IDENTIFICAREA PROTEINELOR PRIN WESTERN BLOTTING

Metoda Western blot este una din metodele de baz utilizate in laboratoarele de biologie celular i molecular. Folosit corect, aceast metod duce la rezultate uor de interpretat, unice, lipsite de ambiguitate, care pot fi utilizate ca atare sau in completarea altor metode de imunomarcare, in cercetare sau n diagnosticul de laborator.1. Noiuni generale: definiia metodei, denumirea metodeiDefiniie: WB, cunoscut i sub denumirea de imunoblot, este o tehnic analitic pentru identificarea unei proteine specifice dintr-o prob de omogenat tisular sau celular, ori din probe biologice lichide (ser sau LCR).Tehnica WB aduce informaii concrete i utile care nu pot fi puse la dispoziie prin alte metode de imunomarcare. Dac proteina, dei prezent n prob, este modificat calitativ sau cantitativ, se poate observa prin prezena unei benzi mai subiri, mai groase, poziionat mai sus sau mai jos fa de banda proteinei martor sau chiar prin prezena a doua benzi n loc de una. Aceste modificri fa de o prob martor, cu o protein normal, ne d urmatoarele indicaii: fie proteina int este degradat, fie este cantitativ redus sau n exces, fie este glicozilat sau formeaz multimeri. De asemenea ne poate ghida ctre o investigaie genetic in cazul unei deleii pariale sau duplicaii n gena respectivei proteine.De asemenea metoda WB permite compararea expresiei proteinei tint n mai multe probe, fie in acelai esut, fie in esuturi diferite, n scop de cercetare sau diagnostic, indicnd modificri patologice sau ca rspuns la un anumit tratament.W. Neal Burnette a denumit aceast tehnic, n 1979, ca un joc de cuvinte derivat de la tehnica Southern blot, o tehnic utilizat pentru detectarea ADN, pus la punct de Edwin Southern (1975). n mod similar, tehnica de detectare a ARN, a fost denumit Northern blot, iar detectarea modificrilor post-translaionale a proteinelor se numete Eastern blot. Metoda WB a fost pus la punct n laboratorul prof. George Stark, la Stanford, de ctre Harry Towbin i col., n 1979, iar ulterior a suferit multe modificri i imbuntiri.

2.Principiul metodeiPentru identificarea proteinei tint, proteinele din proba biologic trebuie ntai separate n funcie de greutatea lor molecular prin electroforeza n gel de poliacrilamid, transferate apoi pe un suport solid, membran de nitroceluloz sau PVDF, urmnd imunodetecia proteinei urmrite, cu anticorpi specifici. Odat detectat, sceasta proteina va fi vizualizat printr-una din metodele ce pot fi utilizate n acest sens, in funcie de posibilitaile i experiena laboratorului: chemiluminiscena chimic, imagistica.WB este asadar o tehnic in 4 pai:Electroforeza n gel a probei care conine proteina de interesTransferul electroforetic al proteinei inta de pe gel pe membran (Blotare)Imunomarcarea proteinei de interes cu anticorpi specifici Vizualizarea proteinei int Fig.1 Principalele etape ale metodei Western blot: 1) Electroforeza SDS-PAGE; 2) Transferul proteinelor de pe gel pe membran (blotarea); 3) Imunomarcarea i Vizualizarea proteinei de interes din probele biologice.

3. Pregtirea probelor biologice a) Obinerea lizatului tisularEste esenial ca probele de esut sa fie pstrate n bune condiii, astfel ncat proteinele s nu fie distruse. nc de la recoltarea probelor biologice, acestea trebuie pstrate la rece, pe gheat, n timpul transportului i manipulrii, pentru a reduce la maxim proteoliza, defosforilarea sau denaturarea proteinelor. esutul se omogenizeaza astfel ncat proteinele celulare s fie eliberate i solubilizate. Se utilizeaz o solutie tampon de liz, care conine obligatoriu inhibitori de proteaze i/sau fosfataze, n care se omogenizeaz esutul, cu ajutorul unui omogenizator. Raport optim: 1-5 mg tesut/1 ml tampon de liz. Centrifugare la 40C, 20 minute, la 12.000 rpm. Se recolteaz supernatantul. Se pstreaz timp de 2-3 luni la -200C sau pentru mai mult timp la -800C.b) Obinerea lizatului celular- Celulele se recolteaz din recipientul de cultur, - se spal se centrifugheaz, - depozitul de celule se resuspend n tampon de liz cu inhibitori de proteaze. Toate aceste operaii se fac pe ghea. Denaturarea proteinelor se face pe de o parte prin fierbere (la 95-1000C, 5 minute), n prezena de SDS (Sodium Dodecyl Sulfat). Se pierde structura secundar si teriara a proteinei, se faciliteaz accesul anticorpilor la epitopi (secvena de aminoacizi recunoscut de anticorp). SDS este coninut n reactivul Laemmli, n soluia tampon de electroforez (de migrare) i uneori se poate adauga i in soluia tampon de liz (n funcie de reteta utilizat).

Fig.2 Pregtirea probelor biologice nainte de electroforez: omogenizarea probei biologice n tampon de extracie cu un omogenizator Potter; calcularea concentraiei proteice; denaturarea termic a proteinelor.

Electroforeza n gelElectroforeza SDS-PAGE, este procedeul prin care proteinele migreaz, n gel, ntr-un cmp electric i se separ n funcie de greutatea lor molecular. Se utilizeaz o soluie tampon de migrare care conine SDS i care se adaug n tancul de electroforez.

Fig. 3 Suporturi cu geamuri montate pentru turnarea gelurilor.

Fig. 4 Electroforeza SDS-PAGE: tanc pentru electroforeza; suport cu electrozi pentru geluri.

5. Transferul proteinelor (Blotarea)Dup ce proteinele s-au separat pe gel, urmeaz transferul lor pe un suport mai dur si uor de manipulat, pentru analiza lor ulterioar. Metoda de blotare n camp electric (Towbin et al., 1979) este utilizat n cele mai multe laboratoare, fiind rapid i eficient. Cmpul electric este orientat perpendicular pe suprafaa gelului i membranei.Exist dou sisteme principale de transfer al proteinelor de pe gel pe membran: semi-uscat umed Gelul i membrana sunt asamblate ntr-un sistem sandwich, ntre hrtii de filtru, eventual burei, care s le protejeze i s le menin n contact strns. Important: plasarea membranei s se faca ntre gel i electrodul pozitiv, astfel ca proteinele ncarcate negativ s migreze dinspre gel spre membran. n timpul montrii sandwich-ului trebuie s se ndeprteze cu grij bulele de aer. Soluia tampon utilizat n acest caz este soluia tampon de transfer, (asemanatoare celei de la electroforez), dar nu conine SDS. Conine metanol, care ajut proteinele s se lege de membran.Membranele pentru transfer sunt membrana de nitroceluloza i membrana PVDF (polyvinylidene difluoride). - Transferul se face dinspre catod spre anod. Se menine fie amperajul, fie voltajul constant. Transferul umed. Se utilizeaza un tanc plin cu soluie tampon de transfer, n care se scufund caseta/casetele cu sandwich-ul gel/membrana/hartie de filtru/burei, puse ntr-o anumit ordine i in conexiune cu poziia fat de catod i anod. n tanc se pune obligatoriu i un suport care conine gheat (n funcie de tipul de suport se utilizeaz ap sau tampon ingheat), deoarece n timpul transferului se degaj caldur. Fig. 5 Ordinea componentelor sandwich-ului de transfer n cazul modului de transfer umedFig. 6 Transferul umed: tanc de transfer cu capac, suport cu electrozi, suport pentru sandwich-ul de transfer alctuit din gel, membran, hartie de filtru si burei.

6. Imunomarcarea

Imunomarcarea proteinei de interes se face cu anticorpi specifici. Se pot utiliza: marcarea direct care utilizeaz un anticorp primar direcionat contra proteinei int, legat cu o substant de marcaj. Marcarea indirect, utilizeaz un anticorp primar anti-protein int i un anticorp secundar direcionat contra anticorpului primar, acesta fiind legat cu substana de marcaj. Pasii imunomarcrii: Blocarea: previne legarea nespecific a anticorpilor pe suprafaa membranei,prin incubarea cu o soluie proteic, neutr n raport cu protocolul de imunomarcare. Se recomand lapte degresat 5% n tampon TBS (solutie tampon TRIS), ori BSA (bovine serum albumine) 3-5% n TBS. Pentru detecia fosfoproteinelor se recomand blocarea cu BSA, deoarece laptele conine fosfoproteine (caseina) care pot interfera cu imunodetecia. Timpul de blocare: 30 minute Dupa blocare, membrana se spal cu TBST (TBS+Tween20, un detergent), 5 min. Incubarea cu anticorpi specifici: se incubeaz membrana cu soluia de anticorpi specifici (marcai sau nu), timp de 2 ore la temperatura camerei sau peste noapte la rece. Peste membrana se toarn soluie de anticorp de detecie (diluai corespunzator n TBS. Optimizarea diluiei anticorpilor s se fac de fiecare dat cand se lucreaz cu un anticorp nou). Pentru a intensifica semnalul, se utilizeaz anticorpi secundari cuplai cu biotina. Dup incubarea cu anticorpul primar, membrana este spalat cu TBST. Atat blocarea, splrile, ct i incubarea cu anticorpi a membranei trebuie facute cu suficient reactiv ct s spele bine membrana, pe un agitator. Membrana nu trebuie n nici un caz s se usuce. Se adaug anticorpul secundar (cuplat cu o enzim, peroxidaza, HRP horseradish peroxidase sau fosfataza alcalin, AP) detectabil prin utilizarea unui substrat care produce un semnal vizibil, sau un marker fluorescent. Not: n cazul sistemului ce utilizeaz anticorpi biotinilai, se adaug o enzim cuplat la streptavidin, care permite cuplarea la biotina de pe anticorp.

Fig.7 Detecia proteinei de interes prin imunomarcare pe membran: incubare cu anticorpul primar specific; incubare cu anticorpul secundar cuplat cu o enzim; vizualizarea substanei de marcaj cu ajutorul unui substrat enzimatic.7. Vizualizarea proteinei de interes.Cea mai utilizat enzim ca substan de marcaj, legat de anticorpul primar, este HRP. HRP este detectat cnd vine in contact cu o soluie cu substrat pentru aceasta enzim, un reactiv chimic cu care interactioneaz i produce un semnal vizibil, detectabil colorimetric sau chemiluminiscent.Substratul pentru HRP este DAB (diaminobenzidina), care produce o culoare maro. Detecia dureaz de la cateva minute la cateva ore, pan apar benzile vizibile unde se afl proteina int. Alternative moderne: chemiluminiscena, ECL (enhanced chemiluminescence). Substratul utilizat este luminolul, care este oxidat de HRP in prezena H2O2, producnd lumina. Aceasta este detectata prin expunera membranei unui film radiologic Timpul de detecie este scurt, de la cateva secunde, la 30 minute (rareori mai mult). Filmul developat, poate fi pstrat permanent, iar vizibilitatea este foarte bun.

Metoda WB aplicat in diagnosticul medicalDiagnosticul infeciilor virale Confirmarea testelor HIV n cazuri neconcludente Hepatita B Confirmarea testelor FIV la feline, n medicina veterinarDiagnosticul infeciilor bacteriene Boala LymeDiagnosticul infeciilor parazitare Protozoare (exemple: Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum) Viermi (exemple: Trichinella spiralis, Fasciola hepatica, Capillaria sp.)Diagnosticul unor boli prin detectarea proteinelor umane specifice acestora Encefalopatia spongiform bovin (boala Creutzfeldt-Jakob) Distrofii musculare Unele forme de cancer

BIBLIOGRAFIEMoore C - Introduction to Western Blotting, LIT CMr 2009 1 MorphoSys UK Ltd 2009 All rights reserved Published by MorphoSys UK Ltd Endeavour House, Langford Business Park, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GE, UKBolt M and Mahoney P High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, Anal Biochem. (1997) 247, 185-192Burnette W N - Western Blotting: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein, Anal Biochem (1981) 112, 195-203Hames B D and Rickwood D - Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach 3Rd Edition, The Practical Approach Series, Oxford University Press, 1998.Towbin H et al - Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc Natl Acad Sci U S A (1979) 76, 4350-4354Towbin H and Gordon J - Immunoblotting and dot immunobinding--current status and outlook, J Immunol Methods (1984) 72, 313-340