structura acizi nucleici - curs general
TRANSCRIPT
STRUCTURĂ ACIZI NUCLEICI
Curs general
Moleculele vieţiiViata depinde de stocarea stabila şi compacta a informaţiei
genetice ; Activitatile moleculelor celulare sunt guvernate de
principiile de baza ale chimiei; Apa celulară, ionii anorganici, şi mici molecule organice reprezintă aproximativ 75-80% din greutatea celulei vii; Macromoleculele (proteine, polizaharide, ADN) reprezinta restul.
Celule Procariote
Organisme unicelulare
Două tipuri pricipale: bacterii şi archaea
Relaţii structurale simple
Celule eucarioteOrganisme unicelulare şi multicelulare
Plante şi animale
Structural mult mai complexe: organite, citoschelet...
Structura celulei animale
Structura celulei vegetale
Complexitatea structurală a
organismului uman
NucleulSepară: ADN de citosol; transcriptia de translaţie
Caracteristici: - membrana externă; membrana internă; porii
nucleari; nucleoli
La Eucariote ADN este împachetat în cromozomi
Fiecare cromozom conţine o singură moleculă lineară de ADN asociată cu proteinele.
Intregul ADN compactat în cromozomii unui organism este localizat în genom. Secvenţierea şi alte tehnici au evidenţiat că peste 90% din genomul vertebratelor nu codifică pentru ARNm sau alte tipuri de ARN. La organismele multicelulare acest ADN conţine multe regiuni care sunt similare dar nu identice.
Imagine de cromozomi în metafază evidenţiaţi prin tehnica fluorescentă de hibridizare in situ (FISH)
Acizii nucleici
Acizii nucleici sunt substanţe care au fost pentru prima dată izolate
din nucleii celulelor. Există acizi nucleici şi în citoplasma celulelor.
Două tipuri de acizi nucleici:
ADN (acid dezoxiribonucleic) localizat în principal în nucleul
celulelor (când acesta este individualizat) ca în cazul eucariotelor);
ARN (acizi ribonucleici), prezenţi în principal în citoplasma
celulelor dar şi în nucleu.
Acizii nucleici ADNşi ARN au rol esenţial în sinteza proteinelor,
compuşi fundamentali ai celulei, suportul marii majorităţi a activităţilor
biologice.
ADN este suportul eredităţii;
ARN reprezintă acidul nucleic care permite sinteza proteică
Structuri generale macromolecule
Toţi acizii nucleici au o structură generală comună
Principalele cinci baze din structura acizilor
nucleici
A, G, T, C sunt prezente în ADNA, G, U, C sunt prezente în ARN
Structurile ceto-enol ale bazelor azotate
Forţele de stivuire
Stivuirea inelelor de adenină din cristalul 9-metil-adenină.
Suprapunerea parţială a inelelor reprezintă o asociere tipică a bazelor în structuri cristaline şi în dubla elice a acizilor nucleici
Terminologie nucleozide
Baze azotate Ribonucleozide DezoxiribonucleozideNume S/3L Nume S/3L S/1L Nume S/3L S/1L
Baze Pyr
Pirimidinice
nuclozide Pyd Y
Pirimidinice
2’dezoxiribonucleozide dPyd dY/Yd
pirimidinice
Citozină Cyt Citidină Cyd C 2’.dezoxicitidina dCyd dC/Cd
Uracil Ura Uridină Urd U 2’-dezoxiuridina dUrd dU/Ud
Timină Thy Ribozil-timină Thd T (2’-dezoxi)timina dThd dT/Td
Baze Purinice Pur nucleozide Puo R
Purinice
2’dezoxiribonucleozide dPuo dR/Rd
purinice
Adenina Ade Adenozina Ado A 2’-dezoxiadenozina dAdo dA/Ad
Guanina Gua Guanozina Guo G 2’-dezoxiguanozina dGuo dG/Gd
Xantina Xan Xantozina Xao X 2’-dezoxixantozina dXao dX/Xd
Hipoxantina Hyp
Inozina Ino I
Conformaţia nucleozidelor
Conformaţie C3’-endo
Conformaţie C2’-endo
conformaţie“envelope”
conformaţie “twist”
Izomeri de rotaţie în jurul legăturii glicozidice
Orientările sterice permise bazelor purinice şi pirimidinice în raport cu ataşarea lor la unitatea ribozică
Terminologie generală nucleotide
Nume SimboluriNucleozid x’- fosfat Nuc-5’P NMP x’- difosfat Nuc-5’PP NDP x’- trifosfat Nuc-5’PPP NTPCitidină 5’- fosfat Cyd – 5’.P CMP 5’- difosfat Cyd - 5’PP CDP 5’- trifosfat Cyd - 5’PPP CTPUridină 5’- fosfat Urd - 5’P UMP 5’- difosfat Urd - 5’PP UDP 5’- trifosfat Urd - 5’PPP UTPdtimină 5’- fosfat dThd - 5’P dTMP 5’- difosfat dThd - 5’PP dTDP 5’- trifosfat dThd - 5’PPP dTTPAdenozină 5’- fosfat Ado –5 ’P AMP
5’- difosfat Ado - 5’PP ADP 5’- trifosfat Ado - 5’PPP ATPGuanozină 5’- fosfat Guo - 5’P GMP
5’- difosfat Guo - 5’PP GDP 5’- trifosfat Guo - 5’PPP GTP
Structura generală
nucleotide
Conformaţia unei unităţi nucleotidice este determinată de şapte unghiuri de torsiune
Structura ATP
Complexul ATP-magneziu
Complexul ATP-magneziu
cAMP
UDP-glucoza
S-adenozilmetionina (SAM)
Reactii de transfer de grupari metil
Acetil-CoA
Acetil CoA
NAD(P)+
NAD+
NADP+
FAD
Constituenţii ADN şi ARN
Acid nucleic
PentozaNMP majore
NMP minore
Pyr Pur
ARN D-ribozaU A Foarte
diverse ARNt
C G
ADN 2’-deoxi – D-riboza
dT dA Derivaţi metilaţi ai
A şi CdC dG
Structura generală a acizilor nucleici
Formarea legăturilor fosfodiester
ADN-dublu helix format din catene complementare
Informaţia genetică este
purtată de molecule de ADN foarte
lungi, şi codificată în secvenţa lineară
de nucleotide A, T, C şi G ;
Molecula de ADN, în formă
de dublă elice, compusă dintr-o
pereche de catene complementare
formate din nucleotide care sunt
menţinute împreună prin legături de
hidrogen care se realizează între
perechile de baze G-C şi A-T ;
Tipuri de legături de hidrogen (I)
Împerecheri tip Watson-Crick Alte tipuri de împerecheri
Împrechere de adenine în structura cristalului de 9-metil-adenină
Împerecheri Hoogsteen între A şi T
Împerechere ipotetică între C şi T
Tipuri de legături de hidrogen (II)
Tipuri de legături de hidrogen (III)
Tipuri de legături de hidrogen (IV)
ADN - dublu helix format din catene antiparalele
Fiecare catenă de ADN posedă o polaritate chimică datorată legăturii dintre glucide şi grupările fosfat, care alternează la nivelul scheletului.
Cele două catene ale unei molecule
de ADN sunt antiparalele, adică posedă
orientare inversă;
Fiecare din cele două catene pot
servi ca matriţă pentru sinteza celeilalte
catene.
Astfel, aceeaşi informaţie genetică
este purtata de cele două catene care
formează dubla elice.
Dublul Helixcaracteistici structurale
Structura ADN B
Imaginea se bazează pe studiile cu raze X realizate
pe dodecamerul d(CGCGAATTCGCG)
Structura ADN B
Vedere pertenticulară pe axa helixului. În schemă legăturile fosforice sunt marcate în albastru iar bazele în roşu. Sint marcate în alb bazele, legăturile fosfodiester şi legăturile de hidrogen dintre două baze.
Vedere de-a lungul axei helixului
Caracteristicile conformaţiilor elicei ADNCaracteristici Conformaţie B Conformaţie A Conformaţie ZSens de răsucire drept drept stâng
Număr pb/tur 10,4 (10,0-10,7) 11 12 (6 dinucleotide)
Pasul (înălţinea pe ax)/pe plan de baze
3,4nm0,34 nm
2,8 nm0,26 nm
4,5 nm0,37 nm
Înclinare baze faţă de ax/rotaţia planului bazelor
10
360
200
330
90
-600/dinucleotid
Diametru 2 nm 2,3 nm 1,8 nm
conformaţii
dPyd:pentoză legătura glicozidică
2Eanti
3Eanti
2Eanti
dPuo: pentozălegătura glicozidică
2Eanti
3Eanti
2Esyn
Fosa: mare mică
Mare şi profundăÎngustă şi profundă
Îngustă şi profundăMare şi profundă
-Îngustă şi profundă
Structura ADN A
Vedere de-a lungul axei helixului
Structura ADN A
Vedere perpenticulară pe axa helixului
Structura ADN Z
Vedere de-a lungul axei helixului
Structura ADN Z
Vedere perpenticulară pe axa helixului
Trecerea ADN B în ADN Z
Trecerea ADN-B în ADN Z, reprezentat la nivelul unui fragment de 4 pb, implică răsucirea cu 1800 a fiecărei perechi de baze în raport cu lanţul oză-fosfat
ADN suferă separări reversibile ale catenelor
Metode de determinare a mărimii acizilor nucleici
Metodele de determinare a dimensiunilor acestor macromolecule se bazează pe diferite caracteristici. Mărimea poate fi determinată prin mai multe metode:
Microscopie electronică: datorită dimensiunilor lor acizii nucleici pot vizualizaţi prin această tehnică. Metoda se potriveşte foarte bine moleculelor de ADN de mărime medie (câteva mii la 200 000 pb)
Electroforeza în gel:
Este o tehnică de separare a moleculelor în funcţie de masa lor moleculară. Condiţiile de densitate de sarcină asemănătoare sunt realizate în mod natural, de către scheletul oză-fosfat. De asemenea, dependenţa logaritmică, distanţă de migrare în funcţie de mărime, este bine respectată. Pentru separarea moleculelor de acizi nucleici de diferite dimensiuni sunt folosite geluri de agaroză cu porozităţi variate (Figura 2.2). Pentru facilitarea estimărilor cantitative există colecţii de polimeri „marcheri de masă moleculară” utilizaţi pentru etalonarea separărilor. De altfel, această metodă de separare este omniprezentă în manipulările de biologie moleculară. Electroforeza se poate realiza şi în geluri de poliacrilamidă pentru situaţiile în care este necesară separarea moleculelor polinucleotidice mici sau oligonucleotidelor. Prin electroforeza în gel de poliacrilamidă este posibilă identificarea unor fragmente care diferă numai printr-un singur nucleotid. Din acest motiv tehnica este foarte utilă în secvenţializarea acizilor nucleici şi în determinarea regiunilor de polimorfism normal sau patologic determinat de existenţa unor mutaţii.
Mărimea unor molecule de ADN din diferite surse, comparată cu cea a unei proteine fibroase, colagenul, şi celulele procariote şi eucariote.
ADN/particule/ organisme
n de baze(kb)
Masă(MDa)
Lungime(nm)
(nm)
număr de cromoz
omi
Virusuri ADNSV40fag X174fag
5,25,448
3,23,632
1,7x10-3 (1,7m)1,8x10-3 (1,8 m)17x10-3 (17 m)
222
ProcarioteE. coli
4000 2600 1,36 2 1
EucarioteDrosofilaOm
62 000125 000
4100080 000
2141
22
2x42x23
Colagen 3x1000 aminoacizi
0,33 0,3x10-3 (0,3 m) 1,5
CeluleBacteria E. coliMamifere
2x10-3 (0,5x2 m)aprox 10x10-3 (10 m)
Moleculele ADN de mărime mare sunt analizate şi prin:
a) metoda clasică de ultracentrifugare cu toate că forţele de frecare existente între aceste molecule limitează câmpul aplicaţiilor (molecule de până la 1,5 x 106 pb); Prin această tehnică pot fi separate, în gradient de densitate de clorură de cesiu, următoarele: i) fragmente de ADN care au un conţinut diferit în guanină şi citozină; ii) ADN genomic bacterian; iii) ADN plasmidial; iv) ARN total, etc. Diferitele tipuri de ARN ribozomal de la eucariote şi procariote poate fi separat foarte simplu prin ultracentrifugare în gradient de zaharoză
Separarea acizilor nucleici prin ultracentrifugare: a) Separare ADN prin ultracentrifugare în gradient de CsCl; b) separare ARN prin ultracentrifugare în gradient de zaharoză
Electroforeză în câmp pulsatoriu. a) principiu de separare; b) electroforegramă obţinută în urma separării unor fragmente
mari de ADN. Vizualizarea a fost realizată în urma colorării cu bromură de etidium.
Polimerizarea nucleotidică
Structura unei molecule ARN: a) evidenţierea înlănţuirii nucleotidelor şi vectorizarea catenei; b) reprezentările prescurtată şi simbolică.
Hidroliza acizilor nucleiciHidroliza acizilor nucleici
Degradarea unui polinucleotid poate să se refere la: i) legătura fosfodiester atunci când se produce o depolimerizare; ii) unităţile nucleotidice dacă se rupe legătura glicozidică şi se degradează componentele. În ambele cazuri hidroliza poate fi de natură chimică sau enzimatică.
Hidroliza chimică a acizilor nucleici
Tratamentul acid afectează la fel ARN şi ADN:
Comportamentul ARN şi ADN la hidroliză bazică este foarte diferit:
Condiţii Produşi de hidroliză
ARN ADN
AcidepH 1,0 + încălzirepH 4,0
pentoze + fosfaţi + bazebaze purinice + AN apurinici
Alcaline NMP (2’ sau 3’) -
Produşii de degradare chimică a acizilor nucleici
Schema mecanismului de hidroliza ARN prin cataliza bazică: 1. Hidroxilul din 2’ este deprotonat de către ionul hidroxid; 2. Alcoxidul, nucleofil, atacă gruparea fosfodiester cu formarea unui diester ciclic 2’: 3’; 3. Un al doilea hidroxid provoacă hidroliza uneia sau alteia dintre legăturile ester: se obţin izomeri 2’ şi 3’ fosfat.
Scindarea enzimatică
Enzimele care catalizează hidroliza legăturii fosfodiester din structura acizilor nucleici, fosfodiesterazele, sunt numite şi nucleaze. Acestea sunt prezente în toate celulele şi sunt foarte utile în metabolismul acizilor nucleici şi proteinelor. O parte dintre a ceste nucleaze sunt secretate de către pancreasul exocrin, în intestin, şi participă direct la digestie hranei. Aceste enzime prezintă niveluri de specificitate comparabile cu cele ale peptidazelor şi proteazelor. Ele se pot clasifica în funcţie de:
a) modul lor de atac al catenei: i) exonucleaze, enzimele care acţionează la nivelul extremităţii catenelor; ii) endonucleaze, enzimele care atacă în interiorul catenelor;
b) specificitatea lor faţă de substrat: i) pentru tipul de acid nucleic: ribonucleaze pentru ARN, deoxiribonucleaze pentru ADN şi nucleaze pentru ambele; ii) pentru tipul de structură: mono- sau dublu catenară;
c) specificitatea lor de recunoaştere a situsurilor: i) specificitate pentru baze; ii) specificitate pentru secvenţe;d) tipul de rupere a legăturii fosfodiester: i) exonucleazele şi endonucleazele de tip d scindează extremitatea 5’ şi duc la formarea de 3’NMP; ii) exonucleazele şi endonucleazele de tip p scindează extremitatea 3’ şi determină formarea 5’NMP (Figura 2.8);
Scindarea enzimatică
Nucleaze Substrate1 Tăieturătip2; specificitate
Produşi
Exonucleaze
fosfodiesteraza (venin de şarpe) ARN, ADN s
p extremitatea 3’
5’-NMP
fosfodiesteraza (splină) ARN, ADN s
d extremitatea 5’
3’-NMP
exonucleaza I (E. coli) AND p extremitatea 3’
5’-NMP
exonucleaza III (E. coli) AND p extremitatea 3’
5’NMP+ADNs
Endonucleaze
endonucleaza S1 (Aspergillus oryzae)
ARN,ADN s,d
p aleatoare
5’-NMP +ON în 5’ P
ribonuclează T1 (Aspergillus oryzae)
ARN s pG/N
5’-NMP +ON în 3’ P
ribonucleaza A (pancreas) ARN s d-Pyr/N 3’-NMP +ON în 3’ P
Deoxiribonucleaza II (timus) ADN s d sPyr/dPur ON în 3’ P
Exemple de enzime de restricţie şi situsurile
recunoscute de acestea
Exemple de enzime de restricţie şi palindroamele recunoscute de acestea cu marcarea situsurilor de clivare şi a axei de simetrie: a)
obţinerea de capete coezive; b) obţinerea de capete drepte
Endonucleaza (sursa) Număr de situsuri de tăiereVirus SV40 fag X174 fag
EcoRI (E. coli RY13) 1 0 5BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) 1 0 5HaeIII (Haemophilus aegypticus) 19 11 >50
Metode spectrofotometrice
Determinarea absorbţiei în ultraviolet cu ajutorul unui spectrofotometru permite verificarea purităţii unei soluţii de ADN sau ARN. În urma determinării densităţii optice se va obţine un pic la 260 nm. Pentru estimarea purităţii este necesară calcularea raportului densităţilor optice la 260 nm/280 nm care, în mod normal, trebuie să fie apropiat de valoarea 1,8-2,0. În cazul ADN, un raport mai ridicat indică o contaminare cu ARN. Dacă există o contaminare cu proteine (280 nm) sau fenol (270 nm), raportul va fi net inferior valorii de 1,8. Dacă ADN şi ARN sunt puri, cantitatea poate fi apreciată astfel:
unitatea DO (260 nm) = 50 ng/l pentru ADN dublu-catenarunitatea DO (260 nm) = 33 ng/l pentru ADN monocatenar
unitatea DO (260 nm) = 40 ng/l pentru ARN
Utilizarea de mini-gelulri
Determinarea secvenţei primare a acizilor nucleici
Metoda chimică Maxam W. GilbertMetoda chimică Maxam W. Gilbert
Metoda „dideoxi” a lui F. Sanger
Sinteza în fază solidă a catenelor unui polinucleotid prin metoda „fosforamidiţilor”
Denaturarea ADN
Măsurarea absorbţiei moleculelor denaturate
Determinarea Tm
Analiza denaturării ADN
Renaturarea ADN
Estimarea absorbanţei în funcţie de structură şi temperatură
Absorbanţa relativă a ADN monocatenar şi bicatenar
Estimarea denaturarii termice
Electroforeza şi autoradiografia ADN
Ultracentrifugarea
Ecuaţiile Svedberg
Ultracentrifugarea ADN în gradient de CsCl
Ultracentrifugarea ARN în gradient de sucroză
Enzime de restricţie
Super-helixurile ADN
Linking number
Writhing number
Forme suprarăsucite
Structuri topoizomere
Topoizomeri şi topoizomeraze
Separarea topoizomerilor ADN SV40 DNA evidenţiază existenţa mai multor topoizomeri cu un număr diferit de suprarăsuciri
Rolul topoizomerazelor în replicarea ADN
Moleculele de ADN se pot îndoi şi încolăci în spaţiu conducând la modificări de topologie cum ar fi formarea supra-răsucirilor
Topoizomerazele sunt enzime care controlează topologia ADN şi realizează etape esenţiale în diferite etape ale replicării având drept rezultat înlăturarea constrângerilor.
Topoizomeraze
Topoizomeraza de tip I relaxează ADN prin inducerea de tăieturi la nivelul unei singure catene a duplexului ADN
Topoizomeraza de tip II modifică topologia ADN prin scindarea si resudarea ambelor catene
Mecanism topoizomeraze
Modelul activităţii catalitice a topoizomerazei II (ADN giraza) din E. coli
ADN giraza înlătură super-răsuricirile pozitive care apar în mod normal la nivelul furcii de replicare
Separarea moleculelor de de ADN circular replicate este realizată de topoizomeraza de tip II
Topoizomeraza de tip II separă cromatidele lineare surori
Discuţii
De ce T în ADN şi U în ARN
De ce deoxiriboză în ADN şi riboză în ARN
De ce 2 helixuri (catene ) în ADN şi una în ARN
ADN de la diferite organisme:
Virusurile
Procariotele
Eucariotele
ADN din mitocondrii (ADNmt)
Tipuri de legături de hidrogen care sunt specifice structurii secundare a ARN
Tipuri de baze modificate prezente în
structura acizilor nucleici
Structura ARN de transport: a) Motivele elementare de structură 2-D; b) Structura terţiară în formă de L.
Tipuri de structuri secundare posibile ale ARNr de tip 16S: a) la archebacterii; b) eucariote, drojdii; c)
mitocondrie de mamifer (bovine)
Structura ARNr de 16 S de la E. Coli de 1542 nucleotide bazată pe compararea secvenţelor de la diferite tulpini (se presupune ca aceasta structura este conservata evolutiv)
Sinteza moleculelor de ARNm: a) transcripţia ARNm policistronic la procariote; b)
transcripţia şi maturarea ARNm la eucariote; ARN transcris de la nivelul unei unităţi complexe (albastru)
poate fi procesat pe mai multe căi pentru a conduce la unul sau
la mai multe unităţi ARNm monocistronice funcţionale. Liniile punctate marcheză
înlăturarea intronilor.
Moleculele de ADN ARN posedă conformaţii diferite
Inversiunile repetitive formează structuri “foldback”
Schema unei molecule de ARNt încărcată: a) schema generală a structurii secundare a moleculei; b) modul de
formare a legăturii ăntre ARNt şi aminoacil
Recunoasterea codon
anticodon
Tipuri de molecule de ARNt. Sunt marcate
elementele de identitate majore în cele patru tipuri. Fiecare bază din structura ARNt este reprezentată de
cercuri pline. Cercurile roşii indică poziţiile
identice pentru recunoaşterea ARNt de către aminoacil-ARNt sintetază. Bazele din
structura anticodonului care reprezintă elemente de identificare sunt subliniate.
Diferitele tipuri de ARN
Moleculele de ARN mesager Moleculele de ARN de transfer: structura secundară sub
formă de «frunză de treflă»; structura terţiară 3-D în L a moleculelor ARNt
Moleculele de ARN ribozomal; particulele ribozomale
Ribozimele
Moleculele snARN
Comparaţie ARNm la procariote şi eucariote
Procariote: operonii bacterieni – ARNm este policistronic; Eucariote: ARNm este monocistronic şi conţine exoni şi introni.
Exemple de structuri adoptate de ARNr
Structura ribozomilor la procariote & eucariote
Structura generală a ARNt
Exemple de molecule ARNsn
Structura “cap de ciocan” a unei ribozime
ADN mitocondrial şi din cloroplasteSe consideră că mitocondriile au evoluat din bacterii care prezintă o relaţie
simbiotică cu celulele ancestrale care conţin un nucleu eucariot. Majoritatea genelor originale din aceste organite au fost transferate genomului nuclear în timpul evoluţiei, păstrând diferite gene în organitele diferitelor organisme;
ADNmt de la mamifere conţine numai aprox 16 kb; acesta nu conţine introni şi prezintă numai o mică regiune necodantă. ADNmt de la plante şi drojdii este mult mai mare. Toate tipurile de ADNmt codifică pentru ARNr, ARNt şi pentru câteva proteine implicate în transportul mitocondrial al electronilor şi în sinteza ATP;
Majoritatea ADNmt este moştenit mai degrabă din ou (ovul) decât din spermă, mutaţiile în ADNmt fiind moştenite pe linie maternă;
Ribozomii mitocondriali se aseamănă cu ribozomii bacterieni ca structură, sensibilitate la cloramfenicol şi rezistenţă la cicloheximidă;
Codul genetic pentru ADNmt de la animale şi fungi diferă de cel bacterian şi de cel al genomului nuclear prin aceea că numeroşi codoni codifică pentru aminoacizi sau semnale STOP alternative; Mitocondriile plantelor par să folosească codul standard nuclear şi bacterian;
Mutaţiile ADNmt pot determina maladii neuromusculare umane, probabil datorită necesităţii crescute de ATP a acestor ţesuturi. În general pacienţii prezintă un amestec de mitocondrii care conţin ADNmt normal şi mutant în celule (heteroplasmie). Severitatea fenotipică este mai mare cu cât proporţia de ADNmt este mai mare;
ADN din cloroplaste este circular şi conţine aproximativ 120-160 kb, în funcţie de speciile de plante. Acestea codifică pentru aproximativ 120 de proteine şi folosesc codul genetic standard.
ADNmitocondrial
uman