60081561 studiul efectelor de are a alimentelor cu micotoxine

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

UNIVERSITATEA “DUNĂREA DE JOS” DIN GALAŢIFACULTATEA:ŞTIINŢA ŞI INGINERIA PRODUSELOR

ALIMENTARESPECIALIZARE :C.E.P.A

PROIECT DE DIPLOMĂ

STUDIUL EFECTELOR DE CONTAMINARE A ALIMENTELOR CU MICOTOXINE

Coordonator ştiinţific,Prof. dr. ing. Clemansa Tofan

2008

1


CUPRINS

Cuprins…………………………………………………………………………..1Justificarea alegerii temei de licenţă…………………………………………….5

Introducere……………………………………………………………………....6

Partea întâi - PARTEA DOCUMENTARĂ

Capitolul 1- Micotoxinele....................................................................................7

1.1 Ce sunt micotoxinele?..................................................................................7

1.2 Principalele tipuri de micotoxine de importanţă economică........................8

1.2.1 Aflatoxinele...........................................................................................9

1.2.2 Ochratoxina A.....................................................................................13

1.2.3 Patulina................................................................................................17

1.2.4 Zearalenonă.........................................................................................18

1.2.5 Fumonisinele.......................................................................................20

1.2.6 Tricotecinele........................................................................................21

1.3 Prezenţa micotoxinelor în diverse produse alimentare...............................24

Capitolul 2- Factori care influenţează producerea micotoxinelor.....................30

2.1 Biogeneza micotoxinelor............................................................................30

2.2 Formarea micotoxinelor..............................................................................32

2.3 Influenţa factorilor extrinseci asupra apariţiei micotoxinelor.....................34

2.3.1 Temperatura...........................................................................................34

2.3.2 Umiditatea..............................................................................................37

2.3.3 Tensiunea superficială...........................................................................39

2.3.4 Presiunea osmotică................................................................................39

2.3.5 Lumina...................................................................................................40

2.3.6 Integritatea fizică a boabelor şi a învelişului

produselor vegetale.............................................................................................40

2.4 Influenţa factorilor intrinseci asupra apariţiei micotoxinelor.....................41

2.4.1 Natura substratului................................................................................ 41

2


2.4.2 Influenţa pH-ului asupra dezvoltării mucegaiurilor..............................42

2.4.3 Nutrienţi minerali..................................................................................43

2.4.4 Potenţialul de oxido- reducere..............................................................46

2.4.5 Bacterii..................................................................................................47

2.4.6 Microflora..............................................................................................47

2.4.7 Insectele ................................................................................................48

2.5 Descrierea mucegaiurilor cu potenţial toxicogen……………...................49

2.5.1 Principalele genuri de mucegaiuri din industria alimentară…………..48

2.5.2 Caracterizarea principalelor specii de mucegaiuri

cu potenţial toxicogen……………………………………………………….....50

2.5.2.1 Aspergillus flavus…………………………………………………52

2.5.2.2 Aspergillus nidulans………………………………………………53

2.5.2.3 Aspergillus versicolor……………………………………………..54

2.5.2.4 Aspergillus candidus………………………………………............55

2.5.2.5 Aspergillus ochraceus………………………………………..........56

2.5.2.6 Aspergillus tereus…………………………………………............57

2.5.2.7 Aspergillus fumigatus……………………………………..............58

2.5.2.8 Fusarium graminearum…………………………………………....59

2.5.2.9 Penicilium expansum……………………………………………...60

2.5.2.10 Trichotecium roseum…………………………………………….61

Capitolul 3 - Metode de limitare şi reducere a conţinutului în micotoxine a

unor produse alimentare de origine vegetală......................................................62

3.1 Strategii preventive: limitarea contaminanţilor......................................62

3.1.1 Practici recomandate înaintea recoltării............................................66

3.1.2 Practici recomandate în timpul recoltării..........................................68

3.1.3 Practici privind uscarea cerealelor....................................................69

3.1.4 Practici recomandate la depozitarea cerealelor.................................70

3.1.5 Practici recomandate în timpul transportului produselor..................71

3


3.1.6 Evitarea pătrunderii insectelor, păsărilor şi rozătoarelor în timpul

transportului........................................................................................................71

3.2 Strategii curative: decontaminarea..........................................................71

3.2.1 Metode fizice.....................................................................................72

3.2.1.1 Eliminarea fracţiunilor alterate.................................................72

3.2.1.2 Denaturarea toxinelor...............................................................74

3.2.2 Denaturarea chimică..........................................................................75

3.2.3 Adsorbţia toxinelor............................................................................78

3.2.4 Metode biologice de decontaminare..................................................85

Capitolul 4 - Metode de determinare a micotoxinelor....................................88

4.1 Pregătirea preliminară a

probelor............................................................88

4.1.1 Eşantionarea......................................................................................90

4.2 Metode calitative.....................................................................................95

4.2.1 Metode imunologice.........................................................................96

4.2.1.1 Testele RIA…………...............................................................97

4.2.1.2 Testele ELISA...........................................................................97

4.2.2 Metode de imunoafinitate................................................................99

4.2.2.1 Minicoloanele...........................................................................99

4.2.2.2 Coloane de imunopurificare......................................................99

4.3 Metode cantitative................................................................................100

4.3.1 Teste kit..........................................................................................100

4.3.2 Cromatografie în strat subţire (TLC).............................................100

4.3.3 HPLC(high performance liquid chromatography-

cromatografie cu lichid de înaltă performanţă).................................................101

4


Partea a doua – PARTEA EXPERIMENTALĂ

1. Analiza microbiologică a cerealelor..........................................................103

1.1 Evaluarea calitativă.................................................................................103

2. Evidenţierea mucegaiurilor producătoare de aflatoxine............................106

3. Analiza calitativă a aflatoxinelor...............................................................108

3.1 Pregătire inocul......................................................................................108

3.2 Inoculare şi incubare..............................................................................109

3.3 Extracţie.................................................................................................109

Concluzii..........................................................................................................115Bibliografie......................................................................................................118

5


Justificarea alegerii temei de cercetare

Micotoxinele prezente în mod natural în diverse produse alimentare constituie o

problemă serioasă de siguranţă alimentară, mai ales în anumite regiuni ale globului în care

condiţiile climatice sau standardele din agricultură sunt precare. Există dovezi convingătoare

care arată o asociere între expunerea la aflatoxine şi cancerul primar de ficat. Micotoxinele

produc pagube importante şi în zootehnie. Organizaţia pentru Alimente şi Agricultură (FAO)

estimează că pe plan mondial până la 25 % din culturile alimentare sunt semnificativ

contaminate cu micotoxine. Cele mai importante micotoxine care prezintă riscuri

semnificative pentru sănătatea omului sunt sintetizate de mucegaiurile care cresc pe cereale,

în special porumb, dar şi grâu, orz, ovăz şi orez.

Consecinţele consumului de alimente contaminate cu aflatoxină asupra sănătăţii omului

sunt estimate indirect pe baza efectului observat la animale. Susceptibilitatea omului la

aflatoxină nu este foarte bine cunoscută datorită rarităţii cazurilor. Date cu privire la doza de

risc pentru oameni au fost obţinute cu ocazia unor intoxicaţii colective izbucnite, una în India

în 1974 în cursul căreia au fost afectate aproape 400 de persoane din care o treime au murit şi

alta în Kenia în 1982, unde au fost spitalizate 20 de persoane dintre care au decedat 12.

Investigaţiile din care aceste focare de aflatoxicoză au dus la concluzia că ele s-au datorat

ingestiei repetate a unei cantităţi de 38-55 micrograme de aflatoxină/kg corp mai multe zile la

rând. Cercetările făcute de veterinari americani, sugerează că unii aditivi alimentari cum este

BHT (butil-hidroxitoluen, sau E 321) ar putea fi folosiţi în viitor ca măsură de protecţie faţă

de efectele nedorite ale alimentelor contaminate cu aflatoxină. Vivacitatea şi viteza de

răspândire în condiţiile naturale este uimitoare. De exemplu: dintr-un spor de Penicillium

aflat pe un mediu nutritiv, must de malţ cu agar, după a doua zi de la germinarea acestuia s-au

format 100.000 spori şi în următoarele 24 ore încă 2· spori. Pe un bob de grâu mucegăit cu

Penicillium verrucosum var. Cyclopium s-au numărat 25 milioane spori. O portocală

mucegăită este purtătoare a aproximativ 15 miliarde de spori.

6


INTRODUCERE

Dintotdeauna consumatorul a fost preocupat ca alimentele puse la dispoziţia lui să fie

sigure din punct de vedere igienico-sanitar, să nu îi provoace îmbolnăviri.

Astăzi, această cerinţă a devenit tot mai insistentă, întrucât consumul de alimente

pregătite pe scara industrială a crescut foarte mult şi deoarece, tot mai des, consumatorul află

că alimentele sunt cauza multor îmbolnăviri, uneori a unor decese, consumatorul este aşadar

vizat că nu în toate cazurile, alimentele consumate sunt de o calitate igienico-sanitară

corespunzatoare.

Contaminarea produselor cu mucegaiuri, ridică aspecte importante legate de pierderea

inocuităţii alimentului.

Atenţia deosebită acordată mucegaiurilor este datorată caracteristicilor anumitor specii

de fungi de a elabora şi elibera în aliment metaboliţi secundari numiţi micotoxine, care au o

structură chimică mai mult sau mai puţin cunoscută, dar şi capacitatea dovedită de a modifica

structuri normal biologice. Micotoxinele, ca metaboliţi ai anumitor tipuri de mucegaiuri au

astfel efecte nocive atât asupra sănătaţii omului, cât şi asupra animalului care consumă

alimente contaminate cu acestea.

Evoluţia tehnicilor de recoltare şi transformare a produselor agricole, transportul

alimentelor pe distanţe lungi şi prezentarea consumatorilor prin stocarea prelungită constituie

condiţii care dacă sunt realizate necorespunzător, devin favorabile dezvoltării

microorganismelor nedorite şi în particular, a mucegaiurilor.

Micotoxinele sunt metaboliţi ai mucegaiurilor cu o structură chimică mai mult sau mai

puţin cunoscută care au capacitatea de a modifica structuri biologice anormale, cu efecte

degradante atât la om,cât şi la animale. Aceste toxine pot fi conţinute în sporii de mucegai

sau de cele mai multe ori eliminate în substratul de creştere (aliment).

Oamenii de ştiinţă le-au descoperit la începutul anilor 1960 odată cu izbucnirea bolii

curcanilor x din Anglia. Aproape 100.000 de curcani au fost ucişi deoarece alunele pe care

le-au consumat erau contaminate cu Aspergillus flavus, un mucegai ce produce micotoxine.

7


PARTEA DOCUMENTARĂ

CAPITOLUL 1

Micotoxinele

1.1 Ce sunt micotoxinele?

Termenul de micotoxină vine de la cuvântul grecesc “mycos” care inseamnă “ciupercă” şi

de la cuvântul latin “toxicum” care înseamnă otravă. Ele desemnează metaboliţi secundari

secretaţi de mucegaiurile care aparţin în principal genurilor Aspergillus, Penicillium şi

Fusarium, prezente în mod natural în aerul ambient, pe pământ şi pe culturi.

Micotoxinele sunt considerate ca fiind parte din contaminanţi alimentari cei mai

semnificativi în ceea ce priveşte impactul asupra sănătăţii publice, securităţii alimentare şi

asupra economiei a numeroaselor ţări. Ele se găsesc pe o mare varietate de produse

alimentare înainte, în timpul şi după recoltă. Afectează numeroase produse agricole, anume

cereale, fructele, nucile, boabele de cafea, orezul şi plantele oleaginoase, care sunt substraturi

foarte sensibile la contaminarea cu mucegaiuri şi la producerea de micotoxine. Contaminarea

produselor de către micotoxine se realizează în cazul când întrunesc condiţiile de mediu pe

câmp pentru apariţia lor, precum şi procedee neadecvate de recoltare, de stocare şi de

transformare atunci când sunt cumulate. Prin diversitatea efectelor lor toxice şi a propietăţilor

lor sinergice, micotoxinele prezintă un risc pentru consumatorul alimentelor contaminate.

Tabel 1. Specii fungice producătoare de micotoxine

Micotoxine MucegaiuriAflatoxina B1, B2,G1,G2 Aspergillus parasiticus,Aspergillus

flavusOchratoxina A, B, C Aspergillus ochraceus,Aspergillus

carbonarius, Penicillium verrucosum Zearalenonă Fusarium roseum, Fusarium sp.Desoxinivalenol, Fusarenonă,Toxina T2

Fusarium tricinatum, Fusarium sp.

Fumonisine F. moniliforme, F. proliferatum, Fusarium sp.

Citrinina P. citrinumPatulina P. patulumAcidul penicilic A. ochraceus, A. CyclopiumMoniliformina A. proliferatum

8


1.2 Principalele tipuri de micotoxine de importanţă economică

Un consum de alimente contaminate cu anumite tipuri de mucegaiuri poate provoca la om

şi la animal, efecte nefavorabile pentru sănătate, de la apariţia unor forme de “hepatite

exudative”, până în prezent la consumatorii cronici a unor hepatoame (cancer hepatic).

Majoritatea micotoxinelor au capacitate cancerigenă.

Mecanismul cancerigen al acestora se manifestă prin capacitatea lor de a se fixa pe ADN, cu

producerea de alterări la acest nivel şi cu determinarea de schimbări, sub formă de mutaţii.

Din gama mare de micotoxine atenţia este îndreptată spre aflatoxine, ochratoxine,

sterigmatocistine, patulina.

Micotoxinele pot avea asupra organismului uman şi animal o serie de efecte negative

(fig. 1).

Fig. 1. Efecte toxice asociate micotoxinelor

9


1.2.1. Aflatoxine

După accidentele observate în 1960 în crescătoriile de curci (100.000 păsări moarte),

numeroase cercetări au fost conduse spre un grup de molecule cu înalte proprietaţi toxice:

aflatoxinele. Aflatoxinele constituie un grup de 18 compuşi cu structuri apropiate unde 4

compuşi au forme foarte frecvent întâlnite în alimente: B1, B2, G1 si G2.

Din punct de vedere chimic, aflatoxinele sunt un ansamblu dintre o cumarină şi trei

furani (figura 2). Sunt molecule cu masă moleculară mică (312 - 330 g/mol), foarte puţin

solubile. Sunt solubile în apă, insolubile în solvenţi nepolari. Foarte solubile în solvenţi

organici (cloroform şi alcool metilic), fiind uşor de extras. La lumina ultravioletă, sunt

fluorescente (albastru pentru AFB, verde pentru AFG, AFM1 prezintă o fluorescenţă

albastru-mov).

Fig. 2 Structura chimică a aflatoxinelor

10


Sunt micotoxine produse de mucegaiuri din genul Aspergillus: Aspergillus flavus şi

Aspergillus parasiticus, mucegaiuri prezente în multe locuri şi sunt puţin exigente la creştere:

temperatura cuprinsă între 6 si 50˚C, sursa de carbon şi azot şi o valoare a aw mai mare de

80%. Din acest motiv, numeroase produse alimentare destinate consumului pot conţine

aflatoxine în cantităţi uneori importante: alune, porumb, grâu, fistic, cacao, cafea, manioc,

soia. Metabolizate de diverse enzime microzomiale, aflatoxinele sunt eliminate sub formă de

glucorani pe cale urinară, prin lapte sau bilă, dar pot apărea anumiţi derivaţi epoxidici. Fiind

electrofile, ele reacţionează la grupuri nucleofile de ADN sau de proteine. Microzomii

hepatici, conţin enzime cu înaltă activitate, capabile să oxideze numeroase substraturi

lipofile. Aceste reacţii necesită prezenţa oxigenului şi a NADPH (redus). Un atom de oxigen

este fixat pe substrat şi altul este redus în apă (NADP este oxidat). Astfel, aflatoxinele sunt

toxice pentru numeroase organisme vegetale şi animale procariote şi eucariote (alge,

ciuperci, bacterii).

Aflatoxinele au de asemenea un efect puternic teratogen şi pot provoca moartea în

câteva ore sau câteva zile , în funcţie de cantitatea de micotoxină şi sensibiltatea animalului.

Aflatoxinele au pe de altă parte un rol asupra fosforilărilor şi lipogenezei. În

concluzie, aflatoxinele sunt recunoscute ca fiind cei mai cancerigeni compuşi naturali, şi este

posibil să se obţină o relaţie liniară între incidenţa cancerului primitiv de ficat şi logaritmul

procentului de aflatoxină ingerată. Intoxicaţia acută cu aflatoxină se traduce prin moarte şi în

general cu simptome de depresie, anorexie, diaree, icter sau anemie. Mai presus de orice,

leziunile hepatice (necrozele şi cirozele) evoluează în final cu hepatome sau carcinome.

Formele cronice ale aflatoxicozelor se traduc printr-o scădere a performanţelor de creştere a

animalelor, anemie, icter lejer şi o evoluţie canceroasă în final. O doză de 0.2μg/kg timp de

470 zile declanşează un hematom la şoareci.

11


Mecanismul acţiunii aflatoxinelor: Aflatoxina B1 pătrunde în celulă şi este fie

metabolizată de monooxigenază în reticulul endoplasmatic obţinîndu-se produşi metabolici

hidroxilaţi care sunt ulterior metabolizaţi la glucuronid şi conjugaţi sulfuraţi; fie este oxidată

obţinându-se epoxidul reactiv care este hidrolizat spontan şi se poate lega de proteine

devenind citotoxic. Epoxidul poate reacţiona cu ADN-ul sau cu proteinele, sau poate fi

transformat de o glutationă, S-transferaza la (GSH) – conjugat.

Datorită efectelor negative asupra organismului animal şi uman, limitele maxime

admise de aflatoxine în produsele alimentare sunt cuprinse între 0.05-15 (μg/kg) (tabel 2).

Aflatoxina M1În 1963 s-a demonstrat că la vite, aflatoxina B1 este absorbită cu hrana contaminată,

este metabolizată într-un derivat numit aflatoxina M1 care este regăsit în lapte. 0.5-4% de

aflatoxină B1 ingerată se regăsesc sub formă de aflatoxina M1 în lapte. Această micotoxină

păstrează , la o treaptă inferioară, importantele proprietăţi cancerigene ale aflatoxinei B1.

Astfel, efectul cumulativ legat cu ingerarea regulată a acestor toxine, face să se expună la

mari riscuri copii şi sugarii, marii consumatori de lapte şi produse lactate. Aceste riscuri sunt

cu atât mai importante deoarece aflatoxina M1 rezistă la tratamentele uzuale de conservare şi

procesare a produselor lactate. Aflatoxina M1 se regăseşte în totalitate în laptele smântânit şi

în produsele lactate (iaurt, brânză), se regăseşte foarte puţin în unt. Aceasta este legată de

prezenţa interacţiunilor hidrofobe între aflatoxina M1 şi cazeină.

12


Tabel 2. Aflatoxine - limitele maxime admise

Produs Nivelul maxim de aflatoxina(μg/kg)B1 B1+B2+G1+G2 M1

AflatoxineArahide, nuci şi fructe uscate Arahidele, nucile şi fructele uscate şi produsele procesate din acestea, destinate consumului direct sau folosite ca ingredient alimentar

2.0 4.0 -

Arahidele supuse sortării sau altui tratament fizic,înainte de a fi consumate de către om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar

8.0 15.0 -

Nucile şi fructele uscate supuse sortării sau altui tratament fizic, înainte de a fi consumate de catre om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar

5.0 10.0 -

Cereale (inclusiv hrişca, Fagopyrum sp)Cereale (inclusiv hrişca) şi produsele procesate din acestea destinate consumului uman direct sau folosite ca ingredient alimentar

2.0 4.0 -

Cereale (inclusiv hrişca) cu excepţia porumbului, destinate sortării sau altui tratament fizic, înainte de consumul de către om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar

2.0 4.0 -

Porumbul destinat sortării sau altui tratament fizic, înainte de a fi consumat de către om sau de a fi folosit ca ingredient alimentar

5.0 10.0 -

Lapte (lapte batut, lapte pentru fabricarea produselor pe bază de lapte şi laptele tratat prin căldura, aşa cum este definit prin legislatia sanitara veterinara in vigoare

- - 0.05

Urmatoarele specii de condimente:- Capsicum spp. (fructele uscate ale acestuia, intregi sau macinate, inclusiv chilli, pudra de chilli, cayennesi paprika)- Piper spp.(fructele acestuia, inclusiv piper alb sau negru)- Myristica fragrans (nucşoara)- Zingiber officinale (ghimbir)- Curcuma longa (turmeric)

5.0 10.0 -

Alimentele pentru copii şi alimentele pe bază de cereale procesate, pentru sugari şi copii de vârstâ micâ

0.10 - -

Formulele pentru sugari şi formulele în continuare inclusiv laptele pentru sugari şi laptele în continuare

- - 0.025

Alimente cu destinaţie nutriţională specială destinate în special sugarilor

0.10 - 0.025

13


1.2.2. Ochratoxina A

Ochratoxina A a fost izolată pentru prima dată în 1965, de un grup de cercetători sud

africani. Din punct de vedere chimic este o moleculă de 3-metil-5 cloro-8 hidroxi-3,4

dehidroizocumarina, legată prin legatură peptidică, la nivelul grupărilor carboxil în C7, cu o

grupare aminică a L-β fenilalanina (figura 3).

Există şi alte ochratoxine ca ochratoxina B, care este derivat al ochratoxinei A şi

ochratoxina C – ester etilic. Aceste diferenţe de structură, au efecte marcante asupra

potenţialului toxic. Ochratoxina A este micotoxina cea mai toxică şi cea mai răspândită.

Ochratoxina A are o masă moleculară de 403,8 g/mol, cu un punct de topire la 90ºC,

când se cristalizează în xilen. Spectrul de adsorbţie UV variază cu pH-ul şi polaritatea

solvantului. Ochratoxina A posedă un maxim de adsorbţie de 333 nm, cu un coeficient de

extincţie molară de 5500 ml cm în metanol.

Este o micotoxină toxică, o doză de 2 ppm este suficientă pentru a opri creşterea animalului.

Este un contaminant frecvent al cerealelor, al cafelei, nucilor, fructelor uscate, piperului.

Ochratoxina A este un metabolit secundar, elaborat de diferite mucegaiuri din genurile

Aspergillus şi Penicillium. Producţia de ochratoxina A este legată de temperatura, umiditatea

mediului ambiant şi conţinutul de apă al suportului contaminant. Valorile minimale ale

umidităţii pentru producţia de ochratoxină oscilează între 0,83 şi 0,90, în funcţie de

mucegaiul studiat. Temperatura optimă pentru producţia de ochratoxină de către Aspergillus

ochraceus este de 28ºC, sinteza poate avea loc la temperaturi cuprinse între 15º si 37 ºC.

Penicillium veridicatum însă creşte într-o gamă de temperaturi care variază între 4º si 30ºC în

prezenţa unei umidităţi de 22%. În regiunile reci, ochratoxina este produsă de mucegaiuri din

14


genul Penicillium, iar în regiunile calde , ochratoxina este sintetizată de mucegaiuri din genul

Aspergillus .

Producţia de ochratoxină A este legată de psihologia proprie a fiecărei specii de mucegai şi

de parametrii ecologici.

În Europa şi Canada, Penicilium verrucosum este considerat ca fiind principalul mucegai

producător de ochratoxina A în cereale, formându-se în general pe alimente acide.

Concentraţiile de ochratoxina A, regăsite în alimente sunt foarte variate, şi sunt cuprinse între

câteva ng/kg până la multe zeci de mg/kg.

Mucegaiurile producătoare de ochratoxina A pot produce şi alte toxine sau pot cu alte

mucegaiuri să producă toxine diferite ca citrinina sau aflatoxine. Un fenomen de sinergism cu

ochratoxina A se poate deci produce şi poate complica analiza efectelor toxice, ceea ce nu

poate fi atribuit exclusiv ochratoxinei A.

Prezenţa ochratoxinei A în alimente prezintă un pericol pentru sănătatea umană şi

animală.

Ochratoxina A, odată ingerată este absorbită parţial la nivelul stomacului prin difuzia

pasivă a formei neionizate. Totuşi, acest mecanism pasiv nu contribuie decât la absorbţia

scăzută a ochratoxinei A.

Principala cale de absorbţie este nivelul intestinal. Procentul de absorbţie al

ochratoxinei A la nivel intestinal este de 66, 56, 56 si 40% la porc, şobolan, iepure şi pui.

Este apoi distribuită la diferite organe. Urmează apoi ciclul enterohepatic. Se pot întâlni

cantităţi mici de ochratoxina A liberă în sânge. Ochratoxina A are o mare afinitate pentru

15


anumite proteine plasmatice de care este fixată (aproximativ 90%). Se fixează pe albumina

serică şi pe o macromoleculă serică neidentificată cu masa moleculară de 20KDa.

Fixarea ochratoxinei de aceste proteine este un fenomen saturat. Mecanismul prin care

ochratoxina A se leagă de proteine este puţin cunoscut. S-a arătat că ochratoxina A sub forma

de di-anion, este legată la nivelul a două poziţii de fixare pe albumina serică. Aceste poziţii

de fixare aparţin subunităţilor II A si II B a albuminei serice. S-a arătat de asemenea că aceste

legături pot fi deplasate prin legături anionice, ca aspartamul, fenilalanina şi anti-inflamatorii.

Această fixare întârzie transportul ochratoxinei, la nivelul diferitelor organe, şi contribuie la

dezvoltarea efectelor cronice şi toxice ale acestei toxine.

Profilul toxicogenic al ochratoxinei A variază foarte mult în funcţie de specie. La om,

calea de eliminare a ochratoxinei este încă foarte lungă, şi a fost estimată la o lună. Pe de altă

parte, eliminarea ochratoxinei A a fost descompusă în două faze: una rapidă cu o trecere a

OTA în sânge de 20 ore, şi una secundă, mult mai lentă, unde trecerea OTA în sange este de

25,5 zile. OTA este distribuită la organe, unde este metabolizată în vederea eliminării sale.

EFECTE PATOGENICE/TOXICE-OTA

Mecanismul de acţiune ipotetic al ochratoxinei A: Ochratoxina A (OTA) este transportată în

celulă prin intermediul transportorilor organici anionici multispecifici. Structura chimică a

OTA conţine o grupare izocumarinică legată de fenilalanina (PHE). Multe studii au

demonstrat faptul că OTA poate altera procesele care implică fenilalanina şi multe dintre

efectele biologice ale OTA pot fi prevenite parţial prin suplimentarea cu fenilalanina sau

substanţe analoage.

16


Datorită efectelor negative pe care le are ochratoxina A asupra sănătăţii omului şi

animalului, limitele maxime admise în produsele alimentare sunt cuprinse între 2 – 10 ppb

(tabel 3).

Tabel 3. Limite maxime admise pentru ochratoxina AProdusul Nivelul maxim

(μg/kg sau ppb)Ochratoxina A Cereale (inclusiv orez si hrisca) şi produse cerealiere derivateCereale brute (inclusiv orez si hrisca brute) 5.0Toate produsele derivate din cereale (inclusiv produse cerealiere procesate si boabe de cereale destinate consumului uman direct)

3.0

Stafide uscate 10.0 Cafea crudă prăjită şi cafea prăjită şi măcinată cu excepţia cafelei solubile Cafea solubila (cafea instant)

5.0

10.0 Vin (vin rosu, alb roze) şi alte tipuri de vin si/sau bauturi racoritoare pe baza de must de struguri

2.0

Suc de struguri, suc de struguri ca ingredient în alte băuturi răcoritoare, inclusiv nectarul de struguri şi sucul de struguri concentrat aşa cum este reconstituit

2.0

Must de struguri şi must de struguri concentrat destinat consumului uman direct

2.0

Alimente pentru copii şi alimente pe bază de cereale procesate pentru sugari şi copii de vârstă mică

0.50

Alimente cu destinaţie nutriţională specială destinate în special 0.50

17

Ochratoxina ACH 2 N

H

CH

CO 2HO

C

OH

O

O

CH 3

ClH H

H Legare de proteine

plasmatice

ADN aduct

Afectarea proceselor care implica metabolismul fenilalaninei (PHE)

Inhibarea sintezei proteice

Inhibarea enzimelor folosind PHE ca si

substrat

Legare de proteine citosolice si organelare


sugarilor Cafea verde, fructe uscate altele decat stafidele, cacao şi produsele din cacao, vinurile licoroase, produsele din carne, condimentele şi lemnul dulce (Glycyrrhiza glabra)

-

1.2.3. Patulina

Este o γ lactonă nesaturată, produsă de numeroase mucegaiuri, dar cel mai frecvent

de Aspergillus clavatus, o ciupercă a microflorei granelor, Penicillium expansum, agent de

mucegăire a merelor în depozite şi Bassochlamys nivea şi Bassochlamys fulva prezente sub

forma lor imperfectă.

În alimentaţia animală, este o micotoxină foarte frecventă în furajele depozitate ude

şi în cerealele cultivate în sladarii.

Este folosită de asemenea în farmacii ca antibiotic pentru a lupta împotriva

stafilococilor, însă toxicitatea sa a dus la abandonarea acestei întrebuinţări.

Efectele patulinei se manifestă prin leziuni congestive la nivelul plămânilor, rinichilor

şi splinei, dar poate provoca o degenerescenţă de neuroni în cortexul cerebral, putând rezulta

diferite simptome nervoase (paralizii, etc.). Poate avea efecte toxice asupra globulelor albe

(leucocite), cât şi proprietăţi cancerigene.

Potrivit Monitorului oficial al României din 26 noiembrie 2006 limita maximă

admisă pentru conţinutul de patulină este de 10 μg/kg. (tabel 4).

Tabel 4. Limite maxime admise pentru conţinutul de patulină

18


Produsul Nivelul maxim(μg/kg sau ppb)

PatulinaSuc de fructe şi nectar de fructe, în special suc de mere şi sucurile de fructe ca ingrediente pentru alte băuturi;Suc de fructe concentrat după reconstituirea conform instrucţiunilor producătorilor

50.0

Băuturi spirtoase, cidru şi alte băuturi fermentate derivate din mere sau conţinând suc de mere

50.0

Produsele solide de mere, inclusiv compot de mere, piure de mere destinat consumului direct

25.0

Suc de mere şi produse solide din mere, inclusiv compot de mere şi piure de mere pentru sugari şi copii de vârstă mică şi etichetate şi comercializate ca destinate sugarilor si copiilor de vârstă mică.Alte alimente pentru copii altele decât cele pe bază de cereale procesate

10.0

1.2.4. Zearalenonă

Poate fi produsă de diferite specii de Fusarium: Fusarium culmorum, Fusarium

graminearum şi Fusarium Crookwellense. Este un compus cristalin, de culoare albă.

A fost numită iniţial toxina F2. Condiţiile optime pentru a se produce sunt umiditate

ridicată şi temperatură scăzută.

Fig. 5. Structura chimica a zearalenonei

19


Se prezintă ca o lactonă nesaturată a acidului β exorcilic (figura. 5). Este termostabilă

şi rezistă la o depozitare prelungită. Prin hidrogenare, se reduce funcţia cetonică în alcool

astfel încât se obţin izomerii zearalenonei: izomerul α este folosit ca stimulent de creştere

pentru ovine. Nu are efecte toxice cronice. Porcul este animalul cel mai sensibil.

Contaminarea fungică intervine pe câmp, porumbul prezentând un mucegai roşu. Dar

producţia de toxine se realizează în principal în timpul depozitarii. Nu prezintă efecte toxice

cronice.

Limita maximă admisă pentru conţinutul de zearalenonă este de 20 μg/kg (tabel 6).

Tabel 5. Limite maxime admise pentru conţinutul de zearalenonă


ZearalenonaCereale neprocesate altele decât porumbul 100Porumbul neprocesat -Făina de cereale cu excepţia făinii de porumb 75

Făina de porumb, pudăa de porumb, srot şi ulei rafinat de porumb -Pâine, produse de patiserie, biscuitiBatoane de porumb şi cereale pentru micul dejun pe bază de porumbBatoane din alte cereale si cereale pentru micul dejun altele decât cele pe bază de porumb

50-

50

Alimente pe baza de porumb procesat pentru sugari şi copii de vârsta micăAlimente pe bază de alte tipuri de cereale pentru sugari şi copii de vârsta mică

-20

EFECTE PATOGENICE/TOXICE-ZEARALENONA

Mecanismul de acţiune al zearalenonei: Zearalenona (Z), asemenea poliestrogenilor (PE) şi

al estrogenilor din mediu (AE), traversează pasiv membrana celulară şi se leagă de receptorii

estrogeni. Complexul receptor -Z ajunge în nucleu foarte rapid unde se leagă de receptori

nucleari specifici şi generează raspunsuri estrogene prin activarea genelor: acest lucru are ca

rezultat producerea de ARN mitocondrial (mARN) care codifică în mod normal producerea

de proteine care apar în mod normal prin legarea de receptorii estrogeni.

20


1.2.5. Fumonisinele

Sunt produse de diferite specii de Fusarium, în special de Fusarium moniliforme.

Cele mai toxice fumonisine sunt fumonisina B1 şi fumonisina B2. Se găsesc în principal în

porumb şi produsele pe bază de porumb. Are o structură liniară din 20 atomi de carbon cu

grupări metil, hidroxil şi doi substituienţi cu masa mai mare (figura 6).

Au de asemenea o funcţie aminică primară care ii conferă o reactivitate interesantă şi

o solubilitate în mediu apos. Sunt hepatotoxice, nefrotoxice. Se găsesc de obicei în porumb,

dar şi în orez, mirodenii, bere.

Fig. 6. Structura chimică a fumonisinelor

21

Receptorestrogen

Z

mARN

ZZ

PA PE

Complex ribozomal mARN

Proteina indusă hormonal


EFECTE PATOGENICE/TOXICE-FUMONISINE

Consecinţe: cantitatea crescută de sfinganină a produs moartea celulei; cantitatea scăzută de

ceramidă a produs moartea celulei; a alterat semnalele transmise prin căile mediate de bază

sfingoid 1-fosfat; a alterat funcţionarea în procesele modulate de lipide, sfingomielina şi

glicosfingolipide; se observă niveluri crescute de baze sfingoide 1-fosfat în ser şi în urină.

1.2.6. Trichotecinele

Au fost asociate încă de la începutul secolului cu consumul de “ cereale ameţitoare”

(de fapt mucegăite) în Siberia, având ca simptome greaţă, vărsături, ameţeli şi tulburări

vizuale. După descoperirea lor în anul 1974, s-a putut constata că sunt responsabile de

“Aleucie Toxică Alimentară” ( descreşterea numărului de globule albe), ca o consecinţă a

consumului de cereale mucegăite. În plus s-a văzut că tricotecinele sunt capabile să inducă

reacţii chimice cu irigaţii severe, inflamaţii, descuamări ale pielii în contact cu micotoxina.

Sub acest nume, sunt cunoscute mai mult de 75 de micotoxine, produse de Fusarium, dar şi

de Tricothecium, Mycothecium.

Toxicitatea poate fi folosită ca armă clinică dar se poate folosi şi în chimioterapii

datorită efectelor benefice.

Sunt grupate în tricotecine de tip A ( Toxina T-2 si HT-2) şi de tip B (desoxinivalenolul,

nivalenolul). Sunt formate dintr-un nucleu 12, 13 epoxitricotecine, format din patru cicluri

sixterpenice cu o dublă legătură şi un epoxid stabil. Cei cinci substituienţi care pot fi inseraţi

pe acest nucleu formează 148 compuşi cunoscuţi, grupaţi în patru grupe.

22


Grupele A şi B sunt cele mai frecvente, şi sunt caracterizate prin prezenţa sau nu a unei

funcţii atomice în poziţia C8. Au o mare stabilitate şi rezistă atât la tratamente termice cât şi

alcaline. Toxicitatea este legată de numărul radicalilor substituiţi în nucleul central. Nu se

acumulează în organism, sunt eliminate prin fecale şi urină.

Toxina T-2 este produsă de numeroase specii de Fusarium, în special de Fusarium

tricinctum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium solani şi Fusarium equiseti .

- formula brută : C24H34O9,

- masa moleculară : 466,50 g/mol,

- solubila în solvenţi organici polari ca acetona sau acetonitrilul ;

- stabila în solvenţi ca acetatul de etil.

Toxina HT-2, este produsă de numeroase specii de Fusarium, în special de Fusarium

sporotrichioides şi Fusarium poae :

- formula brută : C22H32O8,


- solubilă în solvenţi organici polari,

- stabilă în diferiţi solventi ca acetatul de etil.

Desoxinivalenolul (DON), trichotecina cea mai răspândita în lume şi este produsă de

F. graminearum şi F. culmorum :

- formulă brută : C15H20O6,


- solubil în etanol, metanol, acetat de etil şi apă,

- stabil în acetat de etil la -18 °C.

Dintre trichotecine, cea mai frecvent întălnită este desoxinivalenolu. Limita maximă

admisă conform Monitorului oficial al României din 26 noiembrie 2006 este de 200ppb

(tabel 6).

23


Tabel 6. Limite maxime admise pentru conţinutul de desoxinivalenol


Desoxinivalenol (DON)Cereale neprocesate altele decât grâul dur, ovăz şi porumb 1250Grâul dur şi ovăzul 1750Porumb neprocesat -Făina de cereale, inclusiv făina de porumb 750Pâine, produse de patiserie, biscuiţi, batoane de cereale şi cereale pentru micul dejun

500

Paste fainoase (uscate) 750Alimente pentru copii şi alimente pe baza de cereale procesate pentru sugari şi copii de vârstă mică

200

Modul de acţiune la nivel molecular al DON şi al altor tricotecene: DON pătrunde în

celulă prin difuzie şi se leagă de ribozomii activi care transmit un semnal la proteinkinazele

activate de ARN (PKR) şi la hematopoetokinaza celulară (HCK). Are loc fosforilarea

protein-kinazelor activate (MAPKS) şi se obţine activarea factorului de transcripţie având ca

rezultat efectele cronice şi imunotoxice.

EFECTE PATOGENICE/TOXICE-TRICHOTECINE

24


1.3 Prezenţa micotoxinelor în diverse produse alimentare

Micotoxinele în cereale

Practica a demonstrat faptul că, la depozitarea cerealelor, a produselor de măciniş şi

panificaţie apare în anumite condiţii o microfloră care favorizează creşterea mucegaiurilor şi

producerea de micotoxine. Mucegaiurile existente în depozitele de cereale se înmulţesc când

umiditatea relativă a aerului se situează între 80-85 %, iar temperatura ajunge la peste 26º C.

Produsele atacate la rândul lor devin sursa de infecţie, acumulând toxine. Aflatoxinele au fost

puse în evidenţă în pâine, produse de panificaţie, crupe de porumb şi în unele tipuri de pâine

dietetică. În cereale pe lângă ochratoxina A s-a pus în evidenţă şi alţi metaboliţi toxici ai

fungilor, cei mai mulţi din genurile Aspergillus şi Penicillium, care trec şi în produsele de

măciniş, concentraţiile cele mai mari înregistrându-se în tărâţe. Şi în făina depozitată în

condiţii de umiditate ridicată pot apărea fungi care produc micotoxine (Fusarium, Mucor,

Penicillium, Aspergillus).

Porumbul recoltându-se la o umiditate ridicată poate favoriza apariţia mucegaiurilor

(Aspergillus flavus) chiar încă din câmp.

Orezul poate fi contaminat cu micotoxine, inclusiv aflatoxine, dar prin autoclavare

aflatoxinele sunt inactivate. Micotoxinele din produsele de măciniş pot trece în pâine numai

când se folosesc materii prime puternic contaminate. Este de remarcat faptul că fermentarea

aluatului reduce în mică măsură cantitatea de aflatoxine, coacerea nu are nici un efect asupra

lor, dar adaosul în aluat de substanţe oxidante ( tipul bromaţilor) pot determina reduceri

importante în aflatoxine. Cercetările efectuate au scos în evidenţă că pentru inhibarea

dezvoltării microorganismelor în pâine se pot folosi diverşi fungistatici ca: acidul sorbic şi

palmitatul de sorboil. Pâinea de secară cu aciditate între 8.8-9.7 grade de aciditate, nu permite

aciditatea, formarea ochratoxinelor, iar pe cea de grâu se dezvoltă cantităţi mici din toate cele

4 tulpini izolate.

Micotoxinele în seminţe oleaginoase şi în ulei

Şi seminţele oleaginoase (arahidele etc.) pot fi atacate de mucegaiuri (inclusiv Aspergillus

flavus) care dau naştere aflatoxinelor; momentele critice fiind recoltarea şi depozitarea,

condiţii de climă, de păstrare etc.

25


Umiditatea arahidelor (apa) în perioade ploioase poate ajunge la 30%; recomandându-se

uscarea imediată a acestora pentru a preveni contaminarea cu aflatoxine. La obţinerea uleiului

prin presare cantitatea mare de micotoxine rămâne în turte, numai 5% trece în ulei, respectiv

aflatoxinele din ulei reprezintă 10% din cantitatea existentă în boabe, ceea ce nu reprezintă un

pericol mare. Prin prăjire la arahide se reduce conţinutul de substanţe toxice.

Floarea soarelui respectiv seminţele sunt şi ele mediu bun pentru dezvoltarea aflatoxinelor.

Uleiul din seminţe de floarea soarelui, conţine cantităţi mici de aflatoxine, deoarece prin

procesul de rafinare, (tratare cu alcali) şi filtrare (prin plăci de celuloză-azbest) se reduce

cantitatea de toxine, iar dacă se execută decolorarea în prezenţa acidului citric detoxifierea

este mai completă.

Micotoxinele din legume şi fructe

Legumele şi fructele pot fi şi ele contaminate cu mucegaiuri care pot sintetiza micotoxine.

Astfel la morcovi Aspergillus parasilicus sintetizează Aspergillus flavus, iar pe suprafaţa

citricelor se dezvoltă Aspergillus parasilicus. Dezvoltarea mucegaiurilor pe fructe, în sucuri

formează în majoritatea cazurilor patulina, cantităţi mai mici s-au găsit în sucuri de pere,

gutui, struguri, excepţii făcând sucurile de tomate şi prune; în sucul de mere concentrat

patulina nu se reduce.

Şi pe fructele uscate se pot forma aflatoxine. Zahărul are efect de protecţie asupra

micotoxinelor, ceea ce a făcut ca patulina să existe şi în gemuri.

Micotoxine în cafea şi cacao

În cafea verde mucegăită s-a identificat Aspergillus ochraceus, iar cu frecvenţă mai mică

Aspergillus flavus şi Aspergillus versicolor; prin prăjire se distrug 75%. Boabele de cacao

conţin micotoxine, produse de Aspergillus parasilicus.

Micotoxine în băuturi fermeentate

În băuturile alcoolice au fost depistate aflatoxine, mai frecvent în cidru, prin fermentarea

pulpei. Cercetările efectuate pe 150 de probe de vin nu a evidenţiat aflatoxine. Malţificarea

necorespunzătoare a orzului poate forma aflatoxine, în bere trec 5-10% din cele existente în

malţ.

26


Micotoxinele în carne şi preparate din carne

Micotoxinele pot infecta carnea animalelor ca urmare a ingerării de furaje mucegăite, cea

mai mare cantitate din micotoxină ochratoxină se acumulează în rinichi. Ochratoxina are o

termostabilitate ridicată; prin prăjire se reduce concentraţia de micotoxină, dar în ţesutul gras

nu se schimbă.

Preparatele din carne pot fi contaminate cu mucegaiuri din genurile: Penicillium,

Aspergillus, Fusarium. Şi salamurile fermentate-uscate pot fi contaminate cu tulpini de

Penicillium şi mai multe tulpini de Aspergillus. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc atunci

când păstrarea produselor se face în condiţii nefrigorifice, iar pentru prevenirea dezvoltării

acestora este necesar adăugarea de sorbat de potasiu. S-a constatat că o sursă de infectare a

preparatelor de carne cu mucegaiuri o constituie şi condimentele.

Micotoxinele în lapte şi produsele lactate

Furajele cu conţinut mare de aflatoxine determină la vaci, prezenţa în lapte a unui metabolit

al aflatoxinei B1, denumit milktoxin, care este detectat chiar din primele zile de la ingerare,

declanşând o degerescenţa a celulelor ficatului. Cantitatea de toxină este mai mare în lapte

iarna faţă de primăvara. Şi în laptele praf cercetările au pus în evidenţă existenţa unui număr

mare de mucegaiuri, ca urmare a depozitărilor în condiţii necorespunzătoare. Laptele praf

contaminat cu Aspergillus versicolor produce diaree puternică, iar Penicillium ciclopium

produce simptome nervoase.

În brânzeturi micotoxinele apar ca urmare a prezenţei mucegaiurilor atât în mediul ambiant

cât şi în urma proceselor tehnologice. Absenţa microorganismelor fungice s-a constatat la

telemea şi în unele cazuri la caşcavalul tip Dobrogea. Valorile maxime de micotoxine s-au

constatat la sortimentele păstrate un timp mai îndelungat.

Cu cât consistenţa pastei este mai tare, cu atât filamentele de mucegai pătrund mai greu

în profunzime, numărul cel mai mic de mucegaiuri se înregistrează la brânzeturile opărite; în

brânzeturile topite frecvenţa aflatoxinelor este mult mai mică decât la celelalte tipuri.

Cercetările au arătat că mucegaiurile Penicillium caseicolum, Penicillium camemberti şi

Penicillium roqueforti nu formează toxine. Totuşi, cercetările întreprinse de Scott au

evidenţiat faptul că Penicillium camemberti şi Penicillium roqueforti utilizate la fabricarea

brânzeturilor sunt capabile să producă substanţe toxice (patulina, acid penicilic şi alcaloizi

toxici).

27


Conform Ordinului nr. 1050/97/1145/505/2005 sunt admise urmatoarele limite

maxime pentru aflatoxine in produse, care sunt prezentate in tabelul de mai jos.

Tabel 7. Nivel maxim admis pentru aflatoxine conform Ordin nr.

1050/97/1145/505/2005

Nr. crt. Produs Nivel maxim de aflatoxină(µg/kg = ppb)

B1 B1+B2+G1+G2 M1

1 Arahide, nuci şi fructe uscate şi produse procesate din acestea destinate consumului

uman direct sau folosite ca ingredient alimentar

2 4 -

2 Arahide supuse sortării sau altui tratament fizic, înainte de a fi consumate de către om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar

8 15 -

3 Nuci şi fructe uscate supuse sortării sau altui tratament fizic înainte de a fi folosite ca

ingredient alimentar

5 10 -

4 Cereale (inclusiv hrişcă, Fagopyrum sp.) şi produse procesate din acestea destinate consumului uman direct sau folosite ca

ingredient alimentar

2 4 -

5 Cereale (inclusiv hrişcă, Fagopyrum sp.) cu excepţia porumbului, destinate sortării sau altui tratament fizic, înainte de consumul

uman sau ca ingredient alimentar

2 4 -

6 Porumb destinat sortării sau altui tratament fizic, înainte de a fi consumat de către om sau

de a fi folosit ca ingredient alimentar

5 10 -

7 Lapte (lapte brut, lapte pentru fabricarea produselor pe bază de lapte şi lapte tratat prin

căldură, aşa cum este definit prin legislaţia sanitar-veterinară în vigoare)

- - 0,05

8 Condimente (piper, nucşoară, ghimbir, turmeric, chilli, pudră de chilli, paprika)

5 10 -

9 Alimente pentru copii şi alimente pe bază de cereale procesate, pentru sugari şi copii de

vârstă mică

0,10 - -

10 Alimente cu destinaţie nutritională specială, pentru sugari

0,10 - 0,025

28


Datorită faptului că micotoxine se găsesc în unele produse alimentare, pentru a proteja

sănătatea consumatorilor într-o serie de ţări s-au luat măsuri de limitare a cantităţii de

micotoxine.

Tabel 8. Limita concentraţiei admisibile (LCA) de aflatoxine în diferite ţări

Nr crt Ţara Produse alimentare LCA Mg/kg

aflatoxină

1 Belgia Toate produsele alimentare 40

2 Brazilia Unt de cocos (export), făina din arahide 50

3 Canada Nuci, produse cu nuci, unt de cocos, alune comestibile şi derivate 15

4 Danemarca Produse importate de U.E, produse din

Brazilia (arahide si făina de arahide).

5-10

5 Franţa Toate produsele alimentare (admite limitele impuse de U.E) 5-10

6 Italia Arahide din import (si derivatele de prelucrare). 50

7 India Făina de arahide 30

8 Israel Toate produsele alimentare 20

9 Japonia Toate produsele alimentare 10

10 Anglia Arahide 50

11 Polonia Toate produsele alimentare 5

12 Suedia Toate produsele alimentare 5-10

13 Germania Toate produsele alimentare 5-10

14 S.U.A Arahide de consum şi alte alimente 20

15 România Produse alimentare 5

Micotoxinele în preparatele enzimatice fungice

O preocupare importantă a cercetării ştiinţifice actuale o constituie şi problema folosirii

preparatelor enzimatice în industria alimentară, ca urmare a eficienţei economice, reducerii

timpului de fabricaţie şi a consumurilor specifice, îmbunătăţirii calităţii produselor.

29


Acestea în majoritatea cazurilor fiind de natură fungică s-a ridicat problema verificării

inocuităţii lor, deoarece în condiţii de cultură există posibilitatea dezvoltării de micotoxine.

Părerile specialiştilor în această direcţie sunt contradictorii, deoarece mucegaiurile

Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, etc, produc toxine doar în anumite condiţii de cultură.

De remarcat este faptul că la preparatele obţinute, la aceleaşi mucegaiuri apar diferenţe de

toxicitate.

Preparatele enzimatice nepurificate care sunt obţinute din aspergili pot să ducă la apariţia

unor dereglări profunde, datorită includerii unor metaboliţi toxici (aflatoxine, ochratoxine,

acid aspergilic etc). În urma analizării preparatelor enzimatice din Rhizopus s-a constatat

acţiunea lor negativă asupra organismului animal, ceea ce a determinat scoaterea acestora din

fabricaţie. S-au izolat două micotoxine în preparatele pectolitice obţinute din Sclerotinina

sclerotium şi care au acţiune toxică asupra ficatului, dar şi un posibil efect cancerigen

(tabel 9)

Tabel 9. Posibilităţi de reducere a conţinutului de micotoxine în prod. alim.

Nr.crt.

Metoda aplicată Efecte

1. Prevenirea dezvoltării

mucegaiurilor toxicogene

Reducerea dezvoltării mucegaiurilor toxicogene

2. Procedee prin extracţie cu

solvenţi organici

Aflatoxinele se dizolvă în aceştia

30


CAPITOLUL 2

Factori care influenţează producerea micotoxinelor

Micotoxinele sunt metaboliţi secundari produşi de mucegaiuri aparţinând în principal

genurilor Aspergillus, Penicillium şi Fusarium.

În condiţii nefavorabile de temperatură şi umiditate, mucegaiurile care contamineaza

alimentele au capacitatea de a elabora metaboliţi toxicogeni. Prin consumul de nutreţuri

contaminate cu micotoxine, acestea sunt preluate de animal care le poate metaboliza doar

partţal. De la animal, micotoxinele ajung la om prin consumul de carne, în care micotoxinele

sunt cumulate, prin consumul de ouă, lapte şi produse lactate, în care micotoxinele sunt

excretate. Acestea devin alimente nocive pentru om, adica îţi pierd inocuitatea.

Condiţiile de toxicogeneză sunt în general mai restrictive decât cele necesare creşterii

mucegaiurilor.

2.1 Biogeneza micotoxinelor

Formarea micotoxinelor poate avea loc la toate stadiile din câmp şi până la

comercializarea produselor pentru consumul animal şi uman.

Natura micotoxinelor produse şi care contaminează alimentele depinde de speciile

fungice, de condiţiile ecologice şi de stabilitatea acestor toxine în mediu alimentar.

Micotoxinele nu contituie o clasă chimică. Sunt metaboliţi secundari care nu joacă un rol

evident în economia microorganismelor:

în comparaţie cu metabolismul primar care este cu temeinicie acelaşi pentru toate

fiinţele vii, metabolismul secundar depinde de speciile considerate, în acest caz,

susele;

metabolismul secundar, foarte important la mucegaiuri, aduce o mare diversitate de

molecule, din care micotoxinele;

metaboliţii secundari sunt foarte adesea elaboraţi de familia de produşi chimici

vecini, din punct de vedere toxicologic, aceasta explică în parte că pentru aceeaşi doză de

toxină, efectele sunt foarte grave şi mai puţin specificate în intoxicaţiile naturale faţă de

intoxicaţiile experimentale efectuate cu o micotoxină pură.

31


Natura produselor care se acumulează în aval, depinde de caracterele individuale ale

suselor şi de condiţiile de mediu.

La ora actuală se cunosc în jur de 200 de specii de mucegaiuri care au capacitatea de a

forma micotoxine.

Fig. 7. Biosinteza micotoxinelor

Originea chimică a micotoxinelor este foarte diversă, unele derivă din aminoacizi

(alcaloizii de ergot, acidul aspartic, acidul ciclopiazolic, slaframina, glioxina, roquefortin,

sporodesina), altele sunt policetoacizii ( aflatoxinele, ochratoxina, patulina, citrinina, acidul

penicilic, sterigmatocistina, zeararlenona), iar altele sunt derivaţi terpenici ( fusarenona,

desoxinivalenolul, varidina, toxina T-2).

Micotoxinele se formează la finalul fazei exponenţiale şi începutul fazei staţionare a

creşterii mucegaiului (figura. 8).

Fig. 8 Fazele de creştere fungică şi localizarea sintezei micotoxinelor

2.2 Formarea micotoxinelor

32


Formarea micotoxinelor pe produsele alimentare presupune parcurgerea următoarelor etape:

2.2.1. Infestarea cu mucegai – este favorizată de temperaturi ridicate şi de umiditatea

redusă a solului

2.2.2 Colonizarea –favorizată de atacul de insecte:

- distrugerea barierelor fizice facilitează raspândirea infecţiei pe produs;

- distrugerea pericardului favorizează infecţia interiorului boabelor;

- descreşterea umidităţii boabelor ÷35%;

2.2.3. Producerea de micotoxine –favorizată de:

- temperaturi ridicate;

- precipitaţii reduse-stres hidric al plantelor;

- alţi factori limitativi ai plantelor cu boabe în curs de formare;

- prolina, factor, semnal de stres în plante induce sinteza toxinelor în tulpinele

toxicogene;

33


Creşterea microbiană şi producţia de toxine este influenţată de numeroşi factori (fig. 9).

Este important să cunoaştem modul în care aceşti factori influenţează calitativ şi cantitativ,

dezvoltarea microorganismelor şi producţia de toxine pentru a putea stabili condiţiile optime

de depozitare a cerealelor.

Fig. 9. Factori care favorizeaza creşterea fungica şi producţia de toxine

.

Pentru a întelege modul în care celula microbiană reacţionează la condiţiile mediului

ambient, diferiţi factori au fost împarţiţi arbitrar în trei mari grupe, cu precizia că în condiţiile

naturale, bioefectul acestora poate fi cumulativ sau sinergic:

Factori extrinseci sunt factorii exogeni, ai mediului natural/industrial: temperatura,

umezeala relativă a aerului, concentraţia de oxigen, radiaţii, factori mecanici,

factori chimici, ş.a.

34


Factori intrinseci sunt factori dependenţi de natura alimentului care influenţează

creşterea şi activitatea culturilor starter dar şi de natura alterării specifice a

produselor alimentare-compoziţia chimică şi concentraţia în nutrienţi, pH, rH,

structura anatomică, substanţe chimice .

Factori impliciţi sunt factori biologici determinaţi de relaţiile ce se pot stabili între

diferitele grupe de microorganisme care alcătuiesc microbiota alimentului

respectiv.

2.3 Influenţa factorilor extrinseci asupra apariţiei micotoxinelor

2.3.1 Temperatura

Temperatura are influenţă asupra speciei de mucegai, dar şi asupra produselor de

metabolism.

Procesele metabolice se desfăşoară în limite stricte de temperatură, specifice fiecărui

microorganism. Acest factor poate favoriza sau inhiba dezvoltarea microorganismelor, iar în

anumite cazuri poate chiar determina moartea acestora. Efectul temperaturii asupra

dezvoltării microorganismelor se datoreşte influenţei pe care aceasta o exercită asupra:

- stării de agregare a apei, în funcţie de care se măreşte sau se micşorează disponibilitatea

apei;

- vitezei reacţiilor enzimatice;

- plasticităţii membranei celulare şi citoplasmei;

- macromoleculele pe care le pot denatura;

Mucegaiurile se dezvoltă la temperaturi diferite. Există pentru fiecare specie, un grad de

temperatură la care dezvoltarea se face cu cea mai mare intensitate. Această temperatură se

numeşte temperatura optimă de dezvoltare. Deasupra şi sub temperatura optimă, dezvoltarea

mucegaiurilor slăbeşte, şi când atinge un anumit punct, superior sau inferior, încetează de a se

mai dezvolta chiar dacă mediul nutritiv ramâne acelaşi.

Temperatura superioară optimului, la care se mai poate observa o foarte slabă dezvoltare

a mucegaiurilor, se numeşte temperatura maximă iar cea inferioară, temperatura minimă de

dezvoltare. Când temperatura se ridică deasupra maximului de temperatură, mucegaiul este

distrus. Dacă temperatura scade sub minimul de temperatură, mucegaiul nu este distrus ci se

găseşte într-o stare de viaţă foarte lentă, favorabilă conservării.

35


Temperatura optimă pentru creşterea mucegaiurilor este cuprinsă între 25-30ºC iar limita

maximă este de 40-45ºC (tab.10). Există totuşi mucegaiuri care se pot dezvolta fără probleme

la temperaturi de 55ºC Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, dar şi mucegaiuri care sunt

capabile să se dezvolte la temperaturi de 0ºC, Penicillium cyclopium.

Tabel 10. Temperaturi minime necesare pentru dezvoltarea unor mucegaiuri şi

pentru producţia de micotoxine.

Mucegai ºC Micotoxina ºC

Aspergillus flavus 10 Aflatoxine 10

Aspergillus clavatus 10 Patulina 12

Aspergillus ochraceus 10-12 Ochratoxina 12

Penicillium expansum 0 Patulina 0-24

Penicillium cyclopium 0 Ochratoxina 0-24

Penicillium cyclopium 0 Acid penicilic 4

Fusarium roseum 15 Zearalenona 10

Se observă că sunt unele situaţii în care există o apropiere între temperatura minimă

necesară pentru creşterea mucegaiului şi cea la care are loc producerea de micotoxine. Există

totuşi unele excepţii când temperatura de dezvoltare a mucegaiului este cuprinsă între

6°-45ºC cu un optim la 37ºC iar producţia de micotoxine are loc într-un interval de

temperatură cuprins între 11°-36ºC cu un maxim la 30ºC.

Fusarium roseum (producător de zearalenonă) se dezvoltă bine între 24-27ºC, iar

producţia de micotoxine are loc la temperaturi cuprinse între 10-12ºC. Totuşi, sunt varietăţi

ale lui Fusarium roseum, ca Fusarium roseum „gibbsosum” şi Fusarium roseum

„semitectum” care au capacitatea de a produce în orz la 25ºC, cantităţi de zearalenonă

echivalente cu producţia de micotoxină la temperatura de 10ºC. Plecând de la aceste

temperaturi minime necesare pentru creşterea anumitor mucegaiuri, putem spune că sunt

condiţii optime pentru o creştere şi proliferare fungică la o valoare optimă mai mare de 0.75,

o temperatură mai mare 20ºC şi o umiditate a substratului de 14%.

Mucegaiurile se împart în linii mari, după temperatura de dezvoltare în: mezofile, termofile,

termotolerante si psichrofile. Majoritatea mucegaiurilor sunt mezofile.

36


Tabel nr.11 Exigenţele termice pentru dezvoltarea mucegaiurilor

Mezofile Temperatura

Maxim <50ºC

Minim >0ºC

Optim 15-30ºC

Termofile

Maxim 50ºC

Minim 20ºC

Termotolerante

Maxim 50ºC

Minim >0ºC

Optim 15-40ºC

Psihrofile

Maxim 20ºC

Minim <50ºC

Optim 0-17ºC

La temperaturi foarte joase, de până la -19ºC, mucegaiurile nu sunt omorâte, sporii lor

supravieţuiesc şi rămân apţi germinării atunci când se întorc în condiţii normale. Această

mare stabilitate a mucegaiurilor la temperaturi joase permite în micotecă conservarea uşoară

surselor prin tehnici de liofilizare.

În atmosfera cu temperaturi ridicate, tunelele de uscare a alimentelor tocate, se observă o

microfloră fungică foarte abundentă în care domină speciile termofile sau termorezistente ca:

Aspergillus flavus şi Aspergillus fumigatus. Rhiyopus pusillus, izolat în diverse substraturi

(cacao, cereale, boabe de muştar), este capabil să se dezvolte până la 57ºC. Fără să crească,

poate avea spori care să supravieţuiască la temperaturi foarte ridicate, şi de asemenea, acest

şoc termic stimulează după acea germinare; este cazul ascosporilor de B. Fulva, un

contaminant al sucului de fructe şi ascosporii de Neurospora crasă care se găseşte în lemnul

ars şi în brutării, tubul germinativ dezvoltându-se după expunerea timp de 5-20 minute la

temperaturi mai mari de 100ºC.

37


2.3.2 Umiditatea

Cantitatea de apă existentă în mediul ambiant şi în substraturi este unul din factorii

importanţi pentru dezvoltarea mucegaiurilor şi pentru producţia de micotoxine.

În atmosferă există o umezeală relativă de 70-90% şi prin păstrarea alimentelor, în timp, în

funcţie de temperatură şi compoziţia produsului are loc o absorbţie a vaporilor de apă din aer,

instalându-se o stare de echilibru, cu creşterea cantităţii de apă liberă şi a indicelui de

activitate a apei. Este ştiut faptul că mucegaiurile apar după o creştere accidentală a

umidităţii. Însă, nu doar cantitatea de apă influenţează ci şi forma de prezentare a acesteia

(liberă sau legată).

Apa liberă este apa din interiorul celulelor şi poate fi eliminată fără a interveni în

procesele vitale.

Apa legată face parte integrată din celule. Pentru germinare, sporii de mucegai au nevoie

ca apă să se găsească în formă liberă.

Există două unităţi relaţionate cu cantitatea de apă:

umiditate relativă de echilibru (HRE): este cantitatea de apă care dispun

microorganismele, fiind echilibrul între conţinutul de apă liberă al produsului şi vaporii de

apă existenţi în mediul ambient. Se exprimă în procente şi variază de la un produs la altul în

funcţie de conţinutul acestuia în glucide sau materie grasă.

apa disponibilă sau activitatea apei (aw) este relaţia existentă între apa liberă din

alimente şi capacitatea microorganismelor pentru proliferare. Activitatea apei ne indică care

este cantitatea de apă disponibilă pentru dezvoltarea microorganismelor.

aw se exprimă ca relaţia existentă între tensiunea vaporilor de apă în substratul (P) şi apa

pură (Po), la aceeaşi temperatură, (aw =P/Po). Dacă umiditatea alimentului este în echilibru

cu umiditatea relativă de echilibru a atmosferei, aw este numeric echivalentă cu aceasta (aw =

HRE/100).

Valorile aw la diverse grupe de mucegaiuri variază în funcţie de temperatură şi substrat.

Comportamentul diferit al mucegaiurilor în funcţie de exigenţa lor faţă de valoarea aw, face

ca aceasta să se împartă în:

specii xerofile la care germinarea sporilor este posibilă la o valoare a aw mai

mică de 80%, în special specii din genul Aspergillus repens, Aspergillus

glaucus, Aspergillus versicolor, Aspergillus flavus, Aspergillus nidulans;

21212


specii mezofile cu o exigenţă la apa cuprinsă între 80-90% Penicillium

cyclopium, Penicillium expansum, Alternaria, Cladosporium cladosporioides;

specii hidrofile (superioare 90%) Epicoccum nigrum, Fusarium ssp, Mucorales;

Tabel 12. Valori ale aw necesare pentru dezvoltarea unor mucegaiuri şi pentru

producţia de micotoxine

Mucegai aw Micotoxină aw

Aspergillus flavus 0.78 Aflatoxine 0.83

Aspergillus parasiticus 0.70 Aflatoxine 0.80

Penicillium expansum 0.85 Patulina 0.99

Penicillium patulum 0.83 Patulina 0.95

Aspergillus clavutus 0.85 Patulina 0.99

Aspergillus achraceus 0.77 Ochratoxine 0.88

Aspergillus ochraceus 0.77 Acid penicilic 0.90

Penicillium cyclopium 0.82 Ochratoxine 0.90

Penicillium viridicatum 0.83 Ochratoxine 0.90

Penicillium citrinum 0.80 Citrina 0.88

Penicillium martensii 0.79 Acid penicilic 0.99

Se observă că majoritatea mucegaiurilor se dezvoltă plecând de la valori ale aw-0.7. În

general sunt rare cazurile în care anumite mucegaiuri germinează la valori ale aw cuprinse

între 0.6 şi 0.7. Totuşi producţia de micotoxine este nulă sau foarte scăzută la valori ale aw

mai mici de 0.85, iar creşterea mucegaiurilor toxicogene se poate realiza într-un interval al

aw cuprins între 0.70-0.85.

31213


2.3.3 Tensiunea superficială

Microorganismele sunt influenţate de tensiunea superficială a mediului în care se găsesc.

Substanţele care coboară tensiunea superficială întârzie sau împiedică dezvoltarea

mucegaiurilor, aceste substanţe pot să aibă, de asemenea, influenţă asupra morfologiei şi

sporulării.

2.3.4 Presiunea osmotică

Presiunea osmotică poate provoca modificări bruşte ale structurii celulare (plasmoliza,

turgescenţa) şi modificări ale morfologiei microorganismelor.

41214


Mucegaiurile sunt microorganisme osmofile (se pot dezvolta pe medii cu presiune

osmotică mare) şi din acest motiv, ele pot altera produsele alimentare care conţin o cantitate

mare de zahăr (miere, dulceaţă, etc.). Ele se pot dezvolta pe produse care conţin max. 70%

zahăr.

2.3.5 Lumina

Acţiunea luminii depinde de specia microorganismelor. În general se poate spune că

lumina este dăunătoare mucegaiurilor. Acţiunea vătămătoare a luminii creşte cu scăderea

luminii de undă a razelor luminoase. Din spectrul luminos cele mai vătămătoare sunt razele

violete, iar din spectrul invizibil, radiaţiile ultraviolete. Acţiunea dăunătoare a razelor

ultraviolete depinde de intensitatea şi durata lor de acţiune asupra mucegaiurilor, acestea

putând fi împiedicate sau oprite din activitatea lor, ori complet distruse.

Când acţiunea luminii se exercită asupra unei culturi şi nu numai asupra unui singur

microorganism, se deosebeşte alături de acţiunea directă, şi acţiunea indirectă asupra

mediului de cultură. Astfel, în mediile de cultură care au fost expuse la lumină solară sau la

radiaţiile UV, s-a găsit întotdeauna apă oxigenată, rezultată din oxidarea apei, oxidare

produsă de raze, care constituie un toxic pentru microorganism. Prin urmare, acţiunea luminii

asupra microorganismului, se exercită fie direct, asupra celulei însăşi, fie indirect, prin

producerea apei oxigenate.

2.3.6 Integritatea fizică a boabelor şi învelişului produselor vegetale

Factorul acesta asigură calitatea produselor în timpul conservării şi face mai dificil

atacul mucegaiurilor.

Produsele cerealiere sunt protejate de mediul exterior, de tegumente care sunt o barieră

foarte eficace împotriva penetrării microorganismelor. Această eficacitate scade după

recoltare, deoarece anvelopa protectoare este eliminată sau lezată. Structura internă

reprezentată de pereţii celulozici, diminuează înmulţirea şi deci proliferarea germenilor în

masa produselor alimentare. Microorganismele emit astfel în mediul exterior hidrolaze care le

permit să treacă această barieră.

Structura şi starea fizico-chimică a materiei are un rol important asupra creşterii

germenilor.

51215


Tegumentele intacte ale boabelor îngreunează accesul mucegaiului. Boabele sfărâmate

sunt mai susceptibile invaziei şi creşterii fungice decât boabele întregi deoarece partea internă

a bobului este cea mai vulnerabilă la acţiunea mucegaiurilor datorită compoziţiei chimice a

acestuia.

2.4 Influenţa factorilor intrinseci asupra aparţiei micotoxinelor

2.4.1 Natura substratului

În general, substratul optim este cel glucidic. Mucegaiurile nu sunt exigente din punct de

nutriţional, ele hrănindu-se cu micro şi macro elementele care există în substratul unde se

dezvoltă.

Aflatoxina este secretată în special pe amidon, iar zearenona se formează pe un substrat

celulozic.

61216


2.4.2 Influenţa pH-ului asupra dezvoltării mucegaiurilor

Acţiunea pH-ului asupra creşterii microorganismelor se situează la trei nivele:

mediu

permeabilitatea membranei

activitatea metabolică

Disponibilitatea anumitor nutrienţi în mediul de cultură este modificată prin echilibrul

ionic. La pH acid, ionii de magneziu formează compuşi insolubili, la pH bazic, zincul, calciul

şi ionii ferici sunt complexaţi. Sub această formă aceşti ioni indispensabili ca şi cofactori ai

enzimelor sunt dificil de folosit.

Permeabilitatea membranelor este în egală măsură afectată de variaţiile de concentraţii în

ioni de şi . În mediul acid pearmeazele cationice sunt saturate în ioni de hidrogen,

ceea ce limitează sau anulează transportul acţiunilor indispensabili. În mediul alcalin ionii

hidroxil care saturează membrana impiedică transferul de anioni indispensabili.

Reacţiile enzimatice au un optim de creştere. Totuşi variaţiile de pH citoplasmatic vor

stabili o încetinire a activităţii enzimatice şi creşterii. Enzimele nu au toate acelaşi

comportament în funcţie de pH, hidrolazele extracelulare fiind mai sensibile decât enzimele

citoplasmatice.

Citoplasma este de asemenea protejată de schimbul limită de pH extracelular. Membrana

citoplasmatică este puţin permeabilă la molecule foarte ionizate în general şi la ioni de în

particular, şi citoplasma are funcţie tampon foarte eficace pe de altă parte.

Acţiunea pH-ului este legată de conservatorii sau inhibitorii familiei acizilor organici,

acizi slabi. Mucegaiurile suportă un interval mare de valori ale pH-ului 2.5-7.5, suportând

mai bine un mediu acid decât unul alcalin. Este bine de specificat faptul că mucegaiurile pot

modifica pH-ul, folosind ca sursă acizii organici ai alimentelor.

Keller SE au studiat efectul pH-ului asupra producţiei de fumonisine B1 de către

Fusarium proliferatum în mediul lichid limitat în azot. Au dedus că există un prag care separă

două compartimente fiziologice. La un pH mai mare de 5, Fusarium proliferatum se dezvoltă

normal şi produce puţine toxine, în timp ce la un pH mai mic de 5, creşterea este mai puţin

importantă, iar producţia de toxine este superioară.

71217


2.4.3 Nutrienţi minerali

Microorganismele, pentru dezvoltare au nevoie de apă, o sursă de energie, de azot, de

săruri minerale şi eventual de oxigen şi/sau factori de creştere. Microorganismele care se

întâlnesc pe produsele alimentare sunt chimio-organotrofe şi folosesc mai degrabă hidraţii de

carbon ca sursă de energie decât acizii graşi sau substanţele azotoase. Monomerii sau

moleculele mici sunt încorporate în citoplasmă prin transport membranar, polimerii trebuie să

fie însă hidrolizaţi în prealabil.

Produsele alimentare conţin în general toţi nutrienţii necesari dezvoltării

microorganismelor, dar diferenţele de compoziţie observate au un efect selectiv asupra florei

microbiene.

Sunt în relaţie cu compoziţia substratului, fierul şi zincul, fiind elementele cele mai

importante pentru creşterea fungică. Lipsa anumitor elemente are ca rezultat o creştere

fungică foarte scăzută.

Nutriţia mucegaiurilor

Prin analiza chimică s-a stabilit că celula conţine următoarele elemente: C, N, O, H, P, S,

Si, Cl, K, Ca, Mg, Fe, Na precum şi urme de Mn, Al, Zn, B. Cele mai frecvente elemente

sunt: N, C, H, O, P, S, K, Mg şi uneori Fe, respectiv Mn. Primele opt elemente sunt cu

siguranţă absolut indispensabile vieţii microorganismelor. Folosirea dar nu şi indispensabile

sunt: Na, Ca, Mn, Cl, Si, etc. Calciul este la puţine specii de microbiene.

Proporţia acestor elemente, indispensabile sau utile de asemenea este deosebită. Unele se

găsesc în cantitate mult mai mare decât altele. Cele dintâi servesc ca bază pentru formarea

ţesuturilor microorganismelor (membrana, protoplasma, nucleu) şi din această cauză au fost

numite elemente plastice, spre deosebire de celelalte, care se găsesc în cantităţi foarte mici

sau în urme şi care au fost numite elemente catalitice sau fiziologice servind ca activatori. În

această categorie intră Fe, Mn, care măresc activitatea oxidazelor, sau Ca care joacă rol în

nutriţia azotată şi în transformarea substanţelor azotate prin microorganismelor fixatoare de

azot. Elementele catalitice au fost studiate amănunţite de Gabriel Bertrand, care le-a denumit

şi elemente oligodinamice.

Pentru procurarea acestor elemente indispensabile sau numai utile, microorganismele au

nevoie de diferite substanţe din care să işi procure elementele necesare. Nu orice substanţă,

însă, care conţine aceste elemente, poate servi ca aliment pentru ele.

81218


Se dă numele de aliment, sau poate servi ca aliment orice substanţă de la care un

microorganism dat poate căpăta elementele şi energia necesară organizării sale fară a mai

utiliza căldura solară.

Descompunerile produse de microorganisme trebuie să aibă loc cu degajare de căldură

pentru a le furniza energia de care au nevoie. De obicei, în transformările microbiene, rămâne

puţină căldură care ridică temperatura mediului. Descompunerile microbiene endoterme nu

sunt posibile decât dacă alături se produce un fenomen exoterm, care să dea căldura

disponibilă. În orice caz, bilanţul caloriferic şi ansamblul reacţiilor trebuie să fie exoterm.

Alimentele absorbite de microorganisme sunt utilizate pentru înlocuirea produselor de

dezasimilare şi pentru formarea de noi substanţe necesare creşterii şi dezvoltării vieţii lor.

Toate modificările interne sau externe ale celulelor, reacţiile fizico-chimice, funcţiunile

biologice şi de reproducere, sunt strâns legate de transformările pe care le suferă alimentele

absorbite. Dintre elemente, unele ca protidele, aminoacizi şi sărurile amoniacale, furnizează

alimentele azotoase necesare sintezei substanţei vii. Altele ca glucidele iau de asemenea parte

la formarea protoplasmei şi nucleului, dar în primul rând sunt alimente producătoare de

energie; prin descompunere, ele pun în libertate căldura necesară reacţiilor endoterme. Din

această cauză aceste alimente s-au numit alimente energetice.

Valoarea alimentară a unui element oarecare este reprezentată prin raportul P/ , în care

P este greutatea culturii obţinute în mediu complet şi greutatea culturii lipsită de elementul

căruia i se determină valoarea alimentară. Cele mai interesante studii au fost făcute cu

mucegaiul Aspergillus niger. Începutul acestor studii datează de acum 70 ani servind şi astăzi

în introducerea fundamentală în fiziologia microorganismelor.

Raulin, un elev al lui Pasteur, a alcătuit un mediu de cultură format din compuşi chimici

bine definiţi (acid tartric, zahăr şi săruri minerale) care să ofere posibilitatea maximă de

dezvoltare a acestui microorganism.

Mediul lui Raulin cuprinde următoarele substanţe:

- Apa 1500 - carbonat de magneziu 0,4 g

- Zahăr 70 g - sulfat de amoniu 0,25 g

- Acid tartaric 4 g - sulfat de zinc 0,07 g

- Nitrat de amoniu 4 g

- Fosfat de amoniu 0.6 g - sulfat de fier 0.07 g

- Carbonat de potasiu 0.6 g - silicat de potasiu 0,07 g

91219


Reacţia acestui mediu este acidă. Pentru a realiza maximum de dezvoltare a mucegaiului,

trebuie ca însămânţarea să se facă în strat subţire în condiţii aerobe, iar cultura să fie ţinută la

37ºC, într-o atmosferă umedă. După 24 ore de la însămânţare, suprafaţa lichidului se acoperă

cu o membrană albicioasă care se îngroaşă repede, se încreţeşte şi a patra zi capătă la

suprafaţă o culoare neagră, datorită formării sporilor.

Pentru evaluarea greutăţii recoltei, după trei zile de la cultivare se culege tot miceliul, se

stoarce, se usucă şi se cântăreşte. După alte trei zile se procedează la fel cu noua recoltă care

s-a mai format şi care este ultima. Cantitatea totală de miceliu din cele două recolte este de

25 g.

Alimente minerale

Eliminând pe rând fiecare element mineral din lichidul Raulin, se poate determina

importanţa pe care o au în dezvoltarea culturilor sau utilitatea lor specifică.

Utilitatea specifică a unui element este raportul dintre greutatea microorganismului şi a

elementului considerat sau mai bine zis creşterea greutăţii realizate pentru fiecare unitate din

greutatea elementului adăugat. De exemplu pentru greutatea recoltei de 22.5 g s-au

întrebuinţat 0 mg oxid de zinc- utilitatea specifică=225000/40=562.

Prin suprimarea acidului fosforic, recolta scade la 1/182; a magneziului, la 1/91; a

potasiului, la 1/25; a acidului sulfuric, la 1/25, etc. Aceste rezultate sunt identice cu cele ce

s-ar obţine de la o plantă superioară cultivată în condiţii experimentale identice. Cu totul

altfel se prezintă în cazul celorlalte elemente.

Dacă se suprimă zincul, recolta scade la 1/10, iar prin suprimarea fierului la 1/2.

Cum se poate explica rolul acestor elemente, care se găsesc în cantităţi infinitezimale în

mediul de cultură şi care totuşi au o acţiune asa de importantă?

Dacă se reconstituie mediilor elementele respective de care sunt lipsite, la zinc, recolta

revine la normal, pe când prin adăugarea fierului nu-şi mai revine.

Raulin a dedus prin urmare că zincul este aliment, în timp ce fierul nu este. Fierul nu poate

fi considerat decât un antidot care neutralizeză anumite toxine excretate chiar de Aspergillus

şi care sunt vătămătoare dezvoltării sale.

După Javilier, culturile de Aspergillus în mediul lui Raulin, libere de zinc, nu ating, după 4

zile de dezvoltare, decât 0.37 din greutatea realizată în condiţii normale; condiţiile continuă

să apară mai departe. Pe lângă aceasta, 60% din zahăr, în absenţa zincului, ramâne neutilizat.

1012110


Dacă se adaugă zinc 1/10000000 în raport cu mediul, se ajunge la recolta normală tip, tot

zahărul fiind consumat. Zincul favorează de asemenea şi fixarea siliciului, fierul şi

manganului de către Aspergillus, fiind însă lipsit de efect asupra fixării magneziului, sulfului

şi azotului. Chiar el este fixat în întregime de mucegai, cu condiţia să nu depăşească

cantitatea de 1/250000 în raport cu mediul.

După cum unele doze foarte mici de substanţe minerale sunt indispensabile creşterii

microorganismelor, tot aşa altele devin vătămătoare, chiar în doze extrem de mici. Astfel,

suplimatul împiedică germinarea sporilor în doza de 1/500000, iar azotul de argint în doza de

1/1600000. De asemenea dozele: de zinc 1/25000, de clorură de platin 1/8000, de sublimat

1/51200, de sulfat de cupru 1/2400 şi de nitrat de argint 1/1600000 sunt toxice. Sensibilitatea

aspergillului faţă de sărurile de argint este aşa de mare încât acesta nu se poate dezvolta sub

nici o formă în vase din acest metal.

Alimente hidrocarbonate

După modul cum îşi procură azotul şi carbonul, microorganismele au fost împărţite în două

grupe: autrotofe şi heterotrofe

Microorganismele autrotofe fiind dotate cu pigmenţi ca şi plantele verzi îşi procură

carbonul din bioxid de carbon.

Microorganismele heterotrofe, fiind lipsite de clorofilă, nu-şi pot procura carbonul din

atmosferă ci trebuie să-l obţină din diferite substanţe, în special din hidraţii de carbon.

Este evidentă necesitatea exigenţei unui criteriu după care unele microorganisme pot prefera

un aliment sau altul. Unul din criteriile cele mai des întâlnite este şi acela al configuraţiei

sterice a moleculei organice. Astfel, mucegaiul Penicillium glaucum atacă de obicei, din

acidul tartric inactiv, enantiomorful dextrogir, lasând direct pe cel levogir.

Acelaşi lucru îl face şi Aspergillus niger. De asemenea, din cei doi acizi lactici, Penicillium

glaucum preferă enantionul levogir celui dextrogir.

2.4.4 Potenţialul de oxido- reducere (O 2 /CO 2 )

Acţiunea oxigenului asupra metabolismului microbian se poate manifesta în trei moduri:

- modificarea potenţialului de oxido-reducere. Prezenţa O2 dizolvat indică un potenţial

redox pozitiv, absenţa sa însă în medii organice bogate în compuşi reducători acizi organici,

radicali SH (zaharuri reducătoare) se traduce prin potenţial negativ.

- acceptul final al electronilor pentru aerobioza strictă şi facultativă;

1112111


- agenţi ai stresului oxidativ prin intermediul formelor sale active (peroxid sau

superoxid);

Oxigenul poate fi procurat de microorganisme din aer, din apa cum şi din diferite

substanţe care îl conţin. Rolul principal însă în nutriţie şi în funcţiunea celulei microbiene îl

joacă oxigenul din aer şi cel din compuşii organici.

Majoritatea mucegaiurilor sunt aerobe şi din acest motiv au nevoie de O 2 pentru a creşte

şi pentru reacţiile lor metabolice. O lipsă parţială de O2, condiţionează creşterea

mucegaiurilor, iar lipsa acestuia duce la moartea acestora. Este cazul lui Penicillium, care

poate suporta şi condiţii extreme.

O diminuare a concentraţiei în O2 şi o creştere a concentraţiei de CO2, provoacă o

scădere a toxicogenezei, mai importantă decât creşterea.

În cazul fumonisinei B1, în condiţii de O2 scăzut, creşterea mucegaiului va fi scăzută,

consumul de glucoză va fi important şi producţia de micotoxină va fi nulă.

2.4.5 Bacteriile

Barrios si col. (1996) au arătat că inocularea bacteriilor lactice cu trei zile înaintea

inoculării lui Aspergillus parasiticus provoacă o diminuare a creşterii şi producţiei de

micotoxine. Acest fenomen are un efect de competiţie pentru substrat şi pH.

2.4.6 Microflora

Aziz N.H. si col. (1997a şi1997b) au studiat efectul microflorei netoxice a porumbului în

producţia de aflatoxine de către Aspergillus flavus. Au arătat că Tricoderma viride inhibă

creşterea mucegaiului şi reduce sau anulează producţia de aflatoxină B1 chiar dacă boabele

de porumb au fost sau nu sterilizate. Dacă inocularea lui Tricoderma viride este ulterioară

inoculării lui Aspergillus, nivelul de aflatoxină B1 se diminuiază semnificativ. Această

diminuare atinge cam 31%.

Efectul microflorei acţionează asupra acumulării toxinelor. În termen ecologic, există o

competiţie pentru substraturi: doar sursele foarte competitive şi care posedă un vast spectru

de substraturi metabolizabile se dezvoltă. În plus, anumite surse pot degrada micotoxinele.

Un efect inhibitor al microflorei spontane a fost de asemenea demonstrat de O’Neil K.si col.

(1996).

1212112


Analizând producţia de trichotecine şi zearalenonă de Fusarium culmorum pe porumb, ei au

arătat ca pe boabele sterilizate prin încălzire sau radiaţii, cantitatea de micotoxină este

superioară faţă de cea prezentă pe grânele nesterilizate.

Această diferenţă apare deoarece în primul caz substratul este lipsit de microorganisme, flora

spontană fiind prezentă în cel de al doilea caz.

Marin si col. (1998) au studiat influenţa unei flore competitive în creşterea şi producţia

de fumonisine de către Fusarium moniliforme şi Fusarium proliferatum. La o temperatură de

15-25ºC şi o valoare a aw de 0.98, colonizarea mediului de către cele 2 specii de Fusarium

este mult mai mică decât Aspergillus flavus şi Aspergillus ochraceus, dar în acelaşi timp,

producţia de fumonisine este stimulată de aceste două mucegaiuri.

2.4.7 Insectele

Insectele intervin indirect în producţia de micotoxine, ele fiind vectorii sporilor. În plus,

insectele pătrund în zonele interioare ale grânelor prin rănile pe care le produc. Contaminarea

după recoltare a alunelor şi porumbului cu Aspergillus flavus este corelată cu un atac al

insectele. Acestea pot fi prezente în spaţiile de depozitare creând o contaminare importantă şi

în consecinţă constituie o cauză a prezenţei micotoxinelor.

Rodiquez de Bosque a arătat că 2 factori sunt în relaţie cu creşterea aflatoxinelor în

porumb: semănatul târziu şi pagubele cauzate de insecte.

1312113


2.5 Descrierea mucegaiurilor cu potenţial toxicogen

2.5.1 Principalele genuri de mucegaiuri din industria alimentară

Genurile şi speciile de mucegaiuri cu incidenţă în industria alimentară (microbiota utilă

şi de alterare), sunt grupate în diviziunile Zygomycota (Zygomycetes), Ascomycota

(Ascomycetes) şi Deuteromycota (Deteromycetes) (Gueguen, M. 1994).

Din diviziunea Zygomyceta, pentru industria alimentară, prezintă interes mucegaiurile din

ordinul Mucorales: familia Mucoraceae, (genurile: Mucor, Rhizopus şi Absidia) şi familia

Thamnidiaceae (genul Thamnidium). Acestea sunt denumite mucegaiuri inferioare şi au thal

septat monocelular coenocitic (miceliu neseptat, ramificat aerian şi imersat în substrat). Ele

sunt uşor identificate prin caracterele morfologice ale aparatului reproducător pe cale

asexuată, când sporii se formează în interiorul unui sporange terminal (sporocist) purtat de un

sporangiofor (sporangistofor), care poate să se prelungească sau nu în interiorul sporangelui

cu o columelă.

Reproducerea pe cale sexuată se realizează prin zigospori. Unele specii sunt

heterothalice, în timp ce pentru altele stadiul de zigospori este necunoscut.

Genul Rhizomucor a fost creat cu puţin timp în urmă şi cuprinde speciile termofile ale

genului Mucor (Rhizomucor pusillus) ce prezintă stoloni şi rhizoizi.

Studii efectuate de Kirk (1986) şi Cannon (1988) privind nomenclatura genurilor din

ordinal Mucorales. Au relevat ca genurile Mucor şi Rhizopus nu trebuie considerate ca genuri

separate. Dacă codul de nomenclatură botanică ar fi fost riguros aplicat genul Mucor ar fi

trebuit unit cu Rhizopus, iar anumite specii din genul Rhizopus regrupate în gen Ascophora.

Totuşi, luând în considerare importanţa economică a mucegaiurilor din cele două genuri

Mucor şi Rhizopus, ele continuă să fie acceptate în vechea formă (Scriban.r,s.a 1993)

În diviziunea Ascomycota, sunt incluse mucegaiuri superioare cu miceliu septat care se

reproduc pe cale sexuată prin ascospori ce se formează în asce închise în formaţiuni specifice

numite: Chleistothecium (Ploctomycetes) şi Perithecium (Pyrenomycetes-genurile Eurotiul şi

Byssochlomys). Unele mucegaiuri din această diviziune pot prezenta şi reproducere asexuată

şi în acest caz ele se regăsesc şi în Deuteromycota, dar cu altă denumire.

1412114


Deuteromycota include mucegaiurile superioare cu thal septat care se reproduc numai pe

cale asexuată, denumite fungi imperfecţi. Capacitatea de reproducere pe cale asexuată a fost

pierdută în cursul evoluţiei acestor mucegaiuri. Sporii formaţi prin reproducere asexuată se

numesc conidiospori (conidii). Diferitele moduri de formare a conidiosporilor sunt utilizate

drept criterii de identificare a mucegaiurilor din această subdiviziune. Pentru industria

alimentară prezintă interes mucegaiurile din clasa Hyphomycetes, ce dispun de o diversitate

metabolică deosebită. Aici sunt incluse principalele genuri cu aplicaţii în procesele

biotehnologice, dar şi agenţi de alterare ai produselor alimentare.

2.5.2 Caracterizarea principalelor specii de mucegaiuri cu potenţial toxicogen

Intervenţia nefastă a ciupercilor filamentoase în industria alimentară este întâlnită la mai

multe niveluri. Cerealele pot fi contaminate cu mucegaiuri în plin câmp şi în timpul

depozitării.

Mucegaiurile care se dezvoltă pe câmp ca şi cele care se dezvoltă pe materiale de

putrefacţie necesită o umiditate ridicată (20-25%) pentru creşterea lor (Hesseltine, 1976), în

timp ce mucegaiurile de depozitare sunt capabile să crească pe un strat cu un conţinut de

umiditate de 10-18% (Lillehoj & Elling, 1983).

Speciile cu activitate fitopatogenă sunt foarte periculoase pentru producţia materiilor

prime alimentare brute. Mucegaiurile saprofite contaminează alimentele şi degradează din

punct de vedere calitativ. Anumite specii sunt toxicogene şi eliberează în aliment micotoxine

care reprezintă un grav pericol din punct de vedere sanitar.

1512115


Tabel 13. Principalele mucegaiuri care se gasesc în diferite alimente

Mucegai Toxina Produs

Aspergillus Aflatoxina, sterigmatocistina ochratoxina A Porumb,arahide,orez,fasole,lapte

preparate din carne

Fusarium Fusarine,Moniliformine,

Tricotecine,Zearalenona,Fumonisine

Grâu, porumb,orz,orez,secară,nuci

Penicillium Patulina,citrinina,ochratoxina A Fructe şi sucuri de

fructe,grâu,orez,brânză,nuci

Alternaria Alternariol,Acid tenuazonic Fructe,legume şi produse derivate,mere

şi roşii

Claviceps Ergot Grâu,secara şi orez

Toxicogeneza cum s-ar numi condiţiile de sinteză şi elaborare a micotoxinelor, este un

fenomen de mare complexitate. Condiţiile optime de toxicogeneză depind de o combinaţie de

factori: temperatura, umiditatea şi nivelul de oxigenare a substratului.

Expresia „specie toxicogenă” poate fi interpretată în funcţie de mecanismul care dă

naştere apariţiei toxinelor:

- fie substanţa este un metabolit secundar, propiu sursei fungice considerate, este

cazul majorităţii micotoxinelor secretate de ciuperci în timpul depozitării produselor

alimentare. Rezultă astfel o mare diversitate de familii chimice: derivaţii ai acizilor aminici:

acidul aspergilic, roquefortine şi derivaţi ai terpenelor: DON, tricotecine;

- fie mucegaiul poate transforma un substrat netoxic într-un produs toxic prin

bioconversie; este cazul acidului cumaric prezent în cantitaţi mici în sulfină, care poate fi

transformat în dicumarol, un puternic anticoagulant pentru diferite mucegaiuri;

- fie mucegaiul parazit poate provoacă o deviaţie a metabolismului normal al plantei,

consecinţă a formării produşilor toxici care nu există în plantele sănătoase.

1612116


2.5.2.1 Aspergillus flavus

Caractere coloniale

Colonia pe mediul solid se dezvoltă rapid, 50-70 mm este plană, densă, catifelată, de

culoare, alb-gălbuie; la maturitate, odată cu dezvoltarea uniformă a conidioforilor, culoarea

devine galben-verzui spre galben brun. Reversul coloniei se colorează în galben spre brun.

Aspect microscopic

Conidioforii sunt lungi, cu înălţimi cuprinse între 400-1000 µm şi diametrul de 3-13 µm,

pereţii sunt groşi, cu aspect rugos incolori. Vezicula are formă alungită la început, apoi capătă

formă sferică cu diametrul de 20-40 µm şi este fertilă pe ¾ din suprafaţă. Pe veziculă se pot

dezvolta direct fialide, fie metule cu fialide egale în dimensiuni. Fialidele, aranjate într-un

singur strat măsoară (10-15)x(3-5) µm; cele aranjate în straturi duble au înălţimi egale, de

7-10 µm şi cu diametrul de 3-4 µm pentru cele secundare.

Răspândire şi rol

Este răspândită în natură şi poate fi izolat de pe seminţe de porumb, orz, alune, orez,

cartofi, mazăre, mere, făinuri, lapte praf. Aspergillus flavus are o afinitate deosebită pentru

alune şi seminţe oleaginoase. În condiţii necorespunzătoare de păstrare, ca urmare a

contaminării înainte de recoltare, se poate produce mucegăirea masivă a boabelor de porumb,

alune, seminţe oleaginoase cu importante pierderi economice. Aspergillus flavus creşte

într-un domeniu larg de temperatură (12-48ºC). Valoarea minimă de aw 0.78 la 33ºC, valoarea

optimă de pH = 7.5. Conidiosporii au rezistenţă termică redusă cu D60 = 1 minut. Poate

produce micotoxine cu denumirea generică de aflatoxine.

1712117


2.5.2.2 Aspergillus nidulans

Caractere coloniale

Colonia este catifelată de culoare verde-verde închis cu formare în centru de peritheci de

culoare alb- gălbui. Reversul coloniei apare de culoare roşu purpuriu.

Aspect microscopic

Conodioforii sunt sinuoşi de culoare brună, cu lungime 6-100 µm şi diametrul 2.5-3 µm,

capul conidial este columnar, cu dimensiuni (40-80)x(25-30) µm. Vezicula este

semisferică, cu diametrul de 8-10µm. Fialidele biseriate se dezvoltă în partea superioară a

veziculei. Fialidele primare ca şi cele secundare sunt scurte şi au dimensiunile (5-6)x(2-3)

µm. Fialosporii sunt globoşi, cu suprafaţa rugoasă şi dimetrul 3-3.5 µm. La maturitate, prin

dezintegrare se formează asci, cu câte opt ascospori lenticulari, cu pereţi netezi, cu două

inele situate central, de culoare roşie şi dimensiuni 3.5-4.5 µm.


Se întâlnesc în sol, resturi vegetale, diferite seminţe depozitate, pe pâine. Poate elabora

toxina sterigmatocystina (nidulina).

1812118


4.2.2 Aspergillus versicolor

Caractere coloniale Colonia se dezvoltă lent şi are un aspect compact, catifelat. Zona centrală a coloniei este

mai înaltă şi poate prezenta la margini striaţiuni radiale. La maturitate, colonia prezintă o

culoare gălbui-verde ca mazărea şi o bordură albă îngustă, revers se colorează în galben

portocaliu spre roşu.

Aspect microscopic

Capul conidial este semisferic, radial cu diametrul 100-200 µm. Conidioforii sunt

relativ lungi, cu dimensiuni (500-600)x(4-8) µm, sunt netezi, incolori, iar la maturitate se

colorează în gălbui. Vezicula este semisferică sau elipsoidală, fertile pe 1/2 sau 2/3 din

suprafaţă şi are diametrul cuprins între 12-20 µm. Fialidele sunt biseriate aproximativ egale,

cele primare au dimensiuni cuprinse între (7-10)x(3-4) µm, iar cele secundare au dimensiuni

de (5-10)x(2-2.5) µm. Fialosporii sunt globoşi cu suprafaţa fin rugoasă şi cu dimensiuni de

3.5-5 µm.


Este întalnit în sol, pe resturi vegetale în descompunere, cereale, făinuri, furaje, seminţe

oleaginoase, produse insilozate, produce micotoxina sterigmatocystina cu efect hepatotoxic.

1912119


4.2.3 Aspergillus candidus

Caractere coloniale

Formează colonii catifelat-pâsloase de culoare alb-albastru-cenuşiu spre verde şi

înălţime de 3 mm. Colonia prezintă circumferinţe radiale şi margine albă cu revers incolor,

brun la maturitate.

Aspect microbiologic

Conidioforii au înălţime de 1.3 mm, diametrul 20-30 µm, sunt netezi şi hialini. La

capătul superior prezintă o veziculă clavată alungită ( ca o măciuca) cu dimensiunea (200-

300)x(40-60) µm. Fialidele uniseriate, care acoperă toată suprafaţa veziculei măsoară (2.5-

3.5)x(2-3) µm, cu dimensiuni mai mari la baza şi apexul veziculei fialosporii sunt elipsoidali

netezi, cu dimensiuni (2.5-3)x(3.5-4.5) µm.


Este o specie întâlnită în sol, pe părţi ale plantelor în stadiul de putrezire. A fost izolat

de pe diverse seminţe (porumb germinat, carne, fructe). Poate produce micotoxina patulina.

2012120


4.2.5 Aspergillus ochraceus

Caractere coloniale Colonia are diametrul de 3-5 cm, prezintă zone concentrice şi exudate. Are culoare

galben-portocalie spre roşu, aspect granulat.

Aspect microscopic Conidioforii cu lungimi variabile şi diametrul de până la 10µm, au suprafaţa fin rugoasă

şi sunt coloraţi în galben. Capul conidial este de formă sferică şi la maturitate se separă în

două sau mai multe grupări compacte. Vezicula este globoasă sau elipsoidală, fertile pe

întreaga suprafaţă. Fialidele sunt biseriate: fialidele primare cu lungimi variabile cuprinse

între 15-30 µm, iar cele secundare au dimensiuni între (7-10)x(1.5-2.5) µm. Fialosporii sunt

sferici, elipsoidali, cu suprafaţa alb rugoasă şi diametrul între 3.5-5 µm. Produce rar scleroţi

ovali, de culoare galben -brun.

Răspândire şi rol Este frecvent întalnit în sol, pe resturi vegetale, boabe de orez, porumb, seminţe

oleaginoase, furaje, produse alimentare. În condiţii de facultativ anaerobioza la fermentarea

boabelor de cafea este responsabil pentru formarea unui miros plăcut. Dintre micotoxinele

elaborate în condiţii favorabile de sporulare fac parte: ochratoxina, aflatoxine şi acidul

penicilic. Prin consum de produse mucegăite se produce hepatotoxicoze la animale.

2112121


4.2.6 Aspergillus tereus

Caractere coloniale Colonia apare cu perimetru circular, aspect catifelat şi uneori prezintă zone radiale. Culoarea coloniei variază, de la centru spre periferie, de la cafeniu-brun la bej, reversul este gălbui spre brun. Uneori elaborează un exudat de culoare portocalie.

Aspect microscopic Conidioforii sunt scurţi, drepţi sau curbaţi cu lungimi egale şi dimensiuni între (100-250)x(4.5-5.5) µm, incolori, cu pereţi netezi capul conidial, este columnar, lung până la 500 µm şi diametrul 10-16 µm. Fialidele sunt biseriate şi se dezvoltă pe 1/2 max 2/3 din suprafaţa veziculei. Fialidele primare au dimensiuni cuprinse între (5-7.2)x(2-2.5) µm, iar cele secundare (5.5-7.50)x(1.5-2) µm. Fialosporii sunt de formă globoasă, cu suprafaţa netedă, diametrul cuprins între (1.8-3.5) µm dispuşi în lanţuri lungi.

Răspândire şi rol Poate fi izolat de pe furaje, seminţe, cereale depozitate. Este termofil şi are viteza rapidă de creştere chiar la 37°C, fiind frecvent întâlnit în zona tropicală şi temperată. Poate produce acizi organici: succinic, oxalic, enzime proteolitice. Are potenţial toxicogen produce micotoxine: citrinina şi patulina.

2212122


4.2.7 Aspergillus fumigatus

Caractere coloniale

Pe Agar Czaper-Dox, după incubare de 7 zile la 25ºC, coloniile au dimensiuni de circa

4-5 cm, culoare albastră-verzui şi aspect pulverulent datorită sporulării intense.

Aspect microscopic

La stereolupă, se disting destul de facil capetele aspergilare cu aspect columnar. Hifele

sunt septate şi dau naştere unor conidiofori a căror extremite distală se termină printr-o

veziculă cu aspect clavat, de 20-30 µm diametru. Vezicula este tapetată în jumătatea

superioară cu un singur rând de celule de culoare verzuie, cu dimensiuni de (6-8)x(2-3) µm

- fialidele, care vor genera lanţurile de conidii. Conidiile au formă sferică sau subsferică,

aspect verucos şi diametru 2.5-3 µm.

Răspîndire şi rol

Aspergillus fumigatus este un fung filamentos ubicuitar, saprobiot în sol, unde joacă un

rol important în reciclarea carbonului şi azotului din resturile vegetale. Fiind un fung

contaminant, el se izolează destul de frecvent din aerul ambiant, din apă şi de pe diverse

suprafeţe, inclusiv din clinici şi spitale. Din prelevatele clinice, izolarea sa este destul de

facilă, prin utilizarea mediilor uzuale de cultivare.

2312123


4.2.8 Fusarium graminearum

Caractere morfologice

Colonia dezvoltată pe mediu selectiv are un aspect pâslos, dens şi se extinde rapid în

placă. Culoarea este roz-cenuşiu spre auriu-brun. Reversul este colorat în portocaliu-brun cu

nuanţe mai deschise spre margine.

Aspect microscopic

În preparat microscopic se pot observa:

- macroconidii- se formează pe conidiofori simpli sau ramificaţi de obicei în mănunchi,

care au formă falcată sau fusiformă, cu 5 septuri, cu dimensiuni ce variază între (30-62)x(3.0-

4.5)µm. Nu formează microconidii.

- chlamidosporii- sunt mono sau pluricelulari, de obicei globoşi, care se formează

intercalar, de-a lungul hifelor sau la nivelul macroconidiilor, sunt netezi sau rugoşi, hialini

sau de culoare brun-pal, cu dimensiuni de (10-12)µm.


Se dezvoltă optim la 24-26°C, pH 6.7-7.2. Este răspândit în natură şi este fitopatogen al

gramineelor (putrezirea în coroană la plante de grâu şi porumb). Poate să paraziteze şi alte

plante (mazăre, cartofi, banane). Poate elabora micotoxine de tipul scirpene (zearalenone)

prin ingerarea produselor mucegăite se pot produce gastroenterotoxicoze la porcine ovine şi

cai.

2412124


4.2.9 Penicillium expansum

Caractere coloniale

Formează colonii cu diametrul de 30-40 mm de culoare verde-albăstrui cu aspect

catifelat. În zona centrală si cea marginală, colonia are aspect floconos. Formează în timp

inele circadiene, în care, sunt zone cu miceliu înalt care alternează cu zone cu miceliu scund.

Reversul este colorat în brun -închis sau portocaliu-brun. Produce exudat incolor sau brun

portocaliu foarte deschis şi un pigment solubil portocaliu-brun.

Aspect microscopic

Conidioforii au pereţi netezi, cu lungimi de 200-500µm şi poartă penicili terverticilaţi.

Prezintă fialide fie cu formă de fiolă, fie cu formă cilindrică, cu dimensiuni de (8-ll)x

(2-2.5)µm. Formează conidii elipsoidale cu pereţi netezi cu dimensiuni de (3-4)x(2.5-

3.5)µm.


Este un mucegai psihrofil (poate creşte la 6°C, creşte viguros la 0°C). Se dezvoltă optim

la 28°C. Temperatura maximă de dezvoltare este de 35°C. Necesită pentru germinare un aw

de 0.82-0.83. Nu necesită prezenţa unor cantităţi mari de O2 pentru a se dezvolta. Este

prezentată în mod frecvent la mere şi pere la care produce putrezirea brună. A fost izolat şi de

pe căpşuni şi tomate. Apare pe cereale mai puţin frecvent decât alte specii ale genului. Foarte

răspândit pe alimente cum sunt carnea şi produsele din carne. Produce micotoxine de tipul

patulinei şi citrininei.

2512125


4.2.10 Trichotecium roseum

Caractere coloniale

Formează colonii cu diametrul de 50-60 mm, pufoase, cu miceliu colorat în roz, roz

portocaliu. Reversul este colorat similar, mai puţin intens sau cu nuanţe de brun.

Aspect microscopic

Prezintă conidiofori lungi, neramificati septaţi care poartă la capăt conidii ce se

formează una peste alta şi sunt dispuse de o parte şi de alta a conidioforului formând lanţuri

în V. Conidiile au forma elipsoidală până la pirinformă, prezintă un singur sept transversal,

au pereţi subţiri, netezi şi dimensiuni de (16-20)x(8-12) µm. Prima conidie formată rămâne

verticală în timp ce celelalte, care se formează sub ea, sunt înclinate alternativ spre dreapta şi

spre stânga.


Se dezvoltă în intervalul de temperatură cuprins între 15-35°C, cu un optim la 25°C şi

până la o valoare a aw de 0.9. Este foarte răspândit în natură, în special pe lemnul care

putrezeşte. A fost izolat de pe cereale diverse specii de alune, fasole si carne, dar nu este

considerat agent de alterare a produselor alimentare. A fost deasemenea izolat de pe pereţii

pivniţelor. Produce micotoxina denumită tricotecină.

2612126


CAPITOLUL 3

Metode de limitare şi reducere a conţinutului în micotoxine a unor produse

alimentare de origine vegetala

Prezenţa micotoxinelor, pune o problemă de securitate sanitară a alimentelor. Punerea la

punct a tratamentelor industriale pentru decontaminarea şi detoxifierea produselor alimentare

contaminate a devenit un obiectiv major pentru securitatea sanitară a alimentelor. Înaintea

folosirii procedeelor decontaminare, modul de strategie constă în observarea practicilor care

permit limitarea contaminanţilor. Stăpânirea etapelor înainte de recoltare, în timpul recoltării

şi în timpul depozitării permite prevenirea contaminării, factorii de mediu fiind determinaţi

pentru a preveni contaminarea cu mucegaiuri şi micotoxinelor lor.

3.1 Strategii preventive: limitarea contaminanţilor

Punerea la punct a unui plan de control şi analiza a punctelor critice (HACCP-Hazard

Analysis Critical Control Point).

Sistemul HACCP, o metodă pentru protecţia igienicob - sanitară a alimentelor, este unul

dintre diferitele procedee propuse pentru a garanta producere igienico- sanitară a alimentelor

care a întrunit sufragiile majorităţi organismelor internaţionale în domeniu. Sistemul HACCP

face posibilă prevenirea contaminărilor şi/sau reducerea la un nivel acceptabil a potenţialelor

riscuri inerente procesului productive sau produsului finit.

Este greşit să se considere că sistemul HACCP reprezintă o metodă care determină

eliminarea în totalitate a riscurilor pentru obţinerea de alimente sigure; sistemul HACCP

acceptă şi posibilitatea de a reduce riscurile la un nivel acceptabil. Acest aspect reprezintă o

noutate introdusă de sistemul HACCP, care obligă la o respectare riguroasă a principiilor

preventive conţinute de el; nerespectarea acestor principii în oricare dintre fazele procesului

de producţie pune în pericol întreg sistemul.

2712127


Principiile sistemului HACCP sunt esenţiale. În 1993, Comisia Codex Alimentarius şi

apoi OMS (Organizaţia Mondială a Sănătaţii) în 1995, au pus bazele teoretice ale controlului

prin intermediul sistemului HACCP, enunţând următoarele principii:

Identificarea riscurilor asociate cu producerea alimentelor în toate fazele fluxului

tehnologic, evaluarea lor comparativă şi a nocivităţii faţă de consummator, descriind

şi măsurile de control sau de prevenire;

Identificarea pe fluxul tehnologic a punctelor critice de control care, menţinute sub

control, sunt în măsură să prevină, să elimine sau să reducă până la limite acceptabile

riscul;

Stabilirea limitelor critice care nu trebuie depăşite pentru a ne asigura că punctul critic

este sub control;

Proiectarea de eventuale acţiuni corective, în cazul în care monitorizarea indică faptul

că un anumit punct critic de control nu mai este sub control;

Proiectarea procedurilor pentru a verifica dacă întreg sistemul HACCP îndeplineşte

obiectivele fixate;

Documentarea tuturor procedurilor adoptatea pentru realizarea planului HACCP.

Aplicarea sistemului HACCP presupune parcurgerea logică a 12 etape specifice unui

plan de lucru HACCP, caracteristic pentru fiecare proces şi/sau produs analizat:

definirea scopului;

constituirea şi organizarea echipei HACCP;

descrierea produsului şi identificarea utilizării intenţionate;

elaborarea diagramei de flux tehnologic;

identificarea pericolelor potenţiale;

evaluarea riscurilor potenţiale;

determinarea punctelor critice de control;

stabilirea limitelor critice;

stabilirea sistemului de monitorizare;

stabilirea acţiunilor corective;

stabilirea procedurilor de verificare;

stabilirea documentaţiei şi a înregistrărilor.

Demersul este bazat pe dezvoltarea unei strategii de prevenire, de control, de bune practice

industriale şi control al calităţii la toate etapele producţiei. Presupune punerea în evidenţă a

2812128


punctelor de risc, ca şi a punctelor critice, punerea la punct a soluţiilor finale de luptă, ca şi

dezvoltarea metodelor de verificare.

Ropkins şi Beck (2003) au propus un plan HACCP pentru limitarea contaminării cu

compuşi organici a produselor alimentare în timpul perioadei de depozitare, transformare şi

distribuţie. Procedurile operaţionale standard sunt definite şi trebuie respectate în fiecare

etapă. Pentru a asigura calităţii sanitare în timpul depozitării, trebuie ca spaţiile de depozitare

să fie dotate cu instalaţii conforme şi proprii.

Contaminarea externă prin aer şi apă, trebuie să fie supravegheată. Din practicile care

trebuie respectare pentru limitarea contaminării alimentelor amintim: curăţarea

echipamentelor, o bună igienă personală şi purtarea îmbrăcămintei de securitate. Pentru

fiecare produs, echipa HACCP trebuie să studieze dacă micotoxinele care constituie un

pericol pentru sănătate sunt susceptibile de a fi prezente şi dacă da, care sunt acelea.

Eliminarea completă a micotoxinelor din alimente contaminate nu se poate realiza la ora

actuală, obiectivul fiind acela de a reduce la minim apariţia acestor toxine prin bune practice

agricole. Principiile pentru prevenirea şi reducerea micotoxinelor diferă în funcţie de cultură,

climat şi practice agricole locale. Este important ca producătorii să considere că bunele

practice agricole (BPA) reprezintă primul mod de a lupta împotriva contaminării cerealelor

cu micotoxine, apoi aplicarea bunelor practice de fabricaţie (BPF), depozitarea, transformarea

şi distribuţia cerealelor destinate alimentaţiei umane şi animale. Elaborarea codurilor de

folosire naţionale fondate pe principii generale şi reducerea codurilor specifice pentru

anumite specii de cereale va ameliora aplicabilitatea acestor principii, în particular pentru

culture ca porumbul.

Aceste principii descriu factorii care favorizează infectarea, dezvoltarea şi producţia de

toxine în culture cerealiere la nivelul expoatării ca şi metodele de luptă împotriva acestor

toxine. Trebuie subliniat că strategia trebuie aplicată atât în timpul semănării, cât şi în timpul

recoltării şi după recoltare, dar va depinde de cultura, condiţiile climatice şi va trebui să se

ţină cont de specificitatea locală a culturilor şi modul de producţie în vigoare în fiecare ţară

sau regiune. În consecinţă, toate intervenţiile în lanţul de aprovizionare vor trebui aplicate, la

intervale regulate, evaluarea riscurilor, luarea măsurilor pentru prevenirea sau reducerea la

minimum a contaminării cu mucegaiuri fiind de asemenea obligatorie.

Aceste evaluări care ţin cont de tipul de cultură considerată (grâu, porumb, etc.), se arată

a fi foarte utile.

2912129


Calea de transmitere a infecţiei şi dinamica formării toxinelor diferă de la o cultură la alta şi

sunt influenţate de factori agricoli. Sistemele de cultură în care este inclus porumbul în rotaţie

prezintă un risc ridicat. Grâul şi alte cereale produse în acelaşi sistem de cultură în rotaţie sau

în apropierea acestuia trebuie să facă de asemenea obiectul unei gestionări şi a unei inspecţii

riguroase.

Contaminarea cerealelor cu mucegaiuri se datorează acţiunii mai multor factori. Bunele

practice nu permit controlarea tuturor factorilor, de exemplu, condiţiile climatice.

Parametrii agroclimatici care favorizează producţia de micotoxine sunt:

incidenţa infecţiei cu fungi potenţial toxigeni a porumbului (procente);

severitatea contaminării cu aflatoxina Bl (ng/g);

media temperaturii minime din august;

media umidităţii maxime din iulie;

numărul săptămânilor din timpul perioadei de vegetaţie în care media temperaturii

maxime săptămânale a depăşit 32°C;

media temperaturii maxime din iulie;

media umidităţii minime din iulie;

numărul de săptămâni din timpul perioadei de vegetaţie în care media săptămânala a

umidităţii maxime a depăşit 90%;

variabila compensatorie indicând localităţile cu 0-5 săptămâni în care temperatura

săptămânala maxima a depăşit 32°C;

variabila compensatorie indicând localitatea cu 11-15 săptămâni în care temperatura

săptămânala maxima a depăşit 32°C;

constanta funcţiei lineare;

numărul de săptămâni din timpul perioadei de vegetaţie în care media săptămânală a

umidităţii maxime a depăşit 90%;


temperaturii maxime a depăşit 38°C;


temperaturii minime a depăşit 21°C;


umidităţii minime a depăşit 55 %.

În plus, nu toţi factorii au aceeaşi importanţă şi aceşti factori diferiţi pot de asemenea

antrena o contaminare cu micotoxine. În consecinţă, este important să se adopte o strategie

3012130


integrată ţinând cont de toţi factorii de risc. În particular, trebuie să se evite acumularea

diferiţilor factori de risc în funcţie de interacţiunile lor posibile.

Este de asemenea primordial să se ţină cont de rezultatele obţinute în anii precedenţi în

materie de prevenire şi formare a mucegaiuri lor şi micotoxinelor pentru ai exploata în

vederea definirii măsurilor care trebuie luate pentru a preveni formarea micotoxinelor în

următorii ani.

Principiile prezentate mai sus duc la principalii factori de care trebuie să se ţină cont în

lupta împotriva contaminării cu micotoxine în câmp; rotirea culturilor, gestionarea solului,

alegerea speciile sau hibrizilor şi folosirea adecvată a fungicidelor. În ceea ce priveşte

gestionarea riscurilor, legată de contaminarea cu micotoxine, aplicarea bunelor practici

agricole, descrise de un comitet de experţi FAO/WHO în 2000, poate permite limitarea pe cât

posibil contaminarea cu micotoxine.

3.1.1 Practici recomandate înaintea recoltării

ROTIREA CULTURILOR

Rotirea culturilor constituie în general un mod eficace de a reduce riscul contaminării în

funcţie de sursaa fungică şi specia cultivată. Este foarte eficientă pentru a reduce

contaminarea cerealelor de iarna în particular. Culturile care nu sunt contaminate de specii de

Fusarium, care afectează în general cerealele, precum cartofii, trifoiul, lucerna sau alte

legume, trebuie să fie cultivate prin rotaţie pentru a reduce contaminarea câmpului. Cerealele

cu bobul mic, cum ar fi grâul, trebuie să fie semănate numai după o evaluare a riscurilor de

infecţie cu mucegaiuri.

Interacţiunea semnificativă descoperită între cultura precedentă şi gestionarea solului a

pus în evidenţă importanţa rămăşiţelor de la cultura gazdă în ciclul vieţii patogenilor. S-a

constat că, conţinutul în desoxinivalenol este mult mai mare în cazul cultivării grâului după o

cultură contaminată cu ssp de Fusarium, decât porumbul sau alte cereale.

ALEGEREA SPECIILOR SAU A HIBRIZILOR

3112131


Se recomandă să se aleagă hibrizi sau specii mai bine adaptate la natura solului, sau la

condiţiile climatice şi la practicile agricole uzuale. Acest lucru reduce stresul vegetalelor şi va

proteja mai mult cultura împotriva unei infecţii fungice. Se recomandă să se folosească, când

există, specii de seminţe selecţionate pentru rezistenţa la mucegaiuri sau insecte parazite.

Alegerea speciilor pentru rezistenţa lor la infestarea cu mucegaiuri se face ţinând cont şi de

riscul infestării.

PLANIFICAREA CULTURILOR

Pe cât este posibil, culturile trebuie să fie planificate pentru a evita condiţiile climatice

care prelungesc coacerea în câmp înainte de recoltare. Uscarea trebuie de asemenea

considerată ca fiind un factor de risc în cazul contaminării cu mucegaiuri. Trebuie să se evite

plantarea apropiată a plantelor. Din acest motiv se recomandă respectarea spaţiilor între

rânduri şi între plante. Informaţia referitoare la aceste spaţii poate fi furnizată de producătorii

de seminţe.

GESTIONAREA SOLULUI ŞI A CULTURILOR

La cultivare, trebuie să se ţină cont de riscurile eroziunii şi de buna gestionare a solului.

Toate practicile agricole distrug sau ascund reziduurile culturilor infectate, aratul permiţând

după toate aparenţele reducerea contaminării culturii următoare cu mucegaiuri. Pământul

trebuie semănat astfel încât să se lase o suprafaţă de semănat rugoasă, o zonă de semănat

grosieră, pentru a favoriza infiltrarea apei şi reducerea la minimum a riscului de eroziune a

solului şi nutrienţilor săi. Se recomandă pe cât posibil pregătirea suprafeţelor destinate

semanării prin arare, înlăturarea speciilor rămase pe câmp de la cultura precedentă, precum şi

înlăturarea tijelor şi a altor rămăşiţe vegetale care pot servi ca substrat pentru dezvoltarea

mucegaiurilor producătoare de micotoxine. În zonele care sunt expuse eroziunii, practicile de

lucru pot fi cuplate cu cele de conservare. O atenţie deosebită trebuie acordată gestionării

reziduurilor recoltei susceptibile de a favoriza contaminarea culturii următoare cu

mucegaiuri; aceste reziduuri trebuie să fie sfărâmate cât de fin posibil şi încorporate în sol

astfel încât să se faciliteze descompunerea lor.

Trebuie să se evite pe cât posibil stresul plantelor. Există numeroşi factori de stres: seceta,

frigul, carenţele în nutrienţi şi reacţiile nedorite între materialele folosite pentru cultură.

3212132


Referitor la măsurile luate pentru a evita stresul plantelor, de exemplu irigaţiiile, trebuie să se

reducă la minim riscul ulterior de infestare fungică prin evitarea irigării prin stropire în timpul

dezvoltării organelor florale.

Irigarea este o metodă valabilă pentru reducerea stresului cauzat plantelor în anumite condiţii

de creştere. Un aport optim de nutrienţi este esenţial pentru a evita o „slăbiciune" a plantei,

susceptibilă favorizării unei infestări cu mucegaiuri. Trebuie să se asigure un aport în

nutrienţi specifici plantei.

Tratamentele seminţelor cu fungicide sunt eficace împotriva numeroaselor tipuri de

seminţe. Este recomandat să se aplice măsuri de prevenire, pe cât posibil, pentru a reduce la

minimum infestările fungice şi pagubele cauzate de insecte şi să se folosească, dacă e nevoie,

insecticide şi fungicide agreate si omologate pentru lupta împotriva mucegaiurilor. Dacă este

inoportună folosirea pesticidelor, cum este cazul agriculturii biologice, trebuie să se facă apel

la practici adecvate. Trebuie subliniat că aplicarea fungicidelor în timp util este crucială

pentru lupta împotriva infestărilor fungice. Aceste tratamente trebuie să se bazeze pe

informaţii meteorologice şi/sau anchete asupra recoltelor. Infestarea se derulează de obicei în

timpul înfloririi, ceea ce înseamnă că micotoxinele pot fi produse. Dacă o infestare fungică

este descoperită ulterior în cultură, trebuie să se ţină cont de manipularea produselor, de

amestecarea şi folosirea cerealelor.

Specii de mucegaiuri cu potenţial toxicogen au fost izolate pe un număr mare de ierburi şi

specii de ierburi cu frunzele late. S-a arătat că o densitate ridicată de ierburi implică o

infestare mare cu mucegaiuri. Ierburile prezente în culturi trebuie să fie combătute prin

mijloace mecanice sau prin ierbicide omologate sau alte practici de înlăturare.

S-a stabilit că „culcarea la pământ" a plantelor are un efect semnificativ asupra cantităţii

de micotoxine în cereale. În consecinţă, plantele culcate la pamânt trebuie evitate în timpul

recoltării, în special daca ele sunt umede şi prezintă primele semne ale germinării. Pentru a

evita „culcarea la pământ" a culturilor, se recomandă folosirea judicioasă a îngrăsămintelor şi

aplicarea regulatorilor de creştere. Trebuie să se evite scurtarea excesivă a tijelor.

3.1.2 Practici recomandate în timpul recoltării

Evaluarea calităţii cerealelor înaintea recoltării, ţinând cont de limitele unei eşantionări

reprezentative şi o analiză rapidă pe teren. Separarea, dacă este posibilă, a cerealelor pe baza

3312133


exigenţelor calităţii pieţei - de exemplu - pentru producţia de pâine sau hrană pentru animale -

şi calitatea culturii vechi - umedă, curată sau uscată.

Recoltarea să se facă pe cât posibil atunci când conţinutul de apă al plantei să fie adecvat.

Întârzierea recoltării cerealelor deja contaminate cu mucegaiuri poate provoca o creştere

sensibilă a conţinutului de micotoxine în cultură. Trebuie să se ţină cont de posibilitatea

uscării în cazul în care cultura nu poate fi recoltată în condiţii optime de conţinut de apă.

Înainte de recoltare trebuie să se verifice dacă echipamentul care va fi folosit la recoltare şi

depozitare este în stare bună. O defecţiune în această perioadă critică poate dăuna calităţii

cerealelor şi favoriza formarea micotoxinelor. Trebuie de asemenea verificat şi etalonat

echipamentul necesar pentru măsurarea conţinutului de apă. Trebuie să se evite pe cât posibil

sfărâmarea mecanică a cerealelor şi contactul cu solul în timpul recoltării. Cerealele cu boabe

zbârcite şi mici pot prezenta mai multe micotoxine decât cele cu dimensiune normală. Este

posibilă reducerea conţinutului de micotoxine prin eliminarea boabelor zbârcite prin reglare

corectă a combinei sau printr-o triere post- recoltare pentru a elimina boabele stricate şi alte

particule străine.

3.1.3 Practici recomandate privind uscarea cerealelor

Trebuie să se determine conţinutul de apă al culturii înaintea recoltării sau imediat după

recoltare. Eşantioanele prelevate în acest scop trebuie să fie cât mai reprezentative. Se

recomandă pe cât posibil uscarea cerealelor pentru a atinge conţinutul de apă recomandat

pentru depozitare. În cazul cerealelor umede care trebuie să fie uscate, se va reduce la

minimum perioada cuprinsă între recoltare şi uscare. În consecinţă, va trebui, în anumite

cazuri, să se planifice recoltarea în funcţie de capacitatea de uscare.

Cerealele trebuie să fie uscate astfel încât conţinutul în apă să fie inferior celui care va

permite dezvoltarea mucegaiurilor în timpul depozitarii. O activitate a apei inferioară valorii

de 0,65 corespunde în general unui conţinut în apă mai mic de 15%. Trebuie să se stabilească

valori precise ale conţinutului de apă, ţinând cont de condiţiile locale de depozitare. Este o

necesitate pentru prevenirea dezvoltării unui anumit număr de specii fungice care se pot găsi

în cereale înaintea uscării.

Dacă cerealele umede trebuie să fie depozitate fară să fie uscate, mucegaiurile se vor

dezvolta în câteva zile şi vor provoca reîncălzirea lor.

Cerealele trebuie să fie uscate astfel încât să se reducă la minimum pagubele cauzate de

dezvoltarea mucegaiurilor. Aerarea cerealelor umede poate evita supraîncălzirea înaintea

3412134


uscării. Evitarea pe cât posibil a amestecării loturilor de cereale care prezintă riscuri diferite

de contaminare.

Pentru a reduce variaţia conţinutului de apă în lot, cerealele se pot transfera în altă

instalaţie sau în alt depozit după uscare.

3.1.4 Practici recomandate la depozitarea cerealelor

Pentru mărfurile ambalate trebuie să se asigure că sacii sunt curaţi şi uscaţi şi sunt aşezaţi

pe paleţi sau au intercalat între ei un strat impermeabil.

Aerarea pe cât posibil a cerealelor, prin trecerea circulară a aerului în zone de depozitare

pentru a menţine o temperatură apropiată şi uniforma în toate aceste zone. Controlul regulat

al conţinutului de apă şi temperatura cerealelor depozitate în timpul depozitării este necesară.

Un miros neplăcut poate arăta că boabele sunt încinse, în cazul în care locul depozitării este

închis, lipsit de ventilaţie.

Măsurarea temperaturii cerealelor depozitate la intervale determinate în timpul

depozitarii. O creştere a temperaturii poate indica o dezvoltare microbiana şi/sau o infestare

cu insecte. Separarea părţilor aparent infestate şi prelevarea de eşantioane pentru analiză.

Scăderea temperaturii cerealelor rămase şi aerarea este o metodă eficientă pentru a împiedica

dezvoltarea mucegaiurilor. Evitarea folosirii cerealelor contaminate pentru producţia de

alimente destinate consumului uman şi animal.

Folosirea metodelor de întreţinere dupa reducerea la minimum a prezenţei insectelor şi

formarea mucegaiurilor în depozite. Folosirea insecticidelor şi fungicidelor agreate sau altor

metode adaptate. Alegerea produselor chimice care nu influenţează calitatea cerealelor şi

folosirea acestora în cantităţi prescrise.

Folosirea unui agent de conservare agreat (de exemplu acizi organici - acidul propionic)

poate avea efecte benefice pentru cerealele destinate alimentaţiei animale. Acidul propionic şi

sărurile sale sunt fungistatice şi sunt uneori folosite pentru conservarea cerealelor recoltate

umede, evitând pe cât posibil incingerea sau mucegăirea înaintea aplicării tratamentului.

Aceste produse trebuie să fie aplicate rapid cu ajutorul echipamentelor adecvate astfel încât

să se obţină o repartiţie uniformă în tot lotul tratat. Daca cerealele sunt tratate după o perioadă

de depozitare umedă, prezenţa agentului de conservare nu constituie o garanţie a

necontaminării.

3.1.5 Practici recomandate în timpul transportului produselor35121

35


Maşinile destinate transportului cerealelor trebuie să fie uscate şi lipsite de mucegaiuri

vizibile, insecte şi alte materiale contaminate. Dacă este necesar, trebuie să se cureţe şi

dezinfecteze înainte şi după folosire, fiind adaptate destinaţiei prevăzute. Folosirea

fumigatelor şi ierbicidelor omologate poate fi util. Se vor proteja cerealele, în timpul

transportului, de umezeală. Se vor evita fluctuaţiile de temperatură şi intervenţiile care ar

putea provoca o condensare a suprafeţei cerealelor, ceea ce va conduce la o creştere localizata

a nivelului umidităţii care va favoriza dezvoltarea mucegaiurilor şi formarea micotoxinelor.

3.1.6 Evitarea pătrunderii insectelor, pasărilor si rozătoarelor în timpul transportului.

Totuşi, aplicarea practicilor agricole nu este suficientă pentru a împiedica contaminarea.

Strategiile de decontaminare sunt dezvoltate pentru a face faţă acestei probleme.

3.2. Strategii curative: decontaminarea

Jemmali (1979) şi Park si col. (1988) au propus criterii specifice pentru validarea

procedurilor de decontaminare a micotoxinelor în produsele alimentare. Pentru a fi considerat

eficace, acest procedeu trebuie să răspundă următoarelor exigente:

o trebuie să inactiveze, distrugă sau să elimine toxina;

o nu trebuie să genereze sau să lase reziduuri toxice în produs;

o trebuie să menţină calităţile nutritive ale alimentului;

o trebuie să fie acceptabil pentru alimentaţia umană şi animală;

o nu trebuie să modifice în mod semnificativ proprietăţile tehnologice

o ale produsului;

o trebuie să distrugă dacă este posibil sporii şi mucegaiurile;

O altă strategie constă în limitarea efectelor toxice ale micotoxinelor prin ingerarea de

agenţi chelaţi ai toxinei ca aluminosilicaţii de sodiu sau calciu hidrataţi, sau cu ajutorul aditivilor

alimentari (vitamine, aspartam, melatonine, piroxicam sau acid lactic şi acid ascorbis),

contribuind la protecţia parţială a organismului faţă de toxicitatea micotoxinelor.

3.2.1. Metode fizice

3612136


Metodele fizice pot fi clasificate în două categorii:

metode care conduc la eliminarea fracţiunilor alterate;

metode care produc denaturarea toxinelor.

Rezultatele obţinute în funcţie de tipul de aliment şi de toxinele în cauză sunt prezentate în

tabelul 7.

3.2.1.1 Eliminarea fracţiunilor alterate

Pentru eliminarea părtilor alterate de materie prima se intervine cu diferite metode de

curăţire sau separare. Aceste metode, uneori foarte simple prezintă un interes evident în cazul

contaminărilor localizate sau când distribuţia toxinei în produs este eterogenă.

a) Curăţirea

O simplă triere manuală a produselor contaminate cu mucegaiuri permite o diminuare

însemnată a conţinutului de toxină. Această triere poate fi mărită dacă se realizează în mod

electronic. Plutirea şi segregarea prin densitate a cerealelor contaminate cu mucegaiuri permit

reducerea conţinutului mediu de micotoxină cu peste 90%; 95% din aflatoxine sunt localizate

în boabele care plutesc pe apă. Cernerea porumbului contaminat cu fumonisine permite

reducerea conţinutului de toxine, boabele sparte conţin de 10 ori mai multe micotoxine decât

boabele intacte. Curăţarea, polizarea şi aspirarea boabelor de grâu, permit o eliminare parţială

a desoxinivalenolului, 60-80% rămânând totuşi în făină

b) Măcinarea fină, înmuiere şi separare

Studii efectuate pentru porumb au arătat că măcinarea fină a acestuia permite separarea

diferitelor fracţiuni a căror nivel de contaminare cu toxine este variabil.

În timpul unei măcinări umede, aflatoxina B1 se regăseşte în principal în apa de înmuiere

a porumbului (39-42%) şi în fibre (30-38%), restul fiind repartizat în gluten (13-17%),

germeni (6-10%) şi amidon (1%).

Zearalenona este concentrată în gluten (49-56%) şi în substanţele solubile (17-26%), dar

este absentă în amidon. Substanţele solubile zdrobite conţin de patru ori mai multă

zearalenonă decât originalele şi fracţiunile de gluten. Totuşi, aceste fracţiuni reprezintă

14-19% din porumb, reprezentând 72-75% din părţile contaminate cu zearalenonă.

3712137


Fumonisinele se concentrează în apa de înmuiere. Pentru porumbul puţin contaminat,

(1.0pg/kg), nici o fracţiune nu a putut fi detectată în fracţiunile tratate.

Pentru porumbul foarte contaminat (13.9mg/kg), o parte din toxină este regăsită în apa de

înmuiere şi de tratament, alte fracţiuni contaminate se găsesc în ordine descrescătoare în:

gluten >fibre>germen.

În ceea ce priveşte desoxinivalenolul, marea parte a toxinei se găseşte în apa de înmuiere,

deşi cantităţi măsurabile rămân în amidon. La fel s-a arătat că 67% din toxina T-2 este

eliminată prin apa de înmuiere şi de tratament.

În sfârşit, 43% din ochratoxina A se regăseşte în apa de tratament a porumbului şi în

substanţele solubile de tratament ulterior, 4% în germen şi 51% în crupe.

Nivelul de contaminare al diferitelor fracţiuni de porumb este diferit dacă măcinarea se

realizează uscat. Aflatoxinele se regăsesc concentrate în fracţiunile „germen" şi „înveliş".

Crupele şi făina (produse principale) care nu conţin decât puţină materie grasă, conţin doar

6-10% din cantitatea de aflatoxine. Aflatoxina B1 se găseşte de asemenea în partea periferică

a boabelor de grâu tari. În ceea ce priveşte zearalenona, toate fracţiunile uscate conţin

micotoxine, doar 3-10% pot fi eliminate prin măcinare uscată. Pentru aflatoxine nivelul cel

mai ridicat se regăseşte în fracţiunile cu cantităţi mari de materii grase.

În concluzie, eliminarea fracţiunilor alterate trebuie să fie preconizată de fiecare dată

când este posibilă. Eficacitatea sa este legată de natura invaziei fungice (contaminare de

suprafaţă sau de profunzime) şi de caracteristicile toxinelor (concentraţia aflatoxinelor în

fracţiunile bogate în grăsimi, concentraţia fumonisinelor hidrosolubile în apa de înmuiere).

Dacă echipamentul de separare este standardizat, anumite metode pot prezenta interes în

tratamentul anumitor materii prime (cernerea porumbului de exemplu în vederea diminuării

nivelului contaminării cu fumonisine).

Tabel 14. Compararea eficienţei metodelor fizice de decontaminare

Metoda Produs Toxina Eficienţa

3812138


Curăţire şi eliminareTriere electronica/manuala arahide aflatoxine ++

Plutire şi separare(densitate)

arahide, porumb aflatoxine +++

Cernere porumb fumonisine +++Curăţire şi polizare grâu deoxinivalenol -Măcinare si separare

Măcinare umeda porumb aflatoxine +/-zearalenone +/-

Înmuiere porumb fumonisine ++grâu deoxinivalenol ++porumb ochratoxina A ++

Măcinare uscata porumb aflatoxine +/-zearalenona +/-

Tratamente termiceCăldura umedă toate produsele aflatoxine + sau -

porumb fumonisine + sau -Prăjire toate produsele aflatoxine + sau -Căldura uscata făina ochratoxine ++ Căldura toate produsele tricotecene -Iradiere toate produsele aflatoxine -

+++ : eliminarea sau denaturare mai mult de 90%; ++: eliminare sau denaturare cuprinsă între

70-90%;+ : eliminare sau denaturare cuprinsă între 50-70%; -: eliminare în anumite fracţiuni;

+ sau: eliminare moderată, variabila dupa tratamentul efectuat.

3.2.1.2 Denaturarea toxinelor

Denaturarea prin tratament fizic a micotoxinelor presupune intervenirea mecanismelor de

degradare complexă bazată pe o deshidratare a micotoxinelor sau intervenţia reacţiilor

radicale. Aceste metode prezintă doua inconveniente majore:

lasă produse de degradare în materia primă. Toxicitatea acestor reziduuri trebuie să

fie evaluată;

tratamentul alimentelor poate modifica mult valoarea nutritivă.

Tratamente termice

3912139


Aflatoxinele sunt rezistente la degradare termica şi nu sunt distruse cu apa clocotită, prin

autoclavare sau prin numeroase procedee termice de transformare a alimentelor. Mai mult de

50% din conţinutul de aflatoxine sunt regăsite în alimente după gătirea orezului. Aflatoxina

Bl rezistă la căldură, iar aflatoxina Ml rezistă la pasteurizare. Diferitele tehnici de prăjire a

cafelei, porumbului sau arahidelor permit o diminuare parţială a conţinutului de aflatoxine în

produsele finite. Fumonisinele sunt de asemenea considerate ca fiind rezistente la căldură.

Ochratoxina A este sensibilă la tratamentele termice, mai ales în cazul în care acestea se

fac în lipsa apei. Încălzirea făinii la 250°C timp de 40 minute, permite o reducere cu 76% a

nivelului de contaminare, 62% din conţinutul de ochratoxina A dispare în timpul preparării

biscuiţilor, chiar dacă micotoxina nu este degradată în timpul fabricării pâinii.

Desoxinivalenolul este cel mai stabil la tratamentele termice decât toate micotoxinele

testate.

Iradiere

Efectele radiaţiilor asupra micotoxinelor sunt puţin cunoscute. O iradiere de 2.5 Mrad nu

degradează aflatoxinele într-un aliment pe bază de alune, în timp ce expunerea la UV a

uleiului de arahide sau cocos contaminat artificial va permite reducerea conţinutului de

aflatoxine. Aceste efecte sunt mai puţin importante în cazul unei contaminări naturale a

alimentelor.

Aplicarea unei doze de raze X asupra unui aliment pentru a distruge aflatoxinele are ca

efect distrugerea alimentului.

În concluzie denaturarea fizica a toxinelor nu poate fi propusă ca o metodă sistematică

de decontaminare. Amintim totuşi că diferite tratamente (termice în special) sunt aplicate

materiei prime sau alimentelor în timpul păstrării sau fabricării. Aceste tratamente pot

diminua parţial toxicitatea alimentelor produse, dar nu trebuie considerate în nici un caz ca

fiind tehnici de „asanare" a materiei prime contaminate.

3.2.2. Denaturare chimică

O modificare a structurii micotoxinelor poate fi efectuată prin diferite tipuri de reacţii

chimice (hidroliza epoxizilor şi esterilor, oxidări). Metoda folosită este obligatoriu specifică

structurii compusului degradat, şi pentru aceeaşi familie de micotoxine.

Efectele diferitelor tratamente chimice ale alimentelor conform toxinelor în cauză sunt

prezentate în tabelul 15.

4012140


Tabel 15. Compararea metodelor chimice de decontaminare

Metoda Toxina Eficienţa Acizi si baze Amoniacare aflatoxine +++

fumonisine ? Nixtamalizare aflatoxine + şi?

fumonisine ? Nixtamalizare+H2O2 fumonisine ?

Oxidanţi si redactori Apa oxigenată aflatoxine + Bisulfiti aflatoxine +Glucoză, fructoză fumonisine +

+++: denaturare şi diminuare importantă a toxicităţii; +: efect benefic;

-: efect nefast; ?: denaturare farà modificarea toxicităţii.

3.2.2.1 Acizi si baze

Aflatoxinele pot fi degradate în mediu foarte acid sau foarte alcalin, dar timpul necesar

acestei degradări face inaplicabilă folosirea directă a acizilor sau bazelor pe alimente.

O decontaminare eficientă poate fi obţinută prin asociere cu presiunea, temperatura şi

compuşi alcalini. Aceste tehnici au fost perfecţionate şi sunt cunoscute astăzi sub denumirea

de amoniacare şi nixtamalizare.

Amoniacarea porumbului, arahidelor şi altor materii prime este larg utilizată pentru a

diminua conţinutul în aflatoxine din alimente. Este o metodă eficace de decontaminare a

hranei animaliere, folosită dupa mulţi ani în Statele Unite, în Franţa, Sudan, Brazilia, Mexic

şi în Africa de Sud. O utilizare simultană a temperaturilor înalte şi a presiunilor înalte face

metoda mult mai eficace.

Tratamentul cu amoniac la presiuni atmosferice şi la temperatura mediului ambiant

reduce conţinutul în fumonisine din materialul de cultură, dar nu reduce toxicitatea unui

produs atunci când este administrat pe cale orală la şoareci. O reducere de 79% a conţinutului

de fumonisine în porumb poate fi observată după un tratament de amoniacare la presiune

înaltă şi temperatura mediului ambiant urmat de un tratament la presiune joasă şi temperatură

înaltă.

Nixtamalizare sau tratament alcalin la căldura, utilizat la elaborarea pesmetului de

porumb, reduce semnificativ conţinutul de aflatoxine. Totuşi studii ulterioare au arătat că o

parte din aflatoxine sunt regenerate în timpul acidifierii produselor.

4112141


Deşi nixtamalizarea reduce conţinutul de fumonisine Bl din alimente prin hidroliza

micotoxinelor, toxicitatea lor nu este diminuată. Această tehnică nu este deci o strategie

valabilă de detoxifiere a fumonisinelor. A fost propusă o metodă de nixtamalizare modificată,

prin adăugare de peroxid de hidrogen şi bicarbonat de sodiu. Folosirea pe alimente

contaminate, conduce la o reducere cu 40% a mortalităţii creveţilor de mare (prin comparare

cu alimentele tratate fără adăugare de peroxid de hidrogen şi bicarbonat de sodiu). Trecerea

în mediu acid sau alcalin nu conduce la accelerarea degradării micotoxinelor. Patulina va fi

astfel mult mai sensibilă în mediu acid decât în condiţii de pH apropiat de valori ale

neutralităţii.

3.2.2.2 Oxidanţi şi reducatori

Am amintit deja că adăugarea peroxidului de hidrogen la o metodă de nixtamalizare

clasică ameliorează eficacitatea lor în denaturarea fumonisinelor.

Folosirea peroxidului de hidrogen a fost propus pentru denaturarea aflatoxinei Ml.

Degradarea toxinei este accelerată prin adăugare de riboflavine care vor cataliza formarea

oxigenului reactiv plecând de la peroxidul de hidrogen.

Bisulfitul de sodiu sau de potasiu permit o degradare parţială a aflatoxinelor 50% din

toxinele din soluţie apoasă la un pH de 5.5 vor fi degradate după 150 ore în prezenţa a 3000

ppm bisulfit. Timpul necesar acestei degradări scade prin creşterea temperaturii. Efectul

bisulfitului va fi obţinut şi pe porumb contaminat. O diminuare a toxicităţii in vitro a

aflatoxinelor B1 va fi observată când se încălzesc în prezenţa glucozei şi fructozei.

Oxidanţii şi reducătorii folosiţi singuri nu prezintă un interes scăzut în contaminarea

alimentelor cu micotoxine. Folosirea reducătorilor poate fi eficace în alte circumstanţe cum ar

fi contaminarea sucului de mere cu patulina. Această micotoxină este astfel degradată cu

ajutorul dioxidului de sulf.

O soluţie cu 2000 ppm dioxid de sulf permite distrugerea a 90% din patulina din sucul

de fructe (concentraţia iniţială de 15 ppm).

Acidul ascorbic accelerează degradarea patulinei şi acidului penicilic din sucul de mere.

Cu ajutorul vitaminei C (5%) la un suc de mere contaminat (300 ppb) va permite o reducere a

nivelului de contaminare cu aproximativ 80%, după 15 zile de conservare la 4°C.

3.2.3. Adsorbţia toxinelor

4212142


Imobilizarea unui xenobiotic prin legătura noncovalentă a adsorbanţilor constituie o

metoda de „decontaminare" din ce în ce mai mult folosite când micotoxinele sunt prezente în

alimente.

Această tehnică poate fi performantă pentru anumite toxine sub rezerva alegerii

apropiate a adsorbantului. Termenul de adsorbţie a toxinelor poate avea de asemenea o

eficienţă foarte scăzută când este folosit în alimentaţia animală pentru alte motive:

proprietăţile fluidifiante ale argilelor, efectele benefice ale anumitor adsorbanţi, obişnuinţa,

din motive comerciale.

Obiectivele sunt precizarea interesului pe care îi pot avea adsorbanţii în folosirea lor cu

materii prime contaminate cu micotoxine.

3.2.3.1 Argilele

Termenul de argilă corespunde compuşilor formaţi din silicaţi lamelari, mai mult sau mai

puţin hidrataţi, provenite din alterarea silicaţilor cu structura tridimensională. Când aluminiul

este prezent aceşti compuşi sunt numiţi aluminosilicati. Absorbţia puternică a aflatoxinelor de

aceşti compuşi, asociată cu o diminuare netă a toxicităţii alimentelor contaminate este după

toate aparenţele originea argumentului actual pentru adsorbanţi.

Efectele benefice ale argilelor în alimentaţia animală în absenţa contaminării cu

micotoxine, au fost foarte mult studiate. Aceşti compuşi interferă cu absorbţia

oligoelementelor, efectele nefaste fiind de asemenea raportate.

Aluminosilicaţii de sodium şi de calciu hidratat

Cele mai cunoscute sunt „HSCAS" (aluminosilicaţii de sodiu şi calciu hidratat).

Aluminosilicaţii de sodiu şi de calciu (tabel 16) constituie clasa de alunimosilicaţi foarte

studiaţi pentru proprietăţile sale adsorbante. Aceşti compuşi fac parte din familia zeolitelor

având un deficit în sarcina pozitivă, constituind excelenţi adsorbanţi de cationi.

Aluminosilicaţii prezintă remarcabile proprietăţi adsorbante vis-a vis de aflatoxine,

complexul format fiind stabil pentru un gram de pH activ de 2.5-10. Aflatoxinele astfel

adsorbite sunt imobilizate, mai puţin de 10% pot fi extrase cu solvenţi organici. Această

adsorbţie este un proces care se realizează rapid şi intens. 1 mg de HCSAS poate fixa mai

mult de 200 nmoli AFB1. Această puternică fixare explică faptul că sunt necesare cantităţi

4312143


foarte mici de HCSAS în alimente pentru a diminua efectele negative ale aflatoxinelor. Este

acompaniat de o diminuare a conţinutului de A FM 1 în lapte.

Proprietăţile adsorbante ale HCSAS au fost testate şi pentru alte micotoxine. Rezultatele

obţinute vis-a vis de zearalenonă sau ochratoxina A sunt parţiale, iar în ceea ce priveşte

tricotecinele rezultatele sunt înşelătoare.

Tabel 16. Formule brute ale HSCA

Nume FormuleMezolita Na2Ca2A16Si9O30-8H2OStilbita NaCa2 A15 Si 13 036-14H20Tomsonita NaCa2A15Si5O20-6H2OGmelinite (Na2,Ca)A12Si4012-6H20Heulandite (Ca,Na)2.3Al3(Al,Si)2Sii3036-12H20

Zeolitele

Zeolitele sunt substanţe cristalizate cu o structură formată din tetraede interconectate de

SiO4 şi AlO4. Pentru a face parte din familia zeolitelor, aluminosilicaţii trebuie să respecte

proporţia de 0.5 între (Si+Al)/O. Tetraedrul aluminosilicaţilor este încărcat negativ, lăsând un

spaţiu mare între molecule, izolând cationi (de obicei şi/sau ). În zeolitele folosite

ca absorbant spaţiile libere sunt interconectate, formând un spaţiu mare capabil să adsoarbă

compuşi cu masă mai mare decât sodiu sau calciu. Pe de altă parte, aceşti compuşi se

deshidratează şi hidratează foarte uşor, modificându-şi astfel structura.

În ceea ce priveşte adsorbţia micotoxinelor, efectele zeolitelor au fost testate în prezenţa

aflatoxinelor. Adsorbţia AFB în soluţie în diferite medii a fost în jur de 60% in vitro. Această

adsorbţie, deşi inferioară în prezenţa compuşilor azotaţi, va diminua toxicitatea alimentelor

care conţin 2.5 ppm aflatoxine.

Originea zeolitei este fundamentală. Un studiu comparativ între 5 forme arată diferenţe

de protecţie, importanţa toxicităţii alimentelor contaminate cu aflatoxine la pui.

Zeolitele sunt sintetizate, în special de sodiu, devenind mai active.

Adăugarea de 5% zeolit anionic de sinteză într-un aliment care conţine 250 ppm

zearalenonă previne efectele toxinei la şobolani (câştig în greutate). Nu a fost observată nici o

protecţie cu zeolit cationic de sinteză. Originea zeolitelor folosite nu este menţionată iar

4412144


nivelul de contaminare cu zearalenonă este ridicat, făcând aceste rezultate dificil de exploatat

în practică.

Bentonitele

Bentonita este o argilă, formată prin îmbătrânirea cenuşelor vulcanice. Termenul de

bentonită regrupează deci diferite produse cu aceeaşi origine dar cu compoziţie diferită.

Compuse din aluminiu şi siliciu fac parte din marea categorie a aluminosilocaţilor. Unele sunt

bogate în sodiu altele în calciu, potasiu sau magneziu: toate conţin oligoelemente şi urme de

metale toxice (tabel 17). Originea bentonitei va fi foarte importantă însă în capacitatea de a

adsorbi toxinele.

Bentonita de sodiu este cel mai mult folosită în alimentaţia animală. Având în vedere

marea sa suprafaţă internă, acest compus adsoarbe în jur de 6-7 ori greutatea sa în apă.

Capacitatea sa de schimb cationic este în jur de 80-85 meq/100g.

Utilizările bentonitei sunt multiple. În alimentaţia animală este folosită în principal

pentru proprietăţile sale:

agent de legătură în alimente (peleţi), nivelul său de încorporare variază

între 1.5-3%;

agent anti-aglomerant în forme, pentru a evita formarea bulgarilor;

adsorbant al apei pentru a reduce pierderile de apă din depozite;

sursa de oligo-elemente, în principal seleniu şi magneziu.

În terapie, bentonita a fost folosită ca adsorbant în tratamentul de intoxicare. Proprietăţile

sale adsorbante vis-a vis de aflatoxine au fost explorate:

In vitro, 2% bentonită adsoarbe între 94-100% AFB1 (400pg) soluţie în tampon fosfat la

pH 4,5. Capacitatea adsorbantă variază în funcţie de natura bentonitei folosită. O extracţie cu

cloroform a complexelor formate furnizează un procent de recuperare care variază între

5-25%. În lapte, 2% bentonită adsoarbe 80% din doza de AFB1 (3-6ppb).

Procente de adsorbţie similare sunt observate la pH 2, şi pe amestec biologic complex

reprezentativ de lichide intestinale. Studii făcute pe alimente mucegăite arată că 10%

bentonită adsoarbe 70% din AFB 1 prezentă (44.6ppb).

In vivo, cu ajutorul bentonitei de sodiu, toxicitatea aflatoxinelor din alimentele

contaminate scade . Un nivel de încorporare de 5% prezintă efecte optime. O protecţie vis-a -

4512145


vis de efectele teratogene ale aflatoxinelor a fost observată la şobolani. Pentru bentonite, ca şi

pentru alte argile, nu sunt inhibate toate efectele negative ale aflatoxinelor.

Efectele bentonitei au fost de asemenea testate şi pentru toxicitatea toxinei T-2. La

şobolani, acţiunea negativă a acestei micotoxine este diminuată prin administrarea bentonitei

în alimentul contaminat cu 3 ppb toxina T-2. Efectul protector al bentonitei este mult

diminuat când nivelul de încorporare în raţie depăşeşte 5-10%. Efectul benefic poate fi

asociat cu o adsorbţie a toxinei, dar şi unei modificări a vitezei de tranzit intestinal. Nicele

foarte ridicate de încorporare face aceste rezultate dificil de aplicat în cazul alimentaţiei

animale.

Bentonita (2-5%) nu a avut nici un efect asupra toxicităţii zearalenonei (3 ppm) şi

nivalenolului (11.5 ppm) la porc. Nivelurile mari de contaminare cu toxine (zearalenona

3 ppm şi nivalenol 11.5 ppm) poate satura proprietăţile adsorbante ale bentonitei.

Proprietăţile adsorbante vis-a vis de ochratoxina A sunt variabile în funcţie de pH; insuficient

totuşi în toate cazurile pentru diminuarea concentraţiilor plasmatice în toxină.

Montmorrilonita permite, în soluţie de 2%, o adsorbţie de 95% din conţinutul de AFBI

prezent într-o soluţie tampon fosfat la pH de 6,5. O extracţie cu cloroform a complexelor

formate furnizează un procentaj de recuperare care variază între 10-57%. Rezultate similare

sunt obţinute în mediu lichid unde compoziţia este asemănătoare cu cea a lichidelor

intestinale. Echilibrul este atins după o oră, iar complexul format este stabil pentru un pH

cuprins între 2,5-7. Un gram montmorrilonită permite adsorbţia a mai mult de un miligram

aflatoxine.

Tabel 17. Compoziţia tipică a unei bentonite

Element Procentaj Impurităţi ProcentajSi02 60-65% Umiditate 5-10%AI2O3 15-20% Pietriş < 1%Fe203 <5% Arsenic 0.1-10 ppmMgO <5% Cadmiu 0.1-10 ppmNa20 < 5% Cupru 0.1-10 ppm

4612146


CaO > 1% Mercur 0.1-10 ppmK20 > 1% Plumb 0.1-10 ppmTi02 > 1% Zinc 0.1-10 ppm

Alţi filosilicaţi

Kalinul ( A12Si205(OH)4) sau silicatul de aluminiu este un fílosilicat folosit în tratarea

ulcerelor gastrice; este de asemenea dotat şi cu proprietăţi adsorbante. In vitro, concentraţia

de 2% permite adsorbţia de 87% din conţinutul de AFBI (8 ppm) prezent într-o soluţie

tampon fosfat (6.5). Totuşi, adsorbită este uşor reversibilă, aproximativ 77% din toxina

rămâne extractibilă cu cloroform. Permite de asemenea decontaminarea arahidelor şi previne

efectele toxinei la şobolani în cazul unei contaminări a alimentelor de 5 ppm AFB1 ( adaos de

0.2-1% kaolin) Acest efect devine insuficient dacă nivelul de contaminare este mult mai mare

(20 ppm).

Sepiolita ((MgO)2(Si02)3, 2H20 sau silicatul de magneziu este de asemenea un filosilocat.

Folosind 2% sepiolită se poate adsorbi peste 87% din conţinutul de AFB1 (8 ppm) prezent

într-o soluţie tampon fosfat (pH 6,5). Această adsorbţie este reversibilă, peste 77% din toxină

rămânând extractibilă cu cloroform. Se explică astfel efectele protectoare ale sepolitelor 0.5%

în aliment vis-a- vis de toxicitatea AFB1 (800 ppm) la porc.

Carbonul activ este o pudră neagră nehidrolizabilă, obţinută prin piroliza diferitelor

tipuri de materii organice. Carbonul activ este folosit in vivo pentru adsorbţia toxicilor şi

toxinelor la om şi animal. Capacităţile sale adsorbante variază în funcţie de porozitatea sa

( suprafaţa de contact) şi de mediul în care se regăseşte ( apos, concentraţia în materie

organică şi sare, pH.). Adsorbţia specifică variază între 500 /g - 3500 /g. Carbonul

activ este foarte des folosit în cazul separării micotoxinelor în vederea dozării lor. Este folosit

în vederea unei decontaminări a alimentelor lichide, în special a sucului de mere.

Persistenţa unei coloraţii cafenii închise în produsul tratat face dificilă folosirea lui in

alimentaţia umana. Datorita prezentei sale sub forma de pudra si puterea de colorare,

folosirea în alimentaţia umană este de asemenea delicată. Folosirea carbonului în extracţia

micotoxinelor ca şi frecvenţa utilizării în tratamentul intoxicaţiilor acute explică totuşi

utilizarea sa experimentală mai mult decât în cazul decontaminării.

4712147


Capacitatea adsorbantă a carbonului activ vis-a vis de aflatoxine a fost pusă în evidenţă

totuşi. 100 mg carbon sunt capabile sa adsoarbă 1 mg toxină în prezenţa a 2% serumalbumina

bovina şi 0.5% ulei de porumb, la pH 7. Complexul format este stabil, şi protejează

toxicitatea AFB1: diminuarea semnelor hepatotoxice (mărcări plasmatice şi leziuni hepatice),

creşterea procentajului de supravieţuire, creşterea eliminării micotoxinelor şi metaboliţilor lor

prin excreţii fecale. Aceste efecte au fost observate mai bine în cazul intoxicaţiilor acute

decât în cazul celor cronice, la animalele nerumegatoare şi la pasări. Totuşi semnele unei

aflatoxicoze nu au putut fi evitate, ceea ce sugerează că folosirea carbonului activ este

insuficientă pentru a garanta salubritatea alimentelor contaminate cu aflatoxine.

Efectele benefice ale carbonului „ super activ" (capacitate mare de adsorbţie) au fost

puse în evidenţă în cazul administrării toxinei T-2. O creştere a procentului de supravieţuire a

fost observată în cazul administrării unei doze letale la şobolani. Acest efect a fost parţial

observat la administrarea micotoxinelor, poate fi legată de adsorbţia moleculeor şi

metaboliţilor săi eliminaţi prin excreţii biliare. Este acompaniată de o diminuare a semnelor

de necroză tisulară. Efectele protectoare pot fi mărite prin administrarea concomitentă a

corticoidelor. Carbonul activ permite o adsorbţie a toxinei aplicată pe o piele lezată. Totuşi,

protecţia legată de administrarea carbonului activ (0,5 % de aliment), la puii care primesc un

aliment contaminat cu 6 ppm toxina T-2 nu este dovedită.

În ceea ce priveşte ochratoxina A, carbonul activ este un adsorbant eficace in vitro, el nu

este capabil însă să diminueze toxicitatea micotoxinei in vivo la pui. Acest efect poate fi

consecutiv la o diminuare a capacităţii adsorbante a carbonului în alimente, în raport cu

conţinutul lor ridicat în substanţe organice. Un net efect protector a fost observat în cazul

administrării unor doze mari de carbon în aliment (5-10%) contaminate cu ochratoxina A

(1 ppm), fiind însoţit totuşi de o diminuare a concentraţiilor plasmatice în vitamina E.

3.2.3.2 Răşinile

Răşinile sunt polimeri de sinteză formaţi din cerpetene macromoleculare tridimensionale

prezentând grupări active susceptibile fixării de compuşi organici sau minerali prin legături

cu energie scăzută. Răşinile curente sunt răşinile schimbătoare de cationi de tipul R-SO 3;

R-PO3 ; R-COO şi răşini schimbătoare de anioni de tipul [R-N(CH3)3] . Aceşti compuşi 48121

48


sunt folosiţi în separarea micotoxinelor în vederea dozării ulterioare. Răşinile schimbătoare

de anioni sunt folosite pentru proprietăţile lor adsorbante in vivo. Colestiramina este folosită

în tratamentul hipercolesterolemiei. Proprietăţile sale adsorbante sunt testate in vitro pe

zearalenona (concentraţia de 1%). 1 g colestiramina este capabilă să adsoarbă peste 2 ng

toxine în mediu cu compoziţie apropiată de conţinutul gastric sau intestinal. La şobolani,

folosirea unui nivel de 5% în aliment va diminua nivelul de reziduuri prezente în ficat şi

rinichi. La şoareci, răşina (2.5% în aliment) va duce la creşterea greutăţii corporale dupa

îngerarea unui aliment contaminat cu 6 ppm zearalenonă.

Proprietăţile adsorbante ale colestiraminei au pus în evidenţă administraţia ochratoxinei

A. La şobolani, răşina (2% din aliment) va fi susceptibilă de diminuarea concentraţiilor

plasmatice în OTA ( încorporată în aliment în concentraţie de 1 ppm), de o creştere a

eliminării prin excreţie fecală şi diminuare prin excreţie urinară. Aceste efecte sunt mai puţin

marcante pentru un aliment bogat în lipide saturate, ceea ce corespunde unei diminuări a

ciclului enterohepatic al toxinei. Fixarea ochratoxinei A pe răşini va fi în competiţie cu

sărurile biliare, cu o mare afinitate. Această fixare va fi acompaniată de o diminuare a

neprotoxicităţii ochratoxinei A la şobolani.

Astfel, colestiramina prezintă proprietăţi adsorbante interesante vis-a vis de

micotoxinele anionice.

Proprietăţile adsorbante ale polimerilor divinil - benzen - stiren, altă răşină capabilă să

fixeze anioni, a fost testată. În vivo, adăugarea acestui adsorbant în hrana şobolanilor (5%)

modifică toxicocinetica zearalenonei administrată pe cale orală a dozei de 100 mg/kg, şi

diminuarea efectelor negative a alimentelor contaminate cu 3 ppm toxina T-2 administrată

timp de 2 săptămâni. Rezultatele obţinute în acest ultim experiment sunt asemănătoare cu

cele obţinute cu bentonită, dar superioare celor obţinute cu o răşină schimbătoare de cationi.

Polivinilpirolidonele folosite într-un nivel de 0.2% în aliment, vor fi incapabile să

protejeze efectele toxice ale desoxinivalenolului la porc.

Folosirea concentraţiei de 0,3% în aliment, va diminua toxicitatea aflatoxinelor la pui

(2,5 ppm un amestec care conţine mai mult de 80% AFB1 administrat timp de 3 săptămâni).

3.2.4. Metode biologice de decontaminare

4912149


Se încearcă degradarea în mediu natural a micotoxinelor cu microorganisme sau enzime.

Identificarea potenţialului de degradare cu microorgansime este prima etapă de dezvoltare a

procedeelor. Această activitate de decontaminare trebuie să poată fi transferată pe produsele

contaminate cu micotoxine.

Prin „decontaminare biologică" se întelege transformarea enzimatică a micotoxinei într-un

compus mai puţin toxic.

„Diluarea" nivelului de contaminare cu micotoxine, prin amestecarea unui lot sănătos şi un

lot contaminat este o practică interzisă în Europa (reglementată prin CE N°466/2001) dar,

înainte era totuşi o metodă frecvent folosită.

Degradarea ochratoxinei A prin metode biologice a fost pusă în evidenţă în timpul

procesului de insilozare. Ochratoxina A prezentă în orz poate fi degradată de flora microbiană

existentă. OTA poate fi degradată de asemenea de bacteriile prezente în rumenul vacilor, ceea

ce face ca aceste animale să fie mult mai rezistente la micotoxine decât animalele

monogastrice. Ochratoxina A este hidrolizata în α ochratoxina şi fenilalanina sau este

esterificată în ochratoxina A.

Eubacterium BBSH 797, bacterie izolată din rumen a fost caracterizată de Schtzmayr si

col (2005) pentru potenţialul sau de degradare a ochratoxinei A în α-ochratoxina. Capacitatea

de degradare a ochratoxinei A n α-ochratoxina cu Acinobacter calcoaceticus, izolat de

asemenea din rumen, a fost pusă în evidenţă in vitro pe mediu sintetic la 25-30°C (Hwang şi

Dranghen, 1994).

Enzimele naturale au de asemenea capacitatea de a degrada ochratoxina A. Degradarea

ochratoxinei A în diverse produse neidentificate, a fost pusă în evidenţă în suspensii de celule

de grâu, orz sau porumb. Aceste transformări enzimatice cuprind reacţii de hidroliză, de

metilare care contribuie uneori la pierderea potenţialului toxic al moleculelor ( Ruhland si

col, 1994, 1996a şi 1996b).

O lipază, izolată plecând de la Aspergillus niger degradează ochratoxina A în α-

ochratoxina (Stander si col. 2000).

Alte activităţi enzimatice cât şi alte microorganisme au fost caracterizate pentru potenţialul

lor de degradare a ochratoxinei A.

Ochratoxina este degradată de surse de Rhizopus stolonifer şi Rhizopus microsporus cu o

eficacitate care poate atinge 96% pe grâul umed (Varga si col, 2005).

Rhizopus stolonifer este un patogen ai plantelor care contaminează dupa recoltare.

5012150


Speciile Rhizopus sunt principalele ciuperci izolate în zycomycose; cu toate acestea Rhizopus

stolonifer, este rar menţionat ca patogen uman. Se propune folosirea acestor surse pentru

decontaminarea cerealelor.

Caracterizarea potenţialului de degradare ai ochratoxinei A de anumite microorganisme

care aparţin florei microbiene naturale a alimentului contaminat prezintă un interes mult mai

mare decât caracterizarea activităţilor enzimatice. Sursele de mucegaiuri, izolate plecând de

la ciorchinele de strugure, sunt capabile se degradeze ochratoxina A până la un nivel mai

mare de 80% pe mediu sintetic. (Abrunhosa si col, 2002).

Două căi de degradare diferite au fost puse în evidenţă în funcţie de specie, implicând

activitatea carboxipeptidazei, conducând la transformarea ochratoxinei A în α-ochratoxina. În

plus, această capacitate de degradare a ochratoxinei A a fost identificată în sursele

ochratoxicogene şi în sursele netoxicogene. Aceste surse aparţin florei microbiene naturale a

strugurelui. Folosirea surselor netoxicogene pentru eliminarea ochratoxinei A din struguri

poate fi luată în considerare.

Bacteriile lactice şi drojdiile intervin în procedeele de fermentaţie agroalimentară,

prezentant potenţial pentru decontaminarea micotoxinelor din produsele alimentare (Shetty si

Jespersen, 2005).

Degradarea ochratoxinei A din lapte a fost pusă în evidenţă de bacteriile din iaurt;

Lactobacilius, Streptococcus si Bifidobacterium (Skrinjar si col, 1996). Sacharomyces

cerevisiae, are capacitatea de a elimina ochratoxina A.

Adsorbţia micotoxinelor de drojdii a fost pusă în evidenţă prin folosirea unui amestec de

drojdii sterile şi reziduuri ale fermentaţiei berii: mecanismul dispariţiei ochratoxinei A in

vitro presupune adsorbţa micotoxinei pe peretele drojdiei (Grunkemerer, 1990). Eliminarea

ochratoxinei cu ajutorul drojdiilor este superioară atunci când drojdiile folosite sunt moarte,

atingând aproximativ 90%. Acest lucru confirmă ipoteza potrivit căreia, eliminarea

ochratoxinei A este rezultatul unui fenomen de adsorbţie, în care, volumul de celulă joacă un

rol în capacitatea de eliminare (Bejaouii si col, 2004).

În plus, folosirea acestor drojdii vii, sau moarte, nu atrage modificări ale calităţii vinului.

Acest procedeu poate fi considerat ca fiind promotor pentru decontaminarea ochratoxinei A

din vin. Fermentaţia alcoolică cu Sacharomyces cerevisiae cu must contaminat cu

desoxinivalenol şi zearalenonă a arătat rezultate după 7-9 zile de fermentare,

desoxinivalenolul a fost stabil. Din conţinutul iniţial de zearalenonă, 69% a fost convertită în

5112151


β-zearalenol, 8,1% în α-zearalenol. Marea parte a metabolizării zearalenonei s-a produs după

1-2 zile de fermentaţie.

Folosirea fibrelor vegetale - capabile de a adsorbi imobilizarea micotoxinelor în tractul

gastro-intestinal este de asemenea o metodă biologică folosită la decontaminare.

Activităţile enzimatice au fost identificate pentru degradarea ochratoxinei dar punerea la

punct ca procedee de decontaminare, rămâne să fie rezolvată. Potenţialul de degradare a

micotoxinelor cu microorgansime prezentă în mod natural în siloz sau în produsele

alimentare, prezintă un interes pentru a reduce expunerea animalului şi omului la aceste

toxine. Totuşi, la ora actuală, nici un procedeu nu este pus la punct.

CAPITOLUL 4

Metode de determinare a micotoxinelor

5212152


4.1 Pregătirea preliminară a probelor

Micotoxinele prezintă un real pericol atât pentru animale cât şi pentru om, şi este

obligatoriu ca manipularea probelor să se facă cu grijă şi să se lucreze în condiţii care să

împiedice contaminarea materialelor şi a atmosferei.

În plus, anumite mucegaiuri care produc aceste substanţe sunt ele însuşi toxice: este

exemplul lui Aspergillus flavus şi Aspergillus parasiticus pentru care s-au diagnosticat trei

tipuri de simptome la om: infecţie, alergie şi toxicoză. Infecţia reprezintă o invazie a

ţesuturilor vii în timp ce alergia este o manifestare de hipersensibilitate la o antigenă fungică.

Toxicozele sunt maladii rezultate în urma expunerii, în general prin ingerare, prin inhalare

sau prin contact direct, la micotoxine produse de mucegaiuri. Trebuie să se insiste asupra

faptului că atmosfera este un bun vector de contaminare cu micotoxine. Securitatea trebuie sa

fie maximă.

Personalul din laborator trebuie să fie familiarizat cu reglementările privind securitatea.

Mai mult, un control medical al pesonalului este recomandat şi trebuie să se realizeze un set

complet de analize la sânge. Gestionarea riscurilor de laborator trebuie să cuprindă trei

puncte:

1. identificarea sursei periculoase şi a efectelor posibile asupra sănătaţii în cazul

nefolosirii echipamentului adecvat;.

2. punerea la punct a metodelor de manipulare a toxinelor şi microorganismelor;

3. înţelegerea sensului responsabilităţii pentru a permite aplicarea măsurilor de

securitate

Manipularea mucegaiurilor

Culturile trebuie să fie păstrate în eprubete, plăci Petri. Pentru manipularea eşantioanelor

se recomandă să se lucreze în cabine securizate biologic. Pentru protecţie, personalul trebuie

să poarte în permanenţă sorţ, mănuşi şi mască.

5312153


Manipularea produselor mucegăite

Produsele mucegăite nu trebuie să fie manipulate niciodată fără mănuşi şi analizele se

vor face în aşa fel încât să se evite pe cât posibil inhalarea particulelor toxice.

Analiza eşantioanelor test

Securitatea manipulării este foarte importantă în timpul acestei operaţii. Este

primordială minimizarea contaminării atmosferice cu vapori toxici si particule de praf.

Contactul direct cu toxinele pure sau în soluţie trebuie să fie evitat prin folosirea

echipamentului de pipetare mecanic. Toate suprafeţele de lucru ca şi echipamentele folosite

în timpul extracţiei trebuie să fie obligatoriu decontaminate după utilizare.

Hranirea animalelor cu alimente contaminate

Când animalele de laborator sunt hrănite cu alimente care conţin toxine trebuie să se

poarte în orice moment echipamentul de protecţie. Alimentele trebuie să fie corect etichetate

şi depozitate cu grijă pentru a evita confuziile.

Decontaminarea laboratorului

Sticlăria de laborator şi suprafeţele care au intrat în contact cu toxinele sunt spălate cu

NaClO 0,5%. Carcasele în care au fost ţinute animalele de laborator sunt incinerate.

4.1.1, Eşantionarea

Studii au arătat că peste 90% din erorile de cuantificare a micotoxinelor se datorează

eşantionării necorespunzătoare; trebuie deci să ne asigurăm că eşantioanele prelevate pentru a

fi analizate sunt reprezentative.

Este important deci să se prezinte un plan de eşantionare care să facă parte din reglementările

privind controlul contaminării cu micotoxine. În ultimii ani, o atenţie deosebită a fost

5412154


acordată ameliorării şi asigurării calităţii analizelor făcute pentru identificarea

contaminanţilor din produsele din alimentaţia umană şi animală. Pentru stabilirea normelor

comerciale, contaminanţii trebuie să fie corect identificaţi si cantităţile determinate să fie

scăzute. Micotoxinele nu fac excepţie de la aceste reguli şi analiza lor prezintă dificultăţi

particulare în ceea ce priveşte obţinerea eşantioanelor reprezentative iar analiza trebuie să

permită identificarea nivelurilor scăzute de micotoxine (sub 500 ppm).

Eşantionarea constitue o etapă crucială în determinarea conţinutului de micotoxine

dintr-un lot de produse alimentare. Deoarece cantitatea de micotoxină nu este proporţională

cu cantitatea de mucegaiuri prezentă, sunt foarte rar distribuite uniform în eşantion. Contrar

metodelor analitice, sistemele de eşantionare nu pot face obiectul încercărilor

interlaboratoriale şi în general, un plan de eşantionare este propus pe baza unui studiu statistic

al repartiţiei toxinelor măsurate, apoi el este adoptat în mod oficial.

Publicaţia colectivă a UNDP si FAO a definit clar procedurile de eşantionare pentru

diferite micotoxine. Se ţine cont de tipul produsului şi de dimensiunea lotului. În fiecare caz,

numărul minim de subeşantioane prelevate este precizat, ca şi dimensiunea unitară minimă a

fiecăruia dintre ele. În plus, cantitatea subesantionului prelevat pentru analiză şi modul în

care este prelevat sunt specificate. Comisia europeana a editat o directivă în care se specifică

metodele analitice de eşantionare pentru controlul oficial la nivelul anumitor contaminanţi în

produsele alimentare. Procedura de eşantionare poate fi rezumata intr-o secvenţa de şapte

etape, indicate în figura nr.10

Figura 10. Etapele eşantionării

Scopul eşantionării

Identificarea punctelor de eşantionare

5512155


Identificarea loturilor

Alegerea metodei de eşantionare

Prelevarea eşantioanelor

Prepararea eşantionului

Condiţionarea eşantionului

Înainte de toate, trebuie să se determine cu precizie scopul eşantionării si apoi se

identifică punctele de eşantionare. Modul de eşantionare diferă în funcţie de modul în care

produsele sunt depozitate în vrac sau în ambalaje (saci, cutii metalice, butelii). Odată ce

modul de condiţionare a fost determinat, trebuie să se localizeze cu precizie, punctele de

eşantionare. A treia etapă constă în identificarea loturilor care trebuie să fie reprezentativă

pentru sistemul analizat. Nu trebuie omisă metoda de eşantionare care trebuie să fie cât mai

apropiată de analiza noastră, se disting trei tipuri de metode:

Eşantionare uniformă

În acest caz, se prelevează o cantitate mică de probă din fiecare porţie. În acest tip de

eşantionare, cantitatea prelevată este testată. Eşantioanele trebuie sa fie deci reduse; această

procedură este numită divizare şi este realizată de un divizor care prelevează o fracţiune

identică din fiecare eşantion în parte.

Eşantionare selectivă

5612156


Acest tip de eşantionare presupune prelevarea părţilor cele mai susceptibile a fi

contaminate din lot. Această tehnică se aplică de exemplu în cazul unui lot de cereale unde

investigaţia se va face doar pe grânele care prezintă un stadiu avansat de mucegăire.

Eşantionare aleatorie

Acest tip de eşantionare se efectuează în cazul în care e nevoie de multe eşantioane,

de calitate diferită, care provin dintr-un lot neuniform. La această tehnică, numărul

eşantioanelor, cantităţile lor totale şi perioada de prelevare nu sunt determinate înainte de

eşantionare. Eşantionarea strict aleatorie este complicată, şi se face apel la tehnicile complexe

de prelevare aleatorie. Prelevarea eşantionului reprezentativ pentru lot este următoarea etapă

a eşantionării. Cea de-a şasea etapă constă în prepararea eşantionului, mai bine spus,

separarea eşantionului de impurităţile de dimensiuni mari pe care le conţine. Ultima etapă

presupune condiţionarea eşantionului în vederea determinărilor. În mod frecvent,

eşantioanele reprezentative cântăresc între 3 şi douăzeci kilograme.

4.1.1.1 Variante de eşantionare, de pregătire a eşantionului şi analitice

Se poate spune că etapa de eşantionare este de obicei sursa cea mai mare de erori în

secvenţa analitica, mai bine spus în secvenţa de eşantionare, prepararea eşantionului şi

analizei. Varianta( ), exprimată de reprezentativitatea eşantionului trebuie să fie cât se

poate de scăzută, sau cel mult egală cu suma variantelor de eşantionare (Ss2), de preparare a

eşantionului (Ssp2) şi de analiză (Sa

2):

St - Ss + SSp + Sa

Determinarea acestor variante se poate face în manieră empirică plecând de la formule

stabilite în prealabil. De exemplu, în cazul arahidelor, Whitaker şi colaboratorii săi au stabilit

următoarele relaţii:

Ss2= (49,0546*ML

U955 - 0,39 ML1,7867) /Ws

Unde Ss este varianta eşantionării

ML este concentraţia în aflatoxină în lot în ppb

Ws este masa de arahide în eşantion in kg

Ssp2= (0,978 MS

1J867-0,0178 Ms1'9339)/Wsp

Unde Ssp2 este varianta de preparare a eşantionului

5712157


Ms este concentraţia în aflatoxine în eşantion în ppb

Wsp este masa de arahide măcinată în subeşantion în kg

Sa2= (l/na)*(0,00482 MSS

1J518)

Unde Sa2 este varianta analitică pentru analiza HPLC

na- este numărul de analize repetate

Mss este concentraţia de aflatoxină în subeşantion în ppb.

4.1.1.2. Conceptul şi evaluarea unui plan de eşantionare

Factorii următori sunt esenţiali în stabilirea unui plan de eşantionare:

- tipul de marfă

- concentraţia maximă în toxine permisă în lot

- concentraţia maximă permisă în eşantion (concentraţia critică)

- dimensiunea eşantionului

- numărul subeşantioanelor;

- numărul eşantioanelor;

- metoda de obţinere a eşantionului;

- metoda analitică;

Trebuie să se ştie că există două tipuri de riscuri legate de planul de eşantionare: riscul

producătorului (Producer Risk, PR), care este acela de a respinge un lot sigur, şi cel al

consumatorului (Consumer Risk, CR), care este acela de a accepta un lot contaminat. După

determinarea părţii relative a fiecăruia dintre cele două riscuri se poate construi o curbă unică

numită curba caracteristică de operare (Operating Characteristic curve, OC curve) care pe

abscisă are reprezentată probabilitatea [P(M)] că planul de eşantionare să accepte un lot în

funcţie de concentraţia în aflatoxina M în lot. Forma acestei curbe va fi influenţată de

următorii parametri:

• concentraţia critică permisă în eşantion;

• mărimea eşantionului;

5812158


• mărimea subeşantionului şi gradul de fragmentare;

• metoda analitică (tipul si numărul analizelor).

Probabilitatea că un lot să fíe acceptat se poate exprima astfel: P(M)=p(X<Xc/M)

Unde X este concentraţia în toxină a eşantionului

Xc este concentraţia critică a eşantionului

M este concentraţia în aflatoxina a lotului.

Pentru analiza micotoxinelor, se vor prelua câte 4 eşantioane identice cantitativ:

- primul pentru analiza propriu-zisă;

- două pentru eventualele analize complementare;

- ultima este păstrată ca referinţă

Dupa principiul Gafta Rules, dacă cantitatea de micotoxină găsită în prima probă este mai

mare de 50% faţă de limita autorizată, cea de-a doua analiză va fi efectuată pe cel deal doilea

eşantion. Dacă rezultatele furnizate de această dată sunt inferioare limitelor, atunci, lotul va fi

acceptat. Dacă ce-a de a doua analiză prezintă valori mai mari decât normele tolerate dar

inferioare primei probe, se va realiza o nouă analiză pe cel de al treilea eşantion. Dacă

rezultatele celei de a treia analiză sunt conforme cu normele în vigoare, lotul este acceptat,

dacă nu este respins.

Metodele care permit evidenţierea micotoxinelor în produsele alimentare sunt scindate în

două categorii calitative şi cantitative menţionând în egală măsura şi „testele kit" care permit

analiza pe teren şi furnizează date referitoare la prezenţa sau absenţa contaminanţilor, dar

trebuie să fie confirmată de o analiză complementară de laborator.

Cele din urmă, reprezintă un protocol recunoscut şi normalizat de AOAC (Association of

Official Analytical Chemist). Totuşi, înainte de a fi normalizat, un protocol de analiză

propus de un laborator trebuie să fie validat prin teste iterlaboratoriale, organizate după

normele ISO 43.

Diferitele metode de referinţă se pot clasa după principiul lor fundamnental de

funcţionare în tehnici fizico-chimice sau imunochimice; totuşi noi le vom împărţi în funcţie

de performanţa lor, în tehnici calitative: minicoloanele, coloanele de imunoafinitate, testul

ELISA (poate fi considerat şi test cantitativ); şi tehnici calitative: cromatografie în strat

5912159


subţire (TLC), cromatografie gazoasă (CG) şi cromatografie lichidă de înaltă rezoluţie

(HPLC).

4.2. Metode calitative

În această secţiune vom trata metodele care în general sunt folosite ca metode rapide de

detecţie a micotoxinelor.

Aceste metode sunt folosite ca etape prealabile de purificare a micotoxinelor. După cum

ştim, metodele calitative folosesc fluorometria cu lumina UV pentru a determina concentraţia

molară a soluţiei. Pentru interpretarea corectă a măsurilor realizate, ne vom folosi de două

legi care descriu absorbţia luminii de materie:

Legea lui Lambert: A = log

Legea lui Beer : A=εCd

Unde: A = absorbanţa sau densitatea optică a soluţiei;

I = intensitatea luminii emise

Io = intensitatea luminii transmise

C = concentraţia substanţei absorbante

ε = coeficeintul de extincţie al substanţei absorbante

În practică, în cazul unui spectofotometru UV cu un fascicol, scala absorbanţei este adusă la

zero cu un solvant folosit ca martor. Celula care conţine soluţia de analizat este apoi plasată

în spectrofotometru şi citirea poate începe. Fiecare micotoxină are o valoare a absorbanţei

bine specificată.

Tabel 19. : Parametri spectrofotometrici pentru diferite micotoxine

Micotoxina Masa Solvant Absorbantamoleculara max (nm)

Aflatoxina B 312 Benzen :acetonitril (98 :2) v/v 353Aflatoxina Bl 312 Chloroform 353Aflatoxina B2 314 Benzen :acetonitril (98 :2) v/v 355Aflatoxina Gl 328 Benzen :acetonitril (98 :2) v/v 355

Aflatoxina 62 330 Benzen .acetonitri! (98 :2) v/v 357Aflatoxina Ml 328 Chloroform 357Ochratoxina A 403 Benzen :acid acetic (99 :1) v/v 333Ochratoxina B 369 Benzen :acid acetic (99 :1) v/v 320

Ochratoxina A etil ester 431 Benzen :acid acetic (99 :1) v/v 333

6012160


Ochratoxina B etil ester 397 Benzen :acid acetic (99 :1) v/v 320Patulina 154 Etanol absolut 276Patulina 154 Metanol 275

Sterigmatocistina 324 Benzen 325Citrinina 259 Chloroform 322

Zearalenona 318 Etanol 236Zearalenona 318 Etanol 274Zearalenona 318 Etanol 316

4.2.1. Metode imunologice

Testele imunologice constituie astăzi metodele rapide de detecţie a aflatoxinelor şi a altor

micotoxine în alimente. Anticorpii policloni şi monocloni folosiţi sunt agenţii de legătură

folosiţi. Se ştie că micotoxinele sunt molecule non antigene cu masa moleculară mică,

anticorpii policloni sunt produşi indirect prin răspunsul imunitar al animalelor la un complex

micotoxină-proteină. Raportul molecular micotoxină-proteină este foarte important pentru

intensitatea răspunsului imunitar. Poziţia şi tipul de legătură între toxină şi proteină sunt de

asemenea critice. Anticorpii monocloni sunt secretaţi prin fusiunea celulelor în splina

şoarecilor şi legarea celulelor miceliene datorită polietilen glicolului. Imunogeneza este

administrată prin injectări repetate de cantităţi mici de proteină (40-300 μg).

Recunoaşterea imunologică este bazată pe complementarismul spaţial al grupelor specifice al

antigenelor cu cei doi anticorpi. Anticorpii sunt reactivul cheie în testul immunologic şi

trebuie să fie obligatoriu corect preparat şi caracterizat. Caracteristicile utile pentru

selecţionarea unui anticorp convenabil sunt: constanta de afinitate, specificitatea şi

randamentul.

Se cunosc trei tipuri de teste imunologice : Testele RIA (radioimmunoassays), testele

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), şi testele pe coloana de imunoafinitate. În

ultima categorie sunt incluse minicoloanele sau coloanele de imunoafinitate.

4.2.1.1. Testele RIA

În testele RIA, aflatoxina este marcată din punct de vedere al radioactivităţii. Aflatoxina

nemarcată sau aflatoxina în soluţie test şi aflatoxina marcată intră în competiţie pentru

numărul limită de legaturi la anticorpi. Cantitatea de aflatoxina în eşantion este invers

6112161


proporţională cu cantitatea de aflatoxină marcată în soluţie. Avantajul acestor teste este acela

că necesită o cantitate scăzută de anticorpi. Prezintă totuşi şi dezavantaje în ceea ce priveşte

radioactivitatea, folosirea marcajelor izotopice.

4.2.1.2 Testele ELISA

Două formate principale ale testelor ELISA sunt dezvoltate: testele competitive şi

testele non-competitive. În testul ELISA tipic, legătură unui complex micotoxină-enzimă cu

anticorpi imobilizaţi este inhibată prin prezenţa micotoxinei în soluţia test. Enzimele legate,

catalizează transformarea substratului într-un complex colorat. Intensitatea culorii este invers

proporţională cu concentraţia de aflatoxine. Peroxidaza care catalizează oxidarea substratului

tetrametilbenzidina într-un complex bleu este enzima de marcaj cel mai des întâlnită. Metoda

ELISA este frecvent întâlnită în cazul laboratoarelor centrale unde sunt frecvent realizate

numeroase teste. Pentru o viziune rapidă şi tot odată detaliată a variantelor metodei, este

prezentat tabelul 2.12.

Principiul metodei ELISA

Testul se bazează pe reacţia antigen - anticorp. Godeurile de microtitrare sunt acoperite cu

anticorpi captură, directionaţi împotriva anticorpilor anti - micotoxină. În fiecare godeu, atât

pentru standard, cât şi pentru probă, se adaugă conjugatul enzimatic şi anticorpii anti -

micotoxină.

Micotoxina liberă şi conjugatul enzimatic concurează pentru siturile de legare ale anticorpilor

de acoperire ai godeurilor (metoda imunoenzimatică competitivă).

Conjugatul enzimatic nelegat este îndepărtat în faza de spălare. Se adaugă substrat/cromogen,

observându-se virarea culorii de la roşu la albastru. Adăugarea reactivului de stopare al

reacţiei determină modificarea culorii albastre în galben. Citirea probelor se realizează la 450

nm. Absorbanţa este invers proporţională cu concentraţia micotoxinei din probă.

Tabel 20. : Aplicaţii ale metodei ELISA în determinarea micotoxinelor în alimentaţie.

Toxina Modul de extracţie Spălare Limita dedetecţie0/g/kg)

Eşantion

6212162


Aflatoxina B1 Metanol :apă 55 :45 (v/v)

eşantion :solvant 1 :5 (v/w)

Fragmentare în CHCI3, evaporare, rediluare în tampon salin de fosfat

(PBS)

2,9 Alune Unt de alune

Af latoxina Bl CHCl3

eşantion:solvant 1 :5 (w/v)

Evaporare si descompunere in PBS

5 Porumb

Aflatoxina Bl Metanol :tampon salin fosfat 1 :1 (v/w)

Concentrare prin evaporare, diluare cu

PBS

0,1 Arahide

Aflatoxina Bl Metanol :apa 55 :45 (v/v)

Diluare cu un tampon 5-10 Alune,porumb

Ochratoxina CHCI3

eşantion:solvant 1:5 (w/v)

Împărţire în volume egale de NaHC03

2,5 Grau

Ochratoxina CHCl3

eşantion:solvant 1:5 (w/v)

Împărţire între 1,4 x NaHC03 (30 g/l) în

metanol:apa 4 :10 (v/v)

0,5 Rinichi de porc

Ochratoxina CHCI3

eşantion :solvant 1:5 (w/v)

Evaporare şi descompunere în PBS

0,06 Grâu

Ochratoxina Metanol Spălare pe cartuş C18 şi împărţire în soluţie

1 M NaHC03

0,5-1 Grâu

3-acetyl desoxynivaleol

Metanol :apa 6:4 (v/v) Diluare cu un tampon 1 Orez

Toxina T2 - Cartuş C18 Sep-Pak în fază inversă

0,2 Serum, lapte, urină

4.2.2. Metode de imunoafinitate

Coloanele de imunoafinitate sunt preparate prin adsorbţie de anticorpi pe un suport inert

(tuburi de microtitrare , membrane, bile de sticlă). Micotoxinele sunt prelevate de soluţiile

test prin anticorpi imunospecifici. Dupa ce impurităţile din cartuş au fost spălate,

micotoxinele sunt desorbite în metanol şi transferate pe coloană în faza inversă pentru a fi

separate. Apoi determinarea se face cu UV. Folosirea coloanelor de imunoafinitate pentru

prelevarea şi concentrarea micotoxinelor prezintă mai multe avantaje: creşterea selectivităţii,

posibilitatea prelevării din volume mari şi asocierea cu alte tehnici analitice. Această tehnică

6312163


prezintă de asemena avantajul de a fi foarte rapidă (10-15 minute) şi nu presupune necesitatea

unui personal calificat. Inconvenientul major al acestei tehnici este folosirea unei cantităţi

importante de anticorpi. Trebuie specificat faptul ca în cazul anumitor micotoxine ca

aflatoxinele, o derivaţie prealabilă trebuie să fie realizată pentru a putea folosi tehnica

fluorimetrică cu lumina UV.

4.2.2.1. Minicoloanele

Aceasta metodă a fost inventată în 1976 în Tailanda. Aflatoxina este extrasă în metanol

apos, urmată de o limpezire prin precipitare cu acetat de zinc sau sulfat de amoniu saturat.

Această ultimă metodă permite mai ales reducerea conţinutului de specii interferate.

Aflatoxina este apoi pusă în fluorisilul din minicoloană. Fluorescenta este apoi detectată cu

ajutorul Luminii UV la 365 nm şi comparată cu standardele. Metoda care face referire la

calibrarea aflatoxinelor în cereale cu o limită de detecţie de 20 ppb este metoda Holaday-

Velasco numită şi minicoloane HV. Această metodă a fost acreditată în 1980 de Federal

Grain Inspection Service. Coloana (25cm-6mm) este realizată din aluminiu, silicagel şi din

fluorisil. Sulfatul de sodiu sau calciul anhidru este de asemenea folosit pentru a înlătura toate

urmele de umiditate. Metoda necesită o purificare prealabilă a extractului, care se face de

obicei printr-o simplă filtrare.

4.2.2.2.. Coloane de imunopurificare

Spre deosebire de minicoloane care sunt de obicei folosite ca metode de calibrare,

coloanele de imunoafinitate normale sunt mai degrabă folosite în timpul unei purificări

prealabile a eşantionului înaintea dozării cantitative prin HPLC, de exemplu.

Imunopurificarea constă în purificarea aflatoxinelor sau ochratoxinelor plecând de la extracţia

unui eşantion prin trecere pe coloane de imunoafinitate care conţin un suport prevăzut cu

anticorpi dirijaţi în mod special împotriva micotoxinelor.

4.3. Metode cantitative

4.3.1. Teste kit

Testele kit permit determinarea conţinutului de micotoxine în laboratoare nespecializate.

Testele kit folosite funcţionează după două metode: metoda cromatografiei în strat subţire şi

6412164


metoda imunologică. Avantajul folosirii testelor kit TLC este acela că un singur test poate fi

folosit pentru determinarea mai multor micotoxine. Testele kit bazate pe metodele

imunologice au avantajul uşurinţei şi rapidităţii metodei.

4.3.2 Cromatografie în strat subţire (TLC) Cromatografia în strat subţire este o metodă folosită începând cu anul 1990 pentru analiza

aflatoxinelor. Pentru cromatografia în strat subţire limita de detecţie pentru dozarea

aflatoxinelor este de 2 ppb, iar cea pentru tricotecine limita este de 50 ppb. De obicei, această

metodă este urmată de un test ELISA în cazul în care furnizează un răspuns pozitiv. S-a arătat

că cromatografia în strat subţire poate fi aplicată în egală măsură şi în cazul analizei

tricotecenelor, în particular a desoxinivalenolului (DON) şi al zearalenonei (ZON).

Principiul metodei

Extracţia micotoxinelor în solvenţi organici şi separarea lor prin cromatografie în strat

subţire, identificarea micotoxinelor separate în lumina ultravioletă la lungimile de undă de

254 nm şi 366 nm faţă de substanţa etalon şi confirmarea prezenzei micotoxinelor identificate

în spoturi prin reacţii de derivatizare.

4.3.3 HPLC (high performance liquid chromatography- cromatografie cu lichid de

înaltă performanţă)

Metoda HPLC realizează cuantificare de mare precizie. Este o metodă de referinţă şi

poate realiza cuantificarea compusului de analizat aflat în cantităţi foarte mici (ng). În cazul

metodei HPLC dezvoltate limita de detecţie poate ajunge până la 0,02 ppm, în timp ce limita

de cuantificare este de 0,06 ppm. HPLC este o metodă folosită pentru analiza numeroaselor

micotoxine ca: zearalenină, ochratoxina A, fumonisina B1, vomitoxina şi alfatoxine. Deşi

este o metodă cu un preţ ridicat, care necesită experienţa şi timp, această metodă este foarte

mult folosită ca tehnica de confirmare în cazul determinărilor folosind cromatografia în strat

subţire sau folosind teste de imunoafinitate. Avantajele acestei metode raportată la

6512165


cromatografia în strat subţire: precizie. Există două tipuri de cromatografie cu lichid de înaltă

performanţă: cu faza normală şi cu faza inversă (RP-HPLC). Dacă prima a avut o perioadă de

glorie acum 20 de ani, astăzi cel mai des folosită este cea de a doua. Totuşi trebuie specificat

faptul că în cazul folosirii (RP-HPLC), fluorescenţa aflatoxinelor B1 şi G1 scade.

Ansamblul cromatografic HPLC este un sistem compus dintr-un modul de separare şi

unul de detecţie.

Modulul de separare – controlează următorii parametri cromatografici: programare

metoda, compoziţie solvent, viteza de eluţie, spălarea garniturilor, injecţia probei, semnalarea

a unor evenimente externe, operarea detectorului prin interfaţa IEEE- 488, termostatare

coloană, termostatare probe, degajare eluent. Modul de separare constă din două sisteme- un

sistem de administrare a solventului (compus din 4 pompe şi o valvă de realizare a

gradientului) şi un sistem de administrare a probei (compus din autosampler cu 5 carusele a

câte 24 de flacoane şi un injector automat)

Modul de deteţie - este un detector performant UV/Vis, cu două canale, destinat aplicaţiilor

HPLC şi operează în domeniul 190- 700 nm. Soft-ul prin intermediul căruia se fac achiziţiile

de date, cât şi prelucrarea lor, este MILLENIUM.

Proba de la care se pleacă este reprezentată de cereale măcinate. Fiind o probă solidă,

trebuie să se facă extracţia prealabilă a compusului de analizat, DON fiind solubil în solvenţi

folosiţi în mod curent pentru extracţie.

Deoarece extractul este foarte complex este necesară realizarea unei separări prealabile,

care are rolul de a înlătura eventualii interferenţi, dar şi de a proteja coloana cromatografică.

Pentru separare s-a optat pentru utilizarea a două tipuri de coloane, pe de o parte, coloane de

iminoafinitate DONprep, care leagă micotoxina, la trecerea acesteia prin coloana, de

anticorpul specific aflat în umplutura coloanei, iar pe de altă parte, coloane multifuncţionale,

Mycosep® 225 şi coloana Multisep® 216, care lasă să treacă micotoxina prin coloana, în

timp ce compuşi de interferenţă sunt reţinuţi în umplutura coloanei.

În selectarea metodei HPLC şi a condiţiilor iniţiale se porneşte de la proba de analizat. În

urma extracţiei şi a separării se obţine o probă care conţine molecule cu mase moleculare

mici. Caracteristicile chimice ale compusului de analizat, DON-ul, indică abordarea unei

cromatografii cu faza inversă.

Alegerea coloanei de separare se face cunoscănd ca DON-ul are masa moleculară mai

mică de 2000, este solubil în solvenţi apoşi, nu este ionic şi nici polar. Coloana de separare

6612166


aleasă pentru analiză este Symetry C18, având lungimea de 25 cm şi diametrul interior de

0,46 cm. Faza staţionară este octadecilsilanul, care prezintă o retenţie foarte bună deoarece

lungimea lanţului hidrocarbonat grefat pe suportul silanic este mare (18 atomi de carbon).

Dimensiunea porilor este de 100 Å, iar dimensiunea particulelor este de 5 μm, opţiunea fiind

justificată de masa moleculară mică a compusului de analizat.

Partea a doua :PARTEA EXPERIMENTALĂ

1. Analiza microbiologică a cerealelor

Analiza microbiologica este indispensabilă atât pentru a asigura produsului o calitate şi

o conservabilitate mai bune, cât şi pentru a garanta calitatea igienică şi siguranţa

consumatorilor. Pentru tehnicile de analiză microbiologică, cantitative şi calitative s-au

cumpărat din Piaţa Centrală Galaţi cereale: porumb, orz şi secară destinate consumului uman

6712167


şi animal. Probele au fost evaluate calitativ pentru a studia gradul de contaminare cu

mucegaiuri.

1.1 Evaluarea calitativa- aprecierea aspectului coloniilor dezvoltate prin cultivarea boabelor

de cereale pe medii selective (MMA) , în condiţii de aerobioză la temperatura de 25˚ C.

Materiale necesare :

S-au folosit 15 probe de porumb, 14 probe grâu, 13 probe orz şi 10 probe de secară,

medii de cultura specifice (must de malţ cu agar), plăci Petri.

Mod de lucru :

Mediul de cultură de MMA este fluidificat, repartizat în plăci Petri. După solidificarea

mediului se adaugă în fiecare placă cu o pensetă sterilă boabe de porumb, grâu, orz şi secară.

Plăcile sunt termostatate la 25°C timp de 5 zile. Coloniile de mucegai dezvoltate în plăcile

Petri sunt izolate (metoda în strii) şi analizate microscopic si macroscopic. După

termostatare s-a observat că gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai este relativ mare

( tabel nr.1.) Astfel din 15 probe de porumb analizate, 80% au fost contaminate cu mucegai,

la 14 probe de grâu 71 % au fost contaminate cu mucegai, din 13 probe de orz 85 % au fost

contaminate şi din 10 probe de secară 70% au fost contaminate cu mucegai.

Tabel 21. Gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai

CEREALE

NUMĂR

PROBE

PROBE CONTAMINATE

CU MUCEGAI (%)

Porumb 15 80

Grâu 14 71

Orz 13 85

Secară 10 70

Identificarea microscopică s-a realizat cu ajutorul preparatelor umede.

Obţinerea preparatelor umede

6812168


Principalele etape pentru executarea unui preparat umed:

- pregătirea lamei şi lamelei- lama curată şi degresată se sterilizează trecând ambele feţe

prin flacăra becului de gaz. Lamela se şterge cu hârtie de filtru;

- realizarea suspensiei de celule pe lamă – se depune o picătură de apă sterilă pe lama de

sticlă sterilizată, în zona centrală. Pentru recoltarea celulelor aflate în medii lichide se

foloseşte ansa sau pipetă sterilă, iar pentru recoltarea microorganismelor aflate pe medii

dense (solide sau solidificate) se foloseşte firul metalic.

- realizarea preparatului între lamă şi lamelă – după obţinerea suspensiei de celule, lamela

curată se sprijină şi se deplasează pe lamă la un unghi de 45°, până când devine tangentă la

picătură, apoi se lasă să cadă peste aceasta. Lichidul în exces se absoarbe pe marginile

lamelei cu hârtie de filtru.

Un preparat bun nu trebuie să prezinte bule de aer, acestea putănd determina aglomerări de

celule şi îngreună studiul preparatului microscopic.

După analiza microscopică şi macroscopică a coloniile de mucegai dezvoltate pe mediul de

cultură după perioada de termostatare s-a observat prezenţa urmatoarelor specii de mucegai

Aspergillus sp., Penicillium, Fusarium, Mucor şi Rhizopus (Fig.nr.11,12,13, 14,).

În urma graficilor obţinute s-a observat că în probele de porumb a predominat într-un

procent de 60% Aspergillus sp. În comparaţie cu celelalte specii care au fost într-un procent

mai mic Penicillium 20%, Fusarium 13% şi Rhizopus 7%. În comparaţie cu probele de grâu

procentul de Aspergillus a fost mai mic de numai 36% dar a predominat Penicillium într-un

procentaj de 43% şi procentul cel mai mic de 21% Fusarium.

În probele de orz au fost observate mai multe speciile de micotoxine în număr de 5 iar

procentul cel mai mare avându-l tot Aspergillus ca şi în probele de porumb celelalte având un

procent de Penicillium 23%, Fusarium 15%, Rhizopus 15% şi Mucor 8%. În probele de

secară s-au observat doar 3 specii de micotoxine în care Fusarium a reprezentat 50% ,

Aspergillus 30% şi Penicillium 20%.

6912169


Fig. 11. Principalele specii de mucegai prezente pe porumb

Fig. 12 Principalele specii de mucegai prezente pe grâu

7012170


Fig.13 Principalele specii de mucegai prezente pe orz

Fig.14 Principalele specii de mucegai prezente pe secară

2. Evidenţierea mucegaiurilor producătoare de aflatoxine

Metoda se bazează pe cultivarea mucegaiurilor izolate sub formă de culturi pure din

alimente mucegăite, pe mediu optim pentru elaborarea aflatoxinelor şi determinarea calitativă

sau semicantitativă a micotoxinelor prin cromatografie şi studiu în lumină U.V cu lungimea

de undă 365 nm.

Modul de lucru: Din culture pure ale mucegaiurilor din genul Aspergillus de pe cereale, cu

ajutorul firului se recoltează cantităţi mici de spori şi se fac inoculări în zona centrală a

plăcilor Petri în care se află în prealabil repartizat mediul Hara cu agar( tabel.nr.2.) Plăcile se

incubează la 28 °C timp de 5-7 zile, condiţii optime pentru elaborarea aflatoxinelor. După

acest interval, plăcile se expun la radiaţii ultraviolete cu λ= 365 nm. Deoarece culturile

analizate au prezentat o zonă fluorescentă în jurul coloniei (fig nr.15), se presupune că

mucegaiul prezintă caracter toxicogen .

Tabel nr.22. Compozitia mediului HARA

Reactiv Cantitate Reactiv Cantitate

(NH4)H2PO4 10 g Zaharoză 30 g

7112171


K2HPO4 1 g HgCl2 5x

MgSO4·7 H2O 0,5 g Glucoză 0,5 g

KCl 0,5 g Agar 20 g

FeSO4·7H2O 0,01 G

Fig.nr.15 Coloniile speciei Aspergillus cultivate pe Mediu HARA incubate la 25°C

timp de 7 zile observate cu şi fără lumina UV

3. Analiza calitativă a aflatoxinelor

Pentru analiza calitativă au fost realizate patru medii de cultură, un mediu lichid sintetic

(tabel nr.23) şi trei medii solide pe bază de cereale (tabel nr.24).

Mediul pe baza de cereale a fost obţinut prin fierberea amestecului de cereale cu apă timp de

30 minute, filtrat şi s-a adus la 1 litru cu apă distilată din fiecare mediu câte 100 ml au fost

repartizate în pahare Erlenmeyer şi sterilizate timp de 20 min. La 121°C.

Tabel 23 Compoziţia mediului lichid sintetic

Component Cantitate Component Cantitate

Peptonă 5 g Sucroză 40 g

Extract drojdie 20 g Apă distilată 1 l

Tabel 24 Compoziţia mediului pe bază de cereale

Component Cantitate

Cereale măcinate

(porumb,grâu,orz şi secară)

30 g

Apă distilată 1 l

7212172


3.1 Pregătire inocul

Mucegaiul a fost crescut 7 zile pe MMA la 25° C, a sporulat. Sporii au fost suspendaţi în

apă distilată cu 0,005 % agent Tween 80. Cu camera Thoma s-au numărat sporii şi pentru a

obţine o suspensie cu spori pentru inoculare s-au realizat diluţii decimale.

Numărare cu Camera Thoma

Pentru numărare se plasează o picătură din suspensia de 73ositiv de analizat pe

platforma centrală, în dreptul suprafeţei delimitate. Peste suspensie se plasează o lamelă

care se sprijină pe cele două platforme la terale şi astfel între lamelă şi citometru se creează

o peliculă de lichid cu înălţime egală cu denivelarea platformei centrale (0,1 mm). Astfel,

volumul de lichid plasat pe fiecare pătrăţel elementar este . Preparatul obţinut se

studiază la microscop cu obiectiv cu grosisment x40, când în câmpul microscopic poate fi

vizualizat un grup de 16 pătrăţele elementare, din care se numără celulele a căror suprafaţă

se află mai multe câmpuri microscopice ( = 100) şi se calculează numărul mediu de

celule pe un pătrăţel elementar:

n =

Numărul de celule prezente într-un de suspensie de analizat se determină cu formula:

N= n·4· ·k

în care : n este numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar;

k- coeficientul de diluţie

3.2 Inoculare şi incubare

În mediu proaspăt preparat s-a inoculate o suspensie cu spori. Mediile au fost agitate

10 min. Pentru repartizarea sporilor în tot mediul. Mediile inoculate au fost termostatate la

28°C, timp de 14 zile, staţionar(fig. nr 6).

7312173


Fig. 16 Mediile de cultură după perioada de termostatare

3.3 Extracţie

După terminarea perioadei de termostatare, s-a adaugat la fiecare probă 100 ml

chloroform apoi s-a agitat timp de 24 h, 200 rot./min la 25°C. Separarea de cloroform s-a

făcut cu pâlnii de separare. Extracţia cu cloroform se va repeta şi cele două extracte se vor

amesteca şi vor fi analizate prin cromatografie în strat subţire. Extractele obţinute au fost

examinate la lampa U.V pentru a vedea fluorescenţa care indica prezenţa aflatoxinelor.

Fig. 19 Extractele obţinute observate cu şi fără lumina U.V

Aparatura necesară pentru cromatografia în strat subţire

- camera de vizualizare în ultraviolete cu filter de 254 nm şi 366 nm;

- plăci pentru cromatografie în strat subţire gata preparate cu strat de silicagel 60 G de

0.3 mm grosime sau plăci sticla preparate în laborator cu dimensiunile de 200x200 mm sau

100x200 mm;

7412174


- tanc pentru cromatografie sau camera cromatografică în formă de U (vas

paralelipipedic din sticlă);

- Shaker

- rotovapor;

- seringa Hamilton 10 μl;

- cilindri gradaţi de 50 ml, 100 ml, 250 ml;

- şablon pentru aplicarea spoturilor pe placă;

Reactivi

- cloroform;

- sulfat de sodiu anhidru;

- aflatoxine: B1;

- amestec de acetonă –apă 85:15 (V/V);

- amestec alcool metilic -apă 85:15 (V/V);

- system de de solvenţi de developare: toluene- acetat de etil acid formic în proporţie

de 6:3:1(V/V/V);

- silicagel G 60

- clorură de metilen acetonă (98: 2)

- amestec eter etilic eter de petrol(20 :30)

-

Prepararea sistemului de cromatografie în strat subţire

Plăcile de sticlă s-au spalat bine cu detergent, s-a clătit bine cu multă apă curentă, apoi cu

apă distilată şi s-a uscat. Înainte de întinderea absorbantului s-a şters cu tampon de tifon cu

alcool sau acetonă, apoi cu tifon curat şi uscat. Pe plăcile astfel pregătite s-a aplicat amestecul

absorbant cu ajutorul dispozitivului de aplicat absorbantului pe placă. Pentru a obţine plăci cu

strat absorbant bine fixat s-a substituit 20 ml amidon 10 %. Grosimea stratului adsorbant

aplicat pe placă trebuie să fie de 0.3 mm.

Plăcile s-a lăsat să se usuce la temperature camerei în poziţie orizontală timp de 1…2 h.

Apoi sunt activate prin introducere în etuvă, la 110°C, timp de 1 h, după care s-a scos

imediat, sau s-a putut păstra într-un exsicator cu clorură de calciu. Dacă s-a ţinut mai mult

înainte de întrebuinţare trebuie activate din nou.

Aplicarea spoturilor pe placa cromatografică

7512175


Placa cromatografică pregătită, s-a aşezat pe o suprafaţă plană, s-a marcat linia de start la 2

cm de la marginea plăcii şi s-a marcat linia până la care trebuie să migreze 76ositiv

solventului care se situează la 15 cm faţă de linia de start.

Reziduul rămas la evaporare conform punctului 1, s-a reluat cu solvent de spotulare din care

s-a luat 10 μl cu o micropipetă şi s-a aplicat pe placa cromatografică sub formă de spoturi

rotunde cu diametrul de 5 mm.

Pe o placă cromatografică cu dimensiunile de 200x200 mm s-a putut aplica maximum opt

spoturi la o distanţă de minim 1 cm faţă de marginile laterale. Din soluţiile etalon de

micotoxine cu concentraţia de 1 mg/ml şi din proba de analiză s-a aplicat cu o microseringă

spoturi de 10 μl soluţie pe placa cromatografică în cele poziţii posibile astfel:

- în poziţia 1 se aplică 10 μl soluţie de aflatoxină B1(soluţia etalon Ridasreen cu o

concentratie de aflatoxine totale de 4050 ppt achiziţionat de la firma Diamedix.

S.R.L fig.nr.10);

- în poziţia 2 se aplică 10 μl soluţie din prima probă de analiză;

- în poziţia 3 se aplică 10μl soluţie din a doua probă de analiză;

- în poziţia 4 se aplică 10 μl soluţie din a treia probă de analiză;

- în poziţia 5 se aplică 10 μl soluţie din a patra probă de analiză;

Fig.17.Soluţia etalon de aflatoxină

Developarea

În tancul de developare s-a introdus amestecul de solvenţi de developare până la o înălţime

de max 5 mm. Partea interioară a tancului s-a căptuşit cu hărtie de filtru care să imbibe cu

solvenţii de developare pentru a asigura o atmosferă saturată cu vaporii developantului şi

pentru a evita evaporarea acestuia de pe placă în timpul developării. După executarea acestor

operaţii tancul s-a închis, s-a lăsat 20…30 minute pentru saturarea atmosferei cu vapori.

7612176


După care s-a introdus placa cromatografică cu capătul pe care s-au aplicat spoturile în

sistemul de solvenţi de developare din tanc. S-a închis etanş cu capacul şi s-a lăsat la

developat până când frontul solventului a atins linia marcată la 15 cm de linia de start.

S-a scos placa, şi s-a uscat la temperatura camerei timp de câteva minute.

Fig. 18 Operaţia de developare

Identificarea micotoxinelor

Pe placa cromatografică s-a examinat la lampa U.V (fig.18) şi s-a încercuit zonele cu

fluorescenţă asemănătoare cu a etaloanelor şi s-a pulverizat cu soluţie de derivatizare. După

pulverizare, placa cromatografică s-a introdus în etuvă timp de 2..3 minute, la o temperatură

de 60°C. Se examinează din nou placa la lumina ultravioletă şi dacă fluorescenţa a suferit

modificări similare celor din etaloane s-a confirmat prezenţa micotoxinei în proba analizată.

Tipurile de micotoxine, raportul zonelor de fluorescenţă asemănătoare etaloanelor şi culoarea

fluorescenţei în ultraviolete sunt redate în tabelul 25. Raportul zonelor de fluorescenţă

asemănătoare cu cele ale etaloanelor (Rt) se calculează cu formula :

Rt = d1/d2

În care : d1- distanţa dintre linia de start şi centrul zonei fluorescente a micotoxinei, în mm;

d2- distanţa dintre linia de start şi linia până la care a migrat frontal solventul, în

mm;

7712177


Fig. Nr. 18 Lampa U.V

Derivatizarea şi confirmarea micotoxinelor

Pentru confirmarea unei micotoxine, se stabileşte pe placa cromatografică zona

asemănătoare cu cea a etalonului micotoxinei respective şi se pulverizează cu soluţie de

derivatizare. După pulverizare zona şi etalonul devin de culoare careacteristică micotoxinei.

După realizarea analizelor se întocmesc buletine de analiză în care trebuie să se menţioneze

următoarele:

- datele necesare pentru identificarea lotului;

- rezultatele obţinute;

- SR 9597/19:1993

Tabel 25 Caracteristici de identificare a micotoxinelor prin cromatografie în strat subţireNr. crt

Denumirea micotoxinei şi forma

Rt Culoarea în UV la 254 nm

Culoarea în UV la 336 nm

Substanţele de

vizualizare

Culoarea în UV la 366 nm după apreciere

1 Aflatoxina B1 0.21 Albastru strălucitor

Albastru strălucitor

Acid sulfuric 20 %

Galben verzui

2 Aflatoxina B2 0.18 Albastru violet

Albastru strălucitor

Acid sulfuric 20 %

Galben verzui

3 Aflatoxina G1 0.15 Albastru verzui

Verde strălucitor

Acid sulfuric 20 %

Galben verzui

4 Afaltoxina G2 0.12 Verde Verde Acid Galben

7812178


strălucitor strălucitor sulfuric 20 %

5 Zearalenona (T2) 0.55 Albastru deschis

Verde albăstrui

Amestec de diazotare

Vizibil brun închis

6 Ochratoxina A 0.42 Bleu strălucitor

Bleu intens strălucitor

Hidroxid de sodium 0.1N Acid sulfuric 50% în metanol

Albastru intens strălucitor Bleu-verde intens strălucitor

Concluzii

Micotoxinele sunt substanţe chimice unele simple sau unele complexe; metaboliţi produşi

de miceţii dezvoltaţi pe un substrat care poate să producă îmbolnăvirea celor ce consumă

produsul respectiv.

Cercetările efectuate a pus în evidenţă 240 de mucegaiuri toxicogene, identificându-se

peste 2000 substanţe toxice, iar o anumită specie de mucegai poate produce un complex de

substanţe cu structuri diferite şi aceeaşi toxină poate fi produsă de mai multe mucegaiuri.

Prezenţa micotoxinelor în alimente nu constituie o problemă nouă, dar este o problemă de

actualitate.

Eradicarea totală a acestor contaminanţi de origine naturală este dificilă, folosirea

metodelor de decontaminare prezentând un interes major. Diversitatea propietăţilor fizice şi

chimice ale diferitelor familii de micotoxine care prezintă risc pentru sănătate face ca fiecare

metodă de decontaminare să fie diferită de la caz la caz.

7912179


Amoniacarea materiilor prime asociată sau nu cu folosirea adsorbanţilor din familia

aluminosilicaţilor prezintă un interes major în cazul contaminării cu aflatoxine.

În ceea ce privesc alte micotoxine, numărul metodelor fiind ineficiente, nici o metodă

chimică sau fizică nu poate reprezenta o metodă garantată pentru o decontaminare totală.

Eliminarea fizică (curăţire şi separare) a materiilor prime contaminate oferă un interes

foarte mare.

Prevenirea dezvoltării mucegaiurilor, pe câmp, sau în timpul depozitării constituie deci un

mod de a lupta împotriva unei contaminări a alimentelor cu fumonisine, tricotecine,

zearalenona, ochratoxine. Folosirea ulterioară a tratamentelor fizice sau chimice cu ajutorul

adsorbanţilor nu poate fi considerată ca fiind o metodă eficientă.

Eficacitatea scăzută a acestor tratamente în termen de “decontaminare micotoxicologică”

nu înseamnă că aceste metode nu trebuie să fie folosite.

Datorită adaptării la diferite condiţii de mediu, micotoxinele se întâlnesc în toate mediile

naturale. Se găsesc în special pe sol, de unde ajung în aer sub formă de spori sau fragmente

de hife.

Temperatura şi umiditatea sunt principali factori care favorizează contaminarea cerealelor

cu micotoxine. Între aceşti factori există o strânsă legătură, la care este posibilă dezvoltarea

microorganismelor; astfel cu cât este mai ridicat conţinutul în apă al boabelor, cu atât este

mai extinsă zona de temperatură la care se observă creşterea numerică a microbiotei.

Analizând valorile temperaturii şi ale aw, putem spune că sunt condiţii optime pentru

creşterea şi proliferarea fungică la t>20°C, aw-0.75 şi umiditatea 14 %.

Prevenirea contaminării cerealelor cu micotoxine presupune:

Aplicarea practicilor bune de lucru;

Determinarea conţinutului de apă al cerealelor şi spaţiului de depozitare;

Verificarea temperaturii;

Menţinerea unei valori a activităţii apei de 0.7 sau inferioară verificarea temperaturi;

Trebuie să se realizeze verificări regulate de temperatură (la o saptămână sau maxim două)

pentru a evita pierderi considerabile de produs. O creştere anormală a temperaturii, poate fi

semnul unui debital degradării cerealelor.

Depozitarea se va realiza în silozuri cu sisteme de ventilaţie, care au rolul de a

menţine cerealele la o temperatură suficient de scăzută şi permite deasemenea în anumite

cazuri, obţinerea unei uscări lente.

Recoltarea se va face la manipularea completă a plantei;

8012180


Prevenirea infestării cu insecte;

Folosirea de soiuri rezistente la contaminarea cu micotoxine;

Astăzi, tot mai mult problema micotoxinelor din nutreţuri şi alimente este abordată nu

numai din prisma profilaxiei infestării şi dezvoltării fungilor, ci şi prin cea a reducerii

efectelor dăunătoare a micotoxinelor din hrana contaminată (inclusiv intensificarea

răspunsului imun al organismului). Modul acesta de a privi lucrurile pleacă de la modificările

nutriţionale datorate micotoxinelor. Dar, există nenumărate date care arată că în ciuda

rezultatelor pozitive obţinute în domeniul cercetării micotoxinelor din hrană, mai sunt încă

multe necunoscute. În permanenţă sunt descoperite noi micotoxine dar limitarea efectelor

acestora şi a cantităţilor de reziduuri în produsele animalelor ridică răspunderi tot mai mari

biotehnologiilor responsabile de protecţia consumatorilor.

Atât micotoxinele, cât şi fungi care le produc au ca efecte deteriorarea şi descompunerea

plantelor şi a alimentelor, în diferite grade. În principiu acestea pot invada şi creşte pe orice

tip de hrană şi în orice moment, atât înaintea recoltării, cât şi în timpul depozitării, precum şi

în alimentele prelucrate sau în amestecul de hrană. Detectarea lor în sau pe hrană depinde de

tipul hranei, organismele implicate şi gradul de invazie.

Studiile au demonstrat că porumbul este cereala cea mai susceptibilă privind contaminarea

cu aflatoxine, în special în clima care favorizează dezvoltarea miceţilor Aspergillus flavus şi

Aspergillus parasiticus în culturi, precum şi în făinuri furaje.

Problemele puse de micotoxine sunt relativ recente, tehnicile care permit analiza lor şi

legislaţia într-o continuă evoluţie. La ora actuală HPLC, se impune ca metodă tehnica de

lucru pentru analiza cantitativă a majorităţii micotoxinelor.

Cum a demonstrat acest studiu al metodologiei analitice analiza micotoxinelor constituie o

problemă complexă şi necesită supervizarea şi controlul organismelor competente, validând

testele interlaboratoriale ale tehnicilor specifice fiecărei micotoxine. Aceste tehnici sunt de

două tipuri: calitative şi cantitative.

Cromatografie în strat subţire continuă să fie o metodă oficială de analiză; este o metodă

ieftină, rapidă şi practică se pot analiza simultan mai multe micotoxine prezintă probleme în

cazul multidetecţiei deoarece este dificilă ca în acelaşi timp să se realizeze mai mult de o

purificare (sistemul de limpezire folosit poate fi foarte eficient pentru un tip de produs şi mai

puţin eficient pentru alt tip de produs).

8112181


HPLC este o tehnică din ce în ce mai utilizată şi este aplicată în mai multe metode oficiale;

este scumpă şi nu permite multidetecţii datorită coloanelor de imunoafinitate care sunt

specifice fiecărei micotoxine în parte.

ELISA este o metodă care permite atât determinarea cantitativă cât şi calitativă a

micotoxinelor.

Bibliografie

1. GABRIELA BAHRIM, ANCA NICOLAU, CLEMANSA TOFAN, MARGARETA

ZARA, Mirobiologia produselor alimentare Tehnici şi analize de laborator, Editura AGIR

2002.

2. CLEMANSA TOFAN, Microbiologie alimentară, Editura AGIR, Bucureşti, 2004.

3. VALENTINA DAN, BRAD SEGAL, RODICA SEGAL, VITALIE TEODORU,

Determinarea calităţii produselor alimentare, Editura CERES, 1985.

4. N. GEORGESCU, C. SAVU, Siguranţa alimentelor, riscuri şi beneficii, Editura SEMNE,

Bucureşti, 2004.

5. LATGE J-P, Aspergillus fumigatus and aspergillosis, Clinical Microbiologz Rewiewes,

1999.

6. CLEMANSA TOFAN, Igiena şi securitatea produselor alimentare, Editura AGIR, 2004

7. GABRIELA BAHRIM, VALENTINA DAN,CRISTINA KRAMER, ANCA NICOLAU,

MARGARETA ZARA, Memorator pentru mucegaiuri, Editura Evrika, Brăila.

8. VALENTINA DAN, Microbiologia cerealelor şi produselor derivate, Universitatea

Galaţi, 1975.

8212182


9. ABDEL-WAHHAB M.A., NADA S.A. et AMRA H.A., Effect of aluminosilicates and bentonite on aflatoxin-induced developmental toxicity in rat. J. Appl. Toxicol., 1999,

10. ABO-NORAG M., EDRINGTON T.S., KUBENA L.F., HARVEY R.B. et PHILLIPS T.D., Influence of a hydrated sodium calcium aluminosilicate and virginiamycin on aflatoxicosis in broiler chicks. Poult. Sci., 1995.

11. ADEMOYERO A.A. et DALVI R.R., Efficacy of activated charcoal and other agents in the reduction of hepatotoxic effects of a single dose of aflatoxin B1 in chickens. Toxicol. Lett., 1983.

12. ANGENAULT J. : La chimie: dictionnaire encyclopédique, Pages, Dunod, Paris, 1991.

13. ANONYMOUS : Classe silicates, http://www2.biam2.org/www/ Cla88482.html, page consultée le 10 octobre 2000.

14. ANONYMOUS , The zeolite group of minerals, http://mineral.galleries.com/minerals/silicate/zeolites.htm, page consultée le 10 octobre 2000

15. BENNETT G.A., RICHARD J.L. et ECKHOFF S.R. : Distribution of fumonisins in food and feed products prepared from contaminatedcorn. Adv. Exp. Med. Biol., 1996, 392, 317-22.

16. BONNA R.J., AULERICH R.J., BURSIAN S.J., POPPENGA R.H.,BRASELTON W.E. et WATSON G.L., Efficacy of hydrated sodium calcium aluminosilicate and activated charcoal in reducing the toxicity of dietary aflatoxin to mink. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 1991.

17. BRACKETT R.E. et MARTH E.H., Ascorbic acid and ascorbate cause disappearance of patulin from buffer solutions and apple juice. J. Food Protect., 1979.

18. CARSON M.S. et SMITH T.K., Role of bentonite in prevention of T- 2 toxicosis in rats. J. Anim. Sci., 1983.

19. CHANG H.L., DEVRIES J.W., LARSON P.A. et PATEL H.H., Rapid determination of deoxynivalenol (vomitoxin) by liquid chromatography using modified Romer column cleanu., J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1984.

20. CONWAY H.F., ANDERSON R.A. et BAGLEY E.B., Detoxification of aflatoxin-contaminated corn by roasting. Cereal Chem., 1978.

8312183

http://www2.biam2.org/www/


21. DALVI R.R. et ADEMOYERO A.A. : Toxic effects of aflatoxin B1 in chickens given feed contaminated with Aspergillus flavus and reduction of the toxicity by activated charcoal and some chemical agents. Avian Dis., 1984.

22. DALVI R.R. et MCGOWAN C., Experimental induction of chronic aflatoxicosis in chickens by purified aflatoxin B1 and its reversal by activated charcoal, phenobarbital, and reduced glutathione. Poult. Sci., 1984.

23. DECKER W.J. et CORBY D.G., Activated charcoal adsorbs aflatoxin B1. Vet. Hum. Toxicol., 1980.

24. DICKENS J.W. et WHITAKER T.B., Efficacity of electronic color sorting and hand picking to remove aflatoxin contaminated kernes from commercial lot of shelled peanuts. Peanut Sci., 1975.

25. DOKO M.B. et VISCONTI A., Occurrence of fumonisins B1 and B2 in corn and corn-based human foodstuffs in Italy. Food Addit.Contam., 1994.

26. DOYLE M.P. et MARTH E.H., Bisulfite degrades aflatoxins: effect of citric acid and methanol and possible mechanism of degradation. J. Food Protect., 1978.

27. DOYLE M.P. et MARTH E.H., Bisulfite degrades aflatoxins: effect of temperature and concentration of bisulfite. J. Food Protect., 1978.

28. FRIEND D.W., TRENHOLM H.L., YOUNG J.C., THOMPSON B.K. et HARTIN K.E., Effect of adding potential vomitoxin (deoxinivalenol) detoxicants for a F. graminearum inoculated corn supplement to wheat diets fed to pigs. Can. J. Anim. Sci., 1984.

29. GUERRE P., Principales mycotoxicoses observées chez les ruminants. Le Point Vétérinaire, 1998.

30. GUERRE P., GALTIER P. et BURGAT V., Le métabolisme : un facteur de susceptibilité à la toxicité des aflatoxines. Revue Méd. Vét., 1996.

31. HUFF W.E., KUBENA L.F., HARVEY R.B. et PHILLIPS T.D., Efficacy of hydrated sodium calcium aluminosilicate to reduce the individual and combined toxicity of aflatoxin and ochratoxin A. Poult. Sci., 1992.

32. AZERST G, The affects of misture and temperature on growth and spore germination in some fungi, J.STORED Prod. Res.5.(1969).

8412184


33. FROBISHER M., Fundamental of Microbiology, London, 1965.

34. Mycotoxin prevention and control in foodgrains: Aflatoxin sampling and determination in bulk maize for export, Pin Pithaya- Acharlyakul, 1998.www.fao.org/inpho/vlibrarz/x0036e/x0036EOf.htm).

35. Mycotoxin : (Woodson- Tenent Laboratories)(http://www.wtlabs.com/mzco.htm).

36. Mycotoxin prevention and control in foodgrains: Aflatoxin analytical methods for groundnuts, D.M. Willson, 1999.

37.Mycotoxin prevention and controlin foodgrains: Palstc minicolumn for aflatoxin detection, Sritsit Karunyavanij,(www.fao.org/inpho/vlibrary/xoo36e/x0036Eoh.htm)

38.Mycotoxin prevention and control in foodgrainns: Aflatoxin anlytical methods for groundnuts,D.M. Wilson, 1999.

39. Pagini web www.mold.ph www.mycology.adelaide.edu.au www.vscht.cz www.tamagawa.ac.ip]

8512185

http://www.tamagawa.ac.ip/

http://www.vscht.cz/

http://www.mycology.adelaide.edu.au/

http://www.mold.ph/

http://www.fao.org/inpho/vlibrary/xoo36e/x0036Eoh.htm

http://www.wtlabs.com/mzco.htm

http://www.fao.org/inpho/vlibrarz/x0036e/x0036EOf.htm

60081561 studiul efectelor de are a alimentelor cu micotoxine

Documents