Universitatea din Bucureti

Facultatea de Biologie

TEZ DE DOCTORAT

STUDIUL DINAMICII TEMPORALE A BIOFILMELOR MICROBIENE DEZVOLTATE PE SUBSTRATURI INERTE I A INFLUENEI INHIBITORII A UNOR EXTRACTE VEGETALE TOTALE I FRACIONATE

CONDUCTOR TIINIFIC:

PROF. UNIV. DR. VERONICA LAZR

DOCTORAND:

KAMERZAN (SAVIUC) CRINA-MARIA

Bucureti, 2012

CUPRINS

Introducere1

PARTEA TEORETICA3

I. Biofilmele microbiene i implicaiile medicale ale formrii lor pe dispozitivele protetice3

I.1. Biomateriale utilizate la fabricarea dispozitivelor protetice3

I.1.1. Biomateriale metalice6

I.1.2. Biomateriale ceramice7

I.1.3. Biomateriale polimerice8

I.2. Aderena microbian la substrat inert10

I.2.1. Aspecte generale i particulare ale aderenei la substrat inert10

I.2.2. Structuri bacteriene implicate n aderena la substrat inert11

I.2.3. Biomolecule i apendice filamentoase implicate n aderena la substrat inert13

I.2.4. Interaciuni fizico-chimice i cinetica fenomenului de aderen microbian la substrat inert17

I.3. Mecanismele patogenezei infeciilor asociate implantrii dispozitivelor medicale22

I.4.Tolerana la substane antimicrobiene a microorganismelor incluse n biofilme31

I.5. Infecii consecutive tehnicilor de implantare/inserare a dispozitivelor medicale40

II. Principii active din plante cu activitate antimicrobian53

II.1. Date generale53

II.2. Modaliti de extracie i controlul calitii uleiurilor volatile55

II.2.1. Metode industriale

II.2.1.1. Presarea la rece56

II.2.1.2. Distilarea cu vapori de ap 56

II.2.1.3. Antrenarea cu vapori de ap56

II.2.1.4. Extracia cu solveni56

II.2.1.4.1. Extracia cu solveni apolari56

II.2.1.4.2. Extracia cu solveni nevolatili 57

II.2.1.4.3 Extracia cu fluide supercritice 57

II.2.2. Metode de laborator58

II.2.2.1 Distilarea cu vapori de ap 58

II.2.2.2. Extracia continu cu extractorul Soxhlet 58

II.2.2.3. Extracia cu microunde 59

II.2.3. Procedee microextractive59

II.2.3.1 Microdistilarea59

II.2.3.2 Recoltarea i analiza direct din structurile secretorii59

II.2.4 Controlul calitii uleiurilor volatile60

II.3. Activitatea antimicrobian a uleiurilor volatile62

II.3.1. Date generale62

II.3.2. Clase de compui cu activitate antimicrobian constitueni ai uleiurilor volatile66

II.3.3. Activitatea anti-patogenic a extractelor vegetale73

II.3.4. Procedee de stabilizare a uleiurilor volatile76

II.3.4.1. Tehnicile uzuale de ncapsulare78

II.3.5. Importanta nanotehnologiei n formularea farmaceutic80

PARTEA EXPERIMENTAL

DEZVOLTAREA UNOR METODE ALTERNATIVE ECOLOGICE BAZATE PE COMPUI FITOTERAPEUTICI - ULEIURI VOLATILE, PENTRU PREVENIREA I ERADICAREA INFECIILOR CU MICROORGANISME INCLUSE N BIOFILME 84

III. Scopul i obiectivele lucrrii84

III.1. MATERIALE I METODE85

III.1.1. Obinerea, caracterizarea fizico-chimic i demonstrarea activitii antimicrobiene i antibiofilm a unor uleiuri volatile asupra tulpinilor microbiene virulente i multirezistente85

III.1.1.1. Caracterizarea fenotipic i genotipic a unor tulpini microbiene virulente i multirezistente izolate din probe clinice 85

III.1.1.1.1. Identificarea biochimic pe baza sistemelor multitest a unor tulpini microbiene virulente i multirezistente izolate din probe clinice85

III.1.1.1.2. Determinarea capacitii de aderen la substrat inert a tulpinilor bacteriene patogene 88

III.1.1.1.3. Metoda Brun-Buisson pentru determinarea cantitativ a capacitii de aderen la substrat inert pentru tulpinile fungice patogene88

III.1.1.1.4. Caracterizarea fenotipic a factorilor de virulen solubili ai tulpinilor fungice izolate 89

III.1.1.1.5. Caracterizarea genotipic a factorilor de virulen utiliznd metodele simplex i multiplex PCR89

III.1.1.2. Obinerea i caracterizarea fizico-chimic a extractelor vegetale97

III.1.1.2.1. Materialul vegetal recoltare i pregtirea pentru extracie97

III.1.1.2.2. Obinerea uleiurilor volatile prin hidrodistilare99

III.1.1.2.3. Obinerea uleiurilor volatile prin hidrodistilare asistat de microunde99

III.1.1.2.4. Obinerea maceratului din Forsythia spp.99

III.1.1.2.5. Obinerea prin presare la rece a extractului din Aronia melanocarpa99

III.1.1.2.6. Caracterizarea fizico-chimic a extractelor vegetale100

III.1.1.2.6.1. Msurarea densitii uleiurilor volatile100

III.1.1.2.6.2. Msurarea indicelui de refracie al uleiurilor volatile100

III.1.1.2.6.3. Analiza GC-MS a uleiurilor volatile101

III.1.1.2.6.4. Determinarea coninutului de acid ascorbic102

III.1.1.2.6.5. Determinarea coninutului total de antociani102

III.1.1.2.6.6. Extracia i determinarea cantitativa a carotenoizilor102

III.1.1.2.6.7. Determinarea coninutului n polifenoli totali exprimai n acid cafeic al extractelor din Forsythia spp.102

III.1.1.3. Evaluarea calitativ i cantitativ a activitii antimicrobiene i antibiofilm, ca i a aciunilor sinergice i a mecanismelor de aciune ale uleiurilor volatile asupra celulelor microbiene n suspensie i a celor aderate la un substrat104

III.1.1.3.1. Determinarea calitativ a spectrului antimicrobian al extractelor vegetale104

III.1.1.3.1.1. Metoda difuzimetric standard104

III.1.1.3.1.2. Curba dinamicii temporale a efectului microbiostatic/microbicid104

III.1.1.3.1.3. Evaluarea activitii antifungice a uleiului volatil prin tehnica citometriei n flux105

III.1.1.3.2. Determinarea cantitativ a activitii antimicrobiene i stabilirea concentraiei minime inhibitorii105

III.1.1.3.3. Studiul influenei uleiurilor volatile asupra capacitii de aderen la substrat inert a unor tulpini bacteriene prin testul producerii de slime105

III.1.1.3.4. Studiul influenei asupra sesnsibilitii la antibiotice a tulpinilor studiate105

III.1.1.3.4.1. Metoda difuzimetric adaptat105

III.1.1.3.4.2. Metoda microdiluiilor seriale zecimale pentru determinarea comparativ a concentraiei minime inhibitorii pentru soluii de antibiotice respectiv soluii de antibiotice cu ulei volatil din Eugenia caryophyllata106

III.1.1.3.5. Influena uleiurilor volatile totale i fracionate asupra sintezei factorilor de virulen solubili (toxine formatoare de pori, exoenzime)106

III.1.1.3.6. Evaluarea activitii uleiurilor volatile i a unor fracii ale acestora asupra biofilmelor microbiene experimentale monospecifice dezvoltate pe substraturi inerte105

III.1.1.3.6.1. Determinarea influenei inhibitorii a uleiurilor volatile asupra biofilmelor microbiene experimentale dezvoltate pe substrat inert submersat110

III.1.1.3.6.2. Determinarea influenei inhibitorii a uleiului volatil din Eugenia carryophyllata asupra biofilmelor experimentale de Candida sp. dezvoltate pe substrat inert textil110

III.1.1.3.6.3. Determinarea prin citometrie n flux a influenei inhibitorii a uleiurilor volatile i a unor fracii ale acestora asupra biofilmelor experimentale de Candida albicans ATCC 10231 dezvoltate pe substrat inert 111

III.1.1.3.7. Evidenierea influenei uleiurilor volatile i a unor fracii ale acestora asupra expresiei unor gene codificatoare ale unor factori de virulen i molecule implicate n semnalizarea intercelular111

III.1.2. Determinarea aciunii extractelor vegetale selectate asupra celulelor eucariote i optimizarea activitatii antimicrobiene prin obinerea unor nanosisteme hibride functionalizate115

III.1.2.1. Testarea citotoxicitatii extractelor vegetale asupra celulelor eucariote prin metoda coloraiei cu tripan blue 115

III.1.2.2. Obinerea unor materiale nanostructurate hibride anorgano-organice cu proprieti antiaderente i antimicrobiene115

III.1.2.2.1. Sinteza magnetitei funcionalizate cu acid oleic115

III.1.2.2.2. Sinteza nanotuburilor de carbon multistrat (MWCNT)117

III.1.2.2.3. Asamblarea nanofluidului pe baza de magnetit i uleiuri eseniale pentru obinerea de suprafee antiaderente117

III.1.2.2.4. Asamblarea MWCNT-urilor pe baz de carbon-fier i fitocomponeni ai apelor de cohobaie pentru obinerea materialelor antiaderente118

III.1.2.2.5. Obinerea suprafeelor antiaderente119

III.1.2.2.5.1. Modificarea suprafeelor prin imersare n nanofluid aliniat n cmp magnetic119

III.1.2.2.5.2. Modificarea suprafeei dispozitivelor medicale prin depunere asistat laser utiliznd tehnica MAPLE (Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation)121

III.1.2.2.6. Caracterizarea materialelor nanostructurate prin DRX, FT-IR, AFM, ATG i TEM121

III.1.2.2.6.1. Difracia de Raze X (DRX)121

III.1.2.2.6.2. Spectroscopia n Infrarou (FT-IR)121

III.1.2.2.6.3. Microscopia Electronic prin Transmisie (TEM)121

III.1.2.2.6.4. Microscopie cu For Atomic (AFM)122

III.1.2.2.6.5. Analiza Termo-Gravimetric (ATG-TD)122

III.1.2.3. Determinarea activitii antimicrobiene/ anti-biofilm a nanosistemelor pe baz de uleiuri volatile122

III.1.2.3.1. Evaluarea calitativ a activitii anti-biofilm prin microscopie confocal (CLSM)122

III.1.2.3.2. Determinarea concentraiei minime inhibitorii pentru MWCNT-uri ncapsulate n fitocomponeni din apa de cohobaie din Eugenia caryophyllata123

III.1.2.3.3. Determinarea cantitativ a capacitii de aderen la substrat inert pentru tulpinile fungice patogene 124

III.1.2.3.4. Determinarea activitii antipatogenice a nanofluidului pe baz de magnetit i ulei volatil din muguri de Eugenia caryophyllata124

III.2. REZULTATE I DISCUII125

III. 2.1. Caracterizarea fenotipic i genotipic a unor tulpini microbiene izolate din infecii consecutive dezvoltrii biofilmelor pe dispozitive biomedicale125

III.2.1.1. Determinarea capacitii de aderen la substrat inert i formarea consecutiv a biofilmelor monospecifice pentru tulpini microbiene aparinnd speciilor Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Candida albicans128

III.2.1.2. Studiul plasticitii morfologice la tulpini fungice din specii diferite133

III.2.1.3. Caracterizarea fenotipic a factorilor de virulen solubili pentru tulpini microbiene aparinnd speciilor Staphylococcus aureus, Pseudomona. aeruginosa i Candida albicans134

III.2.1.4. Caracterizarea genotipic a tulpinilor selecionate pentru prezena unor gene de virulen137

III.2.1.4.1. Distribuia genelor de virulen la tulpinile de Staphylococcus aureus 137

III.2.1.4.2. Distribuia genelor de virulen la tulpinile de Pseudomonas aeruginosa139

III.2.1.5. Concluzii143

III.2.2. Obinerea i caracterizarea fizico-chimic a extractelor vegetale145

III.2.2.1. Extracia i caracterizarea fizic a uleiurilor volatile145

III.2.2.1. Caracterizarea chimic a uleiurilor volatile146

III.2.2.3. Caracterizarea sucului obinut din fructe de Aronia melanocarpa168

III.2.2.4. Caracterizarea extractelor din Forsithya spp.168

III.2.2.5. Concluzii170

III.2.3. Evaluarea calitativ i cantitativ a activitii antimicrobiene/ antipatogenice i a mecanismelor de aciune ale uleiurilor volatile asupra celulelor microbiene n suspensie i a celor aderate la un substrat171

III.2.3.1. Evaluarea calitativ i cantitativ a activitii antimicrobiene171

III.2.3.2. Evaluarea activitii antipatogenice i a mecanismelor de aciune ale uleiurilor volatile asupra celulelor microbiene n suspensie i a celor aderate la un substrat180

III.2.3.2.1 Studiul dinamicii temporale a efectului microbicid al uleiurilor volatile 180

III.2.3.2.2. Studiul influenei inhibitorii a extractelor vegetale asupra sintezei factorilor de virulen solubili bacterieni evideniai fenotipic182

III.2.3.2.2. Activitatea antibiofilm a extractelor vegetale185

III.2.3.2.2.1. Inhibarea capacitii de aderen microbian la substraturi inerte 185

III.2.3.2.2.2. Eradicarea biofilmelor monospecifice experimentale dezvoltate pe substraturi inerte187

III.2.3.2.2.3. Efectul modulator asupra expresiei genelor de QS la tulpini de Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa192

III.2.3.2.3. Efectul potenator al uleiurilor volatile asupra activitii antimicrobiene a antibioticelor195

III.2.3.2.4. Concluzii199

III.2.4. Studiul biocompatibilitii i optimizarea activitii antimicrobiene a extractelor vegetale selectate prin obinerea unor nanosisteme hibride funcionalizate202

III.2.4.1. Determinarea aciunii extractelor vegetale selectate asupra celulelor eucariote202

III.2.4.2. Caracterizarea sistemelor nanostructurate anorgano-organice204

III.2.4.3. Studiul in vitro al dezvoltrii biofilmelor de Candida sp. pe suprafaa dispozivitelor medicale reprezentate de seciuni de cateter (ne)peliculizate cu fito-nanosistem (magnetit funcionalizat i ulei volatil din Rosmarinus. officinalis)211

III.2.4.4. Studiul in vitro al dezvoltrii biofilmelor de Candida pe suprafaa lamelelor de sticl (ne)peliculizate cu fito-nanosistem pe baz de Salvia officinalis213

III.2.4.5. Studiul in vitro al dezvoltrii biofilmelor de Candida pe suprafaa lamelelor de sticl (ne)peliculizate cu fito-nanosistem pe baz magnetit funcionalizata nepolar i ulei volatil de Anethum graveolens214

III.2.4.6. Studiul in vitro al dezvoltrii biofilmelor de Staphylococcus aureus pe suprafaa lamelelor de sticl (ne)peliculizate cu fito-nanosistem (magnetit funcionalizat i acid usnic)216

III.2.4.7. Studiul in vitro al activitii antimicrobiene a fito-nanosistemului (Fe3O4/acid oleic drop-cast vs film subire) pe baz de Eugenia caryophyllata asupra unor tulpini de Staphylococcus aureus216

III.2.4.8. Studiul in vitro al activitii antimicrobiene a fito-nanosistemului pe baz de MWCNTs i fitocomponente din apa aromatic de E. carriophyllata asupra unor tulpini de Staphylococcus aureus217

III.2.4.9. Demonstrarea in vivo a activitii antimicrobiene a nanosistemelor pe baz de ulei volatil din muguri de Eugenia caryophyllata219

III.2.5. Concluzii220

III.3. CONCLUZII GENERALE221

Lista de lucrri publicate pe parcursul elaborarii tezei226

Bibliografie228

Introducere

Cunotinele despre plante dateaz din cele mai vechi timpuri, primele documente despre valoarea terapeutic a unor plante fiind descoperite n Mesopotamia (mil. IV- II .Hr.), Babilonia (mil. II - I .Hr.), India, Egipt. Prima scriere despre plante cu rol terapeutic aparine unui chinez, Yen Ti, i tot n China s-a elaborat primul dicionar ilustrat al plantelor cunoscute i utilizate de om.

Perioada renaterii marcheaz folosirea observaiei i a experimentului n scopuri medicale. De la Paracelsus (1493-1541), considerat ntemeietorul chimioterapiei, i pn n prezent, au fost parcurse numeroase etape n dezvoltarea diferitelor ramuri ale chimiei, care s-au dovedit indispensabile progreselor n domenii conexe precum farmacologia, medicina, biologia, agricultura.

Studiul compuilor naturali cu aciune terapeutic este o preocupare de top a cercetrii naionale i internaionale axate pe valorificarea superioar a plantelor medicinale bazat pe cunoaterea compuilor chimici constitueni. Uleiurile volatile, produi ai metabolismului secundar vegetal, se gsesc n anumite pri ale plantelor, n caviti sau canale speciale, alteori fiind prezente n exsudate naturale sau patologice ale acestora (rezine, balsamuri, oleogumirezine, gumirezine). Spectrul aciunilor terapeutice ale uleiurilor volatile reuneste proprieti care se manifest selectiv i modulat asupra tuturor organelor i sistemelor organismului uman (Cercasov i colab., 2009).

Rezistena bacterian la antibiotice este o problem acut a medicinei moderne, reducerea consumului inutil de antibiotice fiind o soluie aparent accesibil, dar ridicnd problematica stabilirii unui echilibru ntre reducerea presupus a antibiorezistenei i beneficiile evidente ale antibioterapiei. Subiectul, extrem de complex, face obiectul a numeroase studii, fiind o preocupare major a literaturii de specialitate (Geli si colab., 2012). n ultimii ani, o schimbare de paradigm a determinat definirea unor entiti nosologice noi, infeciile cronice, profund diferite de bolile acute, epidemice, specifice secolului trecut, entiti n strns corelaie cu dezvoltarea biofilmelor microbiene pe dispozitive protetice diverse. Aproximativ 60-70% dintre infeciile nosocomiale sunt infecii consecutive implantrii/inserrii unui dispozitiv medical (Bryers, 2008). Utilizarea dispozitivelor medicale este indispensabil practicii medicale moderne, datorit efectelor benefice evidente asupra calitii vieii i, n anumite condiii, asupra ratei de supravieuire a pacienilor (Shunmugaperumal, 2010). O varietate de bacterii Gram pozitive i Gram negative, precum i microfungi, au fost identificati ca ageni etiologici ai infeciilor consecutive introducerii n organismul uman a unui corp strin, - Staphylococcus epidermidis i ali stafilococi coagulazo-negativi (CoNS) fiind cel mai adesea implicai n FBRI (foreign body related infections - infecii cu microorganisme incluse n biofilme dezvoltate consecutiv implantrii unui dispozitiv protetic) dup implantarea dispozitivelor medicale temporare sau permanente. FBRI cuprind toate entitile nosologice cu etiologie microbian, infecii localizate sau bacteriemice, asociate cu implantarea/inserarea dispozitivelor medicale.

Descoperirea cea mai important a ultimilor ani este aceea c bacteriile aderente sunt profund diferite fenotipic de cele aflate n suspensie. Modificrile cele mai importante se produc la nivelul peretelui celular i al sistemelor de transport membranar (Lazr, 2003). nelegerea bazelor genetice ale adaptrii reprezint o problem central n cercetarea biologic. Elucidarea mecanismelor moleculare este complicat de faptul c fitness-ul microorganismelor poate fi rezultatul modificrilor aprute pe mai multe ci de reglare, fiecare dintre acestea contribuind la fenotipul adaptativ ntr-o msur variabil. Tolerana/recalcitrana la substane antimicrobiene este un proces multifactorial, determinat de factori fizici i fiziologici. Natura rezistenei biofilmelor la substane antimicrobiene rmne incomplet elucidat, fiind propuse mai multe mecanisme pentru explicarea acesteia. n acest context, este pe deplin justificat interesul tiinific pentru fundamentarea tiinific a fitoterapiei, att ca o alternativ, ct i ca o component complementar a terapiei cu medicamente de sintez.

Scopul lucrrii de fa a fost:

Dezvoltarea unor metode alternative si complementare ecologice de prevenire i eradicare a infeciilor consecutive dezvoltrii biofilmelor de ctre tulpini microbiene virulente i multirezistente, pe dispozitive protetice, bazate pe uleiuri volatile totale i fracionate i optimizarea activitii antimicrobiene a extractelor vegetale selectate prin obtinerea unor nanosisteme hibride funcionalizate.

PARTEA TEORETICA

I. Biofilmele microbiene i implicaiile medicale ale formrii lor pe dispozitivele protetice

I.1.Biomateriale utilizate la fabricarea dispozitivelor protetice

S-a estimat c aproximativ 20 milioane de indivizi au implantate dispozitive medicale diverse. Costurile asociate cu aceste terapii depesc 300 mld.$ pe an i reprezint aproximativ 8% din ngrijirile medicale practicate n ntreaga lume (Ratner i colab., 2004). Aplicaiile acoper domenii variate, de la cel cardiovascular, ortopedic, oftalmologic i stomatologic, la cel al chirurgiei regenerative (substituente pentru esuturi) i industriei farmaceutice (sisteme de transport la int sau matrice ncorporant, senzorii pentru diagnostic).

tiina biomaterialelor este n prezent un domeniu care necesit o abordare interdisciplinar, care rezid din ntreptrunderea a cel puin trei domenii: (1) tiina materialelor i ingineria procesrii structurii - proprietilor; (2) tiine biologice, de la anatomie i fiziologie la biologie celular molecular; (3) tiine medicale (Shi, 2006).

Biomaterialele tipice sau clasice (prezentate n Tabelul nr. 1) sunt structuri metalice, ceramice, polimerice sau materiale compozite.

Tabel nr. 1. Tipuri de biomateriale (dup Ratner i colab., 2004).

BiomaterialeAvantajeDezavantajeAplicaii

PolimericeRezilienteDeformabile, degradabile n timpSuturi, proteze vasculare, proteze osoase, substitueni de esuturi moi

MetaliceMateriale dure, ductileCoroziunea, procedeele de fabricaie complicate i costisitoareSubstitueni de esuturi dure, implanturi dentare, dispozitive pentru suturi

CeramiceBiocompatibile, inerte, rezistente la presiuneFragile, procedee de fabricaie complicate i costisitoareImplanturi dentare, tratamente de suprafa pentru acoperirea implanturilor dentare sau ortopedice

CompoziteMateriale dure, personalizateProcedee de fabricaie complicate i costisitoareImplanturi articulare, valve cardiace

Biomaterialele moderne sunt acelea care utilizeaz materiale clasice n combinaie cu medicamente (molecule mici farmacologic active), proteine cu rol terapeutic, molecule biologice, populaii de celule viabile. Acestea au determinat clasificarea biomaterialelor n alte trei subspecialiti: (1) biomateriale cu suprafee modificate; (2) biomateriale inteligente care i schimb proprietile n prezena unui factor declanator din mediu, cum sunt temperatura, valoarea pH sau diverse substane chimice; (3) biomateriale bioactive care ncorporeaz ageni farmacologici precum factorii de cretere, anticorpii, citokinele, factorii de aderen sau conin situsuri de recunoatere enzimatic; (4) ingineria esuturilor (Bhatia, 2010).

Utilitatea biomaterialelor se reduce, totui, la aplicaii relativ simple din punct de vedere structural i funcional, deoarece funcii biochimice, precum cele realizate de ficat, sau electrice i electrochimice, realizate de creier i organele de sim nu pot fi suplinite prin utilizarea biomaterialelor.

Evoluia implantologiei este legat de dezvoltarea materialelor, dar de a tehnicilor chirurgicale. Succesul biomaterialelor n organism depinde de factori controlabili, ca proprietile i designul materialelor, de biocompatibilitatea acestora, dar i de tehnica chirurgical, starea de sntate i activitile pacientului. Factorii de risc care nu pot fi controlai i limiteaz sever utilizarea implantului sunt eventualele infecii, atacul sistemului imunitar al organismului asupra implantului sau al implantului asupra organismului (toxicitate, reacii alergice induse, carcinogenez), factori de care depinde cea mai important calitate a biomaterialelor, respectiv biocompatibilitatea. Mai concret, biocompatibilitatea implic acceptarea implantului de ctre esuturile adiacente i de organismul gazd ca ntreg. Materialele biocompatibile nu irit structurile juxtapuse i nu provoac rspuns inflamator, reacii alergice sau imunologice.

Microarhitectura (microgeometria, rugozitatea) suprafeei biomaterialelor i compoziia chimic sunt caracteristici extrem de importante. Natura fizic a suprafeei la nivel atomic, molecular sau mai mare n funcie de dimensiunile unitilor biologice implicate (celule, biomolecule) se reflect n suprafaa de contact (ca form i dimensiune), ceea ce cauzeaz o cascad de reacii legate de tipurile de legturi cu unitile biologice, crora le sunt influenate structura i funciile.

I.2. Aderena microbian la substrat inert

I.2.1.Aspecte generale i particulare ale aderenei la substrat inert

Dac manufacturarea i proprietile biomaterialelor sau tehnica chirurgical sunt factori de risc controlabili i previzibili n implantologie, infeciile sunt factori de risc care nu pot fi controlai i limiteaz sever utilizarea oricrui implant. Etapele desfurrii unui process infecios implic un debut legat de colonizare, care depinde de capacitatea microorganismelor implicate de a adera la suprafee.

Noiunea de aderen n biologie constituie un concept de o importan fundamental, mecanismele de fixare fiind o etap prealabil necesar majoritii proceselor biologice. Organizarea arhitectural complex, ca i potenialul funcional al nveliurilor celulare, care interfer n toate procesele biologice celulare, au determinat ca structurile de suprafa s devin unul din subiectele privilegiate ale biologiei celulare i moleculare, dar i al imunologiei (Lazr, 2003).

De peste 25 de ani cercettorii au investigat capacitatea de aderen microorganismelor la diferite suprafee, pentru a identifica proprietile acestora legate de aderen n corelaie cu specia sau tipul de microorganism, proprietile substraturilor implicate (substraturi rezistente sau nu la colonizare) i condiiile de mediu care influeneaz semnificativ acest proces (de exemplu temperatura, valoarea pH, concentraia de electrolii). Au fost i sunt n studiu numeroase ncercri de a controla acest fenomen n sensul atarii sau detarii microorganismelor, n corelaie cu mecanismele extrem de diversificate ale aderenei microbiene. n consecin, orice studiu de aderen trebuie s fie bine definit i controlat pentru a rspunde unei ntrebri specifice (Atlas i Bartha, 1999; An i Friedman, 2000).

I.3. Mecanismele patogenezei infeciilor asociate implantrii dispozitivelor medicale

Un concept fundamental n patogeneza infeciilor legate de implantarea dispozitivelor protetice este formarea biofilmelor microbiene. O varietate de bacterii Gram pozitive i Gram negative, precum i microfungi au fost identificai ca ageni etiologici ai infeciilor consecutive introducerii n organismul uman a unui corp strin, Staphylococcus epidermidis i ali stafilococi coagulazo-negativi fiind cel mai adesea implicai n FBRI dup implantarea dispozitivelor medicale temporare sau permanente. FBRI cuprind toate entitile nosologice cu etiologie microbian, infecii localizate sau bacteriemii asociate cu implantarea dispozitivelor medicale.

Formarea unui biofilm este un proces multistadial ce presupune:

1) sedimentarea nutrienilor i formarea unui film macromolecular sau condiionant pe o suprafa dat pe care se concentreaz nutrienii, ca i microorganismele planctonice prin procese de transport activ (chemotaxie) sau pasiv, care ader, procesul fiind la nceput reversibil, apoi ireversibil i dependent de sinteza microbian de substante polimerice;

2) etapa de colonizare i eventual invazia substratului, n funcie de natura sa chimic; celulele ferm aderate se multiplic formnd microcolonii ce vor conflua rezultnd un biofilm, la inceput unistratificat, apoi multistratificat;

3) etapa de maturare a biofilmului, care ncepe s devin neuniform, prin apariia unor structuri asemntoare coloanelor i ciupercilor (pillar-like i mushroom-like); celulele biofilmului sunt acum nglobate ntr-o matrice extensiv de exopolizaharide (EPS-extracellular polimeric substances) ce va influena fiziologia biofilmului;

4) detaarea de celule solitare sau agregate celulare din biofilmul matur, care vor coloniza noi spaii, relund ciclul (fig. 9).

Fig. 9. Model de formare si dinamica dezvoltrii unui biofilm (dup Lazr, 2011).II. Principii active din plante cu activitate antimicrobianII.1. Date generaleUleiurile volatile sunt amestecuri complexe de compui volatili produi de sisteme biologice, de obicei de plante, obinute exclusiv prin metode fizice (presare, distilare, extracie simpl sau continu) din planta ntreag sau din organe ale acesteia. Componentele amestecurilor sunt produi ai metabolismului secundar vegetal, secretate de structuri anatomice specializate. Uleiurile pot fi preformate i depozitate n structuri anatomice specializate sau eliminate prin celulele epidermale, ca urmare a unor activiti metabolice, sau a interaciunii plantei cu diveri ageni declanatori sau pot fi prezente sub form de glicozide (glucosinolate).

Toate organismele vegetale prezint capacitatea de a produce, n urma diverselor reacii metabolice, substane chimice volatile, dar, convenional, plante productoare de uleiuri volatile, denumite curent plante aromatice, sunt acelea din care sunt extrase uleiuri volatile care prezint sau ar putea prezenta interes comercial. Uleiurile volatile de interes comercial sunt selecionate, n principal, dup dou criterii:

aspectul calitativ legat de proprieti aromatice deosebite ale amestecului de compui volatili, specific florilor (exemplu Rosa spp., Jasminum sambac, Polyanthes tuberosa), care produc i elimin rapid prin epiderma petalelor componentele uleiului volatil specific. Randamentul de extracie n acest caz este sczut. aspectul cantitativ secreia i acumularea uleiurilor volatile la nivelul unor structuri anatomice specializate, ceea ce conduce la creterea concentraiei uleiurilor volatile i a randamentului de extracie (Hsn Can Baer i Buchbauer, 2010).Ca i n cazul altor extracte vegetale, activitatea biologic a uleiurilor volatile este determinat de anumii contitueni chimici, a cror aciune este sinergic sau concertat.

Din a doua jumtate a secolului al XX-lea, datorit evoluiei tehnicilor de chimie analitic (metode moderne de identificare spectrometrie RMN, spectrometrie de mas i de separare metode cromatografice diverse), cunotinele de fitochimie evolueaz exponenial (Hsn Can Baer i Buchbauer, 2010; Dudareva i colab., 2004).Polimorfismul fitochimic al uleiurilor volatile, intra- i interspecific, este demonstrat de spectrul foarte larg de aciuni biologice care depinde de ansamblul constituenilor i de proporia lor n amestec. Diversitatea compoziional este influenat calitativ i cantitativ de mai muli factori.

Importana uleiurilor volatile industriale a determinat intensificarea studiilor pentru identificarea cilor de biosintez a acestora i utilizarea tehnicilor de inginerie genetic pentru obinerea unor randamente sporite de extracie a unor compui utili, ntrebuinnd metoda modelrii matematice pentru predicia i optimizarea unor parametri de studiu (Rios-Estepa, 2010).

II.1. Modaliti de extracie i controlul calitii uleiurilor volatile

Metodele de obinere a uleiurilor volatile sunt clasificate n: (1) metode industriale; (2) metode de laborator; (3) metode microextractive.

La baza procedeelor de extracie a uleiurilor volatile din produsele vegetale stau proprietile fizico-chimice ale acestora, n special tensiunea mare de vapori i solubilitatea n solveni volatili neapoi i n substane grase. Produsele supuse extraciei pot fi att proaspete ct i uscate, ntregi sau fragmentate, concasate (organe subterane) sau sub form de rumegu (lemnul) (Istudor, 2001).II.3. Activitatea antimicrobian a uleiurilor volatileII.3.1. Date generale

Unele familii de plante sunt cunoscute ca fiind productoare de uleiuri volatile. Dintre acestea pot fi menionate familiile: Apiaceae, Asteraceae, Cupressaceae, Hypericaceae, Lamiaceae, Liliaceae, Myrtaceae, Pinaceae, Piperaceae, Rosaceae, Rutaceae, Fabaceae, Santalaceae, Zingiberaceae, Zygophyllaceae (Thormar, 2011).

Rolul fiziologic al uleiurilor volatile este puin precizat. Se pare c acestea sunt implicate n autoaprarea speciilor respective mpotriva infeciilor bacteriene i fungice, n stimularea polenizarii cu ajutorul insectelor i deci n semnalizarea interspecific. Datorit faptului c unii constitueni pot fi solubilizai prin glicozidare i depozitai n esuturi, a fost propus ipoteza c uleiurile volatile ar putea avea i rol de subtane de rezerv (Istudor, 2001; Dudareva, 2004; Pichersky i Dudareva, 2006). Carson C. i Hammer K. (2011) susin ipotezele anterior menionate privind aciunile fiziologice ale uleiurilor volatile i faptul c aparenta lips a rolurilor fiziologice nu se coreleaz cu absena real a acestora, ci mai degrab cu lipsa studiilor de confirmare a proprietilor unor substane de tipul metaboliilor secundari.

Aciunea terapeutic a uleiurilor volatile rezult din combinarea proprietilor terapeutice comune i specifice anumitor constitueni. Aceast combinare a efectelor terapeutice a constituenilor nu trebuie privit ca o simpl sum a acestora, deoarece uleiuri volatile care au unul sau mai muli constitueni comuni pot prezenta proprieti terapeutice diferite, demonstrate de numeroase studii publicate in literatura de specialitate. Proprietile terapeutice ale uleiurilor volatile includ:

(1) Proprietatea antiinfecioas. Efectul antimicrobian este unul dintre primele efecte farmacologice studiate pentru extractele din plante, literatura de specialitate coninnd foarte multe astfel de studii care reunesc o diversitate de metode i rezultate experimentale. Baza de date PubMed prezint rezultate ale acestor studii, care relev aciunea anumitor uleiuri volatile (Dabbah i colab., 1970; Zarai i colab., 2011; Wang i colab., 2012), sau concluzii experimentale asupra diverilor compui activi din plante i modalitilor de aciune ale acestora (Cowan, 1999). Metodele de testare a activitii antimicrobiene reunesc metode de microbiologie clasic (tehnica antibiogramei - metoda difuzimetric adaptata, in mai multe variante metodologice, metoda cinetic, metoda microdiluiilor (Zeng i colab., 2011; Kaur i Arora 2009; Knowless i colab., 2005, Kaya i colab., 2008; Husnu can Baser i Buchbauer, 2010, Thormar, 2011), metode microscopice (pentru demonstrarea unor modificri morfologice la tulpinile microbiene studiate Tyagi i Malik, 2010). Derakhshan i colab., 2010, demonstreaz proprietile anti-patogenice al uleiului din Cuminum cyminum, Apiaceae, asupra unor tulpini de Klebsiella pneumoniae, manifestat prin efectul antibiofilm, sinergismele de aciune cu antibiotice curent utilizate n clinic i prin vindecarea de plasmide indus prin degradarea ADN plasmidial la tulpinile studiate (Derakhshan i colab., 2010). Studiile asupra efectului antimicrobian au demonstrat eficiena uleiurilor volatile att in vitro, ct i in vivo (Sokovi i colab. 2012).Efectul antiviral este de asemenea intens studiat pentru demonstrarea proprietilor antiinfecioase ale uleiurilor volatile (Wu i colab., 2010).(2) Aciunea antitumoral. n 2011, Suhail i colab. demonstreaz activitatea proapoptotic a uleiului volatil de Boswellia sacra asupra culturilor de celule standardizate T47D, MCF7, MDA-MB-231 i MCF10-2A, prin studiul fragmentrii ADN genomic, analiz Western blot i a reglrii ciclului celular. Scherbina i colab., 2010, demonstreaz efectul chemoterapeutic al pansamentelor ocluzive impregnate cu concentraii specifice de ulei volatil din Lavandula angustifolia.(3) Aciunea antioxidant

(4) Proprietile imunomodulatoare

(5) Aciunile asupra sistemului nervos central

(6) Aciunile asupra aparatului cardiovascular (Istudor, 2001; Thormar, 2011).

De fapt, spectrul aciunilor terapeutice ale uleiurilor volatile reunete proprieti care se manifest selectiv i modulat asupra tuturor organelor i sistemelor organismului uman (Cercasov i colab., 2004).

Ca i n cazul altor produse vegetale, i la uleiurile volatile, de activitatea biologic este responsabil ansamblul constituenilor, care pot aciona sinergic sau concertat, i mai rar componentele izolate. Probleme ca rezistena microbian la substanele antibiotice existente i declinul nregistrat n formularea de noi antibiotice au generat un interes sporit pentru medicamentele pe baz de plante cu potenial antiinfecios (Gonzlez-Lamothe i colab., 2009, Murphy Cowan, 2009).

Uleiurile volatile au inte de aciune multiple la nivelul celulei microbiene, ceea ce reprezint un avantaj al utilizrii lor, ca substane antimicrobiene, cu activitate sinergic sau concertat a componentelor activitatea lor antimicrobian, i nu numai, fiind o rezultant a faptului c sunt sisteme multicomponent. De asemenea, extractele din plante pot manifesta afinitate pentru anumite esuturi i organe, ceea ce orienteaz activitatea biologic ctre situsuri specifice unde diferitele principii active realizeaz concentratii active farmacologic (Husnu can Baer i Buchbauer, 2010; Dudareva i colab., 2004). Numeroase studii demonstreaz activitatea antimicrobian a unor componente majoritare ale amestecurilor de tipul uleiurilor volatile (Brehm-Stecher i Johnson, 2003), iar altele stabilesc posibile mecanisme de aciune pentru constituenii cu activitate antimicrobian (Trombetta i colab., 2005).

Efectul microbicid sau microbiostatic al biocidelor de origine vegetal poate influena sensibilitatea unor tulpini rezistente la substane antibiotice. intele de aciune ale acestora includ, ca i n cazul antibioticelor, interferena cu procesul de biosintez a peptidoglicanului, inhibarea activitii pompelor de eflux, destabilizarea integritii membranei externe (Gonzlez-Lamothe i colab., 2009). De asemenea, biocidele din plante pot aciona prin inhibarea expresiei factorilor de virulen la nivelul celulelor microbiene (Qiu i colab., 2010; Qiu i colab., 2010; Qiu i colab., 2011).

In ultima perioad un interes deosebit este atribuit comportamentului social al microorganismelor, respectiv capacitii de aderen a acestora la substraturi vii sau inerte, factor de virulen cu implicaii clinice majore (dezvoltarea infeciilor microbiene cu producere de biofilme), dar i un important aspect ecologic i practic cu efecte benefice sau detrimentale. Consecutiv aderenei la substrat se formeaz biofilmele microbiene, iar la baza acestui proces st un mecanism reglator QS, de cuantificare a densitii populaionale. Biocidele de origine vegetal au fost studiate i ca posibili inhibitori ai acestui factor de virulen, prin blocarea acestui mecanism de comunicare (prin interaciuni fizico-chimice) (Knowles i colab., 2005; Adonizio i colab., 2008). Activitatea antibiofilm a extractelor vegetale ar putea fi ns privit i ca o consecin a modificrilor substratului (modificarea potenialului de oxido-reducere, a rezistivitii sau a a valorii pH).

Activitatea antimicrobian a unor uleiuri volatile, dar i a componentelor acestora, a fost demonstrat fa de o gam larg de microorganisme, bacterii Gram pozitive i Gram negative i fungi. Se pare c bacteriile Gram negative sunt mai rezistente la activitatea biocidelor obinute din plante, datorit lipopolizaharidelor prezente la nivelul membranei externe, dar exist i excepii (Murphy Cowan M., 1999; Gonzlez-Lamothe i colab., 2009).

Mecanismele activitii antimicrobiene sunt relativ puin nelese, n special pentru uleiurile volatile, care sunt amestecuri complexe de terpenoide (Bont i colab., 1995; Hyldgaard i colab., 2009).II.3.3. Activitatea anti-patogenic i mecanismele de aciune ale uleiurilor volatile

Atenuarea virulenei, n opoziie cu efectul microbicid direct, pare s fie o strategie de lupt antiinfecioas care se impune n cercetarea actual. Moleculele anti-patogenice inhib producerea de toxine la nivelul celulei microbiene sau afecteaz capacitatea microorganismelor de a se adapta la condiiile de mediu oferite de gazd, conferind astfel un avantaj competitiv sistemului imunitar al gazdei care va putea realiza clearance-ul microorganismelor infectante. Avantajul acestei abordri rezid din conservarea microbiotei normale a gazdei, care nu va fi afectat de moleculele anti-patogenice, dar i din lipsa presiunii selective care conduce la selecionarea tulpinilor microbiene rezistente i multirezistente (Alvana i colab., 2011). Astfel de molecule anti-patogenice eficiente mpotriva bacteriilor Gram negative se adreseaz ntreruperii mecanismelor de comunicare QS, sistemelor de secreie i capacitii de aderen mediat de pili, n timp ce la bacteriile Gram pozitive este studiat inhibiia capacitii de aderen. Supresia producerii toxinelor bacteriene, ca i interferena cu mecanismele de evitare a rspunsului imun al gazdei sunt posibile edfecte anti-patogenice (Barczack i Hung, 2009). Aceast abordare se poate corela cu mecanismele de aciune antimicrobian ale uleiurilor volatile, relativ puin studiate, care se manifest pe urmtoarele ci: (1) permeabilizarea nveliurilor celulare, (2) depolarizarea membranei plasmatice, (3) afectarea polimorfismului lipidic, (4) interaciunea cu proteinele membranare la bacterii Gram negative, (5) afectarea proceselor respiratorii, (6) coagularea materialului citoplasmatic, (7) inhibiia histidin-decarboxilazei (8) depleia ATP intracelular, (9) supresia producerii de toxine microbiene. nc i mai puine sunt informaiile legate de sinergismul sau antagonismul de aciune al componentelor uleiurilor volatile, care acioneaz concertat, ceea ce sugereaz importana studiilor de transcriptomic i proteomic pentru elucidarea cilor de aciune i a spectroscopiei RMN, cristalografiei de raze X sau modelrii moleculare pentru elucidarea interaiunilor la nivel molecular, care s fundamenteze tiinific utilizarea uleiurilor volatile ca strategie de lupt antiinfecioas (Hyldgaard i colab., 2012).II.3.4. Procedee de stabilizare a uleiurilor volatile

Utilizarea uleiurilor volatile este limitat de volatilitatea constituenilor. Acest fapt se reflect asupra aplicaiilor practice n domenii diverse ale acestora, dar i asupra metodelor de testare a activitii lor. Testele care demonstreaz activitatea antimicrobian a uleiurilor volatile pot fi grupate n: metode difuzimetrice, metoda diluiilor i metode autobiografice. Aceste metode sunt citate n literatur, dar nu exist standardizare n testarea activitii antimicrobiene a uleiurilor volatile, metodele menionate fiind adaptate dup metodele CLSI pentru testarea activitii antimicrobiene a antibioticelor. Adaptrile au fost realizate n funcie de domeniul de aplicabilitate a uleiurilor volatile testate, comparaia ntre rezultatele obinute fiind imposibil. Dei activitatea antimicrobian a acestor compui a fost intens studiat, totui influena fraciilor volatile asupra testelor prin metoda microdiluiilor a fost adesea neglijat. Novy i Rondevaldova, 2011, demonstreaz c vaporii de timochinon pot conduce la false rezultate pozitive la testarea susceptibilitii microorganismelor la standardul de timochinon.

Stabilitatea este definit drept capacitatea unei substane medicamentoase de a-i menine proprietile (de exemplu identitatea chimic, proprietile terapeutice, proprietile fizico-chimice, puritatea), n accord cu specificaiile tehnice, pe toat perioada de valabilitate, sau pn la termenul recomandat pentru retestare.

ncapsularea uleiurilor volatile avnd ca efect reducerea volatilitii constituenilor i lrgirea zonelor de aplicabilitate a fost intens studiat n cercetarea industrial, numeroase brevete avnd acest subiect. Controlul parametrilor de ncapsulare va depinde de natura substanelor volatile care urmeaz s fie ncapsulate, dar i de matricea utilizat.

ncapsularea uleiurilor volatile ar putea permite i mbuntirea relevanei studiilor pentru demonstrarea activitii biologice a acestora. Totui, procedeele de ncapsulare sunt laborioase, iar caracterizarea sistemelor obinute necesit aparatur de laborator complex.

II.3.5. Importanta nanotehnologiei n formularea farmaceutic

In ultimii 35 de ani, dezvoltarea nanotehnologiei a deschis noi perspective n tiinele medicale, n special n domeniul industriei farmaceutice. Biodisponibilitatea optim a formulrilor farmaceutice, ca i minimizarea efectelor secundare sau creterea eficienei terapeutice odat cu scderea dozei principiului activ sunt doar cteva dintre avantajele formulrii nanosistemelor farmaceutice pentru transport la int/eliberare controlat. n ultimii ani numrul studiilor prezentate n literatura de brevete, dar i al produselor comerciale existente a crescut semnificativ. Cele mai cunoscute aplicaii vizeaz terapia bolilor canceroase, utiliznd nanosistemele comerciale: Caelyx, Doxil, Transdrug, Abraxane etc.

Polimerii sunt substanele cele mai utilizate ca vectori n nanosistemele farmaceutice cu transport la int/eliberare controlat. Dimensiunile acestora variaz ntr-un interval larg, de la civa nanometri pn la cteva sute de nanometri. Marea varietate a matricelor purttoare a substanelor active rezid din necesitatea optimizrii formulrilor pentru a obine eficien farmaceutic maxim. De la primele sisteme nanoparticulate pentru transport la int/eliberare controlat, propuse de Gregory Gregoriadis n 1974, cercetrile au condus la descoperiri importante bazate pe abordri multidisciplinare, cu aplicaii clinice n toate specialitile medicale (Pathak i Thassu, 2009).n concluzie, uleiurile volatile sunt amestecuri fitochimice complexe, coninnd pn la 100 de compui chimici aparinnd la clase diferite. Cea mai modern abordare n cercetrile de identificare a constituenilor amestecurilor multicomponente este aceea de utilizare a cuplajelor tehnice, utiliznd metode cromatografice. Cuplajele tehnice au permis efectuarea studiilor de metabolomic i metabonomic pentru atestarea calitii uleiurilor volatile provenite dintr-un material vegetal.

Probleme ca rezistena microbian la subtanele antibiotice existente i declinul nregistrat n formularea de noi antibiotice au generat un interes sporit pentru medicamentele cu potenial antiinfecios extrase din plante.

Biocidele sunt subtane antimicrobiene cu inte de aciune multiple la nivelul celulei microbiene, ceea ce reprezint un avantaj al utilizrii lor. Biocidele de tipul uleiurilor volatile conin compui cu activitate sinergic sau concertat, activitatea lor antimicrobian, i nu numai, fiind o rezultant a faptului ca sunt sisteme multicomponent.

Extractele din plante pot manifesta afinitate pentru anumite esuturi i organe, ceea ce orienteaz activitatea biologic ctre situsuri specifice, unde diferitele principii active realizeaza concentratii active farmacologic.

Atenuarea virulenei, n opoziie cu efectul microbicid direct, pare s fie o strategie de lupt antiinfecioas care se impune n cercetarea actual. Moleculele antipatogenice inhib producerea de toxine la nivelul celulei microbiene sau afecteaz capacitatea microorganismelor de a se adapta la condiiile de mediu oferite de gazd, conferind astfel un avantaj competitiv sistemului imunitar al gazdei, care va putea realiza clearance-ul microorganismelor infectante.

Utilizarea uleiurilor volatile este limitat de volatilitatea constituenilor. Acest fapt se reflect asupra aplicaiilor practice n domenii diverse ale acestora, dar i asupra metodelor de testare a activitii lor, procedeele de stabilizare a acestora reprezentnd direcii importante de cercetare.

In ultimii 35 de ani, dezvoltarea nanotehnologiei a deschis noi perspective n tiinele medicale, n special n domeniul industriei farmaceutice. Biodisponibilitatea optim a formulrilor farmaceutice, ca i minimizarea efectelor secundare sau creterea eficienei terapeutice odat cu scderea dozei principiului activ sunt doar cteva dintre avantajele formulrii nanosistemelor farmaceutice pentru transport la int/eliberare controlat.PARTEA EXPERIMENTALDEZVOLTAREA UNOR METODE ALTERNATIVE ECOLOGICE BAZATE PE COMPUI FITOTERAPEUTICI - ULEIURI VOLATILE, PENTRU PREVENIREA I ERADICAREA INFECIILOR CU MICROORGANISME INCLUSE N BIOFILMEScop i obiective

Oportunitatea studiului compuilor naturali cu aciune terapeutic este evident n contextul nevoii acute de soluii terapeutice pentru rezolvarea problemei rezistenei la antibiotice i a toxicitii/efectelor secundare caracteristice substanelor xenobiotice utilizate ca medicamente. n acest context, scopul tezei a fost:

Dezvoltarea unor metode alternative i complementare ecologice, de prevenire i eradicare a infeciilor consecutive dezvoltrii biofilmelor de ctre tulpini microbiene virulente i multirezistente, pe dispozitive protetice, bazate pe uleiuri volatile totale i fracionate i optimizarea activitii antimicrobiene a extractelor vegetale selectate prin obinerea unor nanosisteme hibride funcionalizate.Obiectivele dup care s-a condus studiul au fost:

a)Caracterizarea fenotipic i genotipic a unor tulpini microbiene izolate din infecii consecutive dezvoltrii biofilmelor pe dispozitive biomedicale;

b)Obinerea i caracterizarea fizico-chimic a unor extracte vegetale;

c)Evaluarea calitativ i cantitativ a activitii antimicrobiene i antibiofilm, ca i a mecanismelor de aciune ale uleiurilor volatile asupra celulelor microbiene n suspensie i a celor aderate la un substrat;

d)Testarea influenei extractelor i componentelor selectate pe baza activitii antimicrobiene asupra celulelor eucariote

e)Obinerea unor nanosisteme hibride funcionalizate anorgano-organice cu activitate antimicrobian/anti-biofilm pe baz de uleiuri volatile.III.1. MATERIALE SI METODE

III.1.1. OBINEREA, CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMIC I DEMONSTRAREA ACTIVITII ANTIMICROBIENE I ANTIBIOFILM A UNOR ULEIURI VOLATILE ASUPRA TULPINILOR MICROBIENE VIRULENTE I MULTIREZISTENTEPentru studiul activitii antimicrobiene a uleiurilor volatile s-a realizat o selecie a materialului vegetal, din specii cunoscute ca fiind productoare de uleiuri volatile i o seecie a tulpinilor microbiene testate, prin abordarea unor metode fenotipice i genotipice de caracterizare a acestora.III.1.1.1. Caracterizarea fenotipic i genotipic a unor tulpini microbiene virulente i multirezistente izolate din probe clinice

Tulpinile izolate din probe clinice diverse s-au identificat biochimic i s-au caracterizat din punct de vedere al profilului factorilor de virulen.III.1.1.1.1. Identificarea biochimic pe baza testelor biochimice a unor tulpini microbiene virulente i multirezistente izolate din probe clinice

Tulpini microbiene izolate din probe clinice. Pentru stabilirea efectului antimicrobian al uleiurilor volatile s-au utilizat tulpini bacteriene aparinnd speciilor S. aureus, S. epidermidis i Ps. aeruginosa i specii fungice aparinnd genurilor Candida, Saccharomyces i Aspergillus. Identificarea tulpinilor s-a realizat cu ajutorul galeriilor microtest ID32 Staph, API 20NE, Fungichrom I. n acest studiu s-au utilizat 30 tulpini de Ps. aeruginosa i 30 de S. aureus selectate dintr-o colecie de tulpini izolate din infecii cu producere biofilme ntre anii 2005-2008, furnizate de Laboratorul de Microbiologie al Institutului de Boli Cardiovasculare C. C. Iliescu din Bucureti. III.1.1.1.2. Determinarea capacitii de aderen la substrat inert a tulpinilor bacteriene patogene prin testul producerii de slime Testul slime s-a utilizat pentru evidenierea capacitii de aderen la substratul inert reprezentat de materialul polimeric din care sunt confecionate plcile cu 96 de godeuri (principiul metodei va fi descris n capitolul III.1.1.3.3).III.1.1.1.3. Metoda Brun-Buisson pentru determinarea cantitativ a capacitii de aderen la substrat inert pentru tulpinile fungice patogene Principiul metodei. Fragmente de catetere din polipropilen de 1 cm2 au fost supuse colonizrii prin incubare cu o suspensie microbian ajustat nefelometric conform standardului McFarland 0.5. Dup colonizare s-a evaluat dezvoltarea biofilmelor experimentale monospecifice n dinamic temporal, cuantificndu-se UFC la 24, 48, respectiv 72h.

III.1.1.1.4. Caracterizarea fenotipic a factorilor de virulen solubili pentru tulpinile fungice studiate Caracterizarea fenotipic a factorilor de virulen solubili pentru tulpinile fungice studiate s-a realizat prin metode enzimatice specifice, descrise n cap. III.1.1.3.5.III.1.1.1.5. Caracterizarea genotipic a factorilor de virulen bacterieni utiliznd metodele simplex i multiplex PCR

ADN genomic a fost extras din cte cinci tulpini aparinnd speciilor S. aureus i Ps. aeruginosa, respectiv cate patru tulpini clinice i o tulpin ATCC. O colonie din fiecare cultur dezvoltat pe geloz simpl a fost inoculat n 5 ml de mediu BHI (Brain Heart Infusion), supensiile rezultate fiind incubate peste noapte (18h) la 37C, cu agitare la 300 rpm. Din culturile obinute, extracia ADN a fost realizat cu ajutorul kitului Wizard DNA Genomic Purification (Promega, USA), n acord cu recomandrile productorului. ADN genomic obinut a fost utilizat ca matri pentru toate experimentele PCR.

Detectarea prin PCR a genelor de virulen la tulpinile de S. aureus Caracterizarea la nivel molecular a prezenei genelor care codific pentru patru factori de virulen la tulpinile de S. aureus studiate a fost realizat cu ajutorul tehnicii PCR. Toate reaciile PCR au fost efectuate cu ajutorul Thermal Cycler Corbet. Tehnica PCR a fost utilizat pentru detectarea a opt gene care codific pentru principalele adezine MSCRAMMs la tulpinile de S. aureus. Detectarea prin PCR a genelor de virulen la tulpinile de Ps. aeruginosa Caracterizarea la nivel molecular a prezenei genelor care codific pentru 11 factori de virulen la tulpinile de Ps. aeruginosa studiate a fost realizat cu ajutorul tehnicii PCR. Astfel, detectarea genelor care codific pentru: trei proteaze, ramnolipid, dou fosfolipaze, sideroforul pioverdin si pentru patru exotoxine (ExoA, ExoS, ExoU, ExoT) s-a realizat prin teste PCR simplex pentru ficare gen utiliznd Thermal Cycler Corbet.Detectarea genelor care codific pentru proteazele elastaza (lasB), proteaza alcalin (aprA) i pentru ramnolipidul (rhlAB) s-a realizat prin PCR simplex pentru fiecare gen folosind acelai program de amplificare. De asemenea, gena ce codific pentru proteaza IV a fost detectat printr-un PCR simplex cu primeri specifici. Detectarea genei plcH, care codific pentru sinteza fosfolipazei C hemolitice i a genei plcN, care codific pentru fosfolipaza C nehemolitic, s-a realizat prin dou reacii PCR simplex pentru fiecare gen folosind acelai program de amplificare. Detectarea genei pvdA care codific pentru sideroforul pioverdin a fost realizat printr-un PCR simplex cu primeri specifici. Cteva exotoxine (ExoA, ExoS, ExoT i ExoU) au fost detectate prin reacii PCR individuale folosind primeri genici specifici (Cotar, 2009). Caracterizarea sistemelor de QS la tulpinile de S. aureus i Ps. aeruginosa a) Determinarea prin PCR a tipului de sistem QS agr la tulpinile de S. aureus Caracterizarea la nivel molecular a sistemului QS agr la tulpinile de S. aureus studiate a fost realizat prin real-time multiplex PCR. Caracterizarea genotipic a sistemelor QS las i rhl la tulpinile de Ps. aeruginosa Caracterizarea molecular a locilor genici responsabili de QS la tulpinile de Ps. aeruginosa analizate s-a realizat prin detectarea prin real-time-multiplex PCR a genelor lasI, lasR, care codific pentru sistemul QS las i a genelor rhlI, rhlR, care codific pentru sistemul QS rhl (Cotar i colab., 2008). III.1.1.2. Obinerea i caracterizarea fizico-chimic a extractelor vegetale

III.1.1.2.1. Materialul vegetal - recoltare i pregtirea pentru extracieMaterialul vegetal pentru extracii a fost obinut de la furnizori locali (Rosmarinus officinalis, Mentha x piperita, Foeniculum vulgarae, Salvia officinalis, Eugenia caryophyllata, Citrus maxima), din flora spontan (Picea abies), dintr-o cultur organic (Anethum graveolens), din cultura Grdinii Botanice din Cluj (Forsythia sp.), din pepiniera Istitutului de Cercetare Dezvoltare pentru Pomicultur Piteti-Mrcineni (Aronia melanocarpa) i a Institutului de Cercetri i Amenajri Silvice (ICAS) (arbori din familia Pinaceae). III.1.1.2.2. Obinerea uleiurilor volatile prin hidrodistilarePlantele sau prile de plante recoltate (Anethum graveolens, Picea abies, Pinus nigra, Larix decidua, Abies alba, Pseudotsuga menziesii) au fost uscate i separate manual. Recoltarea s-a realizat n fenofaze optime de dezvoltare a plantelor pentru separarea organelor vizate pentru extracia uleiurilor volatile. Plantele achiziionate de la furnizori locali (Citrus maxima, Eugenia carryophyllata, Mentha piperita, Rosmarinus officinalis, Foeniculum vulgare) au fost identificate nainte de a fi utilizate pentru extracia uleiurilor volatile. Probele de material vegetal uscat/proaspt au fost hidrodistilate ntr-un aparat de tip Neo-Clevenger timp de 4 h (Farmacopeea Romn, ed. a-X-a). III.1.1.2.3. Obinerea uleiurilor volatile prin hidrodistilare asistat de microunde

Procedeul este similar hidrodistilrii clasice, nclzirea realizndu-se n condiii de microunde, ceea ce scurteaz durata de extracie i crete randamentul n ulei volatil.

III.1.1.2.4. Obinerea maceratului din Forsythia spp.Materialul vegetal a fost reprezentat de tulpini, frunze i flori din cultura Grdinii Botanice din Craiova. Speciile utilizate au fost F. suspensa, F. viridissima i hibridul Forsythia x intermedia. Metoda de obinere a extractului: macerarea la temperatura camerei cu o soluie de alcool 96%, timp de 10 zile. Maceratul s-a prelucrat n continuare prin evaporare la sec i resolubilizare a compuilor din extract ntr-o solutie alcoolic 20%. III.1.1.2.5. Obinerea prin presare la rece a extractului din Aronia melanocarpaFructele au fost recoltate din pepiniera Institutului de Cercetare Dezvoltare pentru Pomicultur de la Piteti-Mrcineni. Pentru meninerea proprietilor fructelor pn la efectuarea extraciei acestea s-au congelat la 45C. Exprimatul s-a obinut din fructele mojarate, sonicate i supuse centrifugrii n vederea separrii sucului. Pentru testarea proprietilor i caracterizarea compuilor coninui de fructe de Aronia melanocarpa au fost identificate calitativ i cuantificate substanele: acid ascorbic, -caroten i antocianii.III.1.1.2.6. Caracterizarea fizico-chimic a extractelor vegetale

III.1.1.2.6.1. Msurarea densitii uleiurilor volatile

S-a realizat prin msurarea greutii la balana analitic (precizie cinci zecimale) i raportare la volum. Pentru acuratee, masa a fost msurat folosind un program statistic al balanei, cu 10 determinri.

III.1.1.2.6.2. Msurarea indicelui de refracie al uleiurilor volatile

n cazul lichidelor transparente, indicele de refracie se poate determina cu ajutorul refractometrului Abb. III.1.1.2.6.3. Analiza GC-MS a uleiurilor volatile

Pentru determinarea compozitiei chimice s-a utilizat un cromatograf de gaze Fisons Instruments GC 8000, cuplat cu spectrometru de mas cu ionizare prin impact i analizor quadrupol, model MD 800. III.1.1.2.6.4. Determinarea acidului ascorbic

Pentru determinarea cantitativ a acidului ascorbic a fost aplicat metoda dicromatometric, care utilizeaz ca titrant dicromatul de potasiu, soluie standard i ca indicator amidonul. Excesul de ioni dicromat reacioneaz cu ionii de iodur de potasiu elibernd iod, iar acesta coloreaz amidonul din mediul de reacie n albastru.

III.1.1.2.6.5. Determinarea coninutului total de antociani

Pentru determinarea coninutului total de antociani a fost utilizat metoda diferenei de pH. Aceast metod este una spectrofotometric, rapid i simpl, bazat pe transformrile structurale ale antocianilor atunci cnd se modific valoarea pH (soluie colorat la pH=1,0 i soluie incolor la pH=4,5) (Bratu i Crmaru, 2000).III.1.1.2.6.6. Extracia i determinarea carotenoizilor

Metoda spectrofotometric de determinare cantitativ a totalului carotenoidic (Willstder i Stoll, citai de Jungmin i colaboratorii, 2005) folosete ca substan de referin -caroten soluie 2,5 mg% preparat n benzen i const n saponificarea esterilor xantofilici cu KOH 10%, extracia xantofilelor rezultate n eter i msurarea absorbanei soluiei eterice la spectrofotometru la =460 nm, n cuve de 1 cm (Jungmin i colab., 2005.III.1.1.2.6.7. Determinarea coninutului n polifenoli totali exprimai n acid cafeic

S-a realizat prin metoda Folin-Cioclteu.

III.1.1.3. Evaluarea calitativ i cantitativ a activitii antimicrobiene i antibiofilm, ca i a aciunilor sinergice i a mecanismelor de aciune ale uleiurilor volatile asupra celulelor microbiene n suspensie i a celor aderate la un substratIII.1.1.3.1. Determinarea calitativ a spectrului antimicrobian al extractelor vegetaleTestele calitative efectuate pentru determinarea spectrului activitii antimicrobiene al extractelor vegetale au fost metoda difuzimetric, metoda dinamicii instalrii efectului microbicid i tehnica citometriei n flux.

III.1.1.3.1.1. Metoda difuzimetric standardPentru testarea calitativ a activitii antimicrobiene s-au preparat suspensii microbiene ajustate la 1.5x108 UFC/mL conform standardului McFarland 0,5 din culturi de 15-18 h dezvoltate pe mediu solid (Sabouraud). Activitatea antimicrobian s-a determinat prin metoda difuzimetric adaptat, standardizat pentru controlul activitii antimicrobiene a antibioticelor, CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), 2009. III.1.1.3.1.2. Curba dinamicii temporale a efectului microbiostatic/microbicid

Principiul metodei presupune meninerea n contact a suspensiilor microbiene cu extractele vegetale, n proporie de 1:1, timp de contact de 1, 3, 5, 15, 30 minute, determinndu-se numrul de celule viabile (UFC) prin nsmnare pe mediu solid (geloz simpl/Sabouraud pentru speciile bacteriene/ fungice). III.1.1.3.1.3. Evaluarea activitii antifungice a uleiului volatil utiliznd tehnica citometriei n flux

Pentru analiza citometric, diluii seriale, n intervalul de concentraii 3.125-200L/mL s-au testat n trei variante de lucru, n care timpii de incubare pentru fiecare prob au fost: 5, 30 min i 24 ore (Pina-Vaz i colab., 2004). Pentru marcare s-a utilizat ca fluorocrom iodura de propidiu, care absoarbe la 488nm i emite la 562-568 nm i se leag specific de acizii nucleici. Concentraia fluorocromului a fost de 5 g/mL, iar protocolul de colorare a fost aplicat la temperatura camerei timp de 10 min nainte de achiziia de date citometrul FACS Calibur. Produsul software WinMDI 2.8 a fost utilizat pentru analiza statistic.III.1.1.3.2. Determinarea cantitativ a activitii antimicrobiene i stabilirea concentraiei minime inhibitorii (CMI)

Analiza cantitativ s-a realizat prin metoda microdiluiilor seriale n mediu lichid, n plci cu 96 de godeuri/tuburi Ependorf de 1.5mL (Lazr i colaboratorii, 2005). CMI s-a stabilit macroscopic, ca fiind ultima concentraie la care nu s-a observat apariia creterii microbiene, respectiv apariia turbiditii mediului i prin citire spectrofotometric a absorbanei la 620nm.III.1.1.3.3. Studiul influenei uleiurilor volatile asupra capacitii de aderen la substrat inert a unor tulpini bacteriene prin testul producerii de slime Influena asupra capacitii de aderen la substrat inert s-a cuantificat dup efectuarea protocolului analizei cantitative a efectului antimicrobian, prin metoda microtitrrii, evalundu-se biomasa, dup fixare cu metanol i colorare cu cristal violet.

III.1.1.3.4. Studiul influenei asupra sesnsibilitii la antibiotice a tulpinilor studiate

III.1.1.3.4.1. Metoda difuzimetric adaptat

Testarea sensibilitii la antibiotice a tulpinilor de S. aureus i Ps. aeruginosa studiate a fost realizat prin metoda difuzimetric (Kirby-Bauer) standardizat, recomandat de CLSI, ediia 2009. Citirea rezultatelor s-a realizat prin msurarea comparativ a diametrelor zonelor de inhibiie generate de diferite antibiotice, respectiv antibiotice i soluie stoc de ulei volatil, cu ajutorul unei rigle gradate. III.1.1.3.4.2. Metoda microdiluiilor seriale zecimale pentru determinarea comparativ a concentraiei minime inhibitoriiAnaliza cantitativ comparativ s-a realizat prin metoda microdiluiilor seriale n mediu lichid (bulion Mueler-Hinton), n plci cu 96 de godeuri/tuburi Ependorf de 1.5mL (Lazr i colab., 2005). S-au realizat diluii specifice pentru antibioticele neomicin, bacitracin, cefotaxim i gentamicin. Soluiile iniiale de antibiotic s-au realizat la concentraia 1mg/mL n DMSO. n godeuri s-a adugat soluie stoc ulei volatil:DMSO, 0.1% (v/v). CMI s-a stabilit macroscopic, ca fiind ultima concentraie la care nu s-a observat apariia creterii microbiene, respectiv apariia turbiditii mediului i prin citire spectrofotometric a absorbanei la 620nm.

III.1.1.3.5. Influena uleiurilor volatile i a unor fracii din acestea asupra producerii factorilor de virulen solubili (toxine formatoare de pori, exoenzime)

Pentru stabilirea influenei asupra producerii factorilor de virulen solubili tulpinile de S. aureus i Ps. aeruginosa, crescute n concentraii subinhibitorii de soluii stoc ulei volatil:DMSO (CMI/2) i martorii pozitivi (tulpina netratat) au fost utilizate pentru nsmnarea fiecrui tip de mediu de cultur specific pentru detectarea fiecrui factor de virulen solubil (hemolizine, DN-az, lecitinaze, lipaze, cazeinaz, amilaz, factori siderofori-like) (Iordache i colab., 2008).III.1.1.3.6. Evaluarea activitii uleiurilor volatile i a unor fracii ale acestora asupra biofilmelor microbiene experimentale monospecifice dezvoltate pe substraturi inerte

III.1.1.3.6.1. Determinarea influenei inhibitorii a uleiurilor volatile asupra biofilmelor microbiene experimentale dezvoltate pe substrat inert submersatStudiul s-a realizat pentru 45 de tulpini microbiene izolate din probe clinice, aparinnd speciilor S. aureus, Ps. aeruginosa i C. albicans, C. glabrata, C. famata, C. krusei. Uleiurile volatile utilizate au fost extrase din M. piperita, R. officinalis, E. caryophyllata , S. officinalis A. graveolens. Concentraiile uleiurilor volatile n mediul de cultur au fost CMIx5. Biofilmele microbiene (de 24, 48h) dezvoltate pe substratul inert reprezentat de plcile cu 96 de godeuri s-au tratat cu soluii stoc ulei volatil:DMSO 1:1 (v/v) i s-au incubat 24h. Pentru evaluarea biomasei aderate s-a utilizat testul slime (cap. III.1.1.3.3.).III.1.1.3.6.2. Determinarea influenei inhibitorii a uleiului volatil din E. carryophyllata asupra biofilmelor experimentale de Candida sp. dezvoltate pe substrat inert textil Fragmentele de pansamente sterile au fost supuse colonizrii utiliznd o suspensie microbian de C. albicans ATCC 10231 ajustat nefelometric conform standardului McFarland 0.5. Pentru evidenierea influenei inhibitorii a uleiului volatil din muguri de E. caryophyllata asupra biofilmelor experimentale dezvoltate timp 72h s-au utilizat metode microscopice (SEM) i metoda Brun-Buisson.III.1.1.3.6.3. Determinarea prin citometrie n flux a influenei inhibitorii a uleiurilor volatile i a unor fracii ale acestora asupra biofilmelor experimentale de Candida albicans ATCC 10231 dezvoltate pe substrat inert (lamele de sticl)Procentul de celule viabile din fiecare prob s-a determinat calitativ prin tehnica citometriei n flux. Uleiurile volatile utilizate au fost extrase din plantele: A. graveolens, M. piperita, F. vulgare, E. caryophyllata, R. officinalis. Fracii din uleiurile volatile limonen, carvon, felandren au fost evaluate pentru influena asupra biofilmelor preformate. Concentraiile acestora n mediul de cultur au fost CMIx5.III.1.1.3.7. Evidenierea influenei uleiurilor volatile i a unor fracii ale acestora asupra expresiei unor gene care codific pentru factori de virulen i molecule implicate n semnalizarea intercelular

Extracia ARN total la tulpinile de S. aureus i Ps. aeruginosaExtracia ARN total s-a realizat din culturile bacteriene de 18 ore variante tratate sau netratate cu DMSO/uleiuri utiliznd kitul GeneJet RNA Purification (Fermentas). Extracia ARN din S. aureus s-a facut la fel ca i la Ps. aeruginosa, cu o singura excepie s-a facut suplimentar tratament cu lizozim (concentraie final 10mg/mL) i cu lizostafin (concentraie final 10mg/ml), care s-au adaugat n tamponul TE.Cuantificarea nivelului de expresie a genei agr s-a facut prin qPCR cu primeri i sonde specifice.III.1.2. DETERMINAREA ACIUNII EXTRACTELOR VEGETALE SELECTATE ASUPRA CELULELOR EUCARIOTE I OPTIMIZAREA ACTIVITATII ANTIMICROBIENE PRIN OBINEREA UNOR NANOSISTEME HIBRIDE FUNCTIONALIZATEIII.1.2.1. Testarea citotoxicitatii extractelor vegetale asupra celulelor eucariote prin metoda coloraiei cu tripan blue Influena extractelor vegetale asupra celulelor eucariote s-a realizat prin metoda coloraiei cu tripan blue i apreciere a numrului de celule viabile dup 24h de tratament cu soluie stoc ulei volatil:DMSO, asupra celulelor eucariote aparinnd liniei standardizate HeLa. Celulele tratate cu ulei volatil din E. caryophyllata i suc din fructe de A. melanocarpa au fost prelucrate pentru analiza ciclului celular. III.1.2.2. Obinerea unor materiale nanostructurate hibride anorgano-organice cu proprieti antiaderente i antimicrobieneIII.1.2.2.1. Sinteza magnetitei funcionalizate cu acid oleic

n lucrarea de fa, s-a folosit urmatorul un protocol, adaptat dup metoda Massart (1981).III.1.2.2.2. Sinteza nanotuburilor de carbon multistrat (MWCNT)MWCNT-urile au fost obtinute prin procesare n plasm (Buteic i colab., 2011) i purificate prin extracie cu solvent (succesiv cu benzen, diclormentan i o-diclorbenzen); impuritatile anorganice au fost indepartate cu ameste de acid azotic/acid clorhidric fierbinte; MWCNT-urile au fost spalate cu apa ultrapura si uscate la temperatura de 3000C.III.1.2.2.3. Asamblarea nanofluidului pe baza de magnetita si uleiuri esentiale pentru obtinerea de suprafete antiaderente

Figura 42. Schema asamblrii sistemului nanostructurat core-shell-extrashell: [1] suspendarea nanoparticulelor magnetice n cloroform, [2] mojararea nanoparticulelor magnetice cu ulei volati, [3] evaporare la sec [4] suspendarea n cloroform pentru obinerea unei distribuii uniforme a fitocomponenilor pe suprafaa nanosferelor magnetice [5] evaporare cloroformNanoparticulele magnetice de tip core-shell (magnetit funcionalizat cu acid oleic) s-au suspendat n cloroform n proporie de 30mg/mL, respectiv ulei volatil n proporie de 1:3 n cloroform. Componentii au fost amestecati pn la evaporare la sec a cloroformului, dup care au fost mojarai timp de cinci minute. Procedeul a fost repetat de trei ori pentru a obine o distribuie uniform a fitocomponenilor pe suprafaa nanosferelor magnetice (fig. 42).III.1.2.2.4. Asamblarea MWCNT-urilor pe baz de carbon-fier i fitocomponeni ai apelor de cohobaie pentru obinerea materialelor antiaderenteDup efectuarea procedeului de extracie prin hidrodistilare asistat de microunde, materialul vegetal a fost ndeprtat prin filtrare, iar apele de cohobaie au fost separate n vase cu volume egale (fig. 43).

EMBED ChemDraw.Document.6.0 Figura 43. Schema extraciei compuilor din apa de cohobaie pe nanoparticule magnetice MWCNTIII.1.2.2.5. Obinerea suprafeelor antiaderenteIII.1.2.2.5.1. Modificarea suprafeelor prin imersare n nanofluid aliniat n cmp magneticNanofluidul obinut s-a orientat n cmp magnetic, iar suporturile pentru peliculizare s-au imersat n suspensie pentru obinerea unui strat uniform de nanoparticule, dup evaporarea solventului, obinndu-se sistemul nanostructurat de tip core-shell-extrashell. Suporturile peliculizate s-au sterilizat prin iradiere UV (timp de expunere 10 min).

III.1.2.2.5.2. Modificarea suprafeei dispozitivelor medicale prin depunere asistat laser utiliznd tehnica MAPLE (Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation)Depunerile s-au realizat cu un laser KrF (248nm; 200mJ/cm2), cu o rat de repetiie de 10Hz, ntre 7200 i 20000 de pulsuri. Suprafeele peliculizate au fost imersate n ulei volatil i usacate.III.1.2.2.6. Caracterizarea materialelor nanostructurate prin DRX, FT-IR, AFM, ATG i TEM III.1.2.2.6.1. Difractometrie de Raze X (DRX)Cristalinitatea materialului la dimensiuni nanometrice a fost analizat prin difractometrie de raze X cu ajutorul unui difractometru Shimadzu XRD 6000 la temperatura ambiental. III.1.2.2.6.2. Spectroscopia n Infrarou (FT-IR)Pentru a pune n eviden grupele funcionale ale materialului de dimensiuni nanometrice a fost utilizat un spectrometru FT-IR Nicolet 6700 (Thermo Nicolet, Madison, WI) conectat la programul de lucru Omnic (versiunea 7.0. Thermo Nicolet). III.1.2.2.6.3. Microscopia Electronic prin Transmisie (TEM)Imaginile au fost obinute pentru materialul sub form de pulbere, utiliznd HR-TEM (High Resolution Transmission Electron Microscope). Microscopul a operat n modul transmisie la 300kV, rezoluie punctual 2 , rezoluie liniar 1 . Pulberea s-a suspendat n etanol absolut prin sonicare timp de 15 min. O pictur din proba diluat s-a plasat n suportul din cupru texturat cu carbon. III.1.2.2.6.4. Microscopie cu for Atomic (AFM)Dimensiunea peliculelor a fost msurat utiliznd un sistem Stylus Profiler XP- 2 (Ambios) cu rezoluie vertical 0.1 nm. Micrografiile AFM au fost obinute cu ajutorul platformei SPM-NTegra model Prima n contrast de faz. Imaginile s-au nregistrat pe o suprafa de 25 m2. III.1.2.2.6.5. Analiza Termo-Gravimetric (ATG-TD)Pentru evaluarea cantitatii de ulei volatil adsorbit pe suprafaa nanosferelor de magnetit a fost utilizat un instrument Netzsch TG 449C STA Jupiter. Materialul nanostructurat a fost obinut dintr-un gram de magnetit functionalizat i 1 mL de ulei volatil. III.1.2.3. Determinarea activitii antimicrobiene/ anti-biofilm a nanosistemelor pe baz de uleiuri volatile

III.1.2.3.1. Evaluarea calitativ a activitii anti-biofilm prin microscopie confocal Probele au fost vizualizate folosind un microscop CSLM TCS-SP Leica dotat cu PL FLUOTAR i un laser Ar-Ne reglat la 488nm. A fost obinut o rezoluie lateral de 200 nm. Probele reprezentate de biofilme experimentale monospecifice dezvoltate pe substraturile inerte dup 24/48/72 de ore de la incubare au fost spalate de 3 ori cu tampon fosfat salin, fixate cu metanol i uscate nainte de examinarea microscopic.

III.1.2.3.2. Determinarea CMI pentru MWCNT-uri ncapsulate n fitocomponeni din apa de cohobaie din E. caryophyllata Determinarea CMI pentru MWCNTs/Ph (MWCNT/fitocomponeni) s-a realizat prin tehnica diluiilor binare. Sistemul MWCNTs/Ph s-a suspendat n DMSO (100mg/mL), iar apoi s-au realizat diluii seriale binare n intervalul 50-0.39 mg/mL, n plci cu 96 de godeuri. Determinarea CMI s-a realizat conform protocolului descris anterior.III.1.2.3.3. Determinarea cantitativ a capacitii de aderen la substrat inert pentru tulpinile fungice patogene (metoda Brun-Buisson modificat) (descris n cap. III.1.1.1.3)

III.1.2.3.4. Determinarea activitii antipatogenice a nanofluidului pe baz de magnetit i ulei volatil din muguri de E. caryophyllata Pentru studiul activitii anti-patogenice a Fe3O4/C18/UV (Fe3O4/acid oleic/ulei volatil) s-a realizat un experiment in vivo pe oareci albi de laborator n vrst de 4-5 sptmni, cntrind aproximativ 25g. Animalele au fost pretratate prin administrarea oral a fito-nanosistemului timp de o sptmn (100 L), dup care au fost injectate intraperitoneal cu 200 L suspensie bacterian ajustat nefelometric conform standardului McFarland 0.5, obinut dintr-o cultur dezvoltat pe mediu solid (geloz simpl) de Ps. aeruginosa izolat dintr-o hemocultur pozitiv. Tratamentul oral s-a desfurat timp de nc dou sptmni de la injectare. Animalele au fost evaluate prin inspecie zilnic, urmrindu-se comportamentul, greutatea i situsul injeciei. III.2. REZULTATE I DISCUII

III. 2.1. Caracterizarea fenotipic i genotipic a unor tulpini microbiene izolate din infecii consecutive dezvoltrii biofilmelor pe dispozitive biomedicalePentru stabilirea spectrului de activitate antimicrobian al uleiurilor volatile s-au utilizat tulpini de colecie aparinnd speciilor Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, Aspergillus niger.

III.2.1.1. Determinarea capacitii de aderen la substrat inert i formare consecutiv a biofilmelor monospecifice pentru tulpini microbiene aparinnd speciilor S. aureus, Ps. aeruginosa i C. albicansn studiul de fa a fost caracterizat capacitatea de aderen la substrat inert i de formare consecutiv a biofilmelor a unor tulpini de S. aureus, Ps. aeruginosa (cte 15 tulpini) i Candida sp. (40 de tulpini) izolate din probe clinice diferite, considerat fiind criteriu de selecie a tulpinilor cu profiluri de virulen semnificative care au fost utilizate n demonstrarea activitii biologice a unor uleiuri volatile i extracte vegetale.

Pentru 7 tulpini de S. aureus i 8 de Ps. aeruginosa capacitatea de colonizare a substratului inert, dup protocolul testului slime, a fost mai mare de 1mAu, acestea fiind clasificate drept nalt aderente. Reprezentarea grafic a distribuiei tulpinilor de Candida sp. studiate in funcie de capacitatea lor de aderen/formare biofilme, determinat prin metoda Brun-Buisson modificat, a permis clasificarea acestora n aderente (36%), nalt aderente (37%) i neaderente (27%).III.2.1.2. Studiul plasticitii morfologice la tulpini fungice din specii diferite

Elucidarea mecanismelor de patogenitate ale fungilor patogeni (de exemplu Aspergillus fumigatus, Candida albicans) a suscitat un mare interes, datorit numrului n continu cretere de cazuri de infecii fungice invazive. O caracteristic esenial a acestor infecii este interaciunea dintre diferitele morfotipuri fungice cu celulele epiteliale sau efectorii imunitari n gazda uman (Horn i colab., 2012).

n studiul de fa, 3 dintre tulpinile fungice selectate au manifestat plasticitate morfologic n condiiile incubrii cu adaos de ser bovin n mediul de cultur.

III.2.1.3. Caracterizarea fenotipic a factorilor de virulen solubili pentru tulpini microbiene aparinnd speciilor S. aureus, Ps. aeruginosa i C. albicansBacteriile posed sisteme eficiente de sintez, secreie i translocare a factorilor de virulen, care modific morfo-funcional celula gazd permind colonizarea substaturilor tisulare.

Pentru selectarea tulpinilor cu profiluri de virulen semnificative care au fost utilizate pentru demonstarea activitii biologice a uleiurilor volatile i extractelor vegetale s-a analizat fenotipic expresia factorilor de virulen solubili, toxine formatoare de pori (lecitinaz, hemolizine, lipaz) i exoenzime (cazeinaza, amilaza, DN-aza, factori siderofori-like) produi de microorganismele studiate.III.2.1.4. Caracterizarea genotipic a tulpinilor selecionate pentru prezena unor gene de virulenIII.2.1.4.1 Distribuia genelor de virulen la tulpinile de Staphylococcus aureus Expresia mai multor factori de virulen la S. aureus este sub controlul agr care, la intrarea n faza staionar, represeaz expresia proteinelor asociate suprafeei celulare (proteina A i coagulaza) i stimuleaz expresia factorilor solubili (de exemplu, lipaz, hemolizine, proteaze), care joac un rol important in invazia tisular si toxigenez (Cotar, 2008).

Analiza rezultelor testelor PCR. La S. aureus 4 tulpini poseda gena agr III, iar tulpina de referin apartine grupului agr I. III.2.1.4.2. Distribuia genelor de virulen la tulpinile de Ps. aeruginosa selecionateStudiile din literatur au demonstrat contribuia sistemelor de QS n patogeneza infeciilor cu Ps. aeruginosa. Analiza curbelor de amplificare obinute n experimentul real-time PCR la tulpinile de Ps. aeruginosa analizate a aratat ca toate tulpinile posed cele patru gene care codific pentru sistemele de semnalizare las i rhl, dar i un important spectru de gene de virulen.

III.2.1.5. Concluzii Algoritmul de selecie a tulpinilor care au fost utilizate n demonstrarea activitii biologice a uleiurilor volatile s-a bazat pe caracterizarea fenotipic a expresiei factorilor de virulen solubili, toxine formatoare de pori (lecitinaz, hemolizine, lipaz) i exoenzime (cazeinaza, amilaza, DN-aza, factori siderofori-like), dar i pe evidenierea capacitii de aderen la substraturi inerte a acestora, iar in cazul fungilor a capacitii de a genera forme filamentoase.

Tulpinile de S. aureus au sintetizat toi factorii de virulen, cele mai virulente dovedindu-se cele izolate din secreiile de plag. Producerea factorilor de virulen solubili nu se coreleaz cu sursa de izolare la tulpinile de Ps. aeruginosa studiate. Profilurile factorilor de virulen solubili pentru tulpinile fungice incluse n studiul de fa au fost relativ uniforme (diferenele nu au fost statistic semnificative), factorii cei mai abundent secretai fiind amilaza, lipaza i agenii chelatori de fier. De asemenea, tulpinile fungice studiate s-au dovedit a fi sensibile la antifungicele curent utilizate n clinic (itraconazol, voriconazol, amfotericina B, caspofungin metoda E-test). La S. aureus au fost evidentate prin PCR genele care codifica pentru reglatorul de quorum sensing agr, identificandu-se tipurile agr III, si agr I, precum si geneler ce codific nou receptine (asociate suprafeei celulare i respectiv secretate): fnbA, ce codific sinteza unei proteine de legare a fibronectinei (FnbpA) i gena fnbB, ce codific o protein omoloag de legare a fibronectinei (FnbpB) gena cflA, care codific pentru factorul clumping A., ena fib, care codific pentru proteina extracelular care leag fibrinogenul clfB, care codific pentru factorul clumping B.

Analiza curbelor de amplificare obinute n experimentul real-time PCR la tulpinile de Ps. aeruginosa analizate a artat ca toate tulpinile posed cele 4 gene care codific pentru sistemele de semnalizare intercelular las i rhl, precum i genele pentru proteaza IV, elastaza B (lasB), ramnolipid (rhlAB). Gena plcN, ce codific fosfolipaza C nehemolitic (PLC-N) o hemolizin labil termic este prezent la toate tulpinile studiate, ca i gena plcH, care codific sinteza fosfolipazei C hemolitice (PLC-H). Gena care codific pentru proteaza alcalin, aprA, a fost detectat la toate cele cinci tulpini studiate, iar ena care codific pentru proteaza IV a fost absent la tulpinile izolate din urocultur. Analiza rezultatelor PCR privind prezena genelor exoA, exoT, exoS i exoU, care codific pentru toxinele ExoT, ExoS i ExoU, a artatat c toate tulpinile studiate posed genele exoA, exoS i exoU, iar exoT este absent la tulpinile izolate din urocultur. Gena care codific pentru pioverdin, pvdA a fost detectat la trei dintre cele 5 tulpini studiate. n urma acestei abordri complexe, fenotipice i moleculare, au fost selectate 7 tulpini de S. aureus, 8 de Ps. aeruginosa i 15 tulpini fungice cu profiluri de virulen semnificative, pentru a fi utilziare n experimentele ulterioare.III.2.2. OBINEREA I CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMIC A EXTRACTELOR VEGETALEIII.2.2.1. Extracia i caracterizarea fizic a uleiurilor volatile

Pentru extracia uleiurilor volatile i teste biologice s-au ales reprezentani din specii de plante din grupul angiospermelor (din familiile Apiaceae, Lamiaceae, Myrtaceae, Rutaceae) i din grupul gimnospermelor (familia Pinaceae), cunoscute ca fiind productoare de uleiuri volatile (Thormar, 2011).

Selecia realizat a fost arbitrar, cunoscut fiind din literatur efectul antimicrobian al majoritii uleiurilor volatile, efect doz-specific, microbicid (concentraia minim inhibitorie i concentraia minim bactericid cu valori sensibil egale), manifestat la concentraii sub 5% (v/v) (Thormar, 2011).

Uleiurile volatile au fost caracterizate fizic determinndu-se densitatea i indicele de refracie.

III.2.2.1. Caracterizarea chimic a uleiurilor volatile a relevat compoziia n terpene i terpenoide, specie specific.III.2.2.3. Caracterizarea sucului obinut din fructe de Aronia melanocarpaPentru testarea proprietilor i caracterizarea compuilor coninui de fructele de Aronia melanocarpa au fost determinai: acidul ascorbic, -carotenul i antocianii. III.2.2.4. Caracterizarea extractelor din Forsithya spp.

Tabelul 37 Compoziia chimic a extractelor alcoolice din Forsithya spp.

Probe mg fenoli (exprimai ca acid cafeic)/mL extract

F12,5772

F23,0594

F31,5644

III.2.2.5. Concluzii

Terpenoidele sunt cel mai mare grup de compui naturali, numrnd aproximativ 23000 de compui cunoscui, unele dintre ele avnd activitate farmacologic. Diversitatea chimic i structural a terpenoidelor ca i a cilor lor de biosintez este impresionant, ceea ce face ca potenialele aplicaii ale acestor substane s acopere o palet larg de domenii. n 2002, vnzrile produselor farmaceutice pe baz de terpene ajungeau la sume de ~12mld. $. Cele mai cunoscute produse farmaceutice pe baz de terpene sunt Taxol, medicament antitumoral, i antimalaricul Artimesinin.

n studiul de fa au fost caracterizate fizico-chimic uleiuri volatile extrase din reprezentani aparinnd grupului angiospermelor, din familiile Apiaceae, Lamiaceae, Myrtaceae, Rutaceae, i plante aparinnd familiei Pinaceae, din grupul gimnospermelor cunoscute ca fiind productoare de uleiuri volatile,cu efect doz-specific, microbicid (concentraia minim inhibitorie i concentraia minim bactericid cu valori sensibil egale), manifestat la concentraii sub 5% (v/v).

Uleiurile volatile au fost extrase din cantiti diferite de material vegetal, cuprinse ntre 50 i 200g, iar randamentul de extracie a fost cuprins ntre 0.1 i 8.4%, cel mai mare coninut de uleiuri volatile fiind prezent n mugurii uscai din E. caryophyllata.

Extractele etanolice din Forsithya spp. au fost caracterizate pentru coninutul de polifenoli totali, iar sucul din A. melanocarpa pentru coninutul de acid ascorbic, antociani i -caroten.III.2.3. EVALUAREA CALITATIV I CANTITATIV A ACTIVITII ANTIMICROBIENE/ ANTIPATOGENICE I A MECANISMELOR DE ACIUNE ALE ULEIURILOR VOLATILE ASUPRA CELULELOR MICROBIENE N SUSPENSIE I A CELOR ADERATE LA UN SUBSTRATActivitatea antimicrobian a uleiurilor volatile i a extractelor vegetale, evaluat calitativ i cantitativ, este adesea prima proprietate farmacologic demonstrat pentru acestea (Husnu can Baser i Buchbauer, 2010), ns specificitatea i complexitatea interaciunilor la nivel molecular ntre componente celulare i componente ale extractelor din plante sunt subiecte nc nenelese pe deplin. n cazul n care mecanismele de aciune antimicrobian a uleiurilor volatile au fost investigate, au fost descrise efecte variate i specifice.

Uleiurile volatile manifest o activitate antimicrobian difereniat, strns corelat cu structurile chimice ale componentelor prezente n uleiuri, influenat de mecanisme specifice de sinergism/antagonism ntre componente sau de factori de mediu ori specifici microorganismelor studiate. Valorile CMI sunt cuprinse ntre 125 i 500L/mL (fig. 83-85), pentru extractele ozidice i respectiv 6.25 i 50 L/mL (fig. 85-87) pentru cele de tip uleiuri volatile, cele mai sensibile la aciunea antimicrobian fiind tulpinile fungice i speciile bacteriene Gram pozitive, ceea ce poate fi corelat cu faptul c uleiurile volatile, metabolii secundari ai plantelor au rol de protecie antimicrobian a acestora, majoritatea fitopatogenilor fiind Gram negativi.III.2.3.2. Evaluarea activitii antipatogenice i a mecanismelor de aciune ale uleiurilor volatile asupra celulelor microbiene n suspensie i a celor aderate la un substrat

III.2.3.2.1 Studiul dinamicii temporale a efectului microbicid al uleiurilor volatile

Metoda citometriei n flux a fost aplicat n studiul de fa pentru confirmarea rezultatelor obinute calitativ, respectiv instalarea timpurie a efectului microbicid al extractelor vegetale de tip uleiuri volatile.

III.2.3.2.2. Studiul influenei inhibitorii a extractelor vegetale asupra sintezei factorilor de virulen solubili bacterieni evideniai fenotipicTulpinile testate s-au dovedit productoare de factori de virulen enzimatici, cu rol de toxine formatoare de pori n membrana celulelor eucariote i n invazie (lecitinaz, hemolizine lipaz, cazeinaz). Influena modulatorie a uleiurilor volatile asupra profilului factorilor de virulen solubili la tulpinile selectate s-a manifestat n sensul inhibiiei producerii acestor enzime, la concentraii CMI/2 ale uleiurilor volatile din E. caryophyllata, R. officinalis, M. piperita i F. vulgarae, fr specificitate pentru tulpinile studiate. Standardele analitice au exercitat un efect inhibitor, dar tulpin specific. Testarea a furnizat rezultate predictibile, dac se ine seama de complexitatea compoziional a uleiurilor volatile (fig. 98-102). Carson i Hammer (2011) analizeaz literatura de specialitate i menioneaz studiile asupra expresiei factorilor de virulen efectuate pentru uleiurile volatile (Thormar, 2011); datele din literatur pentru acest subiect sunt relativ puine, dat fiind amploarea subiectului, dar concluziile care se pot trage sunt clare, plednd pentru relevana efectului antipatogenic al uleurilor volatile.

Expresia factorilor de virulen solubili a fost influenat de concentraii subinhibitorii ale extractelor ozidice din Forsithya sp. studiate prezente n mediul de cultur, n sensul exprimrii sau represiei, extractul din F. intermedia dovedindu-se cel mai activ.III.2.3.2.2. Activitatea antibiofilm a extractelor vegetale

III.2.3.2.2.1. Inhibarea capacitii de aderen la substraturi inerte

Activitatea antibiofilm asupra tuturor tulpinilor microbiene selectate, dar i asupra tulpinilor de colecie, s-a observat la concentraii CMI/2 ale uleiurilor volatile studiate. Influena asupra capacitii de aderen la susbstrat inert a concentraiilor subinhibitorii ale extractelor etanolice asupra tulpinilor fungice selectate s-a observat dup un prag critic, cel mai eficient dovedindu-se a fi extractul din F. viridissima, a crui activitate antibiofilm s-a manifestat pe domeniul cel mai larg de concentraii, 1.95-31.25L/mL.III.2.3.2.2.2. Eradicarea biofilmelor monospecifice experimentale dezvoltate pe substraturi inerte

Procesul stadializat de formare a biofilmelor poate fi influenat prin efectul cidal al unei substane n oricare din etapele sale. n studiul de fa s-a studiat influena concentraiilor CMIx5 ale uleiurilor volatile din R. officinalis, E. caryophyllata, F. vulgarae, A. graveolens i a fraciilor limonen, carvon, felandren. n figura 107 este evideniat eradicarea biofilmelor experimentale monospecifice de C. albicans ATCC 10231 n vrst de 48h, dezvoltate pe substraturi inerte reprezentate de lamele de sticl (1 cm2). Fig. 107. Cuantificarea prin citometrie n flux a celulelor viabile(C. albicans ATCC 10231) dup tratarea biofilmelor preformate cu uleiuri volatile (cui48h=cuantificarea numrului de celule viabile dup tratamentul biofilmului de 48h cu ulei volatil din E. caryophyllata, R48h= cuantificarea numrului de celule viabile dup tratamentul biofilmului de 48h cu ulei volatil din R. officinalis, Me48h=cuantificarea numrului de celule viabile dup tratamentul biofilmului de 48h cu ulei volatil din M. piperita, Ma48h= cuantificarea numrului de celule viabile dup tratamentul biofilmului de 48h cu ulei volatil din A. graveolens, Fe48h= cuantificarea numrului de celule viabile dup tratamentul biofilmului de 48h cu ulei volatil din F. Vulgarae, Lim48h= cuantificarea numrului de celule viabile dup tratamentul biofilmului de 48h cu fracia limonen, Carv48h= cuantificarea numrulu