UNIVERSITATEA „AL. I. CUZA” IAŞI

FACULTATEA DE FIZICĂ

Rezumatul tezei de doctorat

SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA UNOR SISTEME

HIBRIDE DE POLIMERI HIDROSOLUBILI

ŞI MEDICAMENTE/NANOPARTICULE CU APLICAŢII

ÎN BIOMEDICINĂ

Conducător ştiinţific,

Prof. Dr. Dana Ortansa Dorohoi

Doctorand,

Daniela Angelica Bîndar (căs. Pricop)

Iași – 2012

Universitatea „Al. I. Cuza” Iaşi

În atenția

…………………………………………………..

Vă facem cunoscut că în data de 18 februarie 2012, ora 10, în

amfiteatrul L1, doamna Daniela Angelica Bîndar (căs. Pricop)

va susține, în ședință publică, teza de doctorat:

SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA UNOR SISTEME HIBRIDE DE POLIMERI

HIDROSOLUBILI ŞI MEDICAMENTE/NANOPARTICULE CU APLICAŢII ÎN

BIOMEDICINĂ

în vederea obținerii titlului științific de doctor în domeniul fundamental

Științe Exacte, domeniul Fizică.

Comisia de examinare a tezei:

Prof. Univ. Dr. Dumitru LUCA,

Președinte

Facultatea de Fizică, Universitatea „Al. I. Cuza”, Iaşi

Prof. univ. dr. Dana – Ortansa DOROHOI

Conducător științific

Facultatea de Fizică, Universitatea „Al. I. Cuza”, Iași

CP. I Dr. Valeria Harabagiu Referent

Institutul de Chimie Macromoleculară „Petru Poni”, Iași

Prof. Univ. Dr. Viorica ȘIMON Referent

Facultatea de Fizică, Universitatea „Babeş-Bolyai”, Cluj-Napoca

Prof. univ. dr. Viorel MELNIG

Referent

Facultatea de Fizică, Universitatea „Al. I. Cuza”, Iași

Vă invităm pe această cale să participați la ședința publică de susținere

a tezei de doctorat.

Cuprins Introducere

Cap I. Stadiul actual al cunoaşterii în domeniul materialelor polimere inteligente şi a

obţinerii de nanoparticule

Bibliografie

Cap II Metode de caracterizare a materialelor nanofazice, suprafeţelor si filmelor

II.1 Voltametrie ciclică

II.2 Determonarea distribuțiilor de dimensiuni prin împrăștierea dinamică a

luminii

II.3 Determinarea potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

II.4 Microscopie electronică de transmisie

II.5 Microscopia de forţă atomică AFM

II.6 Microscopie optică

II.7 Difracţia radiaţiei X

II.8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrale

Bibliografie

Cap III.Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de lipidă şi

chitosan

III.1 Încapsularea unor medicamente specifice în vezicule lipidice

III.1.1 Încapsularea clorurii de magneziu în vezicule lipidice

III.1.2 Încapsularea ketoprofenului in vezicule lipidice

II.1.3 Încapsularea dexketoprofenului în vezicule lipidice

II.1.4Încapsularea tramadolului în vezicule lipidice

II.1.5 Încapsularea hidrocloridului hidrat în vezicule lipidice

III.2 Caracterizarea in vivo a cineticii de eliberare a medicamentelor de către sistemele de

vezicule lipidice stabilizate în chitosan și compararea cu eliberarea in vivo

III.3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili trapaţi cu

medicament

IV.3.1 Cinetica de fixare si eliberare controlată a compuşilor sintetizaţi (in vivo)

IV.3.2 Testarea biocompatibilității medicamentelor încorporate în vezicule

IV.3.3 Cercetarea efectelor medicamentelor încorporate în vezicule, pe modele

nociceptive

Bibliografie

Cap IV.Obţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale nobile , în

medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

IV.1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

IV.1 Sinteza nanoparticulelor de platina

IV.2 Sinteza nanoparticulelor de argint

IV.3 Sinteza nanoparticulelor de aur

IV.2 Caracterizarea structural a nanoparticulelor obținute

IV.3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au în chitosan în raport cu

diferiți factori

IV.3.1 Analiza stabilității în timp a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de au

IV.3.2 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

încălzite

IV.3.3 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

înghețate

IV.3.4 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

sub acțiunea unor activatori

IV.3.4 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

sub acțiunea radiației din spectrul vizibil

IV.4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule de metale nobile

IV.4.1 Evaluarea proprietăților antibacteriene ale nanoparticulelor in vivo pe

diferite medii de cultură

IV.4.2 Efecte induse de nenoparticulele de metale nobile

Bibliografie

Concluzii generale

Lucrări publicate

1

Cap I. Stadiul actual al cunoaşterii în domeniul materialelor polimere

inteligente şi a nanoparticulelor metale nobile

Medicina modernă a făcut pași considerabili în înțelegerea necesității

compatibilizării medicamentului cu țesutul. Practica a arătat că de multe ori corpul

percepe medicamentul ca pe un dușman și se comportă în consecință. Un domeniu

de interes pentru aplicațiile din biomedicină, se ocupă cu îmbunătățirea eficacității

medicamentelor în medii biologice, folosind nanotehnologia, în scopul

dimensionării acestora la nivel nanometric și creșterea bio-disponibilității lor. În

ultimii ani au fost dezvoltate o varietate de tehnici în eliberarea controlată a

medicamentelor și în aplicaţii legate de funcționalizarea nanoparticulelor de metale

nobile. Interesul medical, în potențialul acestor nanomateriale, este motivat de

capacitatea lor de a interacționa individual cu biomoleculele și cu celulele. Și într-

un caz și în celălat nu există încă informaţii suficiente referitoare la impactul

acestora asupra sănătăţii organismelor şi a mediului înconjurător.

Răspunsul transportatorilor de medicamente, la stimulii mediului biologic,

este condiționat de nivelul de stabilitate al soluțiilor coloidale care-i conțin.

Această stabilitate depinde de îmbunătățirea proprietăților de suprafață a

coloizilor, realizată prin acoperirea cu polimeri și care induc între aceștia procese

repulsive. Dacă ținem cont că stabilitatea sistemelor coloidale, atât sub formă de

vezicule lipidice cât și sub formă de nanoparticule, este influențată de diferiți

factori cum ar fi pH-ul, temperatura, forța ionică, dimensiunea particulei, etc. ne

putem aștepta ca interacțiunile ce au loc între polimeri şi coloizi (vezicule sau

nanoparticule) să fie extrem de complexe. Stabilirea nivelului de stabilitate a

soluţiilor coloidale este definită în acord cu valoarea medie a potenţialului Zeta.

Acesta indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să aglomereze,

urmând să precipite, sau prezintă acel nivel de dispersivitate care să la permită

interacțiunea cu mediul biologic.

Obținerea veziculelor lipidice

Studiile au arătat că folosirea în medicații a transportatorilor de

medicamente sub formă de vezicule, având dimensiuni nanometrice, este mai puțin

toxică. Veziculele sunt structuri sferice formate prin auto-asamblarea moleculelor

amfifile de fosfatidilcolină în soluţie apoasă. Celula vie pare să-și fi autoansamblat

membrana dintr-un bistrat lipidic după aceeași strategie. Pentru a obține vezicule,

filmul lipidic de fosfatidilcolină, este hidratat cu diferite soluţii (medicament) care,

2

de altfel, vor deveni conținutul veziculelor. Trecerea sistemului, din starea de

bistrat lamelar în starea de vezicule, are loc ca urmare a creşterii entropiei

sistemului, care le determină autoansamblarea, împachetându-se unele în altele sub

formă de vezicule multilamelare de diferite dimensiuni.

Fig. 5 Formarea veziculelor lipidice din unităţi individuale de formă cilindrică.

Pentru a produce mici vezicule unilamelare și cu dimensiuni nanometrice

(15 - 50 nm), se folosește o baie de ultrasunete (figura 5). Ultrasonarea

fragmentează aleatoriu veziculele multistrat, în ceea ce am putea numi vezicule

unilamelare [24], a căror dimensiuni depind de amplitudinea semnalului ultrasonor.

Adăugarea chitosanului în soluțiile de vezicule cu medicament conduce la

modificarea dimensiunii şi morfologiei veziculelor unilamelare, provocând

creșterea stabilității acestora.

Obținerea nanoparticulelor de metale nobile

Metodele de sinteză a nanoparticulelor au fost inspirate din natură,

utilizând faze suport polimerice. De exemplu, este bine cunoscut că în procesele de

biomineralizare, proteinele și polizaharidele pot acționa ca suport pentru

structurarea materialelor anorganice la nivel nanometric. Aceste faze suport s-au

folosit pentru obținerea de nanoparticule bine definite și cu o distribuție îngustă.

3

Nanoparticulele din metale nobile se pot obține prin sinteza

electrochimică a nanostructurilor mono și bimetalice [33 - 35] și îşi găsesc aplicaţii

în domenii ce includ cataliza [35], sisteme de stocare a datelor, dispozitive

electronice noi, chemo şi biosenzori electrochimici [34], senzori refractometrici şi

de fluorescenţă. Folosirea efectului ultrasunetelor în electrochimie [37]

îmbunătățește mult transportul de masă, modificându-i viteza şi, de asemenea,

modificând mecanismul reacţiei electrochimice. Sinteza nanoparticulelor de aur în

soluții apoase de chitosan a pus în evidență faptul că acesta devine agent de

stabilizare și reducere datorită controlului nucleației. Dimensiunea nanoparticulelor

de aur formate variază în funcţie de concentraţia şi masa moleculară a chitosanului.

Stabilitatea acestor soluții, este asigurată prin adsorbția moleculelor de

polimer la suprafața nanoparticulelor, producandu-se automat scăderea tensiunii

interfazice, datorită interacţiunii între faza dispersată şi mediul de dispersie.

Cap II. Metode utilizate de caracterizare a materialelor nanofazice,

suprafeţelor și filmelor

Una din caracteristicile fundamentale ale coloizilor de dimensiuni

nanometrice, este raportul foarte mare suprafaţă-volum, care duce la apariția unor

proprietăţi fizice sau chimice noi. Problema care se pune este de a determina exact

aranjamentul în polimer și modificările ce apar la nivel local în cadrul

nanostructurilor. Caracterizarea soluțiilor coloidale obținute a constat în: analiză

structurală, mezofazică, nanofazică și a proprietăților optice și de stabilitate.

II.3 Determinarea Potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

Analiza proprietății de stabilitate a soluțiilor coloidale s-a realizat prin

măsurarea potenţialului Zeta. Această tehnică constă în împrăştierea unui fascicul

de lumină laser, incident prin centrul unei celule ce conține proba, sub un unghi de

aproximativ 13° pentru a fi detectat și comparat cu fasciculul laser de referintă.

Potenţialul Zeta se calculează din mobilitatea electroforetică a coloidului,

a cărui spectru de frecvențe va fi analizat cu un software. Stabilitatea soluţiilor

coloidale este definită în acord cu o valoare medie a potenţialului Zeta (tabelul 1)

care indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să floculeze [8]. Particulele

care au potențialul Zeta mai pozitiv decât +30 mV sau mai negativ decât -30 mV,

sunt în mod obișnuit, considerate stabile. Măsurarea distribuțiilor de dimensiune și

a stabilității soluțiilor coloidale a necesitat utilizarea unui aparat Malvern Zetasizer

Nano ZS, model Zen-3500.

4

II.4 Microscopia electronică de transmisie (TEM) și Microscopia de forţă

atomică (AFM)

Imaginile micrografiilor TEM și AFM pentru nanoparticulele de Au, Ag

și Pt au fost făcute cu un microscop Phylips CM 100 și în modul semicontact cu un dispozitiv Solver pe filme subţiri. Aceste analize au avut drept scop analiza

morfolofică a nanoparticulelor și evaluarea gradului de acoperire cu polimer.

În TEM, tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre

cele două lentile condensor, unde este focalizat [11]. Câmpul asociat unei lentile

electrostatice, sub formă de diafragmă metalică circulară, modifică viteza

electronilor, atât în mărime cât şi în direcţie. Pentru a putea concentra câmpul

magnetic în vecinătatea axei optice, se utilizează lentilele magnetice sub formă de

solenoizi, coaxiali cu fasciculul electronic. Câmpul magnetic al lentilei modifică

direcţia mişcării electronilor, înfăşurând" traiectoria lor în jurul axei optice, fapt ce

produce rotaţia imaginii electronice în raport cu obiectivul. Proba este plasată în

apropierea lentilei electromagnetice obiectiv. Imaginea formată de obiectiv se

numește prima imagine intermediară și servește drept obiect pentru lentila

electromagnetică intermediară. Apoi, această ultimă imagine, este mărită de lentila

electromagnetică proiector, care va forma imaginea finală a obiectului pe un ecran

fluorescent.

În ceea ce privește realizarea schiţei topografice a suprafeţei probei,

efectuată prin AFM, s-a folosit un aparat Solver Pro 7M. Imaginea este obţinută

prin măsurarea forţe de interacțiune, în care forţa repulsivă este influenţată de

densitatea totală a electronilor din jurul unui atom. În timpul deplasării vârfului de-

a lungul suprafeţei probei, forța de interacțiune pune ușor în mișcare un cantilever.

Componentele de bază ale unui AFM sunt vârful ascuţit montat pe

cantilever, sistemul de detecţie pentru măsurarea devierii cantileverului, traductorul

piezoelectric pentru mişcarea sondei în raport cu proba, sistemul de feedback

pentru menţinerea constantă a devierii prin reajustarea înălţimii sondei și sistemul

imagistic pentru convertirea punctelor înregistrate într-o imagine. Devierea

cantileverului este amplificată cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele

cantileverului şi este reflectat spre un detector cu fotodiodă.

II.6 Microscopie optică. Microscopie în câmp întunecat (DF)

Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibilă prin DF

datorită efectului de plasmon, care s-a creat la interacțiunea nanoparticulelor cu

lumina, și care extinde dimensiunea aparentă a acestora cu peste 100 nm.

Câmpul întunecat este obţinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic,

astfel încât razele nedifractate să nu poată fi colectate de lentilele obiectiv. Efectul

de câmp întunecat poate fi obţinut rapid, din câmpul luminos, prin rotirea

5

condensorului, astfel încât să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de

probă [13] și s-a realizat utilizând un microscop inversat Nikon Eclipse Ti.

II.7 Difracţia radiației X

Structura micro- şi nano- fazică, ca și dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000, utilizând radiaţia CuKα (1,54060 Å) care

operează la 40 kV şi 30 mA. Difracţia radiației X este o metodă folosită în

principiu pentru evaluarea constantei de reţea, d a unei probe cristaline [14, 15].

Datorită lungimii de undă mici, relativ la cea din lumina vizibilă, radiația

X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor.

Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a

fasciculului monocromatic împrăştiat [15]. Utilizând legea lui Bragg, putem

prezice unghiurile de difracție. Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer

[14].

II.8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existenţa legăturilor între polimer şi nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile în

cei doi polimeri. Spectroscopia în domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de

identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor

compușilor organici. Spectrometrul IR clasic este un aparat în care radiația

electromagnetică furnizată de o sursă este separată în două fascicule: un fascicul de

referință și unul care trece prin probă [17]. Măsurând absorbţia radiaţiei ca funcţie

de frecvenţă, se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o „amprentă”

moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor

funcţionale. Spectrele FTIR au fost înregistrate între 4000 şi 400 cm-1

cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker.

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)

Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării

electronice excitate a nanoparticulelor de Au, s-a folosit o tehnică de împrăştiere

Raman la rezonanţă. Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe

suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman

cunoscut, în literatura de specialitate, sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificată de suprafaţă). Împrăștierea Raman la rezonanță, are loc atunci când

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate în stare excitată. În urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală. Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman, Renishaw, având un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm).

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de îmbătrânire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizând

un spectrofotometru Hitachi U–2001.

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice în

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante, de

nanoparticule de aur în soluții de chitosan. Spectroscopia de absorbție moleculară

constă în aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se înregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33].

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1. Obținerea în condiții blânde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de:

- vezicule lipidice încărcate cu medicament și stabilizate în chitosan,

- nanoparticule din metale nobile sintetizate în polimeri biocompatibili.

2. Evaluarea proprietăților acestor materiale atât sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-încălzire/răcire, pH-ul în procese de dializare, activatori chimici,

radiație luminoasă) cât și în studii in vivo în interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură, la eliberarea în medii gastrice sau în sânge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică.

Cap III. Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea în condiții blande a soluțiilor coloidale , se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii, în copolomerii bloc, prin reglarea

echilibrului hidrofilic/hidrofobic. În acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice, de dimensiuni nanometrice, încărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului. Medicamentele încapsulate

în veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu, ketoprofenul,

dexketoprofenul, U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul.

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat, după

evaporarea solventului, cu o soluţie de apă distilată şi medicament. După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min, pentru a obţine vezicule unilamelare, soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 0,5% chitosan [5]. Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice, cu medicament stabilizat în chitosan, la un pH neutru, aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore.

Fig. 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor îcărcate cu

ketoprofen și stabilizate în chitosan CKLV.

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament în primele minute de după administrare, ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare, întreaga cantitate de medicament a fost încapsulată în vezicule.

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis încărcarea

lor cu sarcină pozitivă. Ca urmare, în toate sistemele analizate, chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor, corespunzând criteriilor soluţiilor

suspendate. Procesul de dializare, necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic, a

condus la diminuarea stabilității veziculelor, datorită proceselor de protonare/

deprotonare.

III.3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

încărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face într-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei, la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen în același mediu de eliberare.

Și eliberarea, în sânge, a medicamentului din veziculele lipidicese, se face

cu întârziere față de medicamentul neâncorporat. În sânge, concentrația maximă de

medicament, eliberat din vezicule, se menține cu câteva ore în plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat.

8

Fig. 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate,

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

în același mediu de eliberare.

Fig. 33 Variaţia în timp a concentraţiei

de ketoprofen în sânge, la şoarecii

trataţi atât cu vezicule cu medicament

cât și cu o soluție simplă de ketoprofen.

În studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei, pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și încărcate cu oricare din medicamentele utilizate.

Graficele obținerii efectului maxim posibil, pentru toate soluțiile

încorporate în vezicule lipidice stabilizate în chitosan, au arătat că:

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce în același timp;

- intensitatea efectului scade față de substanțele neâncorporate;

- maximul de efect, se obține aproximativ în același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții;

-efectul medicamentelor încorporate se prelungește în acelașii interval de

timp.

Coroborând efectele medicamentelor încorporate, cu nivelul de

medicament eliberat în sânge la diferite momente de timp, din testele de

comportament și testele de nocicepție, s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic.

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket. eliberat în sânge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket. în tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket. în writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare între obținerea concentrației maxime de

medicament în sânge și inducerea unui efect antinociceptiv, semnificativ statistic,

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol/

L)

x 1

05

%

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

*

**

**

** KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

g/m

L)

Timp (ore)

9

doar în testul tail-flick. La nivel gastric, în testul Writhes, efectul întârzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos, din cadrul testului de comportament, întarzie cu 4 ore.

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului, ce acoperă veziculele

cu medicament, la pH-urile specifice acestor medii de eliberare.

Efectul produs de analgezice în sânge, s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide, la care efectul s-a menținut maxim (4

ore), deoarece chitosanul, la pH-ul ridicat al sângelui, devine mai puțin solubil,

permițând o mai lentă destrămare a veziculelor. La nivel abdominal, efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament, în testul Writhes, s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit, deoarece chitosanul devine mai

solubil permițând eliberarea mai rapidă a medicamentului.

Cap IV.Obţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile în medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

În acest capitol este prezentată sinteza, caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină, argint și aur. Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale, ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie, în condiții blânde, asiguranduli-se o bună dispersabilitate, prin reducerea

în agenți de stabilizare. Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos.

IV.1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint , s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi. Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului. Prezența electrolitului,

alcătuit din soluția de precursor și polimer, permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează.

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU,

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2, 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează în microdomeniile

polimerului.

Nanoparticulele de argint, acoperite cu poliamidhidroxiuretan, s-au

sintetizat prin electrosinteză în regim galvanostatic, pentru densităţi de curent de

6,25 mA/cm2 (AgI) şi 1,56 mA/cm

2 (AgII), la temperatura camerei, sub agitare

puternică şi în atmosferă de azot. Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min.

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere în soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7]. Prepararea soluțiilor precursor, pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan, s-a făcut amestecând 2, 4, 6, 8 și 10 ml HAuCl4 ·3H2O 10-

3 M cu 38, 36, 34, 32 și respectiv 30 ml de chitosan 0,1%; sub agitație cu

ultrasunete .

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse în domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 0,6 mA/cm2 1,2 mA/cm

2.

Dimensiunile, mai mari, obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii între

polimer și nanoparticule, conform studiilor FTIR. Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta.

Nanoparticulele de argint, împachetate în polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm). Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor, de la câțiva zeci de nm până la cîteva sute de

nm, ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme, puse în

evitență atât prin DF cât și prin TEM. Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul.

Fig. 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4.

Fig. 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF, evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite,

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit.

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie, urmând ca prin

îmbătrănire în timp să li se îmbunătățească nivelul de stabilitate.

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

0.05

0.10

0.15

0.20

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

u.a

.)

Lungim

ea d

e undã

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV.3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au în chitosan

în raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de îmbătrânire în timp, soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ºC), au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2, 3, 4, 7, 8 și respectiv 11 luni, și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2, 3, 7 și 11 luni după sinteză.

Fig. 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur.

Soluțiile cu cea mai îndelungată stabilitate, de 11 luni, s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur, indiferent de masa

moleculară a chitosanului. Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor, în

polimerul cu masă mică și mare moleculară. Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur.

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C într-o etuvă

termostatată, au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta, fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10].

Fig. 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG, 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur.

400 600 8000,0

Ab

sorb

anta

(u

.a.)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

u.a

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

2918,5

1571,8

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

u.a

.

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

1571,8

1599,7

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

u.a

.

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

659,5

603,6

1570

15152132,5

2118 2945

2917,6

400 600 800

0,0

Ab

sorb

anta

(u

.a.)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 8000,0

Ab

sorb

anta

(u

.a.)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

524,5

12

S-a observat că cu cât masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atât soluțiile prezintă o mai bună stabilitate, odată cu creșterea timpului de

încălzire. Supuse procesului de încălzire, sistemele coloidale tind, în primele ore,

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm, fapt ce indică o

îmbunătățire a mediului dielectric în imediata vecinătate a nanoparticulelor [12].

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor, fenomen pus în

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13], mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur.

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C, în cicluri

de câte 20 min în care au atins starea solidă prin înghețare și apoi au fost readuse în

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot în 20 min, au fost analizate

spectral, li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta, distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10]. S-a observat că, cu excepția probelor ce conțin chitosan PG,

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă. Pierderea stabilității a

fost motivată, în toate cazurile, de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule, lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului. Cu cât masa chitosanului scade cu atât

maximul de absorbție scade mai repede, ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vâscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15].

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG, 6MMW și 6LMW la înghețare.

O proprietate care se manifestă, de altfel și la încălzirea soluțiilor

coloidale, este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular. Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H, făcându-o mai flexibilă [16].

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris),

supuse unui proces de oxidare electrochimică în regim galvanostatic la un curent

de 0,25 mA timp de 10 min, au fost analizate spectral în UV-Vis-NIR după 30

minute și în final prin DF și RAMA.

(a) (b)

Fig. 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol. 2LMW în ac. formic.

Procedura de oxidare electrochimică, a probelor, s-a repetat de încă 4 ori,

la intervale de 24 de ore. S-a observat o scădere a absorbanței, însoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari. Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței, ci mai curând mici scăderi însoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari.

În final dispariția semnalului Raman pune în evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative.

Fenomenul poate fi datorat adsorbției/absorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] în urma oxidării electrochimice. Se induc astfel

schimbări structurale în masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22]. Odată cu îmbătrânirea acestor

soluții, are loc o reorganizare structurală lentă, care conduce la stări mai puţin

active.

Au fost supuse iradierii, în spectrul vizibil, probe de nanoparticule de aur

epuizate prin îmbătrânire în timp, în scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS. S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min, distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C. S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS.

400 600 800 1000

0.0

0.2

0.4

Ab

sorb

ance

(a.

u.)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac. Formic

10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

.a.)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

235,5

14

Creștea semnalului Raman sugerează o înbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule. Soluțiile care conțin chitosani, cu mase

mici și medii moleculare, prezintă cel mai puternic semnal Raman. La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară, acest fenomen este mai slab.

(a) (b)

Fig. 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii.

IV. 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru început au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse în medii de cultură bacteriană. S-a urmărit modul în care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II), de concentrația (10, 30, 60 μg/ml în mediu) și modul în care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor în mediile biologice [25].

Fig. 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene în mediu LB cu E. coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig. 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene în mediu LB cu S. aureus. pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint.

400 600 8000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Inte

nsi

tate

(u

.a.)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

u.a

.

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

1546,5

2134

2123,4

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Control

AgI (1g/ml)

AgI (5g/ml)

AgI (5g/ml)

AgII (1g/ml)

AgII (5g/ml)

AgII (5g/ml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1g/ml)

AgI (5g/ml)

AgI (50g/ml)

AgII (1g/ml)

AgII (5g/ml)

AgII (50g/ml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus în evidență prezența

nanoparticulelor de argint în mediul de cultură și inducerea unor modificări în

morfologia celulei. Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decât cele din literatură. Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian, datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor. Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor,

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă.

Control Ag I, 10 μg/mL Ag II, 10 μg/mL

a b c

d e f

Fig. 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I – 29 nm şi Ag II – 23

nm asupra morfologiei celulelor de E. coli (a, b, c) şi S. aureus (d, e, f).

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente, pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene, ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor în polimer se menține chiar și în formele aglomerate.

Studiul își propune, de asemenea, să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor în condiții de stres. S-a

folosită o tulpină test (LPS, 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună, produsă de bacteriile Gram negative.

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μg/ml, 10

μg/ml şi polimer (grupului de control), în analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare, GOT, GPT şi

a nivelurilor de LDH, nici a parametrilor imunitari (OC, PC, BC. ).

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135), prin creșterea nivelului anticorpilor.

Fig. 135 Nivelul anticorpilor în a 9-a zi,

postimunizate cu (LPS, 250 μg/kg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2.

Fig. 137. Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante în a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2.

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137).

În urma inducerii stresului electric, s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2, sugerându-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138). Rezultate

experimentale similare au fost observate și în cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală în tub (figura 139), însă efectele sunt mai pronunțate.

Fig. 138 Nivelul anticorpilor evaluat în a

4-a zi postimunizate cu (LPS, 250 μg/kg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2, pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig.139 Nivelul anticorpilor în a 4-a zi

postimunizate cu (LPS, 250 μg/kg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2, pentru

animalele supuse izolării.

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale, la șoareci, au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint.

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag. De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS, de către nanoparticulele de Au împachetate în

chitosan, la şobolanii de laborator, au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului.

S-a constatat, la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag, cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28]. Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate în

procesele memoriei, în loturile tratate cu nanoparticule de Ag, indiferent de

dimensiunea acestora.

Fig. 144 Imagini de microscopie optică în DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag în creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig. 145 Histopatologia creierelor. Control (A), Ag I – 5 µg/ml (B), Ag I – 10 µg/ml (C), Ag

II – 5 µg/ml (D), Ag II – 10 µg/ml (E). Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint.

18

În cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS, ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală,

comparativ cu controlul. S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului în raport cu greutatea corporală numai în cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul. Cu toate acestea în grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative în creier.

AuNP1(în insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig. 146 Imaginile de microscopie optică în DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 în creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (în insert).

Fig. 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2. A. control; B. LPS; C. LPS + AuNP1; D. LPS + AuNP2.

A

B

C

D

19

Concluzii generale

În această lucrare mi-am propus să obțin în condiții blânde, vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme în biomedicină.

Pentru a împiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili.

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul, un biopolimer cationic, care poate interacţiona atât cu bistratul lipidic al

veziculelor cât și cu membranele anionice ale celulelor. Pentru ajustarea pH-ului,

la nivel fiziologic, toate sistemele coloidale au fost dializate, stabilitatea acestora

fiind medie – acceptabilă pentru aplicațiile propuse.

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire, carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o încărcare cu sarcină pozitivă a acestora.

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus în evidență

următoarele:

procesul de eliberare se prelungește în timp față de substanța

neîncorporată;

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu întârziere față de obținerea maximului de

concentrație din sânge, de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu încorporat în vezicule,

a suferit intârzieri și mai mari).

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate.

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (încălzire, răcire) a arătat că soluțiile suferă în timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la înghețare și care în final poate fi considerat

un proces de îmbătrânire mai lentă.

Sub acțiunea unor formulări chimice, nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal. Prin iradiere

în vizibil, am reușit să întârziem procesul de oxidare în soluțiile coloidale,

provocând intensificarea efectului LPR.

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că:

- atât nanoparticulele de argint cât și cele de aur în cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul.

- creșterea activității antibacteriene, datorită prezenței polimerului de asociere în

soluțiile cu nanoparticule de argint, a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate în literatură. Mai mult decât atât s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decât argintul de 29 nm.

- soluțiile cu nanoparticule de aur în chitosan acționează împotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS, fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi în serul animalelor experimentale.

Sub acțiunea celor două forme de stres, nanoparticulele de aur, nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS.

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) în PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan. Ambele soluțiil de aur în chitosan

nu au produs efecte neurotoxice, chiar dacă la aurul de 22,22 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului.

Evaluarea histopatologică a creierelor în vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule, a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor în cazul nanoparticulelor de Ag în PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice în cazul nanoparticulelor de Au în chitosan.

Comparând comportamentul nanoparticulelor de metale nobile în cei doi

polimeri se poate spune că:

Nanoparticulele stabilizate în chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul în care ajung, datorită

comportamentului diferit al chitosanului în funcție de pH.

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate în PAmHU sau în chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile, atât în mediile de cultură cât și în testele pe șobolani.

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1. M. Stefan, L. Hritcu, M. Mihasan, Daniela Pricop, Irina Gostin, R-I. Olariu,

Simona Dunca, V.Melnig, Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media, Journal of Materials Science: Materials in Medicine,

Volume 22, Issue 4 (2011), Pages 789-796, DOI 10.1007/s10856-011-4281-z,

ISSN:0957-4530 (print version). ISSN: 1573-4838 (electronic version),

Article;ISI Factor 2.325 (2010) Influence Score 0.597

2. Laura Obreja, Dana Pricop, N. Foca, V. Melnig, Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods, Materiale Plastice, 47(1), 2010, p.

42 - 47. ISSN 0025/5289.

3. L. Hritcu; M. Stefan; Daniela Pricop; Anca Neagu; M. Mihasan; Liliana

Tartau; V. Melnig, Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats,

Materials Science and Engineering C, 2011 (Impact factor 2,407), Influence

Score 0,61 (trimisa spre publicare ).

4. D. Bîndar, C. Ionescu, V. Melnig, Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions, J.

Colloid. Interf. Sci. (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate în reviste ISI

5. L. Tartau, D. Bindar, D. Ciubotariu, V. Melnig, Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats, Conference:24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location: Paris,

FRANCE Date: SEP 03-07, 2011, Sponsor(s): European Coll

Neuropsychopharmacol,Source:European Neuropsychopharmacology

Volume: 21 Supplement: 3 Pages: S267-S267, Published: SEP 2011, Impact

Factor: 4,201; AIS 1,208 (2010). http://dx.doi.org/10.1016/S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 1,5779)

6. L. Tartau, D. Bindar, V. Melnig, The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice, European

Neuropsychopharmacology, Vol 20 Supplement 3, 2010, p. S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology, AUG 28-SEP 01, 2010 Amsterdam, Netherlands,

22

ISSN 0924-977X. (Abstract) Impact Factor: 4,201; AIS 1,208 (2010).

http://dx.doi.org/10.1016/S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 1,5779)

7. Daniela Bîndar, Ana Garlea, Liliana Tartău, Viorel Melnig, Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier, Magnesium Research 22(3) 2009, p.

185S, ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor: 1.246 (2009))( Influence

Score 0,267).

8. Liliana Tarţău, Daniela Bîndar, Raoul Vasile Lupuşoru, Viorel Melnig, The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice, Magnesium Research 22(3) 2009, p. 212S, ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor: 1.246 (2009)) (Influence Score 0,267) .

Publicații non-ISI publicate

1. Liliana Tartau, Daniela Bindar, V. Melnig, Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488, Acta Chemica Iasi, Vol 18(2)

2. A. Cazacu, D. Bîndar, L. Tarțău, L. Hrițcu, M. Ștefan, L. Niță, C. Ionescu, V.

Nica, G.Rusu, M. Dobromir, V. Melnig (2011): Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis.

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza, Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară, XII(1), pg.45-51.

3. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarțău, V. Melnig, Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice, Academic Journal

of Manufacturing Engineering, vol.8 Issue 1, 2010, pp. 12-17 ISSN 1583-

7904.B+

4. D. Pricop, M. Ștefan, M. Mihasan, L. Hriţcu, R. Olariu, V. Melnig,

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis, The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization: Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies, November 25-27 2010, Sibiu, Romania, Conference

Proceedings Book Series: Knowledge Based Organization International

Conference Volume: 7, ISSN 1843-6722. ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation Index.B+

5. D. Bîndar, L. Tarţău, A. Gârlea, L. Niţă, V. Melnig, Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice, Romanian

Journal of Biophysics, vol. 20, nr. 1, p. 23–35, 2010.B+

6. L.Tarţău, R.V. Lupuşoru, D.Bîndar, V.Melnig, Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice, Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology, Volume XIV,

Number 2, June 2010, pp. 113-117.B+

http://dx.doi.org/10.1016/S0924-977X(10)70359-Xhttp://thomsonreuters.com/products_services/science/science_products/a-z/conf_proceedings_citation_index

23

7. L.Tarţău, C.E Lupuşoru., D.Bîndar, V.Melnig, Biocompatibility investigation

and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles, Annals of the

Romanian Society for Cell Biology, Volume XVIII, Issue 2, December

2010.B+

8. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarţău, A. Chiriac, L. Niţă, V. Melnig, Effect of

acetaminophen soft matter vesicles carrier in a somatic pain model in mice,

Annals of the Romanian Society for Cell Biology, Vol. XIV, Issue 2, p. 256-

260, 2009 .B+

Participări la conferințe/congrese internaționale și naționale:

9. D. Pricop, M. Ștefan, M. Mihașan, L. Hriţcu, R. Olariu, V. Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis. The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization: Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies, November 25-27 2010, Sibiu, Romania (prezentare orală).

10. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarţău, A. Chiriac, V. Melnig, Acetaminophen

entrapped in soft matter vesicles design based on nociceptive model in mice

effects correlation, The 2nd

International Conference on Polymers Processing

in Engineering, Galați, 22 – 23 octombrie 2009 (prezentare orală).

11. L. Tartau, D. Bîndar, R. V. Lupusoru, V. Melnig , The effects of magnesium

soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in mice International

magnesium symposium, Romania, The XII – th International Magnesium

Symposium 22-25 Septembrie 2009 Iasi (prezentare orală).

12. L.Tarțău, L.V. Lupușoru, D.Bîndar, V. Melnig, Experimental Reseaches on

the effects of tramadol soft matter vesicles in a somatic pain model in mice.

Post.Satelite to the 46-th EUROTOX Meeting, Inovation Trough

Nanotechnology and Nanomaterials- Current Aspect of Safety Assesment and

Regulation, 22-24 april 2010, Dresden Germany (prezentare orala)

13. L.Tarțău, D.Bîndar, V.Melnig, Experimental researches on the effects of

original tramadol loaded nanoparticulate formulations in visceral nociception

, Joint meeting of 2-nd Hungarian Symposium on Neurostimulation,

Hungarian Pain Society and Teaching course on Neuromodulation for Central

and Eastern Europe , Greece and Israel, 30sept -2oct 2010, Pecs

Hungary.(prezentare orala)

14. L. Tarţău, C. E. Lupuşoru, D. Bîndar, V. Melnig Biocompatibility

investigation and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles

Al XXVIII Simpozion Stiintific SRBC 9-12 Iunie 2010 , Constanţa

(prezentare orală).

24

15. L. Tarţău, C.E. Lupuşoru, D.Bîndar, V.Melnig, Designul, evaluarea toxicităţii

acute şi studierea eliberării in vivo a ketoprofenului trapat în nano-vezicule

lipidice, , A XXVIII-a Sesiune Anuala a SRBC, 9-12 iunie 2010, Constanţa

(prezentare orală)

16. L. Tarţău, R.V. Lupuşoru, D. Bîndar, V Melnig, In vivo release and visceral antinociceptive effect evaluation of ketoprofen loaded vesicles in mice 11-th

International Congres of Clinical Pharmacology, Therapeutics and Toxicology

8-11 June Oradea 2010 (prezentare orală).

17. V. Melnig, L. Obreja A. Garlea, D. Bîndar, Quantum nanoparticles effects used for biological application. The X-th National Coference of Biophysics

“CNB 2009 „1-3 october 2009 Cluj (prezentare orala).

18. V.Melnig, N.Foca, L.Obreja, D. Pricop Size-controled synthesis of

monodisperse platinum nanoparticle by sonoelectrochemical methods. 3-rd

International Confertence „ Biomaterials & Medical Devices” BioMed 2008,

13-16 november 2008 Bucuresti

Participări cu poster

1. L. Tarțău, D. Bîndar, V. Melnig The effect of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice,The 23rd

ECNPCongres, Amsterdam, The Netherlands, 28 august-1 september 2010

(poster).

2. L. Tarțău, R.V. Lupusoru, D. Bîndar, C. Lupusoru, V Melnig Experimental

researches on the effects of tramadol soft vesicles in a somatic pain model in

mice „Inovation through nanotechnhology and nanomaterials”Dresden 22-24

April 2010 (poster).

3. D. Bîndar, A. Garlea, L. Tartau, V. Melnig, Design of magnesium chloride

soft vehicle carrier, 12th International Magnesium Symposium, Iasi 22-25

septembrie 2009 (poster).

4. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarţău, A.Chiriac, L Nită, V Melnig, Eeffect of

acetaminophen soft matter vesicles carrier in a somatic pain model in mice

The 15 th International Scientific Conference Land Force Academy 26-28

November 2009 Sibiu (poster).

5. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarțău, A. Chiriac, L. Niță, V. Melnig, Soft vesicle

carrier containing magnesium chloride self-assemble characterization,

NanoRomania International Workshop Iasi, 2-5 iunie 2009 (poster).

6. A. Gârlea, D. Pricop, V. Melnig, M. I. Popa, Paracetamol Nanocontainers

Obtained in Cationic Polymer-Surfactant Self-Assembling Matrices, 8th

International Conference on Physics of Advanced Materials, Iasi, 4-7 iunie,

2008 (poster).

25

7. L.Tarțău, D.Bîndar, V.Melnig, Mophologic analysis and in vivo subacute

toxicity evolation of nano-vesicles encapsulating the k-opioid agonist U50488,

1-er Colloque Franco-Romain de Chimie Medicinale, Iasi 07-08 oct 2010

(poster)

8. M. Viorel, Ș. Marius, H. Lucian, M. Mihășan, C. Irina, D.Pricop, Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in

Poly(amide-hydroxyurethane) media. Al III-lea Congres Internaţional şi a

XXIX-a sesiune anuală a S.R.B.C., 8-12 iunie 2011, Arad

9. D. Bîndar, L. Tarțău, A. Gârlea, L. Niță, V. Melnig, Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice, National

Conference on Biophysics, Cluj-Napoca, 1-3 octombrie 2009 (poster).

10. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarţău, A. Chiriac, L. Niţă, V. Melnig, Soft vesicle

carrier containing magnesium chloride self-ansamble characterization,

Romanian Society of Pure and Applied Biophysics (RSPAB), Xth edition.

Cluj Napoca 1-3 october 2009 (poster).

11. A. Cazacu, L. Ursu, D. Pricop, L. Hrițcu, S. Marius, V. Melnig, Silver

nanoparticles plasmon – resonant applications in biological microscopy,

Conferinţa Naţională de Fizică CNF 2010 - Iaşi 23-25 septembrie 2010,

Rezumatele Lucrarilor p.174 (poster)

12. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarțău, A. Chiriac, V. Melnig, Efectele

acetaminofenului transportat in vezicule moi in modelul somatizari durerii la

soareci, 21-22 octombrie 2009, Bucuresti (prezentare poster)

Contract de cercetare

PN II Idei cod 1996 nr. 509/2008: Sinteza in conditii blande prin

nanodimensionarea particulelor metalice in matrice de copolimeri bloc amfifilici

de nanoparticule active biologic - platforme in bioinginerie

26

Bibliografie selectivă

1. D.D. Lasic, Elsevier, New York, 1998. 2. El-Sayed, I. H.; Huang, X.; EL-Sayed, M. A. Nano letters, 5, 821, 2005 3. Mie G (1908) Ann Phys 25:377 4. El-Sayed MA (2001) Acc Chem Res 34:257 5. Kreibig U, Vollmer M (1995) Optical properties of metal clusters, Vol. 25. Springer,

Berlin

6. P. Buseck, J. M. Cowley, L. Eyring eds., High resolution transmission electron microscopy and associated techniques, New York, London, Amsterdam, Oxford

University Press 1988).

7. Douglas B. Murphy Fundamentals Of Light Microscopy And Electronic Imaging, a John Wiley & Sons, Inc., Publication.

8. D. Cullity, Elemnts of X-Ray Diffraction, Reading, Addison-Wesley Publishing Co. Inc., 1978.

9. J. P. Glusker, M. Lewis, M. Rossi, Crystal Structure Analysis for Chemists and Biologists, VCH Publishers, New York, 1994.

10. R. Griffiths, J. A. De Haseth, Fourier Transform Infrared Spectrometr, Wiley, N York, 1986

11. J. R. Ferraro, K. K. Krishnan, Practical Fourier Transform Infrared Spectroscopy: Industrial and Laboratory Chemical Analysis, Academic Press, San Diego, 1990.

12. R. K. Poole, Uldis Kalnenieks (2000) Introduction to light absorption: visible and ultraviolet spectra, în Michael. G. Gore (ed.), Spectrophotometry and

Spectrofluorimetry Oxford University Press

13. Gârlea, A., M.I. Popa, V. Pohoaţă, V. Melnig, Ibuprofen/ketoprofen entrapment in chitosan based vesicle carrier, Rom. J. Biophys, 2007, 17, 157-168.

14. Daniela Bîndar, Ana Garlea, Liliana Tartău, Viorel Melnig, Design of magnesium chloride soft vehicle carrier, Magnesium Research 22(3) 2009, p. 185S, ISSN 0953-

15. Tarţău L., Lupuşoru C.E., Bîndar Daniela, Melnig V., Biocompatibility investigation and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles, Annals of the

Romanian Society for Cell Biology, Volume XVIII, Issue 2, December 2010

16. Sánchez-Carpena, J., Domínguez-Hervella, F., García, I., Gene, E., Bugarín, R., Martín, A., Tomás-Vecina, S., García, D., Serrano, J.A., Roman, A., Mariné M,

Mosteiro ML. Comparison of intravenous dexketoprofen and dipyrone in acute renal

colic. Eur J Clin Pharmacol. 63 (8):751-60, 2007

17. Zippel, H, Wagenitz, A., A multicentre, randomised, double-blind study comparing the efficacy and tolerability of intramuscular dexketoprofen versus diclofenac in the

symptomatic treatment of acute low back pain. Clin Drug Investig, 27 (8):533-43,

2007.

18. Jiménez-Martínez, E., Gasco-García, C., Arrieta-Blanco, J.J., Gomez del Torno, J., Bartolome Villar, B.. Study of the analgesic efficacy of Dexketoprofen Trometamol

25mg. vs. Ibuprofen 600mg. after their administration in patients subjected to oral

surgery. Med Oral, 9 (2):143-8, 138-43, 2004.

19. L.Tartau, D. Bindar,V.Melnig, The effects of ketoprofen and dexketoprofen soft matter vesicles in an experimental pain model in mice, European Neuropsychopharmacology,

Vol 20 S.3- Papers of the 23rd ECNP Congress,p. S276, ISSN 0924-977X

20. Obreja, l., Foca, N., Popa, M. I., Melnig, V., Analele Univ. Al. I. Cuza, 7, 2008, p. 31.

21. Cismaru, l., Hamaide, T., Popa, M., Materiale Plastice, 44(3), 2007, p. 243.

27

22. Laura Obreja, Daniela Pricop, Neculai Foca, Viorel Melnig, Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods, Materiale Plastice, 47 (1) pg.42-47 2010

23. Obreja, L., Foca, N., Popa, M. I., Melnig, V., Analele Univ. Al. I. Cuza, 7, 2008, p. 3

Obreja L, Dorohoi DH, Melnig V, Foca N, Nastuta A (2008)

Poly(amidehydroxyurethane) templated Fe3O4 and Ag nanoparticles galvanostatic

assay synthesis. Mater Plast 3: 261-2641

24. Melnig, V., Ciobanu, C., J Optoelectron Adv Mater, 7(6), 2005, p. 2809.

25. Ana Cazacu, Daniela Bîndar, Liliana Tarțău, Lucian Hrițcu, Marius Ștefan, Loredana

Niță, Cezar Ionescu, Valentin Nica, George Rusu, Marius Dobromir, Viorel Melnig

(2011): Effect on nerve structures of functionalized gold-chitosan nanoparticles

obtained by one pot synthesis. Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan

Cuza, Secțiunea Genetică și Biologie Moleculară, XII(1), pg.45-51

26. Bîndar Daniela, Cezar Ionescu , V. Melnig, Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions, J. Colloid.

Interf. Sci. (trimisă spre publicare)

27. M. Baia, F. Toderas, L. Baia, J. Popp, S. Astilean, Chem. Phys. Letters 422, 127, 2006

28. Panacek A, Kevitek I, Prucek, R, Kolar M, VecerovaR, Pizorova M, Sharma VK,

Nevena T, Zeboril R. Silver colloid nanoparticles: synthesis,characterization, and their

antibacterial activity

29. Ming-Hua Hoa, Pei-Yun Kuoa, Hsyue-Jen Hsieha, Tzu-Yang Hsienb, Lein-Tuan

Houc,Juin-Yih Laid, Da-Ming Wanga, Preparation of porous scaffolds by using freeze-

extraction and freeze-gelation methods Biomaterials 25 (2004) 129–138)

30. L.D. Burke, A.M. O'Connell, A.P. O'Mullane, J. Appl. Electrochem. 33 (2003) 1125.

31. B. Bozzini, G. Giovannelli, S. Natali, Scr. Mater. 43 (2000) 877.

32. O'.M. Bockris, Z. Minevski, Int. J. Hydrogen Energy 25 (2000) 747.

33. J. Das, S. Patra, H. Yang, Chem. Commun. (2008) 4451

34. Hyun Ju Kang, Srikanta Patra, Jagotamoy Das, Abdul Aziz, Jinkyung Jo, Haesik Yang

Effect of aging on the electrocatalytic activity of gold nanoparticles H.J. Kang et al. /

Electrochemistry Communications 12 (2010) 1245–1248

35. Lucian Hritcu; Marius Stefan; Daniela Pricop; Anca Neagu; Marius Mihasan; Liliana

Tartau; Viorel Melnig, Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate LPS -

induced toxicity after repeated administration in laboratory rats - trimisa spre publicare

in Materials Science and Engineering C.

36. D. Pricop, M. Ștefan, M. Mihasan, L. Hriţcu, R. Olariu, V. Melnig, Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis, The 16th

International Conference the Knowledge-Based Organization: Applied Technical

Sciences and Advanced Military Technologies, November 25-27 2010, Sibiu,

Romania, Conference Proceedings Book Series: Knowledge Based Organization

International Conference Volume: 7, ISSN 1843-6722. ISI Thomson Reuters

Conference Proceedings Citation Index

37. Garner J.P., Mason G.J., Behav Brain Res. 2002; 136(1):83–92.

38. L. Hritcu, A. Ciobica, L. Gorgan, 2009, Nicotine-induced memory impairment by

increasing brain oxidative stress. Cent. Eur. J. Biol., 4(3), 335–342.

http://admin-apps.webofknowledge.com/JCR/JCR?RQ=RECORD&rank=1&journal=J+COLLOID+INTERF+SCIhttp://admin-apps.webofknowledge.com/JCR/JCR?RQ=RECORD&rank=1&journal=J+COLLOID+INTERF+SCIhttp://thomsonreuters.com/products_services/science/science_products/a-z/conf_proceedings_citation_index