UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREŞTI

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE

Doctorand: Ing. Ana Maria RĂDUCU (COVAŞĂ)

„CERCETĂRI PRIVIND EFICIENŢA UNOR TEHNOLOGII

DE CREŞTERE, ÎN VEDEREA REDUCERII INFECŢIEI

CU SALMONELLA ÎN FERMELE DE PUI DE CARNE”

Conducător ştiinţific: Prof. univ. dr. ILIE VAN

BUCUREŞTI – 2011

UNIVERSITY OF AGRONOMIC SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE BUCHAREST

FACULTY OF ANIMAL SCIENCE

Doctoral student: Eng. Ana Maria RĂDUCU (COVAŞĂ)

“RESEARCHES ABOUT EFICIENCE

OF SOME PRODUCTION TECHNOLOGIES TO REDUCE

SALMONELLA INFECTION IN BROILER FARMS”

Scientific leadership: Prof. ILIE VAN, Phd

BUCHAREST – 2011

REZUMAT

Trebuie să acceptăm faptul că în secolul 21 consumatorii sunt mult mai preocupaţi de

calitatea, aspectul, gustul, valoarea nutritivă şi valorile etice ale alimentelor. Aşteaptă ca alimentele

să fie produse şi procesate conform unor practici agricole corecte, şi cu mai mult respect pentru

confortul animalelor şi mediu. Doresc informaţii clare despre produs, originea sa şi metoda de

producţie, pentru a lua decizii informate despre ce produs să cumpere. Cel mai important, doresc ca

siguranţa alimentelor să fie prioritatea numărul unu a companiilor implicate în lanţul alimentar.

Companiile ce-şi reduc cheltuielile în detrimentul siguranţei alimentelor nu pun în pericol doar

proprii consumatori şi propria activitate, ci întreaga avicultură.

Protejarea efectivelor de păsări de contaminarea cu microorganisme indezirabile este o

componentă extrem de importantă a producţiei avicole industriale. Introducerea unui microorganism

patogen contagios, foarte patogen, în efectivele de păsări ar putea provoca consecinţe economice

grave pentru întreaga companie. Elaborarea şi folosirea zilnică a procedurilor de biosecuritate, în

calitate de cele mai bune practici manageriale în fermele avicole, va reduce posibilitatea introducerii

infecţiilor microbiologice zoonotice, precum Salmonella, ca şi a unor boli infecţioase precum

Influenţa aviară şi Pseudopesta aviară. Crescătorii de păsări şi operatorii din abatoare, trebuie să

înţeleagă şi să fie familiarizaţi cu importanţa detaliilor protocoalelor de biosecuritate şi să se

străduiască să aplice aceste programe, pentru păstrarea unui nivel de biosecuritate constant ridicat.

Managementul şi biosecuritatea bine aplicate pot reduce la nivele minime riscul introducerii

şi menţinerii infecţiei, în special, deoarece îmbunătăţirea prevenirii infecţiei cu Salmonella în

efectivele de reproducţie şi producţia de nutreţuri combinate a redus masiv riscul din partea acestor

surse, deşi în multe companii nutreţurile combinate continuă să fie, principala sursă de introducere a

unor noi infecţii cu Salmonella într-o fermă avicolă.

Cercetările proprii din prezenta lucrare au fost concentrate asupra unor produse care se

comercializează pe piaţa noastră, produse agreeate de legislaţia UE şi care introduse în furaje sunt

recomandate ca fiind produse anti – Salmonella. De asemenea, având în vedere responsabilitatea

proprietarilor de exploataţii s-a cercetat modul cum sunt aplicate practicile de management şi

biosecuritate în fermele avicole.

Pe marginea experienţelor realizate, s-au putut desprinde următoarele aspecte.

Obiectivul general al primei părţi a cercetărilor proprii a fost de stabilirea efectului a doi

acidificatori, denumiţi acidificatorul A şi acidificatorul B, asupra contaminării experimentale a

furajelor cu Salmonella şi bacterii coliforme.

Ţinând cont de efectele asupra sănătăţii animalelor şi ulterior asupra sănătăţii umane, cea

mai importantă ameninţare o constituie contaminarea furajelor cu Salmonella. Recomandarea

internaţională este ca înaintea introducerii în hrana animalelor, furajele să fie controlate pentru

număr total de germeni, contaminare cu bacterii coliforme şi prezenţa E. Coli, prezenţa bacteriilor

sulfito-reducătoare şi pentru contaminare cu Salmonella.

S-au făcut eforturi pentru găsirea unor compuşi care să protejeze furajele împotriva

contaminării cu Salmonella, fără a afecta însă calitatea furajelor şi sănătatea animalelor.

S-au realizat 6 (şase) experimente. Cercetările au fost efectuate la Institutul de Cercetare

Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie Cantacuzino Bucureşti, în cadrul Laboratorului de

Referinţă „Infecţii Enterice Bacteriene”.

Experimentul 1 s-a realizat pentru controlul microbiologic al furajelor incluse în

experimente. Furajul a fost controlat pentru determinarea numărului total de germeni, numărului cel

mai probabil de coliformi şi pentru contaminarea cu Salmonella. A rezultat că furajul a fost liber de

Salmonella şi coliformi, iar numărul total de germeni s-a estimat la 52500 ufc/g.

În cadrul experimentului 2 s-a cercetat efectul antibacterian al celor doi acidificatori în

tratarea furajului pentru pui de carne.

Acidificatorul A (compus solid, pulbere) a fost folosit în experienţă în cantităţile

recomandate de producător, respectiv 2,0; 5,0; şi 15 kg acidificator pe tona de furaj.

Acidificatorul B (compus lichid) a fost folosit în experienţă de asemenea în cantităţile

recomandate de producător, respectiv 1,0; 3,0; şi 8 litri acidificator pe tona de furaj.

S-a testat numărul total de germeni, numărul cel mai probabil de coliformi şi contaminarea

cu Salmonella la interval de 0; 1; 5; 14; 21 şi 28 zile.

Rezultatele obţinute arată că furajul a rămas liber de Salmonella şi coliformi pe toată durata

testării. Numărul total de germeni (NTG) a variat uşor, dar nu în concordanţă cu tipul sau cantitatea

acidificatorilor adăugaţi.

Experimentul 3 a fost realizat pentru a cerceta efectul antibacterian al celor doi acidificatori

asupra contaminării cu 10 ufc Salmonella.

S-au folosit probe de furaj şi acidificatori din acelaşi lot. Cantităţile de acidificatori au fost

identice cu cele din experimentul 2. Furajul a fost contaminat cu 10 ufc Salmonella. Pentru

contaminare s-a folosit un amestec de Salmonella enterica subspecia enterica serovar Enteritidis şi

Salmonella enterica subspecia enterica serovar Typhimurium, tulpini izolate din alimente, primite în

laboratorul Institutului Cantacuzino pentru confirmare şi stocare în colecţia de tulpini a

laboratorului. Probele au fost testate la 0, 1, 5, 14, 21 şi 28 de zile. Rezultatele arată că a fost

identificată Salmonella pentru toate perioadele testate, ceea ce a condus la ideea realizării unor teste

paralele.

S-a testat 1 g furaj suspensionat în 9 ml ser fiziologic steril. Din acest amestec s-au prelevat

0,2 ml şi au fost inoculaţi pe agar McConkey, respectiv ADCL. Conform aşteptărilor s-au obţinut

puţine colonii. Rezultatele confirmă prezenţa Salmonellei şi faptul că numărul de ufc Salmonella

introdus experimental în furaj nu a crescut.

În plus, s-a realizat un alt test constând în suspensionarea unui gram de furaj în 9 ml apă

peptonată, incubare peste noapte şi inocularea unei anse din această cultură pe mediu McConkey şi

ADCL. Creşterea Salmonellei confirmă prezenţa patogenului în probele testate.

În cadrul experimentului 4 s-a urmărit testarea concentraţiei minime inhibitorii de

acidificator asupra tulpinilor de Salmonella.

Dat fiind faptul că s-a identificat prezenţa Salmonellei în toate probele experimentului 3, s-a

decis testarea activităţii anti-Salmonella a acidificatorilor în cultură pură la concentraţiile menţionate

de producător.

Cultura tânără de Salmonella, densitate 0,5 McFarland a fost însămânţată cu un tampon de

bumbac (metoda difuzimetrică, conform procedurii standard elaborată de Clinical and Laboratory

Standards Institute (CLSI) pe agar Mueller Hinton. O ansă de acidificator A şi o ansă calibrată de

acidificator B s-au aplicat pe cultura din plăci. După incubare peste noapte la 37ºC, s-a măsurat

diametrul zonei de inhibiţie.

Rezultatele arată că acidificatorii A şi B nediluaţi au fost eficienţi asupra tulpinilor de

Salmonella. Pentru Salmonella enterica subspecia enterica serovar Enteritidis zona de inhibiţie

detectată a fost de 16 mm când s-a folosit acidificatorul A şi 12 mm în cazul acidificatorul B. Pentru

Salmonella enterica subspecia enterica serovar Typhimurium zonele de inhibiţie au fost de 20 mm

şi 12 mm pentru acidificatorul A şi respectiv B.

S-a testat şi efectul diferitelor diluţii de acidificatori asupra Salmonella enterica subspecia

enterica serovar Enteritidis şi asupra tulpinii de control E. Coli ATCC 25922. Pentru a avea un

control al rezultatelor, s-au testat diluţiile binare ale acidificatorului B asupra tulpinii E. Coli ATCC

25922, recomandată ca tulpină de control pentru testarea sensibilităţii bacteriene. Pe agar Mueller

Hinton s-au spotat 10µl din fiecare diluţie binară, pe tulpinile de Salmonella enterica subspecia

enterica serovar Enteritidis şi E coli ATCC 25922.

Rezultatele arată că, activitatea produsului este comparabilă pentru cele două tulpini testate.

Tot în cadrul acestei serii de experienţe, s-a testat concentraţia minimă inhibitorie în mediu

lichid.

Au fost folosite tulpinile de Salmonella enterica subspecia enterica serovar Enteritidis şi

Salmonella enterica subspecia enterica serovar Typhimurium. Experimentul s-a realizat în apă

peptonată contaminată cu 10 ufc şi 100 ufc amestec din cele două tulpini de Salmonella. S-au

adăugat acidificatorii în concentraţiile recomandate de producător. O ansă cu bulion a fost dispersată

pe agar McConkey în ambele cazuri, fie că s-a observat o tulburare a bulionului, fie că nu.. Din

cultura crescută au fost testate biochimic câte 2 colonii. Acea concentraţie la care mediul de cultură

a rămas limpede şi din care nu s-au dezvoltat ulterior colonii prin subcultivare în placă, a fost

considerată concentraţie minimă inhibitorie.

Cantitatea de 0,100 g corespunzătoare la 6,67 kg/to reprezintă concentraţia minimă

inhibitorie a acidificatorului A, iar pentru acidificatorului B o cantitate de 4 litri/to s-a dovedit a fi

concentraţia minimă inhibitorie asupra tulpinilor de Salmonella.

Experimentul 5 a cercetat efectul antibacterian a celor doi acidificatori, asupra contaminării

cu 100 ufc Salmonella.

Prin metoda standard s-a detectat prezenţa Salmonellei în toate probele şi la fiecare timp de

testare ( 0, 1, 5, 14, 21, 28 zile), faţă de T0, momentul contaminării. Chiar dacă uneori în apa

peptonată sau în ser fiziologic nu a fost identificată Salmonella, patogenul persistă în furaj, fiind

identificat prin metoda standard. Lipsa Salmonellei în unele probe, când au fost inoculate în apa

peptonată sau ser fiziologic, se datorează nivelului de contaminare şi, în plus, faptului că probele

sunt diluate de 10 ori în apă peptonată şi de 50 de ori în ser fiziologic.

În cadrul experimentului 6 s-a cercetat efectul antibacterian al acidificatorilor A şi B asupra

contaminării cu 100 ufc de coliformi.

S-a folosit un amestec de E. coli, Enterobacter spp. si Klebsiella spp. pentru obţinerea unei

suspensii de 10000 ufc/ml coliformi în vederea contaminării furajului cu 100 ufc/g, furaj care a fost

liber de coliformi înaintea începerii experimentului. S-au folosit pentru acidificatorul A şase

concentraţii de produs (martor, 5 kg/to, 6 kg/to, 9 kg/to, 12 kg/to, 15 kg/to), iar pentru acidificatorul

B (3 l/to, 4 l/to, 6 l/to, 8 l/to). Timpul de expunere la produsul testat a fost de 0, 1, 5, 14 , 21 şi 28

zile.

Rezultatele arată că prin adăugarea acidificatorilor A sau B în furaj, contaminarea cu

coliformi rămâne aproximativ la acelaşi nivel. Creşterea numărului comparativ cu nivelul iniţial de

contaminare ar putea fi explicată prin faptul că furajul acţionează ca şi mediu nutritiv, dar rata de

multiplicare bacteriană rămâne scăzută. Teoretic, multiplicarea ar putea înceta când nivelul de

aciditate creşte. Variaţia slabă a numărului de coliformi la diferiţi timpi de analiză şi concentraţii

diferite ale acidificatorilor, este rezultatul gradului de omogenizare.

Partea a doua a cercetărilor proprii, s-a ocupat de aplicarea unor practici de management şi

biosecuritate în fermele avicole, luând în studiu o companie avicolă integrată vertical, cu toate

verigile de producţie, procesare şi distribuţie în componenţă. Compania studiată a fost SC

TRANSAVIA SA Alba Iulia care produce anual 30000 tone carne de găină.

Performanţele de producţie ale companiei studiate, sunt de top european şi sunt la nivelul şi

uneori chiar peste nivelul performanţelor recomandate de ghidul hibridului pe care-l creşte (COBB

500).

Fluxul tehnologic integrat, de la producţia primară la consumator, are ca prioritate

biosecuritatea şi prevenirea contaminării cu patogeni, precum Salmonella şi reducerea contaminării

microbiene în general (NTG) sau coliformi.

Compania dispune de programe specifice de profilaxie a infecţiilor cu Salmonella în

efectivele de păsări, programe menite să reducă contaminarea de la veriga precedentă a lanţului de

producţie, să prevină contaminarea în veriga prezentă şi apoi să protejeze contra recontaminării pe

măsură ce produsul se deplasează în aval.

Măsurile pentru prevenirea introducerii, răspândirii şi menţinerii Salmonella în puii crescuţi

pentru producţia de carne, se aplică în ferma de creştere, la prinderea, încărcarea şi transportul puilor

şi în abator.

Monitorizarea, prelevarea şi testarea pentru Salmonella se face conform Regulamentului

2160/2003 şi 1003/2005, astfel încât transmiterea verticală a primelor cinci serotipuri de Salmonella

să devină mai puţin posibilă. Testarea puilor de carne de o zi la sosirea în fermă este prevăzută de

legislaţia UE, dar nu este obligatorie, în schimb păsările sunt testate cu maximum 3 săptămâni

înainte de tăiete.

În fermele de reproducţie din componenţa companiei studiate, există grafice, bine definite, în

privinţa recoltării probelor de supraveghere a salmonelozei zoonotice. Graficul de recoltare probe

pentru examenul bacteriologic se realizează în baza Deciziei Comisiei 2008 / 897 / CE, care prevede

şi cofinanţarea din partea UE, în vederea minimizării salmonelozelor zoonotice la găini reproducţie

rase grele.

La nivelul fermelor de pui de carne, operează acelaşi program confinanţat prin Decizia

Comisiei 2008 / 897 / CE. În baza acestui program, la nivelul fermelor de pui de carne sunt elaborate

grafice privind racoltarea probelor pentru salmonelozele zoonotice, cu trei săptămâni înainte de

trimiterea puilor crescuţi la abator.

Pentru verificarea eficienţei spălatului şi dezinfecţiei în abator, mai ales din punct de vedere

microbiologic, există o echipă specială de management care elaborează, aplică şi menţine o

procedură sau proceduri, bazate pe principiile HACCP, cu scop de a reduce riscul de contaminare

încrucişată în cursul procesului de abatorizare.

Sunt elaborate programe de prelevare probe de sanitaţie, zilnic şi săptămânal, atât în ceea ce

priveşte echipamentul de transport cât şi echipamentele de abatorizare.

Metodele de analiză pentru Salmonella, NTG şi bacterii coliforme sunt metodele clasice

folosite de obicei în acest scop.

În fermele de pui de carne au fost analizate un număr de 1462 de probe, toate probele

analizate au fost negative pentru bacterii coliforme.

În fermele de reproducţie, staţia de incubaţie şi laboratorul din fermele de reproducţie s-au

recoltat un număr de 406 probe în perioada octombrie, noiembrie, decembrie 2009, iar în urma

analizelor pentru bacterii coliforme (STAS ISO 4831), toate probele au fost negative.

În total, ferme de pui de carne şi ferme de reproducţie, s-au analizat 1868 de probe şi toate au

fost negative pentru bacterii coliforme.

În abator, s-au recoltat 1386 de probe de sanitaţie în perioada noiembrie – decembrie 2009,

repartizate astfel: 551 de probe pentru NTG, din care la 11 probe numărul total de germeni a depăşit

norma admisă, iar 540 probe s-au încadrat în numărul admis; 551 de probe pentru bacterii coliforme,

din care la 10 numărul de coliformi a depaşit norma admisă, iar 541 probe au fost negative; 284 de

probe au fost testate pentru prezenta stafiloccocului coagulazo- pozitiv, rezultatul fiind negativ in

totalitate.

Din mijloacele auto, au fost recoltate un număr de 72 de probe, repartizate astfel: 24 de probe

pentru analiza NTG şi în toate probele numărul de microorganisme nu a depăşit norma admisă de

ISO 4833; 24 de probe pentru bacterii coliforme şi în toate probele numărul de microorganisme nu a

depăşit norma admisă de ISO 4831; 24 de probe pentru drojdii şi mucegaiuri şi în toate probele

numărul de microorganisme nu a depăşit norma admisă de ISO 7954.

De pe materialele folosite la ambalare, au fost recoltate un număr de 156 de probe,

repartizate astfel: 52 probe pentru NTG şi numărul de microorganisme dezvoltate s-a încadrat in

numărul admis de ISO 4833; 52 de probe pentru bacterii coliforme şi numărul de microorganisme

dezvoltate s-a încadrat in numărul admis de ISO 4831; 52 de probe pentru drojdii şi mucegaiuri, şi

numărul de microorganisme dezvoltate s-a încadrat in numărul admis de ISO 7954.

Ca rezultat al cercetărilor proprii, a rezultatelor obţinute în urma cercetărilor proprii şi a

concluziilor generale desprinse din cercetăriile proprii se fac următoarele recomandări:

1. Folosirea unor acidificatori anti – Salmonella, trebuie să fie însoţită de evaluarea

capacitãţii acestora de a obţine efectul scontat de păstrare a furajelor libere de Salmonella. În acest

sens trebuie făcute trei experimente, două în laborator şi unul în fermă. Primul experiment de

laborator priveşte titrarea produşilor pentru determinarea nivelului dozelor eficiente ale aditivului

alimentar. Al doilea experiment constã în evaluarea capacitãţii sale de a preveni recontaminarea,

prin testarea abilităţii de păstrare a dozei eficiente pentru menţinerea furajelor libere de Salmonalla,

în ciuda expunerii repetare a furajului tratat la Salmonella. Al treilea experiment trebuie să fie făcut

în fermele pe păsări cu scopul de a determina, dacă doza stabilită în experimentele de laborator este

suficientă pentru a putea fi folosit singur pentru obţinerea efectului tehnic intenţionat de păstrare a

furajelor Salmonella – negative, în condiţiile practice de folosire. Asemenea condiţii de folosire, le-

ar include pe cele asociate cu prepararea, stocarea şi consumarea furajelor tratate cu acidificatori.

2. Întrucât, conform legislaţiei UE responsabilitatea principală în domeniul siguranţei

alimentare revine proprietarilor de exploataţii (crescătorilor de păsări), recomandăm tuturor

crescătorilor şi procesatorilor de pui de carne, să elaboreze şi să aplice programe proprii de bune

practici de management şi biosecuritate în fermele avicole, programe care trebuie să fie aplicate

împreună cu măsurile de sterilizare a furajului din punct de vedere microbiologic. Aşa cum s-a văzut

în cercetările noastre aceste programe sunt eficiente în reducerea riscului contaminării

microbiologice în producţia de carne de pasăre.

SUMMARY

We should admit that in 21st century consumers are much more aware of foods quality, aspect, taste, nutritive value and ethical values. We are waiting for foods being produced and processed with correct agricultural practices and with much more respect for animal welfare and the environment. They are asking for clear information about the product and their origin and production method for taking informed decisions about buying a product. Most important, they are asking from companies involved in food chain to make food safety their number one priority. Companies which are choosing to cut costs on the expense of food safety are being a treat nut just for their customers and their business but for whole poultry industry.

Protecting poultry flocks against contamination with undesirable microorganisms is extremely important for industrial poultry production. A contagious and highly pathogen microorganism which is introduced in poultry flocks could have serious consequences for whole company. Daily working out and usage of biosecurity means as best management practices in poultry farms is decreasing chances of outbreaks of zoonoses like Salmonella and of some infectious diseases like poultry Influenza and Newcastle disease. Poultry producers and slaughterhouses operators should understand and be aware of importance of biosecurity protocol details and they should make efforts to apply such programs to maintain a constantly high level of biosecurity.

Well done management and biosecurity should minimize the risk of introducing and maintaining infection especially because better prevention of Salmonella outbreaks in breeding flocks and feed mills did massively decreased risks from these sources although combined feeds are still being the main source of Salmonella outbreaks in poultry farms in many companies.

Our own researches from this paper were focused on products sold on our market which are approved by EU legislation and might be used in feeds against Salmonella. Applying management and biosecurity practices in poultry farms was also studied bearing owner responsibilities in mind.

The following aspects were shown by experiments. General objective of first part of our research was establishing effect of two acidifiers, named acidifier A and acidifier B, against experimental contamination of feeds with Salmonella and coliforme bacteria.

Feed contamination with Salmonella is worst treat for animal health and afterwards for human health. It is internationally recommended for feeds to be controlled for total germs number, contamination with coliforme bacteria and presence of E. Coli, presence of sulphure -reducing bacteria and for contamination with Salmonella before being introduced in animal feeding.

Efforts were made to find compounds protecting feeds against contamination with

Salmonella, without affecting feed quality and animal health. 6 (six) experiments have been proceeded. Researches were realized at National Institute of

Research-Development for Microbiology and Immunology Cantacuzino, inside Laboratory of Reference "Infectii Enterice Bacteriene".

Experiment 1 was made for the microbiological control of feeds included in experiments. Feed was controlled to find total germs number, most probable coliforms number and contamination with Salmonella. It was found that feed was Salmonella and coliforms free and total germs number was estimated at 52500 cfu/g. In experiment 2 antibacterial effects of the two acidifiers in broiler feeds was studied.

Acidifier A (solid compound, powder) was used in experiments at producer recommended quantities of respectively 2.0, 5.0 and 15 kg acidifier by ton of feed.

Acidifier B (liquid compound) was also used in experiments at producer recommended quantities of respectively 1,0; 3,0; and 8 liter acidifier by ton of feed. Total germs number, most probable coliforms number and contamination with Salmonella were tested at an interval of 0; 1; 5; 14; 21 and 28 days.

Results are showing that feeds were Salmonella and coliforms free during whole testing period. Total germs number (TGN) was having small variations but not according to type or quantity of added acidifiers.

Experiment 3 was performed to study antibacterial effect of both acidifiers against contamination with 10 cfu Salmonella. There were used feed and acidifiers samples from same batch. Acidifiers quantities were identical with those from experiment 2. Feed was contaminated with 10 cfu Salmonella. Contamination was performed with a mixture of Salmonella enterica subspecies enterica serovar Enteritidis and Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium, isolated from foods, received in Cantacuzino Institute laboratory for confirmation and stoked in laboratories strain collection. Samples were tested at 0, 1, 5, 14, 21 and 28 days. Results are showing that Salmonella were found in all tested periods which lead to idea of performing parallel tests.

1 g feed suspension at in 9 ml sterile physiologic serum was tested. 0.2 ml were sampled from this mixture and they were inoculated on agar McConkey, respectively ADCL. As expected few colonies were found. Results confirm presence of Salmonella and that cfu Salmonella number experimental introduced in feed did not increase.

It was also tested a suspension of gram of feed in 9 ml water with peptones, incubated over night and inoculated on environment McConkey and ADCL. Salmonella growth confirms presence of pathogen in tested samples.

In experiment 4 s-a minimal inhibitory concentration of acidifier on strains of Salmonella was tested.

As Salmonella presence was identified in all samples of experiment 3 sit was decided testing anti-Salmonella action of acidifiers in pure culture at producer recommended concentrations.

Young Salmonella culture density 0.5 McFarland was inseminated with a cotton swab (difusimetrical method, according to standard procedure recommended by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) on agar Mueller Hinton. A spoon of acidifier A and a calibrated spoon of acidifier B were applied on culture in plates. Inhibition zone diameter was measured after incubation at 37°C over night.

Results are showing that undiluted acidifiers A and B were efficient against strains of Salmonella. Detected inhibition zone for Salmonella enterica subspecies enterica serovar Enteritidis was 16 mm after usage of acidifier A and 12 mm after usage of acidifier B. Inhibition zone for Salmonella enterica subspecia enterica serovar Typhimurium was 20 mm and 12 mm for respectively acidifier A and B. It was also tested the effect of different dilutions of acidifiers against Salmonella enterica subspecies enterica serovar Enteritidis and against control strain of E. Coli A TCC 25922. To control results there were tested binary dilutions of acidifier B against E. Coli ATCC 25922 strain, recommended as control strain for testing bacterium sensibilities. 10µl from each binary dilution was put on strains of Salmonella enterica subspecia enterica serovar Enteritidis and E coli A TCC 25922 on agar Mueller Hinton.

Results are showing that product action is comparable for both tested strains. Minimal inhibitory concentration in liquid environment was also tested during this experiment series.

There were used strains of Salmonella enterica subspecies enterica serovar Enteritidis and Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium. Experiment was performed in peptones water contaminated with 10 cfu and 100 cfu mixture of both strains of Salmonella. Acidifiers were added at producer recommended concentrations. A spoon with bullion was dispersed on agar McConkey in both cases, whatever an agitation of bullion was seen or not. 2 colonies from grown culture were biochemical tested. Concentration at which culture medium reminded clear and from which there was no subsequent growth of colonies in plate was considered minimal inhibitory concentration.

The quantity of 0,100 g corresponding to 6.67 kg/to represents minimal inhibitory concentration of acidifier A, and for acidifier B a quantity of 4 liters/to proved to be minimal inhibitory concentration against strains of Salmonella.

Experiment 5 studied antibacterial effect of both acidifiers against contamination with 100

cfu Salmonella. Presence of Salmonella) against contamination momentum was detected in all samples and

to each testing periods (0, 1, 5, 14, 21, 28 days) by standard method. Even if sometimes Salmonella was not identified in peptones water or in physiologic serum, the pathogen remained in feed and was identified by standard method. Lack of Salmonella in some samples after being inoculated in peptones water or in physiologic serum is due to contamination level and also to the fact that samples were diluted 10 times in peptones water and 50 times in physiologic serum.

In experiment 6 was studied antibacterial effect of acidifiers A and B against contamination with 100 cfu coliforms.

It was used a mixture of E. coli, Enterobacter spp. si Klebsiella spp. To obtain a suspension of 10000 cfu/ml coliforms to contaminate with 100 cfu/g a feed that was free of coliforms before experiment. There were used six product concentrations for acidifier A (control, 5 kg/to, 6 kg/to, 9 kg/to, 12 kg/to, 15 kg/to) and acidifier B (3 l/to, 4 l/to, 6 l/to, 8 l/to). Time of exposure to tested product was 0, 1,5, 14, 21 and 28 days.

Results are showing that by adding acidifiers A or B in feed contamination with coliforms remained about at the same level. Increased number compared to initial contamination level might be explained by the fact that feed is acting as a nutritive environment but bacterial growth rate remained low. Theoretical, growth could stop when acidity level increase. Low variation of coliforms number at different acidifiers analyzes times and concentrations ale is the result of homogenization level.

Second part of our research was about applying some management and biosecurity practices in poultry farms by studying a vertically integrated poultry company having all production, processing and distribution links. This company has been SC TRANSAVIA SA Alba Iulia with an annual output of 30000 tones broiler meat.

Company’s production performances are of European top and sometimes exceeding performances recommended by guide of the hybrid in production (COBB 500).

Priorities of technological integrated chain from primary production to consumers are biosecurity and avoiding contamination with pathogens like Salmonella, and reduction of general microbial contamination (TGN) or coliforms.

Company has specific programs of Salmonella infection in poultry, programs aiming to reduce contamination from the precedent link of production chain and to prevent contamination in present link and then to protect against recontamination during downstream movement of product.

Measures to prevent introduction, diffusion and maintaining of Salmonella in broilers are applied in broiler farm at catching, loading and shipping broilers and in slaughterhouse.

Monitoring, sampling and testing for Salmonella are performed according to Regulation 2160/2003 and 1003/2005, to reduce probability of vertical transmission of first five serotypes of Salmonella. Testing day one chicks at arrival in farm is stipulated by EU legislation but is not mandatory but birds are tested with maximum 3 weeks before slaughtering.

In companies breeding farms there are precise graphs about collecting samples to monitor

zoonotical salmonellae. Bacteriological exam samples collecting graph are designed according to

Commission Decision 2008 / 897 / CE stipulating also confirmation from EU to minimize

zoonotical salmonellae in broiler breeders.

At broiler farms level is used the same program confirmed by Commission Decision 2008 / 897

/ CE. Based of this program there are designed elaborate samples collecting graphs to monitor

zoonotical salmonellae at broiler farms level three weeks before shipping broilers to slaughterhouse.

Verifying washing and disinfection efficiency in slaughterhouse especially fro

microbiological point of view is performed by a special management team which plans, applies and

maintains a procedure or procedures based on HACCP principia, aiming to reduce risk of cross-

contamination during slaughtering.

There are performed programs of collecting sanitation samples daily and weekly concerning

both transport and slaughtering equipments.

Analyzing methods for Salmonella, TGN and coliform bacteria are classical methods usually

used in this purpose.

1462 samples were analyzed in broiler farms and all analyzed samples were negative for

coliform bacteria.

406 samples were collected in breeding farms and hatchery and laboratory from breeding

farms during October, November and December 2009 and after analyzing for coliform bacteria (ST

AS ISO 4831) all samples were negative.

In total there were analyzed 1868 samples from broiler farms and from breeding farms and

all samples were negative for coliform bacteria.

1386 sanitation samples were collected in slaughterhouse during November - December 2009

period, as following: 551 samples for TGN, from which 11 samples were positives and 540 samples

were negative; 551 of samples for coliform bacteria, from which 10 au were positives and 541

samples were negative, 284 samples for Staphylococ coag. Pozitiv and from which all samples were

negative.

72 samples were collected from auto vehicles as following: 24 samples for TGN analyzes

and all samples were negative; 24 samples for coliform bacteria and all samples were negative; 24

samples for yeasts and moulds and in all samples microorganisms number did not exceeded norm

admitted by ISO 7954.

156 samples were collected from packing materials as following: 52 samples for TGN and

number of growth microorganisms did not exceeded norm admitted by ISO 4833; 52 samples for

coliform bacteria and number of growth microorganisms did not exceeded norm admitted by ISO

4831; 52 samples for yeasts and moulds and number of growth microorganisms did not exceeded

norm admitted by ISO 7954.Based on our own researches, results of our own researches and

conclusion from our own researches the following recommendations are offered:

1. Usage of anti - Salmonella acidifiers should be based on anti - Salmonella ability

evaluation and of ability to obtain expected effect to preserve feeds Salmonella negative. Three

experiments should be performed of which two in laboratory and one in farm. First experiment of

laboratory is about doze titrates, to determine limits for efficient doses for feed additive. The second

experiment should be about "prevention of recontamination" to evaluate ability to preserve an

efficient dose to maintain feeds Salmonalla - negative in spite of repeated exposure of treated feeds

to Salmonella. The third experiment should be performed in poultry farms aiming to find if dose

established in laboratory experiments is sufficient to be used alone for obtaining expected technical

effect to preserve feed Salmonella - negative in practical usage conditions. Such usage conditions

should include those associated with preparing, stocking and consuming feeds treated with

acidifiers.

2. Because according to UE legislation responsibility for food safety belongs mainly to unit

owner (poultry producer) we recommend to all broiler producers and processors to design and apply

their own good management and biosecurity practices programs in poultry farms and these programs

should be applied combined with measures to sterilize feeds from microbiological point of view. As

our researches have shown, these programs are efficient in reducing risk of microbiological

contamination in broiler production.