1

Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu

Cluj-Napoca

Acțiunea terapeutică a virusurilor

oncolitice in tratarea melanomului la

șoareci.

Autori: Hrapșa Iona

Hosu Andrei

Horiceanu Andreea

Hubeishie Kareen

Data: 3.12.2015

2

Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu

Cluj-Napoca

Introducere

Virusurile oncolitice sunt virusuri care atacă preferenţial celulele

canceroase. Aceste tulpini fie naturale dar mai ales modificate genetic prezintă o

specificitate asupra celulelor cu proliferare ridicată. Studiile în acest domeniu au

început încă din sec al XIX-lea. Complicaţiile iniţiale au fost legate de intervenţia

sistemului imun care împiedica „infecţia” virală. Această tehnică a fost

abandonată din lipsa tehnologiei şi a cunoştinţelor de inginerie genetică însă în

prezent, viroterapia în combinaţie cu chemoterapia sau radioterapia au arătat o

scădere considerabilă a toxicităţii tratamentului convenţional dar mai ales a

mortalităţii.

Scopul acestui studiu este de a demonstra eficienta viroterapiei în tratarea

melanomului la şoareci, cât mai ales de a oferi un model terapeutic clinic.

3

Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu

Cluj-Napoca

Materiale și metode

Am ales ca animal experimental şoarecele. Datorită dimensiunilor lor reduse şi timpului scurt

de generare şi reproducere, păstrarea şoarecilor este relativ simplă şi necostisitoare. În plus, deoarece

aceştia au fost utilizaţi pe scară largă în cercetare de zeci de ani, le este foarte bine cunoscută biologia şi

genetică, existând de asemenea un număr mare de instrumente şi tehnici pentru a-i studia.

Am avut de ales între:

1. Şoareci SCID*1 injectaţi cu ţesut tumoral uman

2. Şoareci SCID umanizaţi*2* injectaţi cu ţesut tumoral uman

3. Şoareci GEMMs*3** cu mutaţii induse genei p53*4*** respectiv genei

CDKN2A*5****

În prezentul studiu am ales tipul 2 de şoareci deoarece mimează cel mai bine micromediul unei

tumori umane. Şoarecii martor vor face bineînţeles parte din aceeaşi categorie.

Procedeele prin care unei tulpini virale i se atribuie capacitate oncolitica diferă. O primă metodă

este aşa numita „atenuare” prin care virusului îi sunt inactivate anumite gene responsabile de funcţia

virală, care vor fi exprimate doar în celulele ce se replica activ. Astfel virusul capăta specificitate pentru

celulele tumorale.

O altă metodă implica modificare învelişului proteic spre a ţinti doar celulele tumorale.

Impedimentul care revine în ambele cazuri este sistemul imun al gazdei întrucât anticorpii sau

interferonii inactivează virusul înainte să ajungă la celulele ţinta. Acest lucru se poate rezolva fie prin

imunosupresie fie prin agenţi antiangiogenici la nivelul tumorii.

În studiul de faţă am condus 3 experimente pentru evaluarea efectelor acestui tip de virus în

cazul melanomului deja avansat (stadiu III). Animalele au fost grupate în 3 loturi: lotul martor (M),

lotul injectat direct în tumora (T) respectiv lotul injectat intravenos (Iv)

* Soareci cu Imunodeficienta severa combinata ** Soareci cu imunodeficienta severa carora li s-a transplantat maduva osoasa umana pentru reconstituirea sistemului imun. *** Genetically Engeneered Mouse Models **** O antioncogena care codifica o proteina implicata in apoptoza celulelor maligne ***** Gena implicata in dezvoltarea melanomului malign

4

Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu

Cluj-Napoca

0

2

4

6

8

10

12

Experimentul 1

zile

Durata medie de viata

M

T

Iv

Test1

Pentru primul test am condus un experiment pentru a verifica acţiunea oncolitica a virusului

HSV1*6 în două ipostaze. Pentru facilitarea urmăririi acţiunii acestuia am utilizat nişte „gene

reporteri*7*” marcate radioactiv. Şoriceii au fost în prealabil injectaţi cu ţesut tmoral uman.

E.1 Am lucrat cu 50 M, 50 T, respectiv 50 Iv. Astfel, în prima zi fiecărui grup (cu excepţia celui

martor) i s-a administrat intratumoral respectiv intravenos 0.5 ml de ser conţinând virusul HSV1 şi

s-a urmărit evoluţia tumorii pe o perioadă de 15 zile. Rezultatele au fost uramtoarele:

* Virusul Herpes Simplex ** gene ce codifica markeri proteici usor de identificat

0

10

20

30

40

50

Ziua1

Ziua2

Ziua3

Ziua4

Ziua5

Ziua6

Ziua7

Ziua8

Ziua9

Ziua10

Ziua11

Ziua12

Ziua13

Ziua14

Ziua15

Nu

mar

ul d

e so

arec

i

Mortalitatea

M

T

Iv

Protocol Experimental

Evoluția melanomului la Lotul Martor. Se observă evoluția gravă și metastazarea tumorii

5

Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu

Cluj-Napoca

E.2 Pentru al doilea experiment am decis să administrăm grupului T pe lângă ser şi un agent

antiangiogenic (IL 12*) pentru inhibarea vascularizaţiei tumorale ce teoretic va duce la „înfometarea”

tumorii şi implicit la diminuarea acţiunii sistemului imun. Grupul Iv în loc de IL 12 i s-a administrat

imunosupresori (Glucocorticoizi). Am urmărit apoi mortalitatea şi evoluţia tumorii identic cu

experimentul anterior.

În urma testului 1 am ajuns la concluzia că administrarea tumorală da rezultatele cele mai bune

iar cea intravenoasa acţionează mai lent dar împiedica metastazarea. S-a observat o creştere a vieţii

medii de 2.3 ori în cazul grupuli T şi o creştere de 1.85 în cazul grupului Iv

* Interleukina 12- inhiba angiogeneza

05

101520253035404550

Ziua1

Ziua2

Ziua3

Ziua4

Ziua5

Ziua6

Ziua7

Ziua8

Ziua9

Ziua10

Ziua11

Ziua12

Ziua13

Ziua14

Ziua15

Nu

mar

so

arec

i

Mortalitatea

M

T+IL12

Iv+Glucocorticoizi

Evolutia melanomulu la Lotul T

Evolutia melanomului la Lotul Iv

6

Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu

Cluj-Napoca

Test 2

E.1 Din cauza rezultatelor destul de nesatisfăcătoare am decis să combinăm cele două experimente

anterioare. Unui alt lot de 50 de şoricei SCID umanizaţi, în urma injectării subcutanate de celule

tumorale dintr-un melanom uman, li s-au administrat o doză intratumorala conţinând virusul HSV1 cu

agenţii antiangiogenici respectiv o doză intravenoasa conţinând serul cu imunosupresorii. Am obţinut

următoarele rezultate:

0

2

4

6

8

10

12

Zile

Experimentul 2 (T+IL12 si Iv+Gluc)

M

T

Iv

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Nu

mar

so

arec

i

Mortalitatea

M T+ Iv

Evolutia melanomului la Lotul T+Iv

7

Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu

Cluj-Napoca

In urma testului 2 s-a observat o creștere a duratei medii de viață de 6 ori cat și o diminuare

semnificativă a tumorii sau chiar o distrugere completa a acesteia.

Evaluarea costurilor

Item Pret

350 șoareci NCID umanizați +/- 10500 RON

500ml ser cu HSV1 +/- 400 RON

Întreținere + hrana +/- 150 RON

Agenți antiangiogenici +/- 200 RON

Glucocorticoizi; +/- 50 RON

Echipament pentru detectarea

radioactivității

+/- 500 RON

Total: +/- 11800 RON

0

5

10

15

20

25

30

Experiment 3

zile

Durata de viata medie

M

T+Iv

8

Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu

Cluj-Napoca

Concluzii

Studiile pe animale indică faptul că un pretratament cu agent

antiangiogenetic (un medicament care împiedică creşterea vaselor de sânge) ar

putea îmbunătăţi eficacitatea virusurilor care atacă tumorile. Acelaşi lucru este

valabil şi cu imunosupresoarele. În combinaţie tratamentul ar putea distruge nu

numai tumora iniţială cât şi metastazele acesteia.

Un experiment similar a fost efectuat cu o altă tulpină de virus: RIGVIR.

Spre deosebire de acesta însă, în care mortalitatea era redusă la până de 4 ori,

experimentul nostru a crescut durata medie de viaţă cu până la de 6 ori. În 2004

viroterapia cu acest virus oncolitic (RIGVIR) a fost introdusă clinic în Letonia în

tratamente de chemo şi radioterapie ducând la o scădere a mortalităţii cu de 4

până la 6 ori faţă de cei pe tratament clasic. Acest lucru ne dă încredere în faptul

că şi metoda noastră ar putea acţiona sinergist alături de tratamentul clasic.

Particularitatea studiului nostru constă în combinarea unor metode ce izolat nu

oferă rezultate destul de satisfăcătoare dar care împreună duc la o creştere

exponenţială a duratei medii de viaţă şi chiar vindecarea tumorii.

În viitor viroterapia alături de tratamentele deja actuale împotriva melanomului ar

putea prelungi semnificativ viaţa pacientului şi poate chiar distruge neoplasmul în

totalitate. Cu toate acestea, mai trebuiesc efectuate studii preclinice pentru

evaluarea eficacităţii şi siguranţei utilizării acestor virusuri oncolitice.

9

Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu

Cluj-Napoca

Bibliografie

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2562196/

https://en.wikipedia.org/wiki/Oncolytic_virus

http://www.medicalstudent.ro/boli-infectioase/virusul-oncolitic.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26319388

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22739258

https://en.wikipedia.org/wiki/Humanized_mouse

https://google.ro/images

https://en.wikipedia.org/wiki/Melanoma