra economiei a numeroaselor ri. Ele se gsesc pe o mare varietate de produse alimentare nainte, n timpul i dup recolt. Afecteaz numeroase produse agricole, anume cereale, fructele, nucile, boabele de cafea, orezul i plantele oleaginoase, care sunt substraturi foarte sensibile la contaminarea cu mucegaiuri i la producerea de micotoxine. Contaminarea produselor de ctre micotoxine se realizeaz n cazul cnd ntrunesc condiiile de mediu pe cmp pentru apariia lor, precum i procedee neadecvate de recoltare, de stocare i de transformare atunci cnd sunt cumulate. Prin diversitatea efectelor lor toxice i a propietilor lor sinergice, micotoxinele prezint un risc pentru consumatorul alimentelor contaminate. Tabel 1. Specii fungice productoare de micotoxine Micotoxine Aflatoxina B1, B2,G1,G2 Ochratoxina A, B, C Zearalenon Desoxinivalenol, Fusarenon, Toxina T2 Fumonisine Citrinina Patulina Acidul penicilic Moniliformina Mucegaiuri Aspergillus parasiticus,Aspergillus flavus Aspergillus ochraceus,Aspergillus carbonarius, Penicillium verrucosum Fusarium roseum, Fusarium sp. Fusarium tricinatum, Fusarium sp. F. moniliforme, F. proliferatum, Fusarium sp. P. citrinum P. patulum A. ochraceus, A. Cyclopium A. proliferatum

8


1.2 Principalele tipuri de micotoxine de importan economicUn consum de alimente contaminate cu anumite tipuri de mucegaiuri poate provoca la om i la animal, efecte nefavorabile pentru sntate, de la apariia unor forme de hepatite exudative, pn n prezent la consumatorii cronici a unor hepatoame (cancer hepatic). Majoritatea micotoxinelor au capacitate cancerigen. Mecanismul cancerigen al acestora se manifest prin capacitatea lor de a se fixa pe ADN, cu producerea de alterri la acest nivel i cu determinarea de schimbri, sub form de mutaii. Din gama mare de micotoxine atenia este ndreptat spre aflatoxine, ochratoxine, sterigmatocistine, patulina. Micotoxinele pot avea asupra organismului uman i animal o serie de efecte negative (fig. 1).

Fig. 1. Efecte toxice asociate micotoxinelor

9

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine 1.2.1. Aflatoxine Dup accidentele observate n 1960 n cresctoriile de curci (100.000 psri moarte), numeroase cercetri au fost conduse spre un grup de molecule cu nalte proprietai toxice: aflatoxinele. Aflatoxinele constituie un grup de 18 compui cu structuri apropiate unde 4 compui au forme foarte frecvent ntlnite n alimente: B1, B2, G1 si G2. Din punct de vedere chimic, aflatoxinele sunt un ansamblu dintre o cumarin i trei furani (figura 2). Sunt molecule cu mas molecular mic (312 - 330 g/mol), foarte puin solubile. Sunt solubile n ap, insolubile n solveni nepolari. Foarte solubile n solveni organici (cloroform i alcool metilic), fiind uor de extras. La lumina ultraviolet, sunt fluorescente (albastru pentru AFB, verde pentru AFG, AFM1 prezint o fluorescen albastru-mov).

Fig. 2 Structura chimic a aflatoxinelor

10

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Sunt micotoxine produse de mucegaiuri din genul Aspergillus: Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus, mucegaiuri prezente n multe locuri i sunt puin exigente la cretere: temperatura cuprins ntre 6 si 50C, sursa de carbon i azot i o valoare a aw mai mare de 80%. Din acest motiv, numeroase produse alimentare destinate consumului pot conine aflatoxine n cantiti uneori importante: alune, porumb, gru, fistic, cacao, cafea, manioc, soia. Metabolizate de diverse enzime microzomiale, aflatoxinele sunt eliminate sub form de glucorani pe cale urinar, prin lapte sau bil, dar pot aprea anumii derivai epoxidici. Fiind electrofile, ele reacioneaz la grupuri nucleofile de ADN sau de proteine. Microzomii hepatici, conin enzime cu nalt activitate, capabile s oxideze numeroase substraturi lipofile. Aceste reacii necesit prezena oxigenului i a NADPH (redus). Un atom de oxigen este fixat pe substrat i altul este redus n ap (NADP este oxidat). Astfel, aflatoxinele sunt toxice pentru numeroase organisme vegetale i animale procariote i eucariote (alge, ciuperci, bacterii). Aflatoxinele au de asemenea un efect puternic teratogen i pot provoca moartea n cteva ore sau cteva zile , n funcie de cantitatea de micotoxin i sensibiltatea animalului. Aflatoxinele au pe de alt parte un rol asupra fosforilrilor i lipogenezei. n concluzie, aflatoxinele sunt recunoscute ca fiind cei mai cancerigeni compui naturali, i este posibil s se obin o relaie liniar ntre incidena cancerului primitiv de ficat i logaritmul procentului de aflatoxin ingerat. Intoxicaia acut cu aflatoxin se traduce prin moarte i n general cu simptome de depresie, anorexie, diaree, icter sau anemie. Mai presus de orice, leziunile hepatice (necrozele i cirozele) evolueaz n final cu hepatome sau carcinome. Formele cronice ale aflatoxicozelor se traduc printr-o scdere a performanelor de cretere a animalelor, anemie, icter lejer i o evoluie canceroas n final. O doz de 0.2g/kg timp de 470 zile declaneaz un hematom la oareci.

11


Mecanismul aciunii aflatoxinelor: Aflatoxina B1 ptrunde n celul i este fie metabolizat de monooxigenaz n reticulul endoplasmatic obinndu-se produi metabolici hidroxilai care sunt ulterior metabolizai la glucuronid i conjugai sulfurai; fie este oxidat obinndu-se epoxidul reactiv care este hidrolizat spontan i se poate lega de proteine devenind citotoxic. Epoxidul poate reaciona cu ADN-ul sau cu proteinele, sau poate fi transformat de o glutation, S-transferaza la (GSH) conjugat. Datorit efectelor negative asupra organismului animal i uman, limitele maxime admise de aflatoxine n produsele alimentare sunt cuprinse ntre 0.05-15 (g/kg) (tabel 2). Aflatoxina M1 n 1963 s-a demonstrat c la vite, aflatoxina B1 este absorbit cu hrana contaminat, este metabolizat ntr-un derivat numit aflatoxina M1 care este regsit n lapte. 0.5-4% de aflatoxin B1 ingerat se regsesc sub form de aflatoxina M1 n lapte. Aceast micotoxin pstreaz , la o treapt inferioar, importantele proprieti cancerigene ale aflatoxinei B1. Astfel, efectul cumulativ legat cu ingerarea regulat a acestor toxine, face s se expun la mari riscuri copii i sugarii, marii consumatori de lapte i produse lactate. Aceste riscuri sunt cu att mai importante deoarece aflatoxina M1 rezist la tratamentele uzuale de conservare i procesare a produselor lactate. Aflatoxina M1 se regsete n totalitate n laptele smntnit i n produsele lactate (iaurt, brnz), se regsete foarte puin n unt. Aceasta este legat de prezena interaciunilor hidrofobe ntre aflatoxina M1 i cazein.

12


Tabel 2. Aflatoxine - limitele maxime admise

Produs

Nivelul maxim de aflatoxina (g/kg) B1 B1+B2+G1+G2 M14.0 15.0 10.0 -

Aflatoxine Arahide, nuci i fructe uscate Arahidele, nucile i fructele uscate i produsele procesate din 2.0 acestea, destinate consumului direct sau folosite ca ingredient alimentar Arahidele supuse sortrii sau altui tratament fizic,nainte 8.0 de a fi consumate de ctre om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar Nucile i fructele uscate supuse sortrii sau altui tratament 5.0 fizic, nainte de a fi consumate de catre om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar Cereale (inclusiv hrica, Fagopyrum sp) Cereale (inclusiv hrica) i produsele procesate din acestea 2.0 destinate consumului uman direct sau folosite ca ingredient alimentar Cereale (inclusiv hrica) cu excepia porumbului, destinate 2.0 sortrii sau altui tratament fizic, nainte de consumul de ctre om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar Porumbul destinat sortrii sau altui tratament fizic, nainte 5.0 de a fi consumat de ctre om sau de a fi folosit ca ingredient alimentar Lapte (lapte batut, lapte pentru fabricarea produselor pe baz de lapte i laptele tratat prin cldura, aa cum este definit prin legislatia sanitara veterinara in vigoare Urmatoarele specii de condimente: 5.0 - Capsicum spp. (fructele uscate ale acestuia, intregi sau macinate, inclusiv chilli, pudra de chilli, cayennesi paprika) - Piper spp.(fructele acestuia, inclusiv piper alb sau negru) - Myristica fragrans (nucoara) - Zingiber officinale (ghimbir) - Curcuma longa (turmeric) Alimentele pentru copii i alimentele pe baz de cereale 0.10 procesate, pentru sugari i copii de vrst mic Formulele pentru sugari i formulele n continuare inclusiv laptele pentru sugari i laptele n continuare Alimente cu destinaie nutriional special destinate n special 0.10 sugarilor

4.0 4.0 10.0 10.0

0.05 -

-

0.025 0.025

13


1.2.2. Ochratoxina A Ochratoxina A a fost izolat pentru prima dat n 1965, de un grup de cercettori sud africani. Din punct de vedere chimic este o molecul de 3-metil-5 cloro-8 hidroxi-3,4 dehidroizocumarina, legat prin legatur peptidic, la nivelul gruprilor carboxil n C7, cu o grupare aminic a L- fenilalanina (figura 3).

Exist i alte ochratoxine ca ochratoxina B, care este derivat al ochratoxinei A i ochratoxina C ester etilic. Aceste diferene de structur, au efecte marcante asupra potenialului toxic. Ochratoxina A este micotoxina cea mai toxic i cea mai rspndit. Ochratoxina A are o mas molecular de 403,8 g/mol, cu un punct de topire la 90C, cnd se cristalizeaz n xilen. Spectrul de adsorbie UV variaz cu pH-ul i polaritatea solvantului. Ochratoxina A posed un maxim de adsorbie de 333 nm, cu un coeficient de extincie molar de 5500 ml cm n metanol. Este o micotoxin toxic, o doz de 2 ppm este suficient pentru a opri creterea animalului. Este un contaminant frecvent al cerealelor, al cafelei, nucilor, fructelor uscate, piperului. Ochratoxina A este un metabolit secundar, elaborat de diferite mucegaiuri din genurile Aspergillus i Penicillium. Producia de ochratoxina A este legat de temperatura, umiditatea mediului ambiant i coninutul de ap al suportului contaminant. Valorile minimale ale umiditii pentru producia de ochratoxin oscileaz ntre 0,83 i 0,90, n funcie de mucegaiul studiat. Temperatura optim pentru producia de ochratoxin de ctre Aspergillus ochraceus este de 28C, sinteza poate avea loc la temperaturi cuprinse ntre 15 si 37 C. Penicillium veridicatum ns crete ntr-o gam de temperaturi care variaz ntre 4 si 30C n prezena unei umiditi de 22%. n regiunile reci, ochratoxina este produs de mucegaiuri din

14

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine genul Penicillium, iar n regiunile calde , ochratoxina este sintetizat de mucegaiuri din genul Aspergillus . Producia de ochratoxin A este legat de psihologia proprie a fiecrei specii de mucegai i de parametrii ecologici. n Europa i Canada, Penicilium verrucosum este considerat ca fiind principalul mucegai productor de ochratoxina A n cereale, formndu-se n general pe alimente acide. Concentraiile de ochratoxina A, regsite n alimente sunt foarte variate, i sunt cuprinse ntre cteva ng/kg pn la multe zeci de mg/kg. Mucegaiurile productoare de ochratoxina A pot produce i alte toxine sau pot cu alte mucegaiuri s produc toxine diferite ca citrinina sau aflatoxine. Un fenomen de sinergism cu ochratoxina A se poate deci produce i poate complica analiza efectelor toxice, ceea ce nu poate fi atribuit exclusiv ochratoxinei A.

Prezena ochratoxinei A n alimente prezint un pericol pentru sntatea uman i animal. Ochratoxina A, odat ingerat este absorbit parial la nivelul stomacului prin difuzia pasiv a formei neionizate. Totui, acest mecanism pasiv nu contribuie dect la absorbia sczut a ochratoxinei A. Principala cale de absorbie este nivelul intestinal. Procentul de absorbie al ochratoxinei A la nivel intestinal este de 66, 56, 56 si 40% la porc, obolan, iepure i pui. Este apoi distribuit la diferite organe. Urmeaz apoi ciclul enterohepatic. Se pot ntlni cantiti mici de ochratoxina A liber n snge. Ochratoxina A are o mare afinitate pentru

15

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine anumite proteine plasmatice de care este fixat (aproximativ 90%). Se fixeaz pe albumina seric i pe o macromolecul seric neidentificat cu masa molecular de 20KDa. Fixarea ochratoxinei de aceste proteine este un fenomen saturat. Mecanismul prin care ochratoxina A se leag de proteine este puin cunoscut. S-a artat c ochratoxina A sub forma de di-anion, este legat la nivelul a dou poziii de fixare pe albumina seric. Aceste poziii de fixare aparin subunitilor II A si II B a albuminei serice. S-a artat de asemenea c aceste legturi pot fi deplasate prin legturi anionice, ca aspartamul, fenilalanina i anti-inflamatorii. Aceast fixare ntrzie transportul ochratoxinei, la nivelul diferitelor organe, i contribuie la dezvoltarea efectelor cronice i toxice ale acestei toxine. Profilul toxicogenic al ochratoxinei A variaz foarte mult n funcie de specie. La om, calea de eliminare a ochratoxinei este nc foarte lung, i a fost estimat la o lun. Pe de alt parte, eliminarea ochratoxinei A a fost descompus n dou faze: una rapid cu o trecere a OTA n snge de 20 ore, i una secund, mult mai lent, unde trecerea OTA n sange este de 25,5 zile. OTA este distribuit la organe, unde este metabolizat n vederea eliminrii sale.

EFECTE PATOGENICE/TOXICE-OTAMecanismul de aciune ipotetic al ochratoxinei A: Ochratoxina A (OTA) este transportat n celul prin intermediul transportorilor organici anionici multispecifici. Structura chimic a OTA conine o grupare izocumarinic legat de fenilalanina (PHE). Multe studii au demonstrat faptul c OTA poate altera procesele care implic fenilalanina i multe dintre efectele biologice ale OTA pot fi prevenite parial prin suplimentarea cu fenilalanina sau substane analoage.

16

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxineO CO 2H CH 2 CH N H Cl H C OH

O

O

Ochratoxina H ACH 3

H

Legare de proteine plasmatice

ADN aduct Afectarea proceselor care implica metabolismul fenilalaninei (PHE) Inhibarea sintezei proteice Legare de proteine citosolice si organelare Inhibarea enzimelor folosind PHE ca si substrat

Datorit efectelor negative pe care le are ochratoxina A asupra sntii omului i animalului, limitele maxime admise n produsele alimentare sunt cuprinse ntre 2 10 ppb (tabel 3).Tabel 3. Limite maxime admise pentru ochratoxina A

Produsul Ochratoxina A Cereale (inclusiv orez si hrisca) i produse cerealiere derivate Cereale brute (inclusiv orez si hrisca brute) Toate produsele derivate din cereale (inclusiv produse cerealiere procesate si boabe de cereale destinate consumului uman direct) Stafide uscate Cafea crud prjit i cafea prjit i mcinat cu excepia cafelei solubile Cafea solubila (cafea instant) Vin (vin rosu, alb roze) i alte tipuri de vin si/sau bauturi racoritoare pe baza de must de struguri Suc de struguri, suc de struguri ca ingredient n alte buturi rcoritoare, inclusiv nectarul de struguri i sucul de struguri concentrat aa cum este reconstituit Must de struguri i must de struguri concentrat destinat consumului uman direct Alimente pentru copii i alimente pe baz de cereale procesate pentru sugari i copii de vrst mic

Nivelul maxim (g/kg sau ppb) 5.0 3.0 10.0 5.0 10.0 2.0 2.0 2.0 0.50

17

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Alimente cu destinaie nutriional special destinate n special sugarilor Cafea verde, fructe uscate altele decat stafidele, cacao i produsele din cacao, vinurile licoroase, produsele din carne, condimentele i lemnul dulce (Glycyrrhiza glabra) 1.2.3. Patulina Este o lacton nesaturat, produs de numeroase mucegaiuri, dar cel mai frecvent de Aspergillus clavatus, o ciuperc a microflorei granelor, Penicillium expansum, agent de mucegire a merelor n depozite i Bassochlamys nivea i Bassochlamys fulva prezente sub forma lor imperfect. 0.50 -

n alimentaia animal, este o micotoxin foarte frecvent n furajele depozitate ude i n cerealele cultivate n sladarii. Este folosit de asemenea n farmacii ca antibiotic pentru a lupta mpotriva stafilococilor, ns toxicitatea sa a dus la abandonarea acestei ntrebuinri. Efectele patulinei se manifest prin leziuni congestive la nivelul plmnilor, rinichilor i splinei, dar poate provoca o degenerescen de neuroni n cortexul cerebral, putnd rezulta diferite simptome nervoase (paralizii, etc.). Poate avea efecte toxice asupra globulelor albe (leucocite), ct i proprieti cancerigene. Potrivit Monitorului oficial al Romniei din 26 noiembrie 2006 limita maxim admis pentru coninutul de patulin este de 10 g/kg. (tabel 4).

18

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxineTabel 4. Limite maxime admise pentru coninutul de patulin

Produsul Patulina Suc de fructe i nectar de fructe, n special suc de mere i sucurile de fructe ca ingrediente pentru alte buturi; Suc de fructe concentrat dup reconstituirea conform instruciunilor productorilor Buturi spirtoase, cidru i alte buturi fermentate derivate din mere sau coninnd suc de mere Produsele solide de mere, inclusiv compot de mere, piure de mere destinat consumului direct Suc de mere i produse solide din mere, inclusiv compot de mere i piure de mere pentru sugari i copii de vrst mic i etichetate i comercializate ca destinate sugarilor si copiilor de vrst mic.Alte alimente pentru copii altele dect cele pe baz de cereale procesate 1.2.4. Zearalenon

Nivelul maxim (g/kg sau ppb) 50.0

50.0 25.0 10.0

Poate fi produs de diferite specii de Fusarium: Fusarium culmorum, Fusarium graminearum i Fusarium Crookwellense. Este un compus cristalin, de culoare alb. A fost numit iniial toxina F2. Condiiile optime pentru a se produce sunt umiditate ridicat i temperatur sczut.

Fig. 5. Structura chimica a zearalenonei

19

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Se prezint ca o lacton nesaturat a acidului exorcilic (figura. 5). Este termostabil i rezist la o depozitare prelungit. Prin hidrogenare, se reduce funcia cetonic n alcool astfel nct se obin izomerii zearalenonei: izomerul este folosit ca stimulent de cretere pentru ovine. Nu are efecte toxice cronice. Porcul este animalul cel mai sensibil. Contaminarea fungic intervine pe cmp, porumbul prezentnd un mucegai rou. Dar producia de toxine se realizeaz n principal n timpul depozitarii. Nu prezint efecte toxice cronice. Limita maxim admis pentru coninutul de zearalenon este de 20 g/kg (tabel 6).Tabel 5. Limite maxime admise pentru coninutul de zearalenon

Produsul Zearalenona Cereale neprocesate altele dect porumbul Porumbul neprocesat Fina de cereale cu excepia finii de porumb Fina de porumb, puda de porumb, srot i ulei rafinat de porumb Pine, produse de patiserie, biscuiti Batoane de porumb i cereale pentru micul dejun pe baz de porumb Batoane din alte cereale si cereale pentru micul dejun altele dect cele pe baz de porumb Alimente pe baza de porumb procesat pentru sugari i copii de vrsta mic Alimente pe baz de alte tipuri de cereale pentru sugari i copii de vrsta mic

Nivelul maxim (g/kg sau ppb) 100 75 50 50 20

EFECTE PATOGENICE/TOXICE-ZEARALENONAMecanismul de aciune al zearalenonei: Zearalenona (Z), asemenea poliestrogenilor (PE) i al estrogenilor din mediu (AE), traverseaz pasiv membrana celular i se leag de receptorii estrogeni. Complexul receptor -Z ajunge n nucleu foarte rapid unde se leag de receptori nucleari specifici i genereaz raspunsuri estrogene prin activarea genelor: acest lucru are ca rezultat producerea de ARN mitocondrial (mARN) care codific n mod normal producerea de proteine care apar n mod normal prin legarea de receptorii estrogeni.

20


Receptor estrogen

Z PA Proteina indus hormonal PE

Z mARN

Z

Complex ribozomal mARN

1.2.5. Fumonisinele Sunt produse de diferite specii de Fusarium, n special de Fusarium moniliforme. Cele mai toxice fumonisine sunt fumonisina B1 i fumonisina B2. Se gsesc n principal n porumb i produsele pe baz de porumb. Are o structur liniar din 20 atomi de carbon cu grupri metil, hidroxil i doi substituieni cu masa mai mare (figura 6). Au de asemenea o funcie aminic primar care ii confer o reactivitate interesant i o solubilitate n mediu apos. Sunt hepatotoxice, nefrotoxice. Se gsesc de obicei n porumb, dar i n orez, mirodenii, bere.

Fig. 6. Structura chimic a fumonisinelor

21


EFECTE PATOGENICE/TOXICE-FUMONISINEConsecine: cantitatea crescut de sfinganin a produs moartea celulei; cantitatea sczut de ceramid a produs moartea celulei; a alterat semnalele transmise prin cile mediate de baz sfingoid 1-fosfat; a alterat funcionarea n procesele modulate de lipide, sfingomielina i glicosfingolipide; se observ niveluri crescute de baze sfingoide 1-fosfat n ser i n urin.

1.2.6. Trichotecinele Au fost asociate nc de la nceputul secolului cu consumul de cereale ameitoare (de fapt mucegite) n Siberia, avnd ca simptome grea, vrsturi, ameeli i tulburri vizuale. Dup descoperirea lor n anul 1974, s-a putut constata c sunt responsabile de Aleucie Toxic Alimentar ( descreterea numrului de globule albe), ca o consecin a consumului de cereale mucegite. n plus s-a vzut c tricotecinele sunt capabile s induc reacii chimice cu irigaii severe, inflamaii, descuamri ale pielii n contact cu micotoxina. Sub acest nume, sunt cunoscute mai mult de 75 de micotoxine, produse de Fusarium, dar i de Tricothecium, Mycothecium. Toxicitatea poate fi folosit ca arm clinic dar se poate folosi i n chimioterapii datorit efectelor benefice. Sunt grupate n tricotecine de tip A ( Toxina T-2 si HT-2) i de tip B (desoxinivalenolul, nivalenolul). Sunt formate dintr-un nucleu 12, 13 epoxitricotecine, format din patru cicluri sixterpenice cu o dubl legtur i un epoxid stabil. Cei cinci substituieni care pot fi inserai pe acest nucleu formeaz 148 compui cunoscui, grupai n patru grupe.

22

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Grupele A i B sunt cele mai frecvente, i sunt caracterizate prin prezena sau nu a unei funcii atomice n poziia C8. Au o mare stabilitate i rezist att la tratamente termice ct i alcaline. Toxicitatea este legat de numrul radicalilor substituii n nucleul central. Nu se acumuleaz n organism, sunt eliminate prin fecale i urin. Toxina T-2 este produs de numeroase specii de Fusarium, n special de Fusarium tricinctum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium solani i Fusarium equiseti . - formula brut : C24H34O9, - masa molecular : 466,50 g/mol, - solubila n solveni organici polari ca acetona sau acetonitrilul ; - stabila n solveni ca acetatul de etil. Toxina HT-2, este produs de numeroase specii de Fusarium, n special de Fusarium sporotrichioides i Fusarium poae : - formula brut : C22H32O8, - masa molecular : 424,5 g/mol, - solubil n solveni organici polari, - stabil n diferii solventi ca acetatul de etil. Desoxinivalenolul (DON), trichotecina cea mai rspndita n lume i este produs de F. graminearum i F. culmorum : - formul brut : C15H20O6, - masa molecular : 296,36 g/mol, - solubil n etanol, metanol, acetat de etil i ap, - stabil n acetat de etil la -18 C. Dintre trichotecine, cea mai frecvent ntlnit este desoxinivalenolu. Limita maxim admis conform Monitorului oficial al Romniei din 26 noiembrie 2006 este de 200ppb (tabel 6).

23


Tabel 6. Limite maxime admise pentru coninutul de desoxinivalenol

Produsul

Nivelul maxim (g/kg sau ppb) 1250 1750 750 500 750 200

Desoxinivalenol (DON) Cereale neprocesate altele dect grul dur, ovz i porumb Grul dur i ovzul Porumb neprocesat Fina de cereale, inclusiv fina de porumb Pine, produse de patiserie, biscuii, batoane de cereale i cereale pentru micul dejun Paste fainoase (uscate) Alimente pentru copii i alimente pe baza de cereale procesate pentru sugari i copii de vrst mic

Modul de aciune la nivel molecular al DON i al altor tricotecene: DON ptrunde n celul prin difuzie i se leag de ribozomii activi care transmit un semnal la proteinkinazele activate de ARN (PKR) i la hematopoetokinaza celular (HCK). Are loc fosforilarea protein-kinazelor activate (MAPKS) i se obine activarea factorului de transcripie avnd ca rezultat efectele cronice i imunotoxice.

EFECTE PATOGENICE/TOXICE-TRICHOTECINE

24


1.3 Prezena micotoxinelor n diverse produse alimentare Micotoxinele n cereale Practica a demonstrat faptul c, la depozitarea cerealelor, a produselor de mcini i panificaie apare n anumite condiii o microflor care favorizeaz creterea mucegaiurilor i producerea de micotoxine. Mucegaiurile existente n depozitele de cereale se nmulesc cnd umiditatea relativ a aerului se situeaz ntre 80-85 %, iar temperatura ajunge la peste 26 C. Produsele atacate la rndul lor devin sursa de infecie, acumulnd toxine. Aflatoxinele au fost puse n eviden n pine, produse de panificaie, crupe de porumb i n unele tipuri de pine dietetic. n cereale pe lng ochratoxina A s-a pus n eviden i ali metabolii toxici ai fungilor, cei mai muli din genurile Aspergillus i Penicillium, care trec i n produsele de mcini, concentraiile cele mai mari nregistrndu-se n tre. i n fina depozitat n condiii de umiditate ridicat pot aprea fungi care produc micotoxine (Fusarium, Mucor, Penicillium, Aspergillus). Porumbul recoltndu-se la o umiditate ridicat poate favoriza apariia mucegaiurilor (Aspergillus flavus) chiar nc din cmp. Orezul poate fi contaminat cu micotoxine, inclusiv aflatoxine, dar prin autoclavare aflatoxinele sunt inactivate. Micotoxinele din produsele de mcini pot trece n pine numai cnd se folosesc materii prime puternic contaminate. Este de remarcat faptul c fermentarea aluatului reduce n mic msur cantitatea de aflatoxine, coacerea nu are nici un efect asupra lor, dar adaosul n aluat de substane oxidante ( tipul bromailor) pot determina reduceri importante n aflatoxine. Cercetrile efectuate au scos n eviden c pentru inhibarea dezvoltrii microorganismelor n pine se pot folosi diveri fungistatici ca: acidul sorbic i palmitatul de sorboil. Pinea de secar cu aciditate ntre 8.8-9.7 grade de aciditate, nu permite aciditatea, formarea ochratoxinelor, iar pe cea de gru se dezvolt cantiti mici din toate cele 4 tulpini izolate. Micotoxinele n semine oleaginoase i n ulei i seminele oleaginoase (arahidele etc.) pot fi atacate de mucegaiuri (inclusiv Aspergillus flavus) care dau natere aflatoxinelor; momentele critice fiind recoltarea i depozitarea, condiii de clim, de pstrare etc.

25

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Umiditatea arahidelor (apa) n perioade ploioase poate ajunge la 30%; recomandndu-se uscarea imediat a acestora pentru a preveni contaminarea cu aflatoxine. La obinerea uleiului prin presare cantitatea mare de micotoxine rmne n turte, numai 5% trece n ulei, respectiv aflatoxinele din ulei reprezint 10% din cantitatea existent n boabe, ceea ce nu reprezint un pericol mare. Prin prjire la arahide se reduce coninutul de substane toxice. Floarea soarelui respectiv seminele sunt i ele mediu bun pentru dezvoltarea aflatoxinelor. Uleiul din semine de floarea soarelui, conine cantiti mici de aflatoxine, deoarece prin procesul de rafinare, (tratare cu alcali) i filtrare (prin plci de celuloz-azbest) se reduce cantitatea de toxine, iar dac se execut decolorarea n prezena acidului citric detoxifierea este mai complet. Micotoxinele din legume i fructe Legumele i fructele pot fi i ele contaminate cu mucegaiuri care pot sintetiza micotoxine. Astfel la morcovi Aspergillus parasilicus sintetizeaz Aspergillus flavus, iar pe suprafaa citricelor se dezvolt Aspergillus parasilicus. Dezvoltarea mucegaiurilor pe fructe, n sucuri formeaz n majoritatea cazurilor patulina, cantiti mai mici s-au gsit n sucuri de pere, gutui, struguri, excepii fcnd sucurile de tomate i prune; n sucul de mere concentrat patulina nu se reduce. i pe fructele uscate se pot forma aflatoxine. Zahrul are efect de protecie asupra micotoxinelor, ceea ce a fcut ca patulina s existe i n gemuri. Micotoxine n cafea i cacao n cafea verde mucegit s-a identificat Aspergillus ochraceus, iar cu frecven mai mic Aspergillus flavus i Aspergillus versicolor; prin prjire se distrug 75%. Boabele de cacao conin micotoxine, produse de Aspergillus parasilicus. Micotoxine n buturi fermeentate n buturile alcoolice au fost depistate aflatoxine, mai frecvent n cidru, prin fermentarea pulpei. Cercetrile efectuate pe 150 de probe de vin nu a evideniat aflatoxine. Malificarea necorespunztoare a orzului poate forma aflatoxine, n bere trec 5-10% din cele existente n mal.

26


Micotoxinele n carne i preparate din carne Micotoxinele pot infecta carnea animalelor ca urmare a ingerrii de furaje mucegite, cea mai mare cantitate din micotoxin ochratoxin se acumuleaz n rinichi. Ochratoxina are o termostabilitate ridicat; prin prjire se reduce concentraia de micotoxin, dar n esutul gras nu se schimb. Preparatele din carne pot fi contaminate cu mucegaiuri din genurile: Penicillium, Aspergillus, Fusarium. i salamurile fermentate-uscate pot fi contaminate cu tulpini de Penicillium i mai multe tulpini de Aspergillus. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc atunci cnd pstrarea produselor se face n condiii nefrigorifice, iar pentru prevenirea dezvoltrii acestora este necesar adugarea de sorbat de potasiu. S-a constatat c o surs de infectare a preparatelor de carne cu mucegaiuri o constituie i condimentele. Micotoxinele n lapte i produsele lactate Furajele cu coninut mare de aflatoxine determin la vaci, prezena n lapte a unui metabolit al aflatoxinei B1, denumit milktoxin, care este detectat chiar din primele zile de la ingerare, declannd o degerescena a celulelor ficatului. Cantitatea de toxin este mai mare n lapte iarna fa de primvara. i n laptele praf cercetrile au pus n eviden existena unui numr mare de mucegaiuri, ca urmare a depozitrilor n condiii necorespunztoare. Laptele praf contaminat cu Aspergillus versicolor produce diaree puternic, iar Penicillium ciclopium produce simptome nervoase. n brnzeturi micotoxinele apar ca urmare a prezenei mucegaiurilor att n mediul ambiant ct i n urma proceselor tehnologice. Absena microorganismelor fungice s-a constatat la telemea i n unele cazuri la cacavalul tip Dobrogea. Valorile maxime de micotoxine s-au constatat la sortimentele pstrate un timp mai ndelungat. Cu ct consistena pastei este mai tare, cu att filamentele de mucegai ptrund mai greu n profunzime, numrul cel mai mic de mucegaiuri se nregistreaz la brnzeturile oprite; n brnzeturile topite frecvena aflatoxinelor este mult mai mic dect la celelalte tipuri. Cercetrile au artat c mucegaiurile Penicillium caseicolum, Penicillium camemberti i Penicillium roqueforti nu formeaz toxine. Totui, cercetrile ntreprinse de Scott au evideniat faptul c Penicillium camemberti i Penicillium roqueforti utilizate la fabricarea brnzeturilor sunt capabile s produc substane toxice (patulina, acid penicilic i alcaloizi toxici). 27


Conform Ordinului nr. 1050/97/1145/505/2005 sunt admise urmatoarele limite maxime pentru aflatoxine in produse, care sunt prezentate in tabelul de mai jos.Tabel 7. Nivel maxim admis pentru aflatoxine conform Ordin nr. 1050/97/1145/505/2005Nr. crt. Produs B1 1 Arahide, nuci i fructe uscate i produse procesate din acestea destinate consumului uman direct sau folosite ca ingredient alimentar Arahide supuse sortrii sau altui tratament fizic, nainte de a fi consumate de ctre om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar Nuci i fructe uscate supuse sortrii sau altui tratament fizic nainte de a fi folosite ca ingredient alimentar Cereale (inclusiv hric, Fagopyrum sp.) i produse procesate din acestea destinate consumului uman direct sau folosite ca ingredient alimentar Cereale (inclusiv hric, Fagopyrum sp.) cu excepia porumbului, destinate sortrii sau altui tratament fizic, nainte de consumul uman sau ca ingredient alimentar Porumb destinat sortrii sau altui tratament fizic, nainte de a fi consumat de ctre om sau de a fi folosit ca ingredient alimentar Lapte (lapte brut, lapte pentru fabricarea produselor pe baz de lapte i lapte tratat prin cldur, aa cum este definit prin legislaia sanitar-veterinar n vigoare) Condimente (piper, nucoar, ghimbir, turmeric, chilli, pudr de chilli, paprika) Alimente pentru copii i alimente pe baz de cereale procesate, pentru sugari i copii de vrst mic Alimente cu destinaie nutritional special, pentru sugari 2 Nivel maxim de aflatoxin (g/kg = ppb) B1+B2+G1+G2 4 M1 -

2 3 4

8 5 2

15 10 4

-

5

2

4

-

6 7

5 -

10 -

0,05

8 9 10

5 0,10 0,10

10 -

0,025

28

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Datorit faptului c micotoxine se gsesc n unele produse alimentare, pentru a proteja sntatea consumatorilor ntr-o serie de ri s-au luat msuri de limitare a cantitii de micotoxine.

Tabel 8. Limita concentraiei admisibile (LCA) de aflatoxine n diferite ri Nr crt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ara Produse alimentare LCA Mg/kg aflatoxin Toate produsele alimentare 40 Unt de cocos (export), fina din arahide 50 Nuci, produse cu nuci, unt de cocos, alune comestibile i derivate 15 Produse importate de U.E, produse din 5-10 Brazilia (arahide si fina de arahide). Toate produsele alimentare (admite limitele impuse de U.E) Arahide din import (si derivatele de prelucrare). Fina de arahide Toate produsele alimentare Toate produsele alimentare Arahide Toate produsele alimentare Toate produsele alimentare Toate produsele alimentare Arahide de consum i alte alimente Produse alimentare 5-10 50 30 20 10 50 5 5-10 5-10 20 5

Belgia Brazilia Canada Danemarca Frana Italia India Israel Japonia Anglia Polonia Suedia Germania S.U.A Romnia

Micotoxinele n preparatele enzimatice fungice O preocupare important a cercetrii tiinifice actuale o constituie i problema folosirii preparatelor enzimatice n industria alimentar, ca urmare a eficienei economice, reducerii timpului de fabricaie i a consumurilor specifice, mbuntirii calitii produselor. Acestea n majoritatea cazurilor fiind de natur fungic s-a ridicat problema verificrii inocuitii lor, deoarece n condiii de cultur exist posibilitatea dezvoltrii de micotoxine. Prerile specialitilor n aceast direcie sunt contradictorii, deoarece mucegaiurile Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, etc, produc toxine doar n anumite condiii de cultur. De remarcat este faptul c la preparatele obinute, la aceleai mucegaiuri apar diferene de toxicitate.

29

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Preparatele enzimatice nepurificate care sunt obinute din aspergili pot s duc la apariia unor dereglri profunde, datorit includerii unor metabolii toxici (aflatoxine, ochratoxine, acid aspergilic etc). n urma analizrii preparatelor enzimatice din Rhizopus s-a constatat aciunea lor negativ asupra organismului animal, ceea ce a determinat scoaterea acestora din fabricaie. S-au izolat dou micotoxine n preparatele pectolitice obinute din Sclerotinina sclerotium i care au aciune toxic asupra ficatului, dar i un posibil efect cancerigen (tabel 9) Tabel 9. Posibiliti de reducere a coninutului de micotoxine n prod. alim. Nr. crt. 1. 2. Metoda aplicat Prevenirea dezvoltrii mucegaiurilor toxicogene Procedee prin extracie cu solveni organici Efecte Reducerea dezvoltrii mucegaiurilor toxicogene Aflatoxinele se dizolv n acetia

CAPITOLUL 2 Factori care influeneaz producerea micotoxinelorMicotoxinele sunt metabolii secundari produi de mucegaiuri aparinnd n principal genurilor Aspergillus, Penicillium i Fusarium.

30

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine n condiii nefavorabile de temperatur i umiditate, mucegaiurile care contamineaza alimentele au capacitatea de a elabora metabolii toxicogeni. Prin consumul de nutreuri contaminate cu micotoxine, acestea sunt preluate de animal care le poate metaboliza doar partal. De la animal, micotoxinele ajung la om prin consumul de carne, n care micotoxinele sunt cumulate, prin consumul de ou, lapte i produse lactate, n care micotoxinele sunt excretate. Acestea devin alimente nocive pentru om, adica i pierd inocuitatea. Condiiile de toxicogenez sunt n general mai restrictive dect cele necesare creterii mucegaiurilor.

2.1 Biogeneza micotoxinelorFormarea micotoxinelor poate avea loc la toate stadiile din cmp i pn la comercializarea produselor pentru consumul animal i uman. Natura micotoxinelor produse i care contamineaz alimentele depinde de speciile fungice, de condiiile ecologice i de stabilitatea acestor toxine n mediu alimentar. Micotoxinele nu contituie o clas chimic. Sunt metabolii secundari care nu joac un rol evident n economia microorganismelor: n comparaie cu metabolismul primar care este cu temeinicie acelai pentru toate metabolismul secundar, foarte important la mucegaiuri, aduce o mare diversitate de metaboliii secundari sunt foarte adesea elaborai de familia de produi chimici vecini, din punct de vedere toxicologic, aceasta explic n parte c pentru aceeai doz de toxin, efectele sunt foarte grave i mai puin specificate n intoxicaiile naturale fa de intoxicaiile experimentale efectuate cu o micotoxin pur. Natura produselor care se acumuleaz n aval, depinde de caracterele individuale ale suselor i de condiiile de mediu. La ora actual se cunosc n jur de 200 de specii de mucegaiuri care au capacitatea de a forma micotoxine. fiinele vii, metabolismul secundar depinde de speciile considerate, n acest caz, susele; molecule, din care micotoxinele;

31


Fig. 7. Biosinteza micotoxinelor

Originea chimic a micotoxinelor este foarte divers, unele deriv din aminoacizi (alcaloizii de ergot, acidul aspartic, acidul ciclopiazolic, slaframina, glioxina, roquefortin, sporodesina), altele sunt policetoacizii ( aflatoxinele, ochratoxina, patulina, citrinina, acidul penicilic, sterigmatocistina, zeararlenona), iar altele sunt derivai terpenici ( fusarenona, desoxinivalenolul, varidina, toxina T-2). Micotoxinele se formeaz la finalul fazei exponeniale i nceputul fazei staionare a creterii mucegaiului (figura. 8).

Fig. 8 Fazele de cretere fungic i localizarea sintezei micotoxinelor

2.2 Formarea micotoxinelor32

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Formarea micotoxinelor pe produsele alimentare presupune parcurgerea urmtoarelor etape: 2.2.1. Infestarea cu mucegai este favorizat de temperaturi ridicate i de umiditatea redus a solului

2.2.2 Colonizarea favorizat de atacul de insecte: - distrugerea barierelor fizice faciliteaz raspndirea infeciei pe produs; - distrugerea pericardului favorizeaz infecia interiorului boabelor; - descreterea umiditii boabelor 35%;

2.2.3. Producerea de micotoxine favorizat de: - temperaturi ridicate; - precipitaii reduse-stres hidric al plantelor; - ali factori limitativi ai plantelor cu boabe n curs de formare; - prolina, factor, semnal de stres n plante induce sinteza toxinelor n tulpinele toxicogene;

33


Creterea microbian i producia de toxine este influenat de numeroi factori (fig. 9). Este important s cunoatem modul n care aceti factori influeneaz calitativ i cantitativ, dezvoltarea microorganismelor i producia de toxine pentru a putea stabili condiiile optime de depozitare a cerealelor.

Fig. 9. Factori care favorizeaza creterea fungica i producia de toxine

. Pentru a ntelege modul n care celula microbian reacioneaz la condiiile mediului ambient, diferii factori au fost mparii arbitrar n trei mari grupe, cu precizia c n condiiile naturale, bioefectul acestora poate fi cumulativ sau sinergic: .a. 34 Factori extrinseci sunt factorii exogeni, ai mediului natural/industrial: temperatura, umezeala relativ a aerului, concentraia de oxigen, radiaii, factori mecanici, factori chimici,

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Factori intrinseci sunt factori dependeni de natura alimentului care influeneaz

creterea i activitatea culturilor starter dar i de natura alterrii specifice a produselor alimentare-compoziia chimic i concentraia n nutrieni, pH, rH, structura anatomic, substane chimice . Factori implicii sunt factori biologici determinai de relaiile ce se pot stabili ntre diferitele grupe de microorganisme care alctuiesc microbiota alimentului respectiv.

2.3 Influena factorilor extrinseci asupra apariiei micotoxinelor2.3.1 Temperatura Temperatura are influen asupra speciei de mucegai, dar i asupra produselor de metabolism. Procesele metabolice se desfoar n limite stricte de temperatur, specifice fiecrui microorganism. Acest factor poate favoriza sau inhiba dezvoltarea microorganismelor, iar n anumite cazuri poate chiar determina moartea acestora. Efectul temperaturii asupra dezvoltrii microorganismelor se datorete influenei pe care aceasta o exercit asupra: - strii de agregare a apei, n funcie de care se mrete sau se micoreaz disponibilitatea apei; - vitezei reaciilor enzimatice; - plasticitii membranei celulare i citoplasmei; - macromoleculele pe care le pot denatura; Mucegaiurile se dezvolt la temperaturi diferite. Exist pentru fiecare specie, un grad de temperatur la care dezvoltarea se face cu cea mai mare intensitate. Aceast temperatur se numete temperatura optim de dezvoltare. Deasupra i sub temperatura optim, dezvoltarea mucegaiurilor slbete, i cnd atinge un anumit punct, superior sau inferior, nceteaz de a se mai dezvolta chiar dac mediul nutritiv ramne acelai. Temperatura superioar optimului, la care se mai poate observa o foarte slab dezvoltare a mucegaiurilor, se numete temperatura maxim iar cea inferioar, temperatura minim de dezvoltare. Cnd temperatura se ridic deasupra maximului de temperatur, mucegaiul este distrus. Dac temperatura scade sub minimul de temperatur, mucegaiul nu este distrus ci se gsete ntr-o stare de via foarte lent, favorabil conservrii. Temperatura optim pentru creterea mucegaiurilor este cuprins ntre 25-30C iar limita maxim este de 40-45C (tab.10). Exist totui mucegaiuri care se pot dezvolta fr probleme 35

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine la temperaturi de 55C Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, dar i mucegaiuri care sunt capabile s se dezvolte la temperaturi de 0C, Penicillium cyclopium. Tabel 10. Temperaturi minime necesare pentru dezvoltarea unor mucegaiuri i pentru producia de micotoxine. Mucegai Aspergillus flavus Aspergillus clavatus Aspergillus ochraceus Penicillium expansum Penicillium cyclopium Penicillium cyclopium Fusarium roseum C 10 10 10-12 0 0 0 15 Micotoxina Aflatoxine Patulina Ochratoxina Patulina Ochratoxina Acid penicilic Zearalenona C 10 12 12 0-24 0-24 4 10

Se observ c sunt unele situaii n care exist o apropiere ntre temperatura minim necesar pentru creterea mucegaiului i cea la care are loc producerea de micotoxine. Exist totui unele excepii cnd temperatura de dezvoltare a mucegaiului este cuprins ntre 6-45C cu un optim la 37C iar producia de micotoxine are loc ntr-un interval de temperatur cuprins ntre 11-36C cu un maxim la 30C. Fusarium roseum (productor de zearalenon) se dezvolt bine ntre 24-27C, iar producia de micotoxine are loc la temperaturi cuprinse ntre 10-12C. Totui, sunt varieti ale lui Fusarium roseum, ca Fusarium roseum gibbsosum i Fusarium roseum semitectum care au capacitatea de a produce n orz la 25C, cantiti de zearalenon echivalente cu producia de micotoxin la temperatura de 10C. Plecnd de la aceste temperaturi minime necesare pentru creterea anumitor mucegaiuri, putem spune c sunt condiii optime pentru o cretere i proliferare fungic la o valoare optim mai mare de 0.75, o temperatur mai mare 20C i o umiditate a substratului de 14%. Mucegaiurile se mpart n linii mari, dup temperatura de dezvoltare n: mezofile, termofile, termotolerante si psichrofile. Majoritatea mucegaiurilor sunt mezofile. Tabel nr.11 Exigenele termice pentru dezvoltarea mucegaiurilor Mezofile Maxim Minim Optim Termofile Temperatura 0C 15-30C

36

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Maxim Minim Termotolerante Maxim Minim Optim Psihrofile Maxim Minim Optim 50C 20C 50C >0C 15-40C 20C 1% Cupru Mercur Plumb Zinc 0.1-10 ppm 0.1-10 ppm 0.1-10 ppm 0.1-10 ppm

Ali filosilicai Kalinul ( A12Si205(OH)4) sau silicatul de aluminiu este un flosilicat folosit n tratarea

ulcerelor gastrice; este de asemenea dotat i cu proprieti adsorbante. In vitro, concentraia de 2% permite adsorbia de 87% din coninutul de AFBI (8 ppm) prezent ntr-o soluie tampon fosfat (6.5). Totui, adsorbit este uor reversibil, aproximativ 77% din toxina rmne extractibil cu cloroform. Permite de asemenea decontaminarea arahidelor i previne efectele toxinei la obolani n cazul unei contaminri a alimentelor de 5 ppm AFB1 ( adaos de 0.2-1% kaolin) Acest efect devine insuficient dac nivelul de contaminare este mult mai mare (20 ppm). Sepiolita ((MgO)2(Si02)3, 2H20 sau silicatul de magneziu este de asemenea un filosilocat. Folosind 2% sepiolit se poate adsorbi peste 87% din coninutul de AFB1 (8 ppm) prezent ntr-o soluie tampon fosfat (pH 6,5). Aceast adsorbie este reversibil, peste 77% din toxin rmnnd extractibil cu cloroform. Se explic astfel efectele protectoare ale sepolitelor 0.5% n aliment vis-a- vis de toxicitatea AFB1 (800 ppm) la porc. Carbonul activ este o pudr neagr nehidrolizabil, obinut prin piroliza diferitelor tipuri de materii organice. Carbonul activ este folosit in vivo pentru adsorbia toxicilor i toxinelor la om i animal. Capacitile sale adsorbante variaz n funcie de porozitatea sa ( suprafaa de contact) i de mediul n care se regsete ( apos, concentraia n materie organic i sare, pH.). Adsorbia specific variaz ntre 500 m 2 /g - 3500 m 2 /g. Carbonul activ este foarte des folosit n cazul separrii micotoxinelor n vederea dozrii lor. Este folosit n vederea unei decontaminri a alimentelor lichide, n special a sucului de mere. Persistena unei coloraii cafenii nchise n produsul tratat face dificil folosirea lui in alimentaia umana. Datorita prezentei sale sub forma de pudra si puterea de colorare, folosirea n alimentaia uman este de asemenea delicat. Folosirea carbonului n extracia micotoxinelor ca i frecvena utilizrii n tratamentul intoxicaiilor acute explic totui utilizarea sa experimental mai mult dect n cazul decontaminrii. 47121 47

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Capacitatea adsorbant a carbonului activ vis-a vis de aflatoxine a fost pus n eviden totui. 100 mg carbon sunt capabile sa adsoarb 1 mg toxin n prezena a 2% serumalbumina bovina i 0.5% ulei de porumb, la pH 7. Complexul format este stabil, i protejeaz toxicitatea AFB1: diminuarea semnelor hepatotoxice (mrcri plasmatice i leziuni hepatice), creterea procentajului de supravieuire, creterea eliminrii micotoxinelor i metaboliilor lor prin excreii fecale. Aceste efecte au fost observate mai bine n cazul intoxicaiilor acute dect n cazul celor cronice, la animalele nerumegatoare i la pasri. Totui semnele unei aflatoxicoze nu au putut fi evitate, ceea ce sugereaz c folosirea carbonului activ este insuficient pentru a garanta salubritatea alimentelor contaminate cu aflatoxine. Efectele benefice ale carbonului super activ" (capacitate mare de adsorbie) au fost puse n eviden n cazul administrrii toxinei T-2. O cretere a procentului de supravieuire a fost observat n cazul administrrii unei doze letale la obolani. Acest efect a fost parial observat la administrarea micotoxinelor, poate fi legat de adsorbia moleculeor i metaboliilor si eliminai prin excreii biliare. Este acompaniat de o diminuare a semnelor de necroz tisular. Efectele protectoare pot fi mrite prin administrarea concomitent a corticoidelor. Carbonul activ permite o adsorbie a toxinei aplicat pe o piele lezat. Totui, protecia legat de administrarea carbonului activ (0,5 % de aliment), la puii care primesc un aliment contaminat cu 6 ppm toxina T-2 nu este dovedit. n ceea ce privete ochratoxina A, carbonul activ este un adsorbant eficace in vitro, el nu este capabil ns s diminueze toxicitatea micotoxinei in vivo la pui. Acest efect poate fi consecutiv la o diminuare a capacitii adsorbante a carbonului n alimente, n raport cu coninutul lor ridicat n substane organice. Un net efect protector a fost observat n cazul administrrii unor doze mari de carbon n aliment (5-10%) contaminate cu ochratoxina A (1 ppm), fiind nsoit totui de o diminuare a concentraiilor plasmatice n vitamina E.

3.2.3.2 Rinile Rinile sunt polimeri de sintez formai din cerpetene macromoleculare tridimensionale prezentnd grupri active susceptibile fixrii de compui organici sau minerali prin legturi cu energie sczut. Rinile curente sunt rinile schimbtoare de cationi de tipul R-SO 3; 48121 48

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine R-PO3 ; R-COO i rini schimbtoare de anioni de tipul [R-N(CH3)3] . Aceti compui sunt folosii n separarea micotoxinelor n vederea dozrii ulterioare. Rinile schimbtoare de anioni sunt folosite pentru proprietile lor adsorbante in vivo. Colestiramina este folosit n tratamentul hipercolesterolemiei. Proprietile sale adsorbante sunt testate in vitro pe zearalenona (concentraia de 1%). 1 g colestiramina este capabil s adsoarb peste 2 ng toxine n mediu cu compoziie apropiat de coninutul gastric sau intestinal. La obolani, folosirea unui nivel de 5% n aliment va diminua nivelul de reziduuri prezente n ficat i rinichi. La oareci, rina (2.5% n aliment) va duce la creterea greutii corporale dupa ngerarea unui aliment contaminat cu 6 ppm zearalenon. Proprietile adsorbante ale colestiraminei au pus n eviden administraia ochratoxinei A. La obolani, rina (2% din aliment) va fi susceptibil de diminuarea concentraiilor plasmatice n OTA ( ncorporat n aliment n concentraie de 1 ppm), de o cretere a eliminrii prin excreie fecal i diminuare prin excreie urinar. Aceste efecte sunt mai puin marcante pentru un aliment bogat n lipide saturate, ceea ce corespunde unei diminuri a ciclului enterohepatic al toxinei. Fixarea ochratoxinei A pe rini va fi n competiie cu srurile biliare, cu o mare afinitate. Aceast fixare va fi acompaniat de o diminuare a neprotoxicitii ochratoxinei A la obolani. Astfel, colestiramina prezint proprieti adsorbante interesante vis-a vis de micotoxinele anionice. Proprietile adsorbante ale polimerilor divinil - benzen - stiren, alt rin capabil s fixeze anioni, a fost testat. n vivo, adugarea acestui adsorbant n hrana obolanilor (5%) modific toxicocinetica zearalenonei administrat pe cale oral a dozei de 100 mg/kg, i diminuarea efectelor negative a alimentelor contaminate cu 3 ppm toxina T-2 administrat timp de 2 sptmni. Rezultatele obinute n acest ultim experiment sunt asemntoare cu cele obinute cu bentonit, dar superioare celor obinute cu o rin schimbtoare de cationi. Polivinilpirolidonele folosite ntr-un nivel de 0.2% n aliment, vor fi incapabile s protejeze efectele toxice ale desoxinivalenolului la porc. Folosirea concentraiei de 0,3% n aliment, va diminua toxicitatea aflatoxinelor la pui (2,5 ppm un amestec care conine mai mult de 80% AFB1 administrat timp de 3 sptmni).

3.2.4. Metode biologice de decontaminare 49121 49

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Se ncearc degradarea n mediu natural a micotoxinelor cu microorganisme sau enzime. Identificarea potenialului de degradare cu microorgansime este prima etap de dezvoltare a procedeelor. Aceast activitate de decontaminare trebuie s poat fi transferat pe produsele contaminate cu micotoxine. Prin decontaminare biologic" se ntelege transformarea enzimatic a micotoxinei ntr-un compus mai puin toxic. Diluarea" nivelului de contaminare cu micotoxine, prin amestecarea unui lot sntos i un lot contaminat este o practic interzis n Europa (reglementat prin CE N466/2001) dar, nainte era totui o metod frecvent folosit. Degradarea ochratoxinei A prin metode biologice a fost pus n eviden n timpul procesului de insilozare. Ochratoxina A prezent n orz poate fi degradat de flora microbian existent. OTA poate fi degradat de asemenea de bacteriile prezente n rumenul vacilor, ceea ce face ca aceste animale s fie mult mai rezistente la micotoxine dect animalele monogastrice. Ochratoxina A este hidrolizata n ochratoxina i fenilalanina sau este esterificat n ochratoxina A. Eubacterium BBSH 797, bacterie izolat din rumen a fost caracterizat de Schtzmayr si col (2005) pentru potenialul sau de degradare a ochratoxinei A n -ochratoxina. Capacitatea de degradare a ochratoxinei A n -ochratoxina cu Acinobacter calcoaceticus, izolat de asemenea din rumen, a fost pus n eviden in vitro pe mediu sintetic la 25-30C (Hwang i Dranghen, 1994). Enzimele naturale au de asemenea capacitatea de a degrada ochratoxina A. Degradarea ochratoxinei A n diverse produse neidentificate, a fost pus n eviden n suspensii de celule de gru, orz sau porumb. Aceste transformri enzimatice cuprind reacii de hidroliz, de metilare care contribuie uneori la pierderea potenialului toxic al moleculelor ( Ruhland si col, 1994, 1996a i 1996b). O lipaz, izolat plecnd de la Aspergillus niger degradeaz ochratoxina A n ochratoxina (Stander si col. 2000). Alte activiti enzimatice ct i alte microorganisme au fost caracterizate pentru potenialul lor de degradare a ochratoxinei A. Ochratoxina este degradat de surse de Rhizopus stolonifer i Rhizopus microsporus cu o eficacitate care poate atinge 96% pe grul umed (Varga si col, 2005). Rhizopus stolonifer este un patogen ai plantelor care contamineaz dupa recoltare. 50121 50

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Speciile Rhizopus sunt principalele ciuperci izolate n zycomycose; cu toate acestea Rhizopus stolonifer, este rar menionat ca patogen uman. Se propune folosirea acestor surse pentru decontaminarea cerealelor. Caracterizarea potenialului de degradare ai ochratoxinei A de anumite microorganisme care aparin florei microbiene naturale a alimentului contaminat prezint un interes mult mai mare dect caracterizarea activitilor enzimatice. Sursele de mucegaiuri, izolate plecnd de la ciorchinele de strugure, sunt capabile se degradeze ochratoxina A pn la un nivel mai mare de 80% pe mediu sintetic. (Abrunhosa si col, 2002). Dou ci de degradare diferite au fost puse n eviden n funcie de specie, implicnd activitatea carboxipeptidazei, conducnd la transformarea ochratoxinei A n -ochratoxina. n plus, aceast capacitate de degradare a ochratoxinei A a fost identificat n sursele ochratoxicogene i n sursele netoxicogene. Aceste surse aparin florei microbiene naturale a strugurelui. Folosirea surselor netoxicogene pentru eliminarea ochratoxinei A din struguri poate fi luat n considerare. Bacteriile lactice i drojdiile intervin n procedeele de fermentaie agroalimentar, prezentant potenial pentru decontaminarea micotoxinelor din produsele alimentare (Shetty si Jespersen, 2005). Degradarea ochratoxinei A din lapte a fost pus n eviden de bacteriile din iaurt; Lactobacilius, Streptococcus si Bifidobacterium (Skrinjar si col, 1996). Sacharomyces cerevisiae, are capacitatea de a elimina ochratoxina A. Adsorbia micotoxinelor de drojdii a fost pus n eviden prin folosirea unui amestec de drojdii sterile i reziduuri ale fermentaiei berii: mecanismul dispariiei ochratoxinei A in vitro presupune adsorba micotoxinei pe peretele drojdiei (Grunkemerer, 1990). Eliminarea ochratoxinei cu ajutorul drojdiilor este superioar atunci cnd drojdiile folosite sunt moarte, atingnd aproximativ 90%. Acest lucru confirm ipoteza potrivit creia, eliminarea ochratoxinei A este rezultatul unui fenomen de adsorbie, n care, volumul de celul joac un rol n capacitatea de eliminare (Bejaouii si col, 2004). n plus, folosirea acestor drojdii vii, sau moarte, nu atrage modificri ale calitii vinului. Acest procedeu poate fi considerat ca fiind promotor pentru decontaminarea ochratoxinei A din vin. Fermentaia alcoolic cu Sacharomyces cerevisiae cu must contaminat cu desoxinivalenol i zearalenon a artat rezultate dup 7-9 zile de fermentare, desoxinivalenolul a fost stabil. Din coninutul iniial de zearalenon, 69% a fost convertit n 51121 51

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine -zearalenol, 8,1% n -zearalenol. Marea parte a metabolizrii zearalenonei s-a produs dup 1-2 zile de fermentaie. Folosirea fibrelor vegetale - capabile de a adsorbi imobilizarea micotoxinelor n tractul gastro-intestinal este de asemenea o metod biologic folosit la decontaminare. Activitile enzimatice au fost identificate pentru degradarea ochratoxinei dar punerea la punct ca procedee de decontaminare, rmne s fie rezolvat. Potenialul de degradare a micotoxinelor cu microorgansime prezent n mod natural n siloz sau n produsele alimentare, prezint un interes pentru a reduce expunerea animalului i omului la aceste toxine. Totui, la ora actual, nici un procedeu nu este pus la punct.

CAPITOLUL 4

Metode de determinare a micotoxinelor52121 52


4.1 Pregtirea preliminar a probelorMicotoxinele prezint un real pericol att pentru animale ct i pentru om, i este obligatoriu ca manipularea probelor s se fac cu grij i s se lucreze n condiii care s mpiedice contaminarea materialelor i a atmosferei. n plus, anumite mucegaiuri care produc aceste substane sunt ele nsui toxice: este exemplul lui Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus pentru care s-au diagnosticat trei tipuri de simptome la om: infecie, alergie i toxicoz. Infecia reprezint o invazie a esuturilor vii n timp ce alergia este o manifestare de hipersensibilitate la o antigen fungic. Toxicozele sunt maladii rezultate n urma expunerii, n general prin ingerare, prin inhalare sau prin contact direct, la micotoxine produse de mucegaiuri. Trebuie s se insiste asupra faptului c atmosfera este un bun vector de contaminare cu micotoxine. Securitatea trebuie sa fie maxim. Personalul din laborator trebuie s fie familiarizat cu reglementrile privind securitatea. Mai mult, un control medical al pesonalului este recomandat i trebuie s se realizeze un set complet de analize la snge. Gestionarea riscurilor de laborator trebuie s cuprind trei puncte: 1. identificarea sursei periculoase i a efectelor posibile asupra sntaii n cazul nefolosirii echipamentului adecvat;. 2. punerea la punct a metodelor de manipulare a toxinelor i microorganismelor; 3. nelegerea sensului responsabilitii pentru a permite aplicarea msurilor de securitate

Manipularea mucegaiurilor Culturile trebuie s fie pstrate n eprubete, plci Petri. Pentru manipularea eantioanelor se recomand s se lucreze n cabine securizate biologic. Pentru protecie, personalul trebuie s poarte n permanen sor, mnui i masc.

53121 53

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Manipularea produselor mucegite Produsele mucegite nu trebuie s fie manipulate niciodat fr mnui i analizele se vor face n aa fel nct s se evite pe ct posibil inhalarea particulelor toxice. Analiza eantioanelor test Securitatea manipulrii este foarte important n timpul acestei operaii. Este primordial minimizarea contaminrii atmosferice cu vapori toxici si particule de praf. Contactul direct cu toxinele pure sau n soluie trebuie s fie evitat prin folosirea echipamentului de pipetare mecanic. Toate suprafeele de lucru ca i echipamentele folosite n timpul extraciei trebuie s fie obligatoriu decontaminate dup utilizare. Hranirea animalelor cu alimente contaminate Cnd animalele de laborator sunt hrnite cu alimente care conin toxine trebuie s se poarte n orice moment echipamentul de protecie. Alimentele trebuie s fie corect etichetate i depozitate cu grij pentru a evita confuziile. Decontaminarea laboratorului Sticlria de laborator i suprafeele care au intrat n contact cu toxinele sunt splate cu NaClO 0,5%. Carcasele n care au fost inute animalele de laborator sunt incinerate.

4.1.1, Eantionarea Studii au artat c peste 90% din erorile de cuantificare a micotoxinelor se datoreaz eantionrii necorespunztoare; trebuie deci s ne asigurm c eantioanele prelevate pentru a fi analizate sunt reprezentative. Este important deci s se prezinte un plan de eantionare care s fac parte din reglementrile privind controlul contaminrii cu micotoxine. n ultimii ani, o atenie deosebit a fost 54121 54

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine acordat ameliorrii i asigurrii calitii analizelor fcute pentru identificarea

contaminanilor din produsele din alimentaia uman i animal. Pentru stabilirea normelor comerciale, contaminanii trebuie s fie corect identificai si cantitile determinate s fie sczute. Micotoxinele nu fac excepie de la aceste reguli i analiza lor prezint dificulti particulare n ceea ce privete obinerea eantioanelor reprezentative iar analiza trebuie s permit identificarea nivelurilor sczute de micotoxine (sub 500 ppm). Eantionarea constitue o etap crucial n determinarea coninutului de micotoxine dintr-un lot de produse alimentare. Deoarece cantitatea de micotoxin nu este proporional cu cantitatea de mucegaiuri prezent, sunt foarte rar distribuite uniform n eantion. Contrar metodelor analitice, sistemele de eantionare nu pot face obiectul ncercrilor interlaboratoriale i n general, un plan de eantionare este propus pe baza unui studiu statistic al repartiiei toxinelor msurate, apoi el este adoptat n mod oficial. Publicaia colectiv a UNDP si FAO a definit clar procedurile de eantionare pentru diferite micotoxine. Se ine cont de tipul produsului i de dimensiunea lotului. n fiecare caz, numrul minim de subeantioane prelevate este precizat, ca i dimensiunea unitar minim a fiecruia dintre ele. n plus, cantitatea subesantionului prelevat pentru analiz i modul n care este prelevat sunt specificate. Comisia europeana a editat o directiv n care se specific metodele analitice de eantionare pentru controlul oficial la nivelul anumitor contaminani n produsele alimentare. Procedura de eantionare poate fi rezumata intr-o secvena de apte etape, indicate n figura nr.10

Figura 10. Etapele eantionrii

Scopul eantionrii

Identificarea punctelor de eantionare 55121 55


Identificarea loturilor

Alegerea metodei de eantionare

Prelevarea eantioanelor

Prepararea eantionului

Condiionarea eantionului

nainte de toate, trebuie s se determine cu precizie scopul eantionrii si apoi se identific punctele de eantionare. Modul de eantionare difer n funcie de modul n care produsele sunt depozitate n vrac sau n ambalaje (saci, cutii metalice, butelii). Odat ce modul de condiionare a fost determinat, trebuie s se localizeze cu precizie, punctele de eantionare. A treia etap const n identificarea loturilor care trebuie s fie reprezentativ pentru sistemul analizat. Nu trebuie omis metoda de eantionare care trebuie s fie ct mai apropiat de analiza noastr, se disting trei tipuri de metode:

Eantionare uniform n acest caz, se preleveaz o cantitate mic de prob din fiecare porie. n acest tip de

eantionare, cantitatea prelevat este testat. Eantioanele trebuie sa fie deci reduse; aceast procedur este numit divizare i este realizat de un divizor care preleveaz o fraciune identic din fiecare eantion n parte.

Eantionare selectiv 56121 56

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Acest tip de eantionare presupune prelevarea prilor cele mai susceptibile a fi contaminate din lot. Aceast tehnic se aplic de exemplu n cazul unui lot de cereale unde investigaia se va face doar pe grnele care prezint un stadiu avansat de mucegire. Eantionare aleatorie Acest tip de eantionare se efectueaz n cazul n care e nevoie de multe eantioane, de calitate diferit, care provin dintr-un lot neuniform. La aceast tehnic, numrul eantioanelor, cantitile lor totale i perioada de prelevare nu sunt determinate nainte de eantionare. Eantionarea strict aleatorie este complicat, i se face apel la tehnicile complexe de prelevare aleatorie. Prelevarea eantionului reprezentativ pentru lot este urmtoarea etap a eantionrii. Cea de-a asea etap const n prepararea eantionului, mai bine spus, separarea eantionului de impuritile de dimensiuni mari pe care le conine. Ultima etap presupune condiionarea eantionului n vederea determinrilor. n mod frecvent, eantioanele reprezentative cntresc ntre 3 i douzeci kilograme. 4.1.1.1 Variante de eantionare, de pregtire a eantionului i analitice Se poate spune c etapa de eantionare este de obicei sursa cea mai mare de erori n secvena analitica, mai bine spus n secvena de eantionare, prepararea eantionului i analizei. Varianta( St ), exprimat de reprezentativitatea eantionului trebuie s fie ct se poate de sczut, sau cel mult egal cu suma variantelor de eantionare (Ss2), de preparare a eantionului (Ssp2) i de analiz (Sa2): St - Ss + SSp + Sa Determinarea acestor variante se poate face n manier empiric plecnd de la formule stabilite n prealabil. De exemplu, n cazul arahidelor, Whitaker i colaboratorii si au stabilit urmtoarele relaii: Ss2= (49,0546*MLU955 - 0,39 ML1,7867) /Ws Unde Ss este varianta eantionrii ML este concentraia n aflatoxin n lot n ppb Ws este masa de arahide n eantion in kg Ssp2= (0,978 MS1J867-0,0178 Ms1'9339)/Wsp Unde Ssp2 este varianta de preparare a eantionului 57121 572

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Ms este concentraia n aflatoxine n eantion n ppb Wsp este masa de arahide mcinat n subeantion n kg Sa2= (l/na)*(0,00482 MSS1J518) Unde Sa2 este varianta analitic pentru analiza HPLC na- este numrul de analize repetate Mss este concentraia de aflatoxin n subeantion n ppb. 4.1.1.2. Conceptul i evaluarea unui plan de eantionare Factorii urmtori sunt eseniali n stabilirea unui plan de eantionare: - tipul de marf - concentraia maxim n toxine permis n lot - concentraia maxim permis n eantion (concentraia critic) - dimensiunea eantionului - numrul subeantioanelor; - numrul eantioanelor; - metoda de obinere a eantionului; - metoda analitic;

Trebuie s se tie c exist dou tipuri de riscuri legate de planul de eantionare: riscul productorului (Producer Risk, PR), care este acela de a respinge un lot sigur, i cel al consumatorului (Consumer Risk, CR), care este acela de a accepta un lot contaminat. Dup determinarea prii relative a fiecruia dintre cele dou riscuri se poate construi o curb unic numit curba caracteristic de operare (Operating Characteristic curve, OC curve) care pe abscis are reprezentat probabilitatea [P(M)] c planul de eantionare s accepte un lot n funcie de concentraia n aflatoxina M n lot. Forma acestei curbe va fi influenat de urmtorii parametri: concentraia critic permis n eantion; mrimea eantionului; 58121 58

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine mrimea subeantionului i gradul de fragmentare; metoda analitic (tipul si numrul analizelor). Probabilitatea c un lot s fe acceptat se poate exprima astfel: P(M)=p(X

studiul efectelor de are a alimentelor cu micotoxine

Documents