ribosomul, biosinteza si destinatia finala a proteinelor

Dr. Mircea Leabu, Ribosomul; biosinteza şi destinaţia intracelulară a proteinelor

1

Ribosomul

Definiţia ribosomului şi semnificaţia biologică a funcţiei ribosomale Ribosomul este un organit celular, nedelimitat de endomembrană, cu o geometrie sferoidală (diametrul de ~20nm), format din două subunităţi ribonucleoproteice (o subunitate mare, respectiv o subunitate mică), având ca rol biosinteza de proteine. Biosinteza oricărei proteine începe în citosol, indiferent care este locaţia şi/sau destinaţia finală a acesteia (vezi mai jos comentariile referitoare la destinul proteinelor nou sintetizate). Proteinele sunt componentele moleculare care fac ca informaţia genetică să capete semnificaţie funcţională. Proteinele sunt principalii efectori la nivelul oricărui proces celular. Inclusiv procesele prin care informaţia genetică este conservată, transmisă, sau ajunge să fie folosită (replicare, transcriere, traducere) sunt efectuate, sau dependente de proteine. Aşadar, producerea de proteine, adică funcţia ribosomală este esenţială pentru existenţa şi funcţionarea celulelor. Există proteine care sunt produse constitutuiv în celulă, dar şi proteine care sunt produse numai atunci când nevoile o impun. Chiar şi pentru proteinele care sunt produse constitutiv, nivelul lor de exprimare poate varia ca urmare a unor continue schimbări în cantitatea de care celula are nevoie la un moment dat. În plus, spectrul de proteine necesar activităţii normale a celulelor depinde de la un tip la altul de celulă, reprezentând ceea ce numim fenotipul celular. Această variabilitate în tipurile de proteine exprimate de diferitele tipuri celulare este rezultatul procesului de diferenţiere celulară. Mai mult, bagajul de proteine al unei celule (tipuri/cantitate) este în continuă dinamică impusă de adaptarea celulei la condiţiile în care se află. Asta înseamnă că funcţia ribosomului trebuie să fie riguros controlată şi modulată. Prin aceasta celula îşi asigură în permanenţă echilibrul adecvat al bagajului proteic necesar adaptării la situaţiile impuse de ansamblul mesajelor interne şi externe pe care le primeşte, sau şi le construieşte. Organizarea ultrastructurală şi moleculară a ribosomului Aşa cum s-a amintit încă de la discuţia generală asupra celulei (din Introducere), ribosomul este un organit comun procariotelor şi eucariotelor. Mai mult, organizarea ultrastructurală este asemănătoare la ambele tipuri de celule: o subunitate mică şi o subunitate mare. Ambele subunităţi sunt complexe ribonucleoproteice. Aceste subunităţi se asociază numai în momentul exercitării funcţiei ribosomului şi se disociază atunci cînd producerea de proteină se opreşte. Aici însă asemănările dintre ribosomii procariotelor şi eucariotelor se cam termină. Detaliile ultrastructurale şi ale organizării moleculare ale ribosomului evidenţiază diferenţe la cele două tipuri celulare. Să le parcurgem pe rând, într-o ordine care ţine de descrierea tot mai amănunţită. Subunităţile ribosomale au constante de sedimentare mai mici la procariote decât la eucariote. Adică, subunitatea mică la procariote are o constantă de sedimentare în câmp centrifugal de 30S1, iar cea a ribosomilor eucariotelor de 40S. Subunitatea mare a ribosomului este de 50S la procariote, respectiv 60S la eucariote. Ribosomul funcţional, adică complexul format prin asocierea celor două subunităţi are 70S la procariote şi 80S la eucariote. În privinţa maselor moleculare ale complexelor ribonucleoproteice care formează subunităţile acestea sunt, în kDa:

1. pentru subunităţile mici 900 la procariote şi 1400 la eucariote; 2. pentru subunităţile mari 1600 la procariote şi 2800 la eucariote; 3. pentru ribosomii funcţionali 2500 la procariote, respectiv 4200 la eucariote, evident mărimi

aditive, ceea ce nu se observă şi în privinţa constantelor de sedimentare, dovedind că asamblarea se face cu rearanjări conformaţionale.

1 S este simbolul unei unităţi de masură a coeficienţilor de sedimentare în câmp centrifugal, numită svedberg, după numele chimistului

suedez, Theodor Svedberg. Svedbergul este o unitate de măsură din afara sistemului internaţional de unităţi şi este egal cu 10-13 secunde (100fs, adică 100 femtosecunde). Theodor Svedberg (1884 – 1971) şi-a desfăşurat activitatea la Universitatea din Uppsala. El a fost laureat cu Premiul Nobel pentru chimie în 1926, ca apreciere a lucrărilor sale în chime coloidală şi pentru inventarea centrifugii. Motivaţia juriului a sunat laconic: "for his work on disperse systems".


2

Caracteristicile fizico-chimice menţionate mai sus, sunt motivate de organizarea moleculară diferită a ribosomilor în cele două tipuri celulare. Astfel, subunitatea mică a ribosomilor din procariote conţine o singură moleculă de acid ribonucleic ribosomal (ARNr) de 1540 nucleotide (constantă de sedimentare 16S) şi 21 de proteine. Subunitatea mică a ribosomilor eucariotelor conţine tot o moleculă de ARNr, dar mai mare (1900 nucleotide, 18S) şi mai multe proteine (cel puţin 33). Subunitatea mare a ribosomilor procariotelor conţine 2 molecule de ARNr (120 nucleotide/5S, respectiv 2900 nucleotide/23S), la care se adaugă 34 proteine, în timp ce subunitatea mare a ribosomilor eucariotelor conţine 3 molecule de ARNr (120 nucleotide/5S, 160 nucleotide/5,8S, respectiv 4700 nucleotiode/28S) şi cel puţin 49 de proteine. Anticipăm, ceea ce aici poate părea speculativ, că organizarea moleculară mai complexă a ribosomului eucariotelor permite şi modularea şi/sau controlul funcţiei sale mult mai nuanţate, mai potenţate. Acest lucru atrage un avantaj pentru celulă în sensul creşterii capacităţii de a modula bagajul proteic şi, prin aceasta, de a se adapta mai eficient la o diversitate de condiţii care pot varia în intervale mai largi sau mai înguste. La microscopul electronic, ribosomul funcţional al celulei eucariote se observă ca o structură granulară, electrono-opacă, sferoidală cu diametrul de 20-22nm. Când secţiunile ultrafine trec prin celulă favorabil se poate sesiza că ribosomii sunt distribuiţi în grupe cu dispoziţie spiralată. Aceste grupuri au fost denumite poliribosomi (vezi mai jos explicaţia acestei stări de fapt). Descrierea de principiu a corelaţiei structură-funcţie la nivelul ribosomului Funcţia ribosomului este aceea de biosinteză a proteinelor. Aşadar, funcţia ribosomului este un proces complex ce poate fi asemănat cu orice activitate productivă. Ei bine, pentru a produce ceva este nevoie de un proiect de execuţie a procesului, o instalaţie care să realizeze etapele procesului de producere şi de materia primă necesară producerii acelui ceva. În biosinteza proteinelor proiectul este reprezentat de molecula de acid ribonucleic mesager (ARNm), purtătorul informaţiei pe baza căreia se biosintetizează proteina. La nivelul lanţului unui ARNm informaţia pentru fiecare aminoacid din structura proteinei, al cărei proiect este, se află sub forma unui triplet de nucleotide denumit codon. Totalitatea codonilor formează codul genetic, iar semnificaţia lor este prezentată în Tabelul I. Se observă la analiza datelor din tabel că există numai doi aminoacizi care au câte un singur codon: metionina şi triptofanul. Mai mult, codonul metioninei, AUG, are şi semnificaţia START al traducerii, atunci când apare pentru prima dată în secvenţa ARNm. Numărul maxim de codoni pentru un aminoacid este de 6, ca în cazul argininei, leucinei şi serinei. Codul genetic este definit mai elaborat ca setul de reguli după care informaţia codificată în materialul genetic este decodificată şi tradusă din limbajul nucleotidelor (aşa cum se află în ADN şi ARN) în limbajul aminoacizilor, adică la proteine, care sunt efectorii acelei informaţii. Trebuie făcută menţiunea că regulile ce formează codul genetic nu se aplică secvenţelor reglatorii de la nivelul genelor. Codul genetic este degenerat, sau redundant în sensul că un aminoacid poate fi codificat de mai mulţi codoni. Degenerarea nu este biunivocă, adică reciproca afirmaţiei din fraza anterioară nu este adevărată. Un codon nu poate codifica mai mulţi aminoacizi. Aceasta înseamnă lipsă de ambiguitate în codul genetic. Aşadar, codul genetic este degenerat, dar nu ambiguu. Înşiruirea codonilor determină secvenţa de aminoacizi a proteinei. ARNm din celulele eucariote are o structură specifică prin care se închide într-o buclă. Lipsa capetelor libere, rezultată prin închiderea ARNm în această buclă îi asigură rezistenţă împotriva degradării. Bucla se formează prin ataşarea capului 5’ al ARNm (care se termină cu un „capac” format dintr-un 7metil-guanozino-trifosfat) la capătul 3’ al lanţului polinucleotidic (format dintr-o structură poliadenilică ce conţine 150 – 250 nucleotide adenilice). La stabilizarea acestei interacţiuni participă şi o serie de proteine care, în acelaşi timp, sunt factori de control şi modulare a iniţierii biosintezei proteinelor.


3

Tabelul I. Semnificaţia informaţională a celor 64 de codoni ai codului genetic. Corespondenţa în aminoacizi pentru 61 dintre codoni, trei fiind codoni nonsens, reprezentând codonii STOP. Semnificaţia culorilor: portocaliu – hidrofob/nepolar; roşu – pozitiv/bazic; albastru – negativ/acid; bleu – hidrofil.

A doua bază A C G U

A

AAA (Lys/K) lizină

AAC (Asn/N) asparagină

AAG (Lys/K) lizină

AAU (Asn/N) asparagină

ACA (Thr/T) treonină

ACG (Thr/T) treonină

ACU (Thr/T) treonină

ACC (Thr/T) treonină

AGA (Arg/R) arginină

AGC (Ser/S) serină

AGG (Arg/R) arginină

AGU (Ser/S) serină

AUA (Ile/I) izoleucină

AUC (Ile/I) izoleucină

AUG * (Met/M) metionină

AUU (Ile/I) izoleucină

C

CAU (His/H) histidină

CAC (His/H) histidină

CAA (Gln/Q) glutamină

CAG (Gln/Q) glutamină

CCA (Pro/P) prolină

CCC (Pro/P) prolină

CCG (Pro/P) prolină

CCU (Pro/P) prolină

CGA (Arg/R) arginină

CGC (Arg/R) arginină

CGG (Arg/R) arginină

CGU (Arg/R) arginină

CUA (Leu/L) leucină

CUC (Leu/L) leucină

CUG (Leu/L) leucină

CUU (Leu/L) leucină

G

GAA (Glu/E) acid glutamic

GAC (Asp/D) acid aspartic

GAG (Glu/E) acid glutamic

GAU (Asp/D) acid aspartic

GCA (Ala/A) alanină

GCC (Ala/A) alanină

GCG (Ala/A) alanină

GCU (Ala/A) alanină

GGA (Gly/G) glicină

GGC (Gly/G) glicină

GGG (Gly/G) glicină

GGU (Gly/G) glicină

GUA (Val/V) valină

GUC (Val/V) valină

GUG (Val/V) valină

GUU (Val/V) valină

Prima bază

U

UAU (Tyr/Y) tirozină

UAC (Tyr/Y) tirozină

UAA (STOP)

UAG (STOP)

UCA (Ser/S) serină

UCC (Ser/S) serină

UCG (Ser/S) serină

UCU (Ser/S) serină

UGA (STOP)

UGC (Cys/C) cisteină

UGG (Trp/W) triptofan

UGU (Cys/C) cisteină

UUA (Leu/L) leucină

UUG (Leu/L) leucină

UUU (Phe/F) fenilalanină

UUC (Phe/F) fenilalanină

* Codonul AUG reprezintă codonul START la prima apariţie în ARNm (de aceea este în verde, semnificaţie: cale liberă), apoi codifică metionina. ARNm conţine (Fig. X), în afară de secvenţa de nucleotide formată din codonii ce semnifică aminoacizii ce vor intra în structura primară a proteinei, două porţiuni necodificatoare către cele două capete (5’, respectiv 3’), notate cu 5’UTR (regiunea dinspre capătul 5’, dinaintea codonului START) şi 3’UTR (regiunea de după codonul STOP, până la structura poliadenilică de la capatul 3’). UTR reprezintă abrevierea sintagmei englezeşti untranslated region. Aceste regiuni necodificatoare sunt implicate în controlul, reglarea şi modularea funcţiei şi vieţii ARNm. De exemplu, porţiunea 3’UTR este zona de interacţiune a ARNm cu microARN (abrevierea interanţională miRNA). Legarea miRNA la 3’UTR atrage o mai rapidă deadenilare a structurii poliadenilice şi grăbirea degradării ARNm prin ribonucleaze.


4

Instalaţia utilizată de celule pentru producerea proteinelor este ribosomul care se formează prin asocierea unei subunităţi mici cu una mare, în momentul în care un ARNm trebuie tradus în lanţ polipeptidic. Detalii asupra organizării molecular-spaţiale a ribosomului vor fi discutate puţin mai jos. Materia primă este reprezentată de complexe formate de acizii ribonucleici de transfer (ARNt2) cu aminoacizii. ARNt la eucariote, indiferent de aminoacidul pe care îl poartă, este un polinucleotid ce conţine ~80 (de regulă între 74 şi 95) nucleotide, astfel organizat spaţial încât structurează 4 regiuni în dublu helix, intercalate cu trei bucle cu nucleotide neîmperechiate. Datorită acestei organizări este comparat cu o frunză de trifoi. Dintre cele trei bucle, una este denumită buclă anticodon, deoarece conţine anticodonul, o a doua este denumită bucla D, iar cea de-a treia este denumită bucla T. Capetele 5’ şi 3’ ale ARNt formează dublul helix în ceea ce ar putea fi considerată zona peţiolului frunzei, dar defazat, capătul 3’ rămânând neîmperecheat şi terminându-se cu tripletul CCA. Aminoacidul corespunzător anticodonului este legat la adenina nucleotidului terminal, prin gruparea carboxilică. Structura tridimensională a ARNt reprezintă o asemenea împachetare a moleculei astfel încât are aspectul literei L cu bucla anticodon la capatul unui braţ al lui L (aşadar accesibilă interacţiunii cu codonul din ARNm), iar aminoacidul ataşat expus la capătul celuilalt braţ al lui L (accesibil, de fapt, sitului din ribosom care catalizează formarea legăturii peptidice necesare în alungirea lanţului polipeptidic, adică legătura ce se formează în procesul de translaţie). Deoarece codul genetic este degenerat, rezultă că pot exista mai mulţi ARNt pentru acelaşi aminoacid. Bagajul maxim de tipuri de ARNt dintr-o celulă poate fi de 61 (deoarece trei din cele 64 de variante posibile de codoni, vezi Tabelul I, sunt codoni nonsens, adică acei codoni care semnifică terminarea procesului de translaţie). În realitate nu toate celulele conţin toţi cei 61 de ARNt. Acest lucru se datorează faptului că primul nucleotid din anticodon este unul modificat (inozină, sau pseudouridină). Aceste nucleotide neuzuale se caracterizează prin uşurinţa cu care se împerechează cu mai multe tipuri de nucleotide din codon, fără afectarea procesului de translaţie. Fenomenul se numeşte împerechere tremurată/ezitantă a bazelor („wobble base pairing”) şi are ca efect capacitatea aceluiaşi ARNt de a se ataşa la mai mulţi codoni ai aminoacidului pe care îl poartă, chiar dacă nu la toţi. Altfel spus indiferent care ar fi codonul din ARNm coresounzător unui anumit aminoacid, anticodonul cu prima bază modificată face o identificare corectă. Asta înseamnă că celula poate utiliza toţi codonii, chiar dacă nu are toţi ARNt corespunzători. Aşadar, procesul de biosinteză a proteinelor înseamnă o utilizare a informaţiei genetice înmagazinată, sub formă de codoni din ARNm, cu trecerea ei de la limbajul nucleotidelor la limbajul aminoacizilor, fenomen denumit translaţie (termen introdus în biologie cu sensul de traducere, pentru o mai mare asemănare cu noţiunea englezească). Producerea oricărei proteine dintr-o celulă este rezultatul unei traduceri a unui ARNm. Să revenim acum la descrierea ribosomului, instalaţia care realizează procesul de biosinteză a proteinelor în celulă. În organizarea spaţială a ribosomului, rezultată prin asocierea funcţională a celor două subunităţi, se definesc 4 elemente structurale ce se constituie prin apoziţii adecvate ale unor suprafeţe şi/sau spaţii ale subunităţilor, elemente care asigură funcţionalitatea organitului:

1. un canal pentru acomodarea lanţului acidului ribonucleic mesager; acest canal se formează prin contribuţia unor şanţuri din structura fiecărei subunităţi;

2. un sit A obţinut prin corecta poziţionare la nivelul ribosomului a două spaţii ale subunităţilor mare, respectiv mică; acest sit este cel care primeşte, ca urmare a unei interacţiuni de mare specificitate între codonul din ARNm şi anticodonul din ARNt, acidul ribonucleic de

2 Mai puţin utilizată pentru ARNt este şi denumirea de acid ribonucleic de transport. Această denumire poate fi justificată de faptul că

ARNt transportă aminoacidul din citosol la nivelul sitului corespunzător al ribosomului. Denumirea larg utilizată este însă acid ribonucleic de transfer implicând faptul că odată ataşat la ribosom, aminoacidul din complexul aminoacil-ARNt primeşte prin transfer, la gruparea amino, lanţul polipeptidic în curs de formare, poziţionat într-un alt sit din organizarea spaţială a ribosomului.


5

transport, care poartă aminoacidul (N.B. pentru uşurarea reţinerii: sit A cu A de la aminoacid);

3. un sit P format prin poziţionarea adecvată a unor alte spaţii din subunităţile mică, respectiv mare; acest sit acomodează ARNt care poartă lanţul polipeptidic în alungire; pe masură ce lanţul polipeptidic creşte este împins în afară, depăşind limitele ribosomului (sit P, cu P de la peptid);

4. un sit E (E de la „exit”) în care ajunge ARNt din situl P, după ce pierde lanţul peptidic în curs de alungire, prin transferul către aminoacil-ARNt din situl A; ajuns aici interacţiunea ARNt liber (necomplexat cu peptidul în creştere) cu componentele moleculare care organizează suprefeţele spaţiului sitului E devin atât de slabe încât ARNt liber părăseşte ribosomul ajungând în citosol, de unde poate intra într-un nou ciclu prin recomplexare cu aminoacidul specific.

O înţelegere mai completă a legăturii dintre modul în care ribosomul este organizat şi modul în care el funcţionează va fi asigurată prin descrierea procesului de biosinteză a proteinelor. Biosinteza proteinelor Biosinteza proteinelor este un fenomen celular ce se desfăşoară la nivelul ribosomilor şi are trei etape:

1. Etapa de iniţiere, prin care la capătul 5’ al ARNm se leagă un complex pe care îl formează subunitatea mică a ribosomului cu un factor de iniţiere şi ARNt ce poartă aminoacidul corespunzător codonului START;

2. Etapa de elongare, care se desfăşoară ciclic (având trei paşi) şi este asigurată de asamblarea ribosomului (cuplarea celor două subunităţi) la nivelul codonului START; numărul de cicluri depinde de lungimea lanţului polipeptidic codificat de ARNm;

3. Etapa de terminare, care se petrece atunci când ribosomul întâlneşte unul dintre codonii STOP, favorizându-se eliberarea lanţului polipeptidic format.

Să încercăm în cele ce urmează să detaliem evenimentele ce se petrec în fiecare etapă a biosintezei proteinelor. Etapa de iniţiere este un proces selectiv şi riguros reglat [1, 2], care presupune interacţiunea dintre ambele capete ale buclei de ARNm şi complexul de iniţiere, format de subunitatea mică a ribosomului cu ARNt purtând metionina, ataşat la suprafaţa corespunzătoare sitului P şi cu factorul de iniţiere eucariotic eIF-2 (eIF de la eucariotic Initiating Factor), care este un comutator molecular, adică o proteină monomerică ce prezintă activitate GTP-azică (o GTP-ază mică). Acest complex de iniţiere se află în stare activată, deoarece eIF-2 poartă GTP. Interacţiunea complexului de iniţiere cu ARNm aflat sub formă închisă (capătul 5’ ataşat la capătul 3’) este favorizată de alţi doi factori de iniţiere eucariotici, eIF-4E şi eIF-4G, care asigură şi formarea buclei ARNm. Mai departe, etapa de iniţiere presupune glisarea subunităţii mici care poartă ARNt-metionina şi eIF-2/GTP (complexul de iniţiere) de-a lungul ARNm, către capătul 3’, până întâlneşte codonul corespunzător metioninei (AUG), numit codon START la prima apariţie. Ataşarea fermă codon-anticodon este însoţită de hidroliza GTP (de pe eIF-2) la GDP şi de eliberarea acestui factor de iniţiere din structura complexului de iniţiere. Ieşirea eIF-2 din complexul de iniţiere crează premizele formării ribosomului funcţional prin ataşarea subunităţii mari. Formarea ribosomului determină structurarea celor trei situri A, P (ocupat în această fază de ARNt-metionină) şi E. Asamblarea ribosomului reprezintă finalizarea etapei de iniţiere şi trecerea la etapa de elongare. Etapa de elongare spuneam că este una ciclică având trei paşi. Primul pas este legarea aminoacil-ARNt corespunzător codonului următor din structura ARNm la nivelul sitului A abia format. Controlul calităţii acestei interacţiuni aminoacil-ARNt-codon este asigurat de un factor de elongare, EF1 (cu EF de la Elongation Factor). EF1 este tot un comutator molecular (GTP-ază


6

mică) ce complexează aminoacil-ARNt în forma activată (conţinând GTP). După stabilirea interacţiunii codon-anticodon corespunzătoare, GTP este hidrolizat la GDP, EF1 se eliberează de la nivelul ribosomului şi se trece la pasul 2 al etapei de alungire. Acesta este reprezentat de transferul metioninei de pe ARNt din situl P, la gruparea amino a aminoacidului de pe ARNt din situl A, dacă ne aflăm în primul ciclu al alungirii (în cazul că ne aflăm în ciclurile mai avansate, ARNt din situl P poartă un peptid, iar transferul se realizează pentru acest peptid). Reacţia de transfer, denumită activitate peptidil-transferazică, este asigurată (cel puţin după cum a fost dovedit la procariote) chiar de ARNr de la nivelul subunităţii mari a ribosomului. Acest gen de activitate enzimatică, identificată la ARNr a fost denumită activitate ribozimică, iar la procariote este asigurată de ARNr de 23S [3, 4]. Transferul este însoţit de culisarea subunităţii mari a ribosomului pe lungimea unui codon, către capătul 3’ al ARNm (dezorganizând structura ribosomului şi afectând organizarea corectă a celor trei situri funcţionale, deoarece subunitatea mică rămâne în urmă). Pe de altă parte, la nivelul ribosomului astfel dezorganizat se ataşază factorul de elongare EF2 (tot o GTP-ază mică). Culisarea subunităţii mari cu un codon aşează ARNt, rămas fără metionină, din situl P în situl E, de unde este eliberat. Pasul trei al etapei de elongare este asigurat de folosirea energiei eliberate de EF2, prin scindarea GTP la GDP şi fosafat. Această energie contribuie la aducerea subunităţii mici a ribosomului în poziţia corectă pentru refacerea siturilor funcţionale A, P şi E. În acest fel structura ribosomului este refăcută, şi următorul ciclu poate începe. Etapa de terminare este indusă de ajungerea ribosomului, cu situl A corect structurat, la nivelul unui codon STOP. În această situaţie situl A este ocupat de factorul de eliberare, care este o proteină a cărei conformaţie mimează organizarea în L a unui aminoacil-ARNt, iar transferul ca urmare a activităţii ribozimice reprezintă de fapt adăugarea unui hidroxil la capătul carboxi-terminal al polipeptidului, cu eliberarea acestuia de la nivelul ribosomului. Cu toate siturile funcţionale neocupate, ribosomul se desface, subunităţile, mare, respectiv mică detaşându-se de pe ARNm. Cele descrise mai sus reprezintă evenimente de la nivelul unui singur ribosom. În realitate, pe un ARNm intrat în procesul de translaţie, operează simultan, dar defazat mai mulţi ribosomi, organizând intracelular ceea ce se numeşte poliribosom. Formarea poliribosomilor permite producerea simultană a mai multor unităţi proteice de acelaşi fel, aşadar eficientizarea procesului de biosinteză. Este uşor de înţeles, intuitiv, că numărul de ribosomi de la nivelul unui poliribosom este cu atât mai mare cu cât lungimea proteinei codificate de ARNm corespunzător este mai mare. Dată fiind importanţa bagajului de proteine în funcţionarea celulei, este evident ca biosinteza acestor macromolecule poate reprezenta o ţintă terapeutică. Există o serie de antibiotice care acţionează prin interferarea cu calea de producere a proteinelor. Deoarece există diferenţe de detaliu între producerea de proteine în celulele eucariote, faţă de procesul de la nivelul procariotelor, antibioticele care afectează producerea de proteine numai la procariote sunt utilizate în tratamente antibacteriene. Enumerăm câteva, specificând nivelul la care acţionează:

- rifamicina se leagă de ARN-polimerază, prevenind sinteza de ARN; - streptomicina blochează trecerea de la etapa de iniţiere la cea de elongare inducând şi greşeli

de decodare; - tetraciclina împiedică legarea aminoacil-ARNt la situl A din ribosom (blochează pasul 1 al

elongării); - cloramfenicolul acţionează în pasul 2 al alungirii, blocând reacţia peptidil-transferazică; - eritromicina împiedică culisarea ribosomului pe ARNm, adică blochează pasul 3 al elongării.

Există însă şi antibiotice cu acţiune atât asupra procariotelor, cât şi asupra eucariotelor, dar şi antibiotice care acţionează numai asupra biosintezei proteice în eucariote. Din prima categorie amintim:

- actinomicina D, care previne sinteza de ARN, interacţionând cu ADN şi blocând mişcarea ARN-polimerazei;

- puromicina, care provoacă eliberarea prematură a lanţurilor polipeptidice din ribosom, inserându-se la capătul proteinelor înainte de terminarea translaţiei.


7

Dintre antibioticile ce acţionează numai asupra eucariotelor menţionăm: - -amanitina, care previne sinteza de ARNm, legându-se preferenţial la ARN-polimeraza II şi

inhibându-i funcţia; - anizomicina, care blochează reacţia peptidil-transferazică (împiedică pasul 2 al elongării); - cicloheximida, care blochează pasul 3 al elongării, inhibând culisarea ribosomului pe

ARNm.

Caseta . Antibioticele cu acţiune doar asupra celulelor eucariote nu pot fi utilizate în scop terapeutic, dar sunt deosebit de utile în cercetare, în special pentru studii care urmăresc în ce măsură anumite procese celulare sunt sau nu dependente de sinteza de novo a proteinelor (adică de declanşarea biosintezei unor proteine).

În ceea ce priveşte biosinteza proteinelor, funcţia ribosomului este necesară, dar nu neapărat şi suficientă. Proteinele, ca orice macromoleculă, trebuie să adopte o conformaţie care să le asigure funcţia şi, mai mult, este necesar ca ele să se localizeze în celulă acolo unde trebuie să acţioneze. Celula şi-a creat modalităţi de rezolvare a tuturor acestor probleme. Să prezentăm mai departe aspecte generale legate de aceste fenomene celulare. Împachetarea corectă a proteinelor Ştim de la chimia organică faptul că macromoleculele adoptă conformaţii stabile prin aranjări tridimensionale care să asigure o încărcătură energetică minimă a respectivei entităţi moleculare. Mai mult, există la compuşii macromoleculari cu mase foarte mari posibilitatea de a adopta mai multe conformaţii de minim energetic faţă de cele obţinute prin rearanjări apropiate, chiar dacă aceste conformaţii nu reprezintă minimul energetic absolut dintre conformaţiile pe care respectiva macromoleculă le poate adopta. Aceste aspecte sunt valabile şi pentru proteine. Pe de altă parte conformaţia care asigură forma activă a unei proteine nu trebuie considerată a fi aceea de minim energetic absolut. Acest lucru înseamnă că asigurarea conformaţiilor funcţionale ale proteinelor nou sintetizate reprezintă o problemă pe care celula trebuie să o rezolve eficient, pentru a nu face risipă de forţe şi mijloace. Rezolvarea acestei probleme a fost realizată de celulă prin folosirea unor proteine speciale a căror funcţie este aceea de a asigura asistarea lanţurilor polipeptidice nou produse de a adopta conformaţia corectă, funcţională. Aceste proteine sunt numite şaperone (în englezeşte „chaperone”; conform regulii limbii române prin care cuvintele noi din ştiinţă se introduc la genul neutru, vom vorbi de şaperon la singular şi de şaperone la plural). Dacă veţi verifica semantica termenului englezesc, veţi găsi că este numele purtat de persoane care se îngrijesc de educarea, pentru o comportare corectă în societate, a tinerilor, adică să facă ceea ce trebuie (în Merriam-Webster, definiţia este următoarea: o persoană în vârstă care însoţeşte un tânăr/o tânără la întruniri de societate pentru a asigura comportarea corespunzătoare a acestuia/acesteia). Există totuşi proteine a căror conformaţie, corectă asigurării funcţionalităţii lor, este adoptată spontan (împachetare spontană). Aceste proteine sunt cazuri de şansă, deoarece putem înţelege că asamblarea lor se face prin întâmplarea că interacţiunile intramoleculare care se stabilesc spontan, pe masură ce lanţul polipeptidic se alungeşte în timpul procesului de biosinteză şi părăseşte spaţiul ribosomului, sunt chiar cele care asigură funcţia proteinei respective. Recent au fost identificate, în diferite proteine, secvenţe cu rol în împachetarea lor. Aceste secvenţe au fost numite şaperone intramoleculare [5] şi sunt de tip I şi de tip II. Şaperonele intramoleculare de tip I sunt aflate la capetele N-terminale ale lanţului polipeptidic şi asistă la realizarea structurii terţiare a proteinei. Şaperonele intramoleculare de tip II sunt localizate la capetele C-terminale ale lanţurilor polipeptidice şi sunt, în principal, responsabile de asamblarea structurilor cuaternare. Ambele tipuri de secvenţe nu sunt implicate în funcţia proteinelor şi sunt eliminate prin proteoliză din lanţurile polipeptidice iniţiale, numite propeptide, după definitivarea conformaţiei funcţionale. Evidenţierea acestor secvenţe cu rol de şaperone intramoleculare ne determină să ne punem întrebarea dacă vom mai putea vorbi de o împachetare spontană propriu-zisă a proteinelor. Rămâne


8

însă o întrebare fără răspuns clar, atâta timp cât activitatea secvenţelor cu rol de şaperone intramoleculare a fost dovedită în experimente in vitro şi nu există până în prezent dovezi că lucrurile se petrec la fel in vivo, adică în celule. De regulă, asamblarea conformaţională corectă este asigurată prin asistare (împachetare asistată) realizată de şaperone. Primele şaperone identificate şi descrise au fost cele denumite proteine de şoc termic (abreviat HSP, de la „heat shock protein”). La celulele care erau supuse unor creşteri de temperatură, 40-45oC [vezi minisinteza 6], era amplificată semnificativ exprimarea unor anumite proteine. Ulterior a fost dovedit că aceste proteine se supraexprimau şi la supunerea celulelor la alţi factori de stres şi că erau menite a asigura conformaţia proteinelor celulare în acele condiţii de stres. Proteinele de şoc termic sunt specii moleculare cu mase de la 20 la 110kDa (vezi Tabelul X) şi sunt denumite şi notate după această caracteristică a masei moleculare (de exemplu HSP27, HSP60, HSP70, HSP90). În momentul de faţă cunoaştem mult mai multe şaperone în celulă decât cele reprezentate prin HSP. În sfârşit, există situaţii în celulă când, în ciuda mecanismelor de control şi reglare, proteinele pot eşua în procesul de adoptare a conformaţiei corecte. În această situaţie, intră în acţiune un mecanism de degradare al acestor proteine a căror conformaţie este incorectă, prin intermediul unui organit nedelimitat de membrană, numit proteasom. În cele ce urmează vom detalia aspecte legate de împachetarea proteinelor asistată de şaperone, apoi despre organizarea şi funcţionarea proteasomului.

Tabelul X. Clasificarea proteinelor de şoc termic în funcţie de greutatea moleculară. Sunt prezentate denumirile conform „HUGO Gene Nomenclature Committee”, precum şi denumirile alternative, uzuale, ale unor reprezentanţi din organismele eucariote (albastru indigo) şi ale omologilor lor de la procariote (roşu).

Denumire Greutate moleculară (kDa, valoare aprox.)

Localizare celulară

(la eucariote)

Particularităţi funcţionale (la eucariote)

Familia HSPE HSPE1 (Hsp10, GroES) 10 mitocondrie cofactor al Hsp60

Familia HSPB ≤ 34 HSPB (Hsp27, GrpE) 20-30 citosol/nucleu reglarea creşterii şi diferenţierii

Familia DNAJ/HSP40 35-54 DNAJ (Hsp40, DnaJ) 40 colocalizare specifică

cu partenerul de interacţiune (Hsp70)

cofactor al Hsp70 (reglează activitatea ATP-azică)

Familia HSPD/HSP60 55-64 HSPD1 (Hsp60, GroEL) 60 mitocondrie chaperone molecular implicat în

plierea proteinelor după importul în mitocondrie

Familia HSPA/HSP70 65-80 HSPA1A (Hsp72, DnaK) 70 citosol/nucleu chaperone molecular înalt

inductibil la stres HSPA8 (Hsp73/Hsc70) 70 citosol/nucleu chaperone molecular cu expresie

constitutivă HSPA9 (mtHsp70/Grp75)

70 mitocondrie chaperone molecular cu expresie constitutivă

HSPA5 (BiP/Grp78) 70 reticul endoplasmic chaperone molecular cu expresie constitutivă

Familia HSPC/HSP90 81-99 HSPC (Hsp90, HtpG) 90 citosol/nucleu componentă a receptorului pentru

steroizi Familia HSPH/HSP110 ≥ 110

HSPH2 (Hsp110, ClpA, ClpB)

100 citosol/nucleu chaperone molecular necesar pentru supravieţuirea la stresuri severe


9

Caseta . Descoperirea HSP reprezintă un exemplu de cum o întâmplare „nefericită” poate fi transformată într-un avantaj pentru cunoaşterea ştiinţifică [7]; asta dacă nu este însoţită de o atitudine necorespunzătoare şi nu este înălţată la rang de catastrofă. Povestea ar putea fi şi un exemplu de cât de greu pătrund în literatura de specialitate noutăţile „stranii”, adică o dovadă a cât de conservatori sunt unii membri ai comunităţii ştiinţifice. Despre ce este vorba? La începutul anilor 1960 în laboratorul lui Adriano Buzzati Traverso, de la Institutul de Genetică din Pavia, a fost organizat un curs la care au participat 10 tineri cercetători între care Ferruccio Ritossa, „beneficiarul” întâmplării şi John Pulitzer, Inge Rasmunssen, Clara Ghini şi Giovanni Magni. Careva dintre ultimii patru menţionaţi, a ridicat din greşală sau neatenţie, temperatura incubatorului în care Ritossa îşi ţinea probele de Drosophila. Rezultatul a fost că s-au detectat modificări de exprimare a genelor din cromozomii politeni din celulele glandelor salivare, cu apariţia unor noi molecule de ARN. Cercetătorul nu s-a panicat, nu s-a lamentat ci a încercat să găsească explicaţia fenomenului. A constatat că aceleaşi molecule au fost produse de celule şi după stresuri chimice datorate unor decuplanţi ai ATP-azelor (dinitrofenol sau salicilat) sau după anoxie. A fost elaborată o lucrare, la care Ritossa a fost ajutat de ceilalţi colegi, a căror eroare a dus la descoperire, fără pretenţia de a fi coautori. Lucrarea a fost trimisă la o revistă de prestigiu. A fost respinsă, deoarece a fost considerată „nerelevantă pentru comunitatea ştiinţifică”. Ritossa nu a renunţat, a continuat experimentările în noua direcţie şi a reuşit, în cele din urmă să publice trei lucrări de pionierat în descoperirea HSP [8-10]. Acum putem aprecia cât de „nerelevantă” a fost descoperirea pentru cunoaşterea celulei.

Împachetarea asistată Şaperonele asistă asamblarea proteinelor [11] şi le ajută, în mod activ (adică utilizând energie preluată din hidroliza ATP la ADP şi fosfat) să adopte conformaţia adecvată exercitării funcţiei. Aici vom vorbi de împachetarea asistată doar pentru proteinele a căror biosinteză se definitivează în citosol. Menţionăm acest lucru deoarece, în ciuda faptului că biosinteza tuturor proteinelor dintr-o celulă se iniţiază în citosol, nu întotdeauna se şi finalizează în citosol. Preluarea proteinelor la nivelul organitelor delimitate de endomembrane se face prin mecanisme specifice fie concomitent cu elongarea lor (deci simultan cu biosinteza, cum este în cazul reticulului endoplasmic), fie după finalizarea biosintezei, dar înainte de împachetarea lor finală, chiar dacă în unele situaţii (de exemplu importul în peroxisom) asamblarea conformaţională este avansată în timpul importului. Vom vedea la studiul organitelor delimitate de endomembrane că proteinele care ajung la nivelul acestora sunt asistate pentru adoptarea conformaţiei corecte, după ce ajung în organit, de şaperone aflate în acele organite. Există două sisteme de împachetare asistată pentru proteinele nou sintetizate în citosol, mai bine cunoscute din punct de vedere al mecanismului: împachetarea prin HSP70 şi împachetarea prin HSP60. Activitatea de şaperon a HSP70 se desfăşoară prin capacitatea acestora de a complexa lanţul polipeptidic pe măsură ce se alungeşte şi părăseşte ribosomul, asigurând mascarea eventualelor suprafeţe hidrofobe. Prin energia preluată de la ATP asigură asemenea rearanjări încât suprafeţele hidrofobe sunt ajutate să se acopere unele pe altele în împerecheri adecvate, astfel încât proteina în conformaţia finală, funcţională ascunde orice suprafaţă hidrofobă la interior şi se înveleşte de suprafeţe hidrofile, acomodabile în mediul apos din citosol. Activitatea şaperonică a HSP60 este cumva diferită. Acestea structurează la nivelul citosolului cuşti de asistare a împachetării în care sunt atrase, pe baza interacţiunii cu suprafeţe hidrofobe, proteinele nou sintetizate. Aceste proteine recrutate în cuştile foramte de HSP60, sunt separate de ambianţa hidrofilă a citosolului şi, prin consum de energie preluată tot de la ATP, sunt ajutate să adopte conformaţia corectă, funcţională. În timpul procesului accesibilitatea în interiorul cuştii este blocată de o componentă cu rol de capac, care se deschide după finalizarea procesului şi permite eliberarea proteinei corect împachetate. Modalităţile prin care celula face controlul de calitate al fenomenelor de împachetare asistată reprezintă, în momentul de faţă, direcţii de cercetare provocatoare [12, 13]. Descifrarea unor


10

asemenea procese reprezintă parte integrantă dintr-o problematică de cercetare recent definită şi intitulată controlul calităţii în celulă.

Eliminarea proteinelor ce eşuează în adoptarea conformaţiei funcţionale Aşa cum am menţionat mai sus, în ciuda mecanismelor de supraveghere şi control activ în ceea ce priveşte asistarea proteinelor în adoptarea conformaţiei funcţionale, există situaţii (nimic nu este perfect) în care unele proteine nou sintetizate eşuează în împachetarea corectă. Aceste proteine sunt recunoscute de celulă prin mecanisme specifice şi supuse degradării pentru eliminarea din bagajul proteic celular. Celula nu are nevoie şi nu înmagazinează, în condiţii normale de funcţionare, proteine inutile, nefuncţionale. Degradarea proteinelor nefuncţionale la nivelul citosolului se realizează prin proteasom. Proteasomul este organitul care digeră şi proteinele devenite nefuncţionale, sau în exces, după ce şi-au făcut treaba pentru că fie iniţial au fost corect împachetate, dar au suferit alterări ulterioare, fie au fost produse mai abundent, ca răspuns la unele nevoi trecătoare ale celulei. Proteasomul este un organit de natură proteică, cu o organizare relativ tubulară, cu trei unităţi structurale, una proteolitică, centrală, cilindrică formată din 14 polipeptide şi două reglatoare, de-o parte şi de alta a unităţii proteolitice, formate din 19 polipeptide [14, 15]. Aşadar există 33 de polipeptide care organizează proteasomul, a cărui masă ajunge la 2500kDa. Constanta de sedimentare a proteasomului întreg este de 26S, în timp ce a unităţii proteolitice este de 20S, iar a unităţilor reglatoare de 19S. De regulă aceste unităţi sunt amintite în textele ştiinţifice prin simbolurile acestor constante de sedimentare (de aceea le şi amintim). Unitatea proteolitică se formează prin stivuirea a 4 inele, două exterioare (la baza şi buza cilindrului) formate din 7 subunităţi omoloage şi două interioare (în partea mediană a peretelui cilindrului) formate din 7 subunităţi omoloage. Compartimentul central al unităţii proteolitice conţine 6 situri de proteoliză. Accesul în unitatea proteolitică se face sub controlul porţiunilor N-terminale ale subunităţilor , care se întrepătrund, realizând o structură de poartă a cărei stare închisă/deschisă se află sub controlul unităţii reglatoare. Unităţile reglatoare reprezintă un fel de capace la unul sau ambele capete ale unităţii 20S, proteolitice. Ele realizează câteva evenimente energetice (dependente de ATP), reprezentând primele etape ale procesului de degradare din proteasom, cum ar fi:

(i) legarea proteinelor marcate (prin poliubiquitinare), destinate degradării în proteasom; (ii) dezasamblarea lanţului poliubiquitinic; (iii) desfacerea lanţului proteic ce trebuie degradat pentru facilitarea accesului în compartimentul

central al unităţii proteolitice. Proteinele care ajung la proteasom pentru degradare trebuie să fie marcate prin poli-ubiquitină. Ubiquitina este o polipeptidă cu 76 aminoacizi, având o masă moleculară de 8,5kDa şi o structură înalt conservată în timpul evoluţiei. Marcarea proteinelor identificate ca nefuncţionale se face printr-un proces complex ce implică acţiunea coordonată a trei enzime. O enzimă ce activează ubiquitina legând-o ca tioester, prin capătul C-terminal, la o grupare –SH proprie. Această enzimă notată cu E1 este numită şi enzimă de activare a ubiquitinei. O a doua enzimă, notată E2 şi numită enzimă de conjugare a ubiquitinei, care preia ubiquitina de la E1 tot prin formarea unei legături tioesterice. Cea de-a treia enzimă, implicată în marcarea proteinelor ce trebuie degradate în proteazom, este notată E3 se numeşte ubiquitin ligază şi transferă ubiquitina de pe E2, pe substrat (adică pe proteina ce urmează să fie degradată). Legarea pe substrat se face la o lizină, folosindu-se tot gruparea carboxil terminală a ubiquitinei. E3 se comportă ca o platformă ce leagă atât E2-ubiquitina, cât şi substratul favorizând transferul ubiquitinei la o lizină a acestuia din urmă. E3 acţionează de mai multe ori producând eticheta poliubiquitinică. Acest proces poartă denumirea de cascadă de ubiquitinare. Sunt necesare cel puţin 4 ubiquitine legate în lanţul poliubiquitinic pentru a constitui o eticheta funcţională, care să determine recrutarea proteinelor poliubiquitinate de către proteasom. Eticheta poliubiquitinică permite recrutarea complexului proteină-poliubiquitină la nivelul


11

proteasomului, prin acţiunea unităţii reglatoare 19S, iar această recrutare reprezintă prima etapă din procesul de degradare.

Caseta . Identificarea şi descifrarea mecanismului prin care proteinele nefuncţionale sunt degradate în citosol, prin implicarea ubiquitinei, au fost considerate de Comitetul de decernare ca justificate pentru acordarea Premiului Nobel în chimie pe anul 2004 trioului de oameni de ştiinţă Aaron Ciechanover, Avram Hershko şi Irwin Rose. Motivaţia juriului a fost, ca de obicei, concisă: "for the discovery of ubiquitin-mediated protein degradation".

Procesul de degradare a proteinelor nefuncţionale se desfăşoară corect într-o celulă ce funcţionează normal. Dacă eliminarea proteinelor inutile, defectuoase nu decurge eficient, pot apărea anumite patologii determinate de depozitarea unor asemenea produşi, care nu sunt degradaţi normal [16]. Este suficient să amintim aici bolile neurodegenerative (boala Alzheimer, boala Parkinson, boala prionică, boala poliglutaminică/Huntington, scleroza laterală amiotrofică/boala Lou Gehrig, sau Charcot). Deşi mecanismele de apariţie a unor asemenea boli nu sunt pe deplin elucidate, toate sunt însoţite de acumulări de depozite proteice nedegradabile. Distribuirea intracelulară a proteinelor nou biosintetizate Să revenim acum la aventura intracelulară a unei proteine nou sintetizate. Spuneam că biosinteza ei este necesară, esenţială, dar nu suficientă. Până aici am abordat nevoia ca macromolecula abia produsă să adopte o conformaţie corectă, corespunzătoare funcţiei, punctând aspecte legate de cum se face această împachetare conformaţională şi ce se întâmplă dacă aceast proces eşuează. Pentru cele a căror conformaţie este realizată cu succes, urmează conducerea lor la locul din celulă în care îşi vor desfăşura activitatea. Ne putem pune practic întrebarea: dacă proteinele se sintetizează în citosol, cum ajung ele în membrane, în nucleu, în lumenele organitelor delimitate de endomenbrane (reticul endoplasmic, aparat Golgi, lizosom, mitocondrie, peroxisom)? Ei bine, celula şi-a dezvoltat mecanisme prin care decide care proteină, unde trebuie să ajungă şi prin care direcţionează proteinele către acele destinaţii şi le ajută să le ocupe. Deşi aceste mecanisme sunt diferite de la o situaţie la alta (detaliile le vom aborda la discuţiile despre fiecare organit amintit), există câteva aspecte de principiu pe care le vom puncta aici. Informaţia referitoare la destinaţia finală a unei proteine în celulă se află în însăşi structura primară a proteinei, în ceea ce numim peptidă semnal, sau secvenţă semnal. Prin peptidă semnal se înţelege o secvenţă din lanţul polipeptidic al proteinei care spune mecanismelor celulare de sortare şi direcţionare spre unul sau altul din locurile din celulă, unde trebuie să fie dusă respectiva macromoleculă. Aceste proţiuni din lanţul polipeptidic pot structura două tipuri de semnale:

(i) ceea ce numim semnal secvenţial, când peptida semnal reprezintă o secvenţă compactă de aminoacizi din structura primară;

(ii) ceea ce numim semnal conformaţional, când mai multe secvenţe compacte sunt astfel aşezate în structura terţiară a proteinei încât sunt puse în comun pentru a crea o suprafaţă cu rol de semnal.

În Tabelul II sunt prezentate câteva secvenţe semnal şi din ce categorie pot fi ele considerate a face parte. Importul în reticulul endoplasmic este dependent de o peptidă semnal cu o structura compactă de aminoacizi hidrofobi. Pentru importul în nucleu este nevoie de o peptidă semnal cu o secvenţă compactă de aminoacizi pozitivi. Pentru importul de proteine de către peroxisom există evidenţiate două tipuri de semnale: unul la capătul C-terminal (PTS1) pentru unele proteine, altul la capătul N-terminal (PTS2) al altor proteine. Mecanismele de import sunt controlate de parteneri diferiţi pentru cele două tipuri de semnale [17]. În cazul mitocondriei, semnalul pare a fi unul combinat secvenţial şi conformaţional, deoarece secvenţa semnal este formată de o succesiune intercalată de aminoacizi pozitivi, aminoacizi hidrofili şi aminoacizi hidrofobi. La aranjarea lanţului în -helix se organizează


12

trei zone longitudinale pe suprafaţă: o zonă pozitivă, una hidrofobă şi alta hidrofilă, zone responsabile de interacţiunea specifică la nivelul complexului ce realizează importul. Alt aspect de similitudine fenomenologică, în logica procesului de distribuire intracelulară a proteinelor, este cel legat de direcţionarea către locul de destinaţie. De regulă, informaţia din semnal este necesară, dar nu suficientă. Sunt de asemenea necesari intermediari de transport şi ţintire. Aceştia complexează proteinele şi le ajută să ajungă la locul cuvenit. Unii dintre aceşti cărăuşi pot fi chiar şaperone (cum se va vedea la importul de proteine în mitocondrie). O ultimă asemănare pe care o putem aminti este dată de complexele proteice de import, care trasportă proteinele în cauză prin endomembranele care delimitează organitele. Aceste complexe de transport poartă denumirea de transloconi. Doar în cazul maşinăriei de transport prin învelişul nuclear denumirea este diferită (complexul porului nuclear), dar acesta este tot o componentă ultrastructurală formată din mai multe subunităţi proteice. Tabelul II. Exemple de peptide semnal cu rolul lor

Funcţia secvenţei semnal Structura în aminoacizi a semnalului* Tipul secvenţei semnal

Import în reticul endoplasmic

+H3NMet-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln-

Semnal secvenţial (secvenţă hidrofobă compactă)

Import în nucleu -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- Semnal secvenţial (secvenţă pozitivă compactă)

Import în peroxisom -Ser/Ala-Lys/Arg-Leu/MetCOO– (PTS1)** +H3NX-X-Arg-Leu-X-X-X-X-X-His-Leu- (PTS2)

Semnal secvenţial ?

Import în mitocondrie

+H3NMet-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-

Semnal combinat (secvenţial/conformaţio-nal)

* Semnificaţia culorilor: portocaliu – hidrofob; roşu – pozitiv; albastru – negativ; bleu - hidrofil ** În paranteză este trecută abrevierea internaţională uzuală; PTS reprezintă iniţialele de la „peroxisomal targeting signal”, iar cifrele reprezintă tipul I, sau II [17]. Aceste fenomene de direcţionare şi poziţionare a proteinelor la nivelul diferitelor organite poartă denumirea de import al proteinelor în organite. Vorbim de importul proteinelor în nucleu, de importul proteinelor în reticulul endoplasmic, de importul proteinelor în mitocondrie sau în peroxisom. Fenomenele de import al proteinelor în organite sunt procese active, necesitând consum energetic. În altă ordine de idei, după datele pe care le cunoaştem până în prezent, doar în cazul proteinelor preluate de reticulul endoplasmic fenomenul se petrece simultan cu elongarea proteinelor importate. Pentru toate celelalte organite biosinteza proteinelor este mai întâi finalizată în citosol şi abia apoi ele sunt importate. În concluzie, biosinteza proteinelor se iniţiază în citosol, unde se şi finalizează pentru o parte din proteine, cu excepţia celor preluate de reticulul endoplasmic şi destinate a ajunge în membrane ca proteine transmembranare (fără cele din membranele mitocondriale), în lumenele aparatului Golgi, lizosomilor, componentelor sistemului endosomal, respectiv în afara celulei, ca proteine secretate. Biosinteza proteinelor este asigurată de un complex ribonucleoproteic numit ribosom, care colaborează în exercitarea funcţiei cu ARNm şi ARNt. Proteinele sunt componentele celulare care asigură utilizarea informaţiei genetice în interesul supravieţuirii celulei. Biosinteza proteinelor în celule este un proces necesar şi esenţial, dar nu şi suficient. Pentru ca o proteină nou sintetizată să devină funcţională, ea trebuie să adopte o conformaţie corectă, corespunzătoare funcţiei. Acest fenomen numit împachetarea proteinelor se desfăşoară într-o masură mică în mod spontan, după câte cunoaştem în acest moment. De regulă este


13

nevoie ca noile polipeptide să fie asistate în procesul de adoptare a conformaţiei funcţionale. Această asistare este asigurată de şaperone. Deşi biosinteza şi împachetarea proteinelor sunt procese celulare bine controlate şi reglate, există situaţii în care aceste fenomene eşuează. Proteinele care nu reuşesc să adopte conformaţia corectă sunt eliminate prin degradare în proteasom. Proteasomul este responsabil şi de degradarea proteinelor care devin nefuncţionale sau în exces. În sfârşit, proteinele nou biosintetizate care adoptă conformaţia corectă trebuie distribuite în celulă la locurile potrivite desfăşurării funcţiei. Acest fenomen se desfăşoară prin mecanisme specifice locurilor de destinaţie şi sunt dependente de secvenţe semnal din structura proteinelor.

Bibliografie specifică 1. Preiss T, Hentze MW. (2003) Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation.

BioEssays. 25, 1201-1211. 2. Sonenberg N, Hinnebusch AG. (2009) Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and

biological targets. Cell. 136, 731-745. 3. Moore PB, Steitz TA. (2003) The structural basis of large ribosomal subunit function. Annu Rev Biochem. 72,

813-850. 4. Steitz TA, Moore PB. (2003) RNA, the first macromolecular catalyst: the ribosome is a ribozyme. Trends

Biochem Sci. 28, 411-418. 5. Chen, Y-J, Inouye M. (2008) The intermolecular chaperone-mediated protein folding. Curr Opin Struct Biol.

18, 765-770. 6. Schlesinger MJ. (1990) Heat shock proteins. J Biol Chem. 265, 12111-12114. 7. Ritossa F. (1996) Discoverz of the heat shock response. Cell Stress Chaperones 1, 97-98. 8. Ritossa F. (1962) A new puffing pattern induced bz temperature shock and DNP in Drosophila. Experientia 18,

571-573. 9. Ritossa F. (1963) New puffs induced by temperature shock, DNP and salicilate in salivary chromosomes of D.

melanogaster. Drosophila Information Service 37, 122-123. 10. Ritossa F. (1963) Experimental activation of specific loci in polztene chromosomes of Drosophila. Exp Cell

Res. 35, 601-607. 11. Saibil HR. (2007) Chaperone machines in action. Curr Opin Struct Biol. 18, 35-42. 12. Bukau B, Weissman J, Horwich AL. (2006) Molecular chaperones and protein quality control. Cell 125, 443-

451. 13. Lee S, Tsai FT. (2005) Molecular chaperones in protein quality control. J Biochem Mol Biol. 38, 259-265. 14. Murata S, Yashiroda H, Tanaka K. (2009) Molecular mechanisms of proteasome assembly. Nat Rev Mol Cell

Biol. 10, 104-115. 15. Besche HC, Peth A, Goldberg AL. (2009) Getting to first base in proteasome assembly. Cell. 138, 25-28. 16. Ardley HC. (2009) Ring finger ubiquitin protein ligases and their implication to the pathogenesis of human

diseases. Curr Pharm Des. 15, 3697-3715. 17. Heiland I, Erdman R. (2005) Biogenesis of peroxisomes. Topogenesis of the peroxisomal membrane and

matrix proteins. FEBS J. 272, 2362-2372.

ribosomul, biosinteza si destinatia finala a proteinelor

Documents