CUPRINS

MOTIVAŢIE..................................................................................................................................3 PARTEA a II a – CERCETĂRI PROPRII ................................................................................5 IPOTEZA DE LUCRU..................................................................................................................5 II.I. MONITORIZAREA UNOR INDICI EPIDEMIOLOGICI DESCRIPTIVI AI TUBERCULOZEI LA BOVINELE DIN UNELE JUDEŢE DIN NORD-VESTUL TRANSILVANIEI .........................................................................................................................7 II.II. ASPECTE ALE EPIDEMIOLOGIEI ANALITICE ........................................................7 Cap. II.III. EVALUAREA EFECTELOR INDUSE DE MYCOBACTERIUM BOVIS ASUPRA SISTEMULUI IMUN AL BOVINELOR ...................................................................8

II.III.1.1.1. Numărarea leucocitelor totale ...................................................................................8 II.III.1.1.2. Determinarea formulei leucocitare............................................................................9 II.III.1.1.3. Determinarea activităţii fagocitare............................................................................9 II.III.1.1.4. Dozarea imunoglobulinelor totale...........................................................................10 II.III.1.1.5. Identificarea şi dozarea complexelor imune circulante...........................................10

II.III.2.1. Monitorizarea activităţii de blastizare a leucocitelor (TTB) ........................................10 II.III.2.2. Dozarea gammainterferonului şi semnificaţia sa practică în tuberculoza bovină........11 II.IV. EVALUAREA COMPARATIVĂ A TESTELOR DE DEPISTAJ A INFECŢIEI TUBERCULOASE LA BOVINELE LUATE IN STUDIU PERIOADA 2004-2008.............11

II.IV.2. CORELAREA REZULTATELOR TESTELOR DE HIPERSENSIBILITATE CU CELE ALE DOZĂRII GAMMAINTERFERONULUI ÎN DIAGNOSTICUL TUBERCULOZEI....11 II.IV.3. CORELAŢII ÎNTRE CONCENTRAŢIILE EFECTORILOR IMUNI UMORALI (IMUNOGLOBULINE ŞI COMPLEXE IMUNE CIRCULANTE) CU TESTELE DE HIPERSENSIBILITATE CUTANATĂ ŞI DE DOZARE A GAMMAINTERFERONULUI 12

II.V. ASPECTE MICROSCOPICE ŞI ANATOMOPATOLOGICE ALE UNOR PRELEVATE PROVENITE DE LA BOVINE ABATORIZATE ÎN VEDEREA STABILIRII DIAGNOSTICULUI DE TUBERCULOZĂ ......................................................12 II.VI. PROFILUL EPIDEMIOLOGIC AL TUBERCULOZEI LA PERSOANELE BOLNAVE DIN JUDEŢELE NORD-VESTULUI TRANSILVANIEI ÎN PERIOADA 2004-2008 ......................................................................................................................................14 II.VII. INVESTIGAREA UNOR METODE DE DIAGNOSTIC ALE TUBERCULOZEI LA OM ..........................................................................................................................................15 II.VIII. INVESTIGAŢII IMUNOLOGICE PRIVIND IMPLICAREA FACTORILOR IMUNI ŞI MECANISMELE INDUSE DE INFECŢIA TUBERCULOASĂ LA ADULŢI ŞI COPII .......................................................................................................................................15

II.VIII.3. INFECŢIA CU MYCOBACTERIUM BOVIS ÎN RÂNDUL POPULAŢIEI UMANE...................................................................................................................................................16

CONCLUZII ................................................................................................................................16

2

REASONS ....................................................................................................................................18 PART II - PERSONAL RESEARCH ........................................................................................20 WORKING HYPOTHESIS........................................................................................................20 II.I. MONITORING OF EPIDEMIOLOGICAL INDICATORS OF TUBERCULOSIS DESCRIPTORS OF BOVINE IN SOME COUNTIES FROM NORTHWESTERN OF TRANSYLVANIA .......................................................................................................................22 II.II. ASPECTS OF ANALYTICAL EPIDEMIOLOGY ........................................................22 II.III. MYCOBACTERIUM BOVIS EVALUATION OF THE EFFECTS INDUCED IMMUNE SYSTEM OF BOVINE .............................................................................................23

II.III.1.1.1. Total number of withe blood cells ..........................................................................23 II.III.1.1.2. Determination of leucocyte formula .......................................................................24

II.III.1.1.3. Determination of the fagocytosis activity .............................................................. 24 II.III.1.1.4. Quantitative detection of the whole gammaglobulines...........................................25 II.III.1.1.5. Quantitative detection of the circulatin immune complex ......................................25

II.III.2.1. Monitoring of the activity of blast transformation leucocytes .......................................25 II.III.2.2. Quantitative detection of gammainterferon and their practice significance .................26 II.IV. COMPARATIVE EVALUATION OF IDENTIFICATION TUBERCULOSIS INFECTION TEST TO STUDIES BOVINE IN PERIOD 2004-2008 ...................................27 II.IV.2. MATCHING TEST RESULTS OF HYPERSENSITIVITY WITH THOSE OF DOSING GAMMAINTERFERONE IN DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS .....................27 II.IV.3. CORRELATION BETWEEN HUMORAL IMMUNE EFFECTORS (IMMUNO- GLOBULIN AND CIRCULATING IMMUNE COMPLEX) WITH SKIN HYPERSENSITIVITY TESTS AND DOSING GAMMAINTERFERONE .........................27 II.V. MICRORSCOPICAL AND PATHOLOGICAL ASPECTS OF SAMPLES TAKEN FROM BOVINE SLAUGHTERED FOR DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS....27 II.VI. EPIDEMIOLOGICAL PROFILE OF TUBERCULOSIS IN ILL PERSONS IN THE NORTHWESTERN TRANSYLVANIA COUNTIES IN THE PERIOD 2004-2008 ..30 II.VII. INVESTIGATION OF METHODS OF DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS IN MAN..............................................................................................................................................30 II.VIII. IMMUNOLOGICAL INVESTIGATIONS ON FACTORS INVOLVEMENT IN CURRED IMMUNITIES AND MECHANISMS OF INFECTION IN ADULTS AND CHILDREN TUBERCULOSIS .................................................................................................31 II.VIII.3.INFECTION WITH MYCOBACTERIUM BOVIS WITHIN THE HUMAN POPULATION.............................................................................................................................31 CONCLUSIONS ..........................................................................................................................32 SELECTIVE BIBLIOGRAPHY ................................................................................................34

3

MOTIVAŢIE Întâlnită la om şi la numeroase specii de mamifere şi păsări domestice şi sălbatice,

tuberculoza este o boală de natură infecto-conatgioasă, produsă de germeni din genul Mycobacterium

În Europa occidentală incidenţa infecţiei la bovine este sub 1% iar în Canada şi SUA procentul este mai scăzut (Perianu, 2003). În România, datorită intensificării măsurilor de combatere şi prevenire, procentul infecţiei s-a redus considerabil în perioada 1990-2001, însă au fost înregistrate valori ale incidenţei mai crescute în următorii 5 ani.

Infecţia tuberculoasă are şi o mare importanţă sanitară, fiind una dintre cele mai răspândite şi mai grave zoonoze (Vordermeier, 2006). În general omul se poate infecta cu toate cele 3 tipuri de micobacterii patogene cuprinse în complexul Mycobacterium, studii de ultima oră arată că şi unele specii micobacteriene netuberculoase (NTM) (Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum); Mycobacterium marinum; and Mycobacterium avium/intracellulare complex (MAC) produc îmbolnăviri atât la om cât şi la animale (Foo, 2009).

Investigarea modificărilor survenite la nivelul efectorilor umorali şi celulari în tuberculoză perminte evaluarea în dinamică a procesului morbid şi exprimarea cât mai corectă a prognosticului (Barnes şi col., 2002; Pop şi col., 1997).

Hewinson şi Vordermeier (2003), în urma numeroaselor cercetări privitoare la infecţia tuberculoasă şi modalităţile de apărare a organismului (uman şi animal) faţă de aceasta, concluzionează că răspunsul imun în tuberculoza bovină produsă de M. bovis mimează fidel pe cea indusă de complexul micobacterium la om. Orme (2005) nu este de acord cu aceştia, el demonstrând că răspunsul imun în infecţia cu tulpina bovină se traduce prin formarea unui granulom caracterizat printr-un substanţial proces de mineralizare cu formarea unor întinse leziuni macrocopice în pulmon şi limfonoduli. Din acest motiv dar şi datorită unor aspecte negative care apar la efectuarea unor protocoale experimentale pe animale mari, majoritatea datele existente la această oră în literatura de specialitate provin în urma cercetărilor efectuate pe modele umane sau murine in vivo. Deşi aceste rezultate pot fi extrapolate la bovine în vederea unei diagnosticări serologice precoce şi utilizate pentru imaginarea unor vaccinuri mai eficiente, totuşi unii cercetători au întreprins, în ultimii ani, protocoale experimentale pe bovine infectate artificial, de cele mai multe ori în paralel cu modele murine. Rezultatele obţinute in vitro sunt cel puţin promiţătoare în vederea obţinerii unor vaccinuri de nouă generaţie. Aceastea trebuie să confere o imunitate solidă la bovine în vederea distrugerii lanţului epiodemiologic care, din păcate, în ultimii ani ameninţă atât populaţiile de bovine din întreaga lume cât şi sănătatea publică.

Atât pe plan internaţional, prin Organizaţia Mondială a Sănătăţi (O.M.S) şi Organizaţia Naţiunilor Unite pentru Alimentaţie şi Agricultură (F.A.O.), cât şi în fiecare ţară prin organele sanitar-veterinare, se acordă o atenţie deosebită cunoaşterii frecvenţei şi difuzării acestor boli precum şi elaborări măsurilor de combatere, care sunt legate în primul rând de eliminarea din circuit a verigii “ animal”.(Pop, 2003).

Infecţia tuberculoasă are origine bacteriană fiind cauzată de micobacterii incluse în complexul Mycobacterium tuberculosis. Infecţia tuberculoasă la bovine poate fi cauzată de M. bovis, M. africannum, considerat a fi cu caractere intermediare între var. bovis şi var. tuberculosis tipul uman sau M. avium (Cousins, 2001). Cercetările efectuate în ultimul timp evidenţiază alte două specii noi incluse în complexul M. tuberculosis care provoacă tuberculoza la bovine: M caprae patogen pentru capre şi M. pinnipedii patogen pentru foci şi lei. Ambele specii au

4

caracter zoonotic şi produc îmbolnăviri în rândul rumegătoarelor. Boala produsă de var. caprae nu se consideră a fi esenţial diferită faţă de cea produsă de var. bovis (Aranaz şi col.,

2003; Prodinger şi col., 2005). În Romania, în perioada 1998-2008 nu au fost depistate cazuri de infecţie cu

Mycobacterium bovis la om, la pacienţi provenind din N-V Transilvaniei (date ale Laboratorului National de Referinta din cadrul Spitalului Judetean de Pneumoftiziologie Cluj), în condiţiile în care în majoritatea judeţelor regiunii a fost diagnosticată şi confirmată boala la bovine (date ale Directiilor Sanitare Veterinare). Ftiziologia modernă consideră că, indiferent de organismul infectat printr-o leziune bacilară, întregul organism participă la procesul morbid, iar prezenţa în organismul infectat a germenilor din complexul Mycobacterium determină o stare de reactivitate particulară, netransmisibilă prin serul animalelor bolnave. Ca urmare, Hewinson şi Vordermeier (2003), în urma numeroaselor cercetări privitoare la infecţia tuberculoasă şi modalităţile de apărare a organismului (uman şi animal) faţă de aceasta, concluzionează că răspunsul imun în tuberculoza bovină produsă de M. bovis mimează fidel pe cel indus de complexul Mycobacterium la om.

Pentru evaluarea modificărilor imunologice în tuberculoză şi a mecanismelor imune implicate în apărarea organismului au fost utilizate diferite metode. Hipersensibilitatea indusă constituie dovada implicării în determinismul acestei stări a componentei celulare a sistemului imun : macrofage, limfocite T, limfocite B (Liebanna şi col., 2001).

Astăzi apare mult mai clar implicarea limfocitelor în lupta antimicobacteriană, incomplet elucidata la om şi la bovine, existând numeroase semne de întrebare privind prezenţa acestor celule în focarul lezional. Studiile cercetătorilor japonezi (Lai şi Shen, 2003), asupra rolului limfocitelor în tuberculoza la om, evidentiază faptul ca infecţia primara cu bacili din complexul Mycobacterium induce un raspuns imun bifazic.

Macrofagul reprezintă celula activată ce deţine rol esenţial în manifestarea rezistenţei antimicrobiene. Macrofagele provin din mononuclearele ce pătrund în leziuni sub influenţa factorilor chemotactici. În funcţie de starea de activare, macrofagele conţin bacili inactivi, distruşi sau, dimpotrivă în faza de multiplicare. Degradarea enzimatică a bacililor se soldează cu eliberarea de fracţiuni micobacteriene şi sub acţiunea inductoare a acestora apar celulele epiteloide, ca forme de diferenţiere a macrofagelor. Celula epiteloidă are un continut enzimatic bogat, un potenţial mitotic foarte scăzut şi nu conţine decât ocazional bacili. Studii numeroase, Solano, 1999, Ustinova, 1999; Mason, 2001, Tupasi, 2003; etc., demonstrează implicarea acestor celule în apărarea antituberculoasă şi nu numai.

Testele de diagnostic curent utilizate în tuberculoză sunt examenele clasice, a căror utilitate s-a dovedit deja, fără ca şi specificitatea lor să fie demonstrată (Costan, 2007).

În privinţa afinităţii tinctoriale, cercetătorul Romarokoto (2002), subliniază afinitatea tuturor bacteriilor din grupul Mycobacterium pentru coloranţii utilizaţi în metoda Ziehl-Neelsen şi nu pentru auramina, indicată de unii cercetatori in perioada 1998-2000 (Cauchoix, 2002). In perioada 1995-1997, în Republica Moldova, Crudu (1995), studiază posibilitatea de identificarea micobacteriilor prin metoda de colorare AFB ( Acid Fast Bacilli) aplicând metoda pentru probele de spută şi apreciazaceă această tehnica drept o metoda foarte bună, cu specificitate ridicată comparativ cu metoda clasica Ziehl-Neelsen.

La bovine nu există date în litera de specialitate care să confirme izolarea lui M. bovis din spută. Whelan (2005) a incercat această tehnică pornind de la secreţiile nazale pe baza considerentului că bovinele, prin toaletarea oglinzii botului şi nărilor se reînsămânţează fără însă ca rezultate satisfăcătoare (Bob, 2007).

Testul imunoenzimatic varianta sandwich (EIAs) din cadrul testului se bazează pe detectarea interferonului gamma (GIFN) eliberat de limfocitele T sensibilizate ale bovinelor şi

5

persoanelor infectate, în prezenţa antigenelor micobacteriene. Determinarea concentraţiei gamma interferonului reprezintă o tehnică modernă (Rothel şi col., 1992), de curând aplicată

şi în Romania pentru diagnosticul tuberculozei bovine prin testul BOVIGAM (Manea şi Manea, 2004). Evaluarea sa a fost efectuată comparativ cu testele intradermice, care au cea mai largă aplicabilitate pe plan mondial la ora actuală.(Costan, 2007; Vasiu, 2007).

PARTEA a II a – CERCETĂRI PROPRII

IPOTEZA DE LUCRU

Experimentele efectuate in vitro nu pot oferi condiţii identice cu cele ale organismului, dar pot să permintă aprecierea efectelor unor substanţe ce pot avea influenţă benefică pentru menţinerea stării de sănătate, prin stimularea potenţialului de apărare. Monitarizarea influenţei potenţialei infecţii tuberculoase, depistate pe baza reactivităţii cutanate la bovine, asupra câtorva dintre laturile răspunsului imun, implicând atât efectori umorali cât şi efectori celulari cu roluri diferite, permite evaluarea diagnostică a acestor tehnici.

MONITORIZAREA UNOR INDICI EPIDEMILOGICI AI TUBERCULOZEI LA BOVINELE DIN UNELE JUDEŢE ALE REGUNII DE NORD-VEST A TRANSILVANIEI ÎN PERIOADA 2004-2008

Investigaţiile epidemiologice în direcţia tuberculozei bovine s-au efectuat în perioada 2004-2008. S-au prelucrat şi valorificat o serie de date multianuale referitoare la evoluţia tuberculozei bovine din unele judeţe din Nord Vestul Transilvaniei. Prelucrarea datelor s-a efectuat prin diverse metode matematice, de la simpla medie artimetică a unor şiruri multianuale până la utilizarea uor formule consacrate pentru stabilirea unor indici epidemiologici:prevalenţa şi incidenţa bolii.

EVALUAREA COMPARATIVĂ A TESTELOR DE DEPISTAJ A INFECŢIEI TUBERCULOASE LA BOVINELE LUATE IN STUDIU PERIOADA 2004-2008

În cadrul acestui capitol am urmărit evaluarea comparativă a rezultatelor oferite de testele alergice şi dozarea gamma interferonului şi examenul histopatologic utilizate în vederea confirmării infecţiei cu M. bovis la bovine suspecte. S-a apreciat prin utilizarea programului statistic valoarea intrinsecă a testului alergic (sensibilitate, specificitate), valoare care a fost corelată prin calului factorului r cu rezultatele obţinute în urma testului Bovigam.

Toate aceste investigaţii cu privire la modalitaţile de diagnostic a tuberculozei bovine au fost evidenţiate ţinând cont de faptul că există o diferenţă de principiu între modul în care se confirmă boala la bovine faţă de alte specii.. Aceasta diferenţă se referă la faptul că, pe câtă vreme la toate celelalte specii inclusive la om, apare suspiciunea de tuberculoză, în baza unor observaţii clinice sau necropsice, care suspiciune se impune a fi verificată prin alte examene, în cazul tuberculozei bovine este absolut necesar ca suspiciunea să apară în baza examenului allergic, efectuat ân mod systematic la toate bovinele (sănătoase), urmând ca rezultatele positive la testul allergic să fie apoi confirmate prin alte examene.

6

Testul imunoenzimatic EIAs-γ IFN reprezintă o posibilitate de exploatare pentru diagnostic care ar putea elimina un procent însemnat din erorile testului allergic, evitând sacrificarea unor animale valoroase neinfectate sau menţinerea în efectiv a unor vaci infectate cu M. bovis, cu infecţie tuberculoasă în stadii incipiente, înnainte de invadarea organismului şi de răspândirea largă a micobacteriilor patogene din mediu.

EVALUAREA EFECTELOR INDUSE DE MYCOBACTERIUM BOVIS ASUPRA SISTEMULUI IMUN AL BOVINELOR

În vederea atingerii acestui deziderat s-au efectuat teste în vedera evidenţierii efectorilor imuni celulari nespecifici şi specifici deopotrivă. Pentru descrierea interrelatiilor imunopatologice cu organismele infectate s-a efectuat :estimarea numărului total de leucocite, s-a determinat formula leucocitară, activitatea fagocitară, imunoglobulinele totale şi complexele imnue circulante. Testele efectuate cu privire la implicaţia efectorilor imuni specifici au vizat monitorizarea activităţii de blastizare a leucocitelor (TTB) şi cuantificarea dozării gammainterferonului în corelaţie cu alte teste imunologice în diagnosticul tuberculozei la bovine.

PROFILUL EPIDEMIOLOGIC AL TUBERCULOZEI LA PERSOANELE BOLNAVE DIN JUDEŢELE NORD-VESTULUI TRANSILVANIEI ÎN PERIOADA 2004-2008

Este cert faptul că profilul epidemiologic al infecţiei cu Mycobacterium tuberculosis în judeţele luate în studiu în perioada 2004-2008 poate oferi date foarte importante cu privire la extincţia bolii într-o unitate de timp iar prin efectuarea anchetelor epidemiologice la care bolnavii sunt supuşi se poate contura modalităţile de transmitere a infecţiei în colectiv şi intarfamilial.

În acest capitol s-au monitorizat incidenţa şi prevalenţa persoanelor infecatate la adulţi şi copii, deasemenea s-au evoluat comparativ indicii epidemiologici utilzaţi în supravegherea tuberculozei infantile.

INVESTIGAREA UNOR METODE DE DIAGNOSTIC ALE TUBERCULOZEI LA OM

Metodele de diagnostic a tuberculozei la om diferă la adult faţă de copil. De aceea în acest capitol s-a testat eficienţa testului alergic la copii corelată cu rezultatele oferite de examenul radiologic cunoscut fiind faptul că la copii examenul sputei este negativ.

În contextul în care testul alergic la adulţi nu este de un real folos, s-au testat alte metode de diagnostic care să confirme sau să infirme boala. Testele care se utilizează în toate spitalele de pneumoftiziologie din România pentru confirmarea infecşiei cu micobancterii tuberculoase sunt :examenul sputei, examenul radiologic şi biochimia sângelui.

INVESTIGAŢII IMUNOLOGICE PRIVIND IMPLICAREA FACTORILOR IMUNI ŞI MECANISMELE INDUSE DE INFECŢIA TUBERCULOASĂ LA OM Relizarea testelor din acest capitol au pornit de la afirmaţiilor unor cercetători cu privire la răspunsul imun în tuberculoză. Aceştia aifrmă că profilul imun al tuberculozei bovine mimează fidel pe cel al tuberculozei la om. În acest context am efectuat aceleaşi teste imune ca şi în cazul bovinelor după care am evaluat comparativ rezultatele. STABILIREA POTENŢIALULUI ZOONOTIC AL TUBERCULOZEI BOVINE Acest capitol a avut ca scop stabilirea potenţialului zoonotic al tuberculozei bovine pe perioada luată în studiu pornind de la premiza că dacă incidenţa bolii a fost în creştere în ultimii ani atât la bovine cât şi la om iar infecţia cu M. bovis la om este cea mai gravă zoonoză, există posibilitatea ca bovinele să fi fost sursa agentului patogen într-o proporţie mai mare decât cea înregistrată în ani precedenţi.

7

Au fost anchetate toate persoanele internate în spitalul de Pneuftiziologie Leon Daniello din Cluj-Napoca în urmă cărora s-a stabilit sursa agentului patogen, influenţa

mediului extern în patologia infecţiei, rolul persoanelor bolnave în transmiterea înfecţiei.

II.I. MONITORIZAREA UNOR INDICI EPIDEMIOLOGICI DESCRIPTIVI AI TUBER RCULOZEI LA BOVINELE DIN UNELE JUDEŢE DIN NORD-VESTUL TRANSILVANIEI

Pentru realizarea unor programe cât mai eficiente de supraveghere epidemiologică trebuiesc cunoscute cât mai multe caracateristici epidemiologice ale tuberculozei cu atât mai mult cu cât boala este considerata zoonoza cu un real pericol pentru sănătatea publică (De Kantor şi col., 1998; Reider, 1999; Stoicescu şi col.2002; Mânzat, 2002).

Investigaţiile epidemiologice în direcţia tuberculozei bovine s-au efectuat în perioada 2004-2008 la toate animalele tuberculinate din cinci judeţe ale regiunii Nord –Vestului Transilvaniei şi care au fost notate generic: A,B,C,D,E.

Cercetările întreprinse, au avut drept scop analizarea unor indici epidemiologici ai infecţiei tuberculoase utilizând tehnica epidemiologiei descriptive - realizată pentru cunoaşterea frecvenţei şi dinamicii focarelor de tuberculoză analizate.

Rezultatele acestui studiu arata ca doar un singur judet este indemn iar restul se confrunta cu un risc scazut al tuberculozei la bovine.

II.II. ASPECTE ALE EPIDEMIOLOGIEI ANALITICE

În vederea stabilirii relaţiilor de cauzalitate în tuberculoză la bovine, am considerat că este importantă identificarea circumstanţelor care facilitează transmiterea bolii şi creşterea riscului de apariţie şi evoluţie a ei în populaţiile de animale. In acest sens am recurs la cuantificarea riscului prin analiza asocierii statistice între boală şi factorul vârstă care pot interveni în evoluţia ei. Riscul relativ a fost exprimat prin calcularea valorii Odds ratio (OR), după formula utilizată în cazul anchetelor epidemiologice de tipul CAZ-MARTOR (Toma şi col., 1998; Bouyer şi col., 1994, Thrusfield, 2007). Validitatea statistică a rezultatelor obţinute, respectiv a valorii Odds ratio, a fost exprimată în funcţie de intervalul de încredere 95% (IC 95%) şi de indicele de probabilitate p, calculate prin utilizarea Testului Fischer, în sistem de analiză categorială ANOVA - Programul GraphPad In Stat (Schwartz, 1992; Motulsky, 2004).

În cazul investigatiilor inteprinse considerăm vârsta un factor de risc de important aceasta

datorită valorii medii ale riscului relativ, exprimat prin Odds ratio. Valoarea acestuia a fost, în perioada 2004-2005, 2,21 cu un interval de încredere (IC 95%)

cuprins între 1,15 şi 6,09 şi un indice de probabilitate p de 0,01 (semnificativ statistic); în perioada 2006-2008, nivelul Odds ratio a fost 3,25, intervalul de încredere (IC 95%) fiind 2,15-10,21 cu un indice de probabilitate p = 0,01 (semnificativ statistic).

8

Tabel 1

Clasificarea bovinelor în vederea cuantificării factorului de risc “vârstă” (2004-2008)

II.III. EVALUAREA EFECTELOR INDUSE DE MYCOBACTERIUM BOVIS ASUPRA SISTEMULUI IMUN AL BOVINELOR

Studiul s-a efectuat pe un eşantion reprezentat de 79 bovine provenite din gospodării particulare sau ferme din Nord-Vestul Transilvaniei. Rasa bovinelor a fost cu prepoderenţa Bălţată Românească (90%) iar 10 % Holstein şi rase mixte autohtone.

In cadrul acestui experiment s-au efectuat teste pentru evidentierea reactivitatii imune mediate nespecific (numarul total de leucocite, determinarea formulei leucocitare si a activitatii fagocitare, dozarea imunoglobulinelor totale si a complexelor imune circulante) si specific (dozarea gammainterferonului si monitorizarea activitatii de blastizare).

II.III.1.1.1. Numărarea leucocitelor totale Din fig.1 se poate observa dinamica numarului totale de leucocite la bovinele reagente

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

1 2 3 4

număr

tota

l de

leuc

ocite

/who

le le

ucoc

ytes

P NCL

Figura 1. Reprezentarea grafică a dinamicii leucocitelor totale la bovinele P şi NCL

Factor de risc analizat

A:viţei 6s –6l cu tuberculoza

B: viţei 6s -6 l reacţionaţi negativ la testul tuberculinic

2004 - 2005

2006 - 2008

2004 - 2005

2006 - 2008

Vârsta 6 săptămâni- 6

luni 18 15 4125 4015

C: Bovine cu tuberculoză confirmată

D: bovine reacţionate negativ la testul tuberculinic

2004 - 2005

2006 – 2008

2004 - 2005

2006 - 2008

Bovine peste

6 luni

143 73 101.57 17553

9

Dacă la bovinele reagente încadrate NCL (neconcludente), media numărului total de

leucocite numărate pe un mm3 de sânge se încadrează în limitele normale ale speciei (7680) nefiind semnificative statistic (p>0,05), la cele reagente P (pozitive) aceasta este mult peste limita superioară (9060)( ( p<0,01) valori care sunt semnficative statistic.

Din corelarea reultatelor obtinute la reactivitatea cutanata cu numarul total de leucocite reiese ca la bovinele P şi NCL există o corelaţie pozitivă între variaţia insă nu este asigurată statistic (p>0,05) la nici o categorie reactionala de bovine.

II.III.1.1.2. Determinarea formulei leucocitare Tabel 2.

Valorile medii şi deviaţiile standard ale fiecărui tip de leucocit la bovinele reagente (P, NCL) corelate cu numarul total de leucocite

Categoria de leucocite Categorii N E B L M

Nr. total leucocite

Media 27,6 2,7 2,25 61,4 7,7 8170 St.dev. 3,2 2,1 1,09 3,17 2,83 0,885 rLt- % 0,190 0,186 0,320 0,484 0,01

După cum se poate observa din tabelul 2 corelaţia este pozitivă între numărul total de

leucocite şi subpopulaţile neutrofile, eozinofile, bazolfile corelaţia fiind asigurată matematic(p<0,01) însă corelaţia este negativă faţă de monocite şi neutrofile nesemnificativ statistic (p>0,05).

II.III.1.1.3. Determinarea activităţii fagocitare Variantele de lucru ale testului de înglobare a particulelor de carbon în vitro sunt prezentate în tabelul 3.

Prin evaluarea comparativă a rezultatelor obţinute pentru cei doi timpi de expunere, se poate constata că dinamica respectiv viteza înglobării particulelor de carbon este similară la 20 respectiv 40 de minute, realizându-se scăderi proportionale. Este posibil deci, ca activitatea fagocitară mai intensă să aibă loc la bovinele regente P în primele 20 de minute de contact cu tuşul de China. Stimularea cu tuberculina bovina si aviara a dus la scaderea activitatii fagocitare.

Tabel 3 Variante experimentale

Variante experimentale

Sânge (ml)

Tuş (μl)

Tb-Ta (μl)

Amestec in SF

Varianta (M) 0,5 1,5 - 100

Varianta (Tb) 0,5 1,5 6 100

Varianta (Ta) 0,5 1,5 6 100

10

II.III.1.1.4. Dozarea imunoglobulinelor totale Rezultatele obtinute la dozarea imunoglobulinelor totale sunt redate in tabelul 4.

Tabel 4

Valori ale gammaglobulinelor totale (UDO) determinate pentru serurile provenite de la animale din diferite categorii de reactivitate TCS.

Criterii P NCL N Media 0,183 0,157 0,138

Dev.std. 0,005 0,054 0,049

Urmărind rezultatele obţinute, se observă că, deşi diferenţele nu sunt semnificative (fiind asigurate si matematic, p>0,05) concentraţiile serice ale gamaglobulinelor la animalele pozitive sunt mai mari faţă de valorile concentraţiilor înregistrate la celălalte două loturi (recontrol şi negative). Acest fapt sugerează că infecţia cu M.bovis induce o creştere a nivelului imunoglobulinelor totale.

II.III.1.1.5. Identificarea şi dozarea complexelor imune circulante

Valorile obţinute la dozarea complexelor imune circulante nu s-au departajat net în ceea ce priveşte lotul pozitiv şi recontrol în timp ce la lotul negativ valorile sunt doar ceva mai mici. Cu toate acestea, evoluţia parametrului este similară cu cea a imunoglobulinelor.

Deoarece diferenţele dintre loturi sunt atât de mici este greu de spus dacă infecţia tuberculoasă influenţează semnificativ formarea complexelor imune circulante la bovine. Totuşi, valorile mai mari, constant apărute la lotul pozitiv, sugerează această posibilitate.

II.III.2.1. Monitorizarea activităţii de blastizare a leucocitelor (TTB)

Rezultatele testului de transformare blasticǎ la loturile experimentale se găsesc în tabelul 5. Dupǎ cum se poate observa s-a obţinut un indice de blastizare pentru varianta martor de 76,63, iar pentru PHA de 98,66 la animalele reacţionate pozitiv.

Pentru probele stimulate valoarea cea mai mare s-a obţinut la E. angustifolia (73,13), urmând apoi E. purpureea (58,26). La stimularea cu preparate specifice (tuberculina aviarǎ şi tuberculina bovinǎ) s-au obţinut aşa cum era de asteptat valorile cele mai ridicate ale indicilor de blastizare de 92,96 respectiv 70,80. La categoria recontrol(NCL) cea mai mare valoare s- obţinut în urma stimulării cu Tb (cu o medie peste 90,00) urmată de E. Ang. cu o medie de 91,567 iar la celelelate variante de lucru valorile au fost în toate cazurile mai mari decât la animalele pozitive.

11

Tabel 5 Indici de stimulare în testul de transformare blasticǎ la loturile pozitive şi recontrol.

Categorii Pozitive

M PHA Alc E. ang.E.

purp. TA TB

Media 76,63 98,664 61,765 73,135 56,266 92,966 70,80

Recontrol

Media 82,10 86,765 85,890 91,576 75,030 85,599 92,37

Dev. St 9,844 16,801 15,350 10,940 16,170 10,805 7,459

II.III.2.2. Dozarea gammainterferonului şi semnificaţia sa practică în tuberculoza bovină

În scopul determinării semnificaţiei dozării gammainterferonului în diagnosticul tuberculozei şi estimarea importanţei sale practice s-au luat în studiu un număr de 79 bovine. În urma efectuării TCS (testului comparativ simultan), în unitatea de provenienţă, 104 bovine au fost încadrate în categoria recontrol şi 45 în categoria pozitiv. Rezultatele obţinute au relevat următoarele categorii de animale:

• bovine reacţionate TCS pozitiv şi Bovigam pozitiv • bovine reacţionate TCS pozitiv şi Bovigam negativ • bovine reacţionate TCS neconcludent şi Bovigam pozitiv • bovine reacţionate TCS necolcludent şi Bovigam negativ • bovine reacţionate pozitiv la TU şi Bovigam negativ • bovine reacţionate NCL la TU şi Bovigam pozitiv • bovine reacţionate NCL la TU şi Bovigam negativ Urmărind rezultatele obţinute, putem spune că testul Bovigam are mai curând valoare de

diagnostic de grup decât de diagnostic individual

II.IV. EVALUAREA COMPARATIVĂ A TESTELOR DE DEPISTAJ A INFECŢIEI TUBERCULOASE LA BOVINELE LUATE IN STUDIU PERIOADA 2004-2008

Investigaţiile au fost efectuate la efectivelede bovine pe care s-au efectuat şi testele imune. Indivizii testaţi au aparţinut unor diferite categorii de vârsă, majoritatea animale adulte, vaci de lapte, cu stare de întreţinere în general bună

II.IV.2. CORELAREA REZULTATELOR TESTELOR DE HIPERSENSIBILITATE CU CELE ALE DOZĂRII GAMMAINTERFERONULUI ÎN DIAGNOSTICUL TUBERCULOZEI

Analiza coeficienţilor de corelaţie obţinuţi sugerează o slabă corelaţie între testul tuberculinic intrademic pozitiv şi rezultatele la testul Bovigam, indiferent dacă ele sunt pozitive sau negative, obţinute pentru stimularea cu tuberculină bovină. Aceste rezultate sunt oarecum paradoxale, pentru că răspunsul mai intens aşteptat ar fi fost, aşa cum se întâmplă în cazul testului de transformare blastică, la stimularea cu acest tip de tuberculină. Corelaţiile stabilite pentru

12

stimularea cu tuberculină aviară şi reacţia cutanată sunt apropiate, semnificaţia lor fiind p<0,001, iar variaţia direct proporţională sugerează posibilitatea de a înlocui cele două teste

unul cu altul.

II.IV.3. CORELAŢII ÎNTRE CONCENTRAŢIILE EFECTORILOR IMUNI UMORALI (IMUNOGLOBULINE ŞI COMPLEXE IMUNE CIRCULANTE) CU TESTELE DE HIPERSENSIBILITATE CUTANATĂ ŞI DE DOZARE A GAMMAINTERFERONULUI

Prin analiza rezultatelor obţinute se constată că pentru categoria TCS pozitive concentraţiile gammaglobulinelor secorelează semnificativ statistic (p<0,001) atât cu rezultatele testului intradermic cât şi cu nivelele densităţilor optice determinate prin Bovigam. Concentraţia gammaglobulinelor se corelează pozitiv cu rezultatele testului Bovigam şi în cazul categoriei recontrol prin TCS (r=0,63, p<0,05). Semnificaţia statistică a corelaţiei dintre tehnica de dozare a CIC şi TCS respectiv Bovigam este p<0,001. Rezultatele obţinute prin dozarea CIC se corelează pozitiv (r=0,54) ca şi în cazul concentraţiei gammaglobulinelor cu rezultatele Bovigam, pentru lotul TCS recontrol.

II.V. ASPECTE MICRORSCOPICE ŞI ANATOMOPATOLOGICE ALE UNOR PRELEVATE PROVENITE DE LA BOVINE ABATORIZATE ÎN VEDEREA STABILIRII DIAGNOSTICULUI DE TUBERCULOZĂ

Probele patologice au provenit de la 69 bovine reagente care urmau să fie sacrificate în vederea confirmării diagnosticului de tuberculoză. Recoltarea probelor a avut loc în incinta abatoarelor.

S-a reuşit evidenţierea micobacteriilor şi izolarea lor din secreţiile nazale provenite de o singură bovină cu tuberculoză.

Figura 2. Aspect microscopic al micobacteriilor din secreţiilor nazale

Figura 3. Aspect cultural din secreţiile nazale ale bovinei bolnave de tuberculoase

13

Bovina de la care provine cultura a avut o reacţie maximă la testul tuberculinic iar la

examenul anatomopatologic prin secţionarea pulmonilor a rezultat o secreţie purulent-cazeoasă în cantitate foarte mare. În urma examenului histopatologic şi al bioprobei (pe cobai) s-a confirmat tuberculoza la bovina luată în studiu.

Figura 4. Colecţii cazeo-purulente la nivelul pulmonilor combinat cu atelectazia lobului apical

Figura 5. Hemoragii pulmonare şi intens emfizem.

Figura 6. Ganglioni retromamari hipertrofici, modificaţi pe secţiune.

14

În urma examenului necropsic şi histopatologic au fost semnalate numeroase leziuni care au fost specifice/patognomonicealtor entităşi morbide, care fie au evoluat simultan

infecţiei tuberculoase fie au determinat reactivitatea cutanată la testul alergic determinând trimiterea bovinelor în abatorizare fără ca ele să fie bolnave de tuberculoză. Dintre cele 69 de bovine abatorizate la 17(21,24%) nu s-a confirmat ulterior tuberculoză.

Figura 7. Pleurită granulomatoasă cu cellule epiteloide fără necroză cazeoasă

Figura 8. Granulom epitelioid cu celule Langhans în centru, limfadenită necrotică (limfonodul traheobronşic) (ZN, 400x ).

Figura 9. Prezenţa în număr extrem de mare a bacililor BAAR la nivelul unui limfonodul mediastinal.

II.VI. PROFILUL EPIDEMIOLOGIC AL TUBERCULOZEI LA PERSOANELE BOLNAVE DIN JUDEŢELE NORD-VESTULUI TRANSILVANIEI ÎN PERIOADA 2004-2008

Investigaţiile bazate pe metodele epidemiologiei descriptive, s-au desfăşurat pe parcursul a

5 ani (2004-2008), datele obţinute fiind centralizate şi prelucrate în grafice sub formă de indicatori de incidenţă. Calcularea valorii incidenţei s-a efectuat cu ajutorul formulelor de calcul cunoscute prin utilizarea testului Fisher din cadrul analizei categoriale în system ANOVA cuprins

15

în programul GraphPad InStad 3.0. (Toma, 1996 ; Thrusfeild, 2007). Rezultatele se pot observa in tabelul 6.

Tabel 6

Nivelul incidenţei în judeţele studiate în anii 2004-2008.

Anul Incidenţa(%000)

2004 93,9 2005 89,2 2006 92,6 2007 94,1 2008 145,8

Investigaţiile efectuate în 5 judeţe din regiunea de Nord-Vest a Transilvaniei au relevat

faptul că epidemiologia cazurilor de tuberculză din zona cercetată se regăseşte în situaţia generală de pe întreg teritotiul României.

Incidenţa pe perioada luată în studiu a cunoscut fluctuaţii destul de mari mai ales în anul 2008 145,8%00. Aceasta incidenţă nu reflectă neapărat numărul real de îmbolnăviri deoarece pe parcursul studiului definirea cazului de tuberculoză a suferit modificări majore ceea ce conduce la calculul eronat a unor indicatori epidemiologici mai ales a incidenţei pe o perioada mai lungă de timp.

II.VII. INVESTIGAREA UNOR METODE DE DIAGNOSTIC ALE TUBERCULOZEI LA OM

Testele au fost efectuate pe 23 de probe de sânge provenite de copii şi 27 de adulţi internaţi ăn cadrul Spitalului de Pneumoftiziologie Leon Daniello Cluj. Probele de sânge provenite de la copii au fost recoltate de la toţi copii supuşi testului alergic. Adulţii testaţi au avut vârste cuprinse între 25 şi 65 de ani. un număr de 13 proveneau din mediul urban iar restul din mediul rural. Ca teste complementare de laborator s-au efectuat: dozarea hemoglobinei (metoda clasică), hematocrit (în capilare), VSH, leucocite totale, hematii (spectrofotometric), fibrinogen, proteina c reactivă (precipitare în tub capilar).

Rezultatele obţinute la analiozele de laborator arată că acestea sunt utile în evaluarea caracterului activ sau inactiv al tuberculozei, în aprecierea eficienţei terapeutice, în evaluarea caracterului activ sau inactiv al tuberculozei, în aprecierea eficienţei terapeutice (criteriul bacteriologic nefiind întotdeauna posibil) ca şi evaluarea unor eventuale efecte negative ale tratamentului şi monitorizarea unor afecţiuni asociate.

II.VIII. INVESTIGAŢII IMUNOLOGICE PRIVIND IMPLICAREA FACTORILOR IMUNI ŞI MECANISMELE INDUSE DE INFECŢIA TUBERCULOASĂ LA ADULŢI ŞI COPII În cadrul acestui experiment s-au utilizat aceleaşi teste imunologice ca şi cele utilizate la bovine. Pentru evidenţierea efectelor induse de infecţia cu M.tuberculosis asupra organismului

16

uman s-au evaluat efectele asupra reactivităţii imune mediate celular specific şi nespecific. Rezultatele obţinute la copii nevaccinaţi BCG au fost comparabile cu cele de la bovine însă

la adulţi au fost mult mai mari.

II.VIII.3. INFECŢIA CU MYCOBACTERIUM BOVIS ÎN RÂNDUL POPULAŢIEI UMANE

Toate persoanele internate şi anchetate în cadrul Spitalului de Pneumoftiziologie Leon Daniello Cluj au fost supuse tuturor testelor reglementate în vederea izolării şi identificării tulpinii de micobacterie responsabilă de patologia existentă. S-au anchetat 2965 de persoane care au provenit din medii de viaţa diferite cu cultura diferită şi vărste diferite.

În urma examinării caracterelor culturale ale coloniilor identificate pe mediile de cultură însămânţate cu material patologic provenit de la fiecare bolnav în parte, s-au identificat bacilii tuberculoşi din speciile M. tuberculosis var. hominis în proporţie de 98%, restul de 2% fiind M. africanum iar la o persoană M. kansasi (această micobacterie este considerată non tuberculoasă). În acest context nu este exclus ca bovinele să fie sursă de Mycobacterium tuberculosis pentru om în condiţiile în care ele pot fi sănătoase, fără să exprime nimic sugestiv clinic sau alergologic. Birişescu (1991) consideră că bacilul uman nu provoacă îmbolnăviri în rândul animalelor însă Dunn (1995) relatează infecţii pulmonare la şoareci atât cu tulpina bovină cât şi cu cea umană

020406080

100120

M. tuberculosis M. africanum

%

%

Figura 11. Incidenţa tulpinilor micobacteriene.la persoanele anchetate Datorită existenţei acestui tip intermediar nu putem exclude riscul zoonotic pe care-l

reprezintă bovinele bolnave. Acest lucru, deoarece, în diagnosticarea tuberculozei bovine (conform legislaţiei în vigoare) nu sunt incluse şi testele biochimice, posibilitatea ca bovinele să fie infectate şi cu M. africanum şi nu doar cu M. bovis, fiind prezentă.

CONCLUZII

• Tuberculoza bovină şi umană este prezentă în rândul populaţiilor bovină şi umană în

judeţele studiate, cu o incidenţă variabilă, fiind răspunzătoare de pierderi şi

îmbolnăviri cu repercursiuni uneori dramatice la copii şi adulţi.

• În unele judeţe din cele luate în studiu riscul tuberculozei este scăzut la ambele specii

studiate, unele păstrându-şi chiar indemnitatea pe perioada evaluată.

17

• Testele intradermice au permis ierarhizarea indivizilor testaţi în categoriile

(pozitiv, neconcludent şi negativ, pentru bovine, respectiv pozitiv şi negativ pentru

copii), din punct de vedere al sensibilităţii tuberculinice.

• Monitorizarea evoluţiei TB prin calcularea unor indici epidemilogici a arătat că la om

incidenţa în mediul urban este crescută faţă de cea existentă în mediul rural.

• Testul EIAs- este o tehnică standardizată, însă specificitatea şi sensibilitatea acesteia

ridică probleme, pretându-se mai mult pentru diagnostic de grup .

• Colectarea datelor, utilizarea lor stocarea şi prelucrarea prin tehnici biostatistice ar

oferi o şi mai eficientă strategie de prevenţie şi control a tuberculozei la bovine dacă s-

ar urma modelul DOTS de la om.

• Evaluarea incidenţei tulpinilor micobacteriene a fost posibilă doar la nivelul judeţului

Cluj, unde în urma consultării arhivei laboratorului microbiologic din cadrul Spitalului

de Pneumoftiziologie s-a constatat că M. tuberculosis a fost izolat în proporţie de peste

98% restul îmbolnăvirilor fiind determinate de contaminarea cu M. africanum şi

M.kansasi. Aceste rezultate nu exclud însă potenţialul zoonotic a lui M.bovis.

• Evaluarea nivelului numeric şi funcţional al liniei albe leucocitare a demonstrat

implicarea acestora în protecţia imună antituberculoasă.

• Lipsa reactivităţii la bovinele NCL ar putea fi pusă pe seama modificărilor fiziologice

imune asociate cu vârsta sau pe absenţa micobacteriilor patogene.

• Pozitivitatea alergică la testarea intradermică cu tuberculină este însoţită de creşterea

concentraţiei imunoglobulinelor circulante. Nivelele acestui parametru sunt crescute la

copii coparativ de bovine, însă cea mai mare valoare a fost obţinută în absenţa reacţiei

cutanate (IDR-BK+).

• Analizând concentraţiile complexelor imune circulante (CIC) se constată că evoluţia

lor dependentă de categorie este similară cu cea din cazul imunoglobulinelor, ierarhia

fiind: categoria pozitiv, categoria recontrol, categoria negativ. La copii, nivelele

acestui parametru sunt mult diminuate comparativ cu bovinele, probabil datorită

activării eliminării complexelor.

• Testul de înglobare a particulelor de carbon se dovedeşte util în urmărirea activităţii

fagocitare, dependent de reactivitatea cutanată. Cu toate că în comparaţie cu lotul

sănătos, activitatea fagocitară la animalele reacţionate la testarea tuberculinică este mai

slabă, tuberculina bovină pare să aibă un uşor efect stimulator. Tuberculina bovină

18

acţionează cel mai intens la copii cu IDR+ BK negativi (lot „sănătos”).

Tuberculina umană are efecte la loturile BK+.

• Urmărindu-se valorile medii obţinute în testul de transformare blastică, se constată că

blastizarea limfocitară spontană este diminuată, dar apropiată de cea normală,

caracteristică speciei. Reactivitatea celulară in vitro la copii este mult crescută, cei din

loturile BK+ prezentând valori ale indicilor mai reduse decât lotul IDR+ BK negativi.

Reacţiile cele mai intense se întâlnesc la lotul BK-.

REASONS

Seen in humans and many species of domestic and wild mammals and birds, tuberculosis is an infectious disease such contagious, produced by the germs of the genus Mycobacterium.

In Western Europe the incidence of infection in cattle is less than 1% and in Canada and the U.S. rate is low (Perianu, 2003). In Romania, due to increase in the control and prevention, infection rate fell considerably during 1990-2001, but were recorded values increased incidence in the next 5 years.

Tuberculosis infection has a very important health being one of the most widespread and most serious zoonoses (Vordermeier, 2006). Generally a person can become infected with all 3 types of mycobacterian pathogens contained in Mycobacterium complex, studies show that last hours and some species nontuberculous (NTM) (Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum) Marinum Mycobacterium, and Mycobacterium avium / intracellular complex (MAC) cause disease in both humans and animals (Foo, 2009).

Investigation of changes in humoral and cellular reactivity tuberculosis allows the evaluation of the dynamic process morbid and accurate expression of prognosis (Barnes and col., 2002, Pop and col., 1997).

Hewinson and Vordermeier (2003), after numerous inquiries regarding tuberculosis infection and the defenses of the body (human and animal) to it, concluded that the immune response in bovine tuberculosis caused by M. bovis closely mimics that of induced Mycobacterium tuberculosis in humans. Orme (2005) disagrees with them, showing him that the immune response to infection with bovine strain is seen in the formation of granuloma characterized by a substantial process of mineralization with the formation of large lesions macros the lung and lymph nodes.

For that reason but also because of the negative aspects that arise in conducting large-animal experimental protocols, most existing data at this time in the literature derived from research conducted on human and murine in vivo models. Although these results can be extrapolated to cattle to serological diagnosis early and used to imagining some vaccines more effective, though some researchers have taken in recent years, experimental protocols in cattle artificially infected, most often in parallel with murine models.

The results obtained in vitro are at least promising to obtain new generation vaccines. This should provide a solid immunity in cattle to destroy epidemiology chain which, unfortunately, in recent years threatens the cattle populations worldwide and public health.

19

Both internationally by World Health Organization (WHO) and United Nations, Food and Agriculture Organization (FAO), and in each country by veterinary bodies, special

attention will be given the knowledge of frequency and distribution of these diseases and developing control measures, which are related primarily to the elimination of circuit "animal"(Pop, 2003).

Tuberculosis infection is bacterial origin caused by mycobacterium found in Mycobacterium tuberculosis complex. Tuberculosis infection in cattle can be caused by M. bovis, M. africannum, believed to be with characters intermediate between var. bovis and lime tuberculosis or M. avium human type (Cousins, 2001).

Research conducted recently shows two new species found in M. tuberculosis complex which causes tuberculosis in cattle: M caprae pathogenic for goats and M. pinnipedii pathogenic for seals and lions. Both species have zoonotyc nature and cause disease among ruminants.

Disease caused by var. caprae not considered to be fundamentally different from that produced by var. bovis ( Aranaz and col., 2003, Prodinger and col., 2005).

In Romania, during 1998-2008 were not detected cases of infection with Mycobacterium bovis in humans, in patients from NV Transylvania (data from the National Reference Laboratory for Food & Cooking Cluj County Hospital), given that in most counties region was diagnosed and confirmed disease in cattle (Veterinary Health Directorates data).

Modern pneumology considered, irrespective of the body infected with bacillary injury, the whole body participates in morbid process, and the presence in the body of germs of complex mycobacterium infection causes a state of reactivity private, non-assignable by sera of sick animals.

To assess immunological changes in tuberculosis and immune mechanisms involved in defending the body were used different methods. Induced hypersensitivity is evidence that state involvement in the determinism of the cellular component of the immune system: macrophages, T lymphocytes, B lymphocytes (Liebanna and col., 2001).

Today is more clear-cell involvement in the fight against micobacteria incompletely elucidated in humans and cattle, there are many questions about the presence of these cells in the lesion focus. Japanese researchers studies (Lai and Shen, 2003), the role of lymphocytes in human tuberculosis, show that primary infection with bacteria from complex two-phase Mycobacterium induce an immune response.

Cell activated macrophages are holding role in antimicrobial resistance expression. Macrophages that enter the lesions under the influence of chemotactic factors. Depending on the state of activation, macrophages containing bacteria inactive, destroyed, or rather the multiplication phase. Bacilli enzymatic degradation leads to release of mycobacterial fractions and under the action of inducing them epiteloide cells appear as forms of differentiation of macrophages. Epiteloide cell enzyme content has a rich, very low mitotic potential and contains only occasional bacillus. Numerous studies, Solano, 1999, Ustinov, 1999, Mason 2001, Tupasi, 2003, etc.., Demonstrating the involvement of these cells in the defense of tuberculosis and beyond.

Current diagnostic tests used in tuberculosis are classic tests, whose utility was already without their specificity as to be demonstrated (Costan, 2007).

In the tinctorial affinity, researcher Romarokoto (2002), stresses the affinity of all the bacteria Mycobacterium group for the colors used in Ziehl-Neelsen method and not auramina, indicated by some researchers in the period 1998-2000 (Cauchoix, 2002). During 1995-1997, the Republic of Moldova, Crudu (1995), studying the possibility of identifying mycobacterial staining method for AFB (Acid Fast bacilli) using the method for sputum samples and

20

apreciazaceă this technique as a very good, with high specificity compared classical Ziehl-Neelsen method.

In cattle there are specialized data point confirming the isolation of M. bovis in sputum. Whelan (2005) tried the technique from nasal secretions on the grounds that the cattle through the muzzle and nostrils are cleaning mirror without reinfestation that satisfactory results (Bob, 2007).

The test version of sandwich immunoassay tests (EIAs) of the test based on detection of interferon gamma (GIFN) released by sensitized T lymphocytes of cattle and those infected in the presence of mycobacterial antigens. Determination of gamma interferon is a modern technique (Rothel and col., 1992), recently applied for diagnosis of bovine tuberculosis in Romania by BOVIGAM test (Manea and Manea, 2004). Assessment has been made compared to allergic skin test, which have the widest application in the world today. (Costan, 2007; Vasiu, 2007).

PART II - PERSONAL RESEARCH

WORKING HYPOTHESIS In vitro experiments can provide conditions similar to those of the body, but may also

allow the assessment of the effects of substances that can have positive influence to maintain health by stimulating potential defense. Monitoring of the potential influence tuberculosis infection, found on skin reactivity in cattle on some of the sides of the immune response involving both humoral effectors and cellular effectors with different roles, allows diagnostic assessment of these techniques.

MONITORING OF INDICES OF TUBERCULOSIS EPIDEMILOGICI BOVINE

ANIMALS IN COUNTIES REGUNII SOME NORTH WEST OF TRANSYLVANIA IN THE PERIOD 2004-2008

Epidemiological investigations of bovine tuberculosis in direction were made during 2004-

2008. Were processed and enhanced a number of multi-annual data on the evolution of bovine

tuberculosis in some counties in North Western Transylvania. Data processing was carried out by various mathematical methods, the simple average multi strings to use established formulas for setting some epidemiological indicators: prevalence and incidence.

Benchmarking indication tests infection of bovine animals considered for the study period 2004-2008.

In this chapter we follow the results of the benchmarking tests and allergy dosing used gamma interferon and histopathology for confirmation of M. bovis infection in cattle suspected. It has been estimated by using statistical software to test allergic intrinsic value (sensitivity, specificity) value was correlated with the horse factor r with the results of the Bovigam test.

All these investigations on how the diagnosis of bovine tuberculosis were outlined taking into account that there is a difference of principle between how the disease confirmed in cattle than other species. This difference relates to the fact that, as long as all other species including man, is suspected of tuberculosis, based on clinical observations or necropsy, the suspicion is required to be verified through other examinations, where bovine tuberculosis is imperative

21

suspected to occur in the allergic examination, conducted a systematic year on all cattle (healthy), with positive results on allergic test is then confirmed by other examinations is a

diagnostic possibility ofγImmunoassay tests test EIAs IFN- exploitation that could eliminate a significant percentage of allergic test errors, avoiding the killing of precious animals in the herd infected or maintenance of cows infected with M. bovis, with tuberculosis infection in early stages. Starting as body invasion and proliferation of pathogenic environmental mycobacterium.

MYCOBACTERIUM BOVIS EVALUATION OF THE EFFECTS INDUCED IMMUNE SYSTEM OF BOVINE.

To achieve this goal were testing for highlighting non-specific and specific cellular immune effectors alike. Immunopathology to describe interrelations with infected bodies was carried out: estimating the total number of leukocytes was determined leucocytes formula, phagocytosis activity, total immunoglobulin and circulating immune complexes. Tests conducted on the implication effectors have targeted specific immune monitoring activity of leukocytes blastizations (TTB) and quantification of dosage gamma IFN correlated with other immunological tests in diagnosis of tuberculosis in cattle.

EPIDEMIOLOGICAL PROFILE OF TUBERCULOSIS IN THE COUNTIES ILL NORTHWESTERN TRANSYLVANIA THE PERIOD 2004-2008

It is clear that the epidemiological profile of Mycobacterium tuberculosis infection in counties considered for the study during 2004-2008 may provide important data on disease extinction in one time unit and by conducting epidemiological investigations in which patients are subjected to can shape mode of transmission of infection in the community and from family member.

In this chapter were monitored incidence and prevalence in adults and young people, also have evolved wish to use in monitoring the epidemiological evidence against childhood tuberculosis.

INVESTIGATION OF METHODS OF DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS IN HUMANS

Methods of diagnosis of tuberculosis in humans differ from child to adult. Therefore in this chapter to test the effectiveness of allergic test in children correlated with the results of the radioiodine is known that children sputum examination is negative.

With an allergic skin test in adults is of great use, have tested other diagnostic methods to confirm or refute the disease. The tests are used in all hospitals in Romania to confirm infection Mycobacterium tuberculosis are sputum examination, radiological examination and blood biochemistry.

IMMUNOLOGICAL INVESTIGATIONS ON FACTORS INVOLVEMENT IMMUNITIES AND INCURRED BY INFECTION MECHANISMS ON HUMAN TUBERCULOSIS

Issuing of tests in this chapter are started from the statements of scientists on the immune response in tuberculosis. They showed that immune profile of bovine tuberculosis that mimics closely that of tuberculosis in humans. In this context we conducted the same tests as in the case of bovine immune after we benchmarked the results. ZOONOTIC POTENTIAL ESTABLISHMENT OF BOVINE TUBERCULOSIS

This chapter was designed to determine the zoonotic potential of bovine tuberculosis in the period under study from the premise that if the incidence has been increasing in recent years both in cattle and humans and M. bovis infection in humans is the most serious zoonosis, it is possible

22

that cattle may have been the source of the pathogen in a proportion higher than that recorded in previous years.

Have been investigated all persons admitted to hospital Pneumology Leon Daniello Cluj-Napoca ago that established the source of the pathogen, the influence of external environment in the pathology of infection, the role of sick in the transmission of infection.

II.I. MONITORING OF EPIDEMIOLOGICAL INDICATORS OF TUBERCULOSIS DESCRIPTORS OF BOVINE IN SOME COUNTIES FROM NORTHWESTERN OF TRANSYLVANIA

To achieve more efficient programs epidemiological surveillance should be known as more epidemiology aspects of tuberculosis especially since the disease is considered an zoonosis with danger to public health (by Kant and col., 1998; Reider, 1999; Stoicescu and col.2002; Moga- Manzat, 2002).

Epidemiological investigations of bovine tuberculosis in direction were made during 2004-2008 in all animals tuberculin five counties of North-West region of Transylvania, which was marked generic: A, B, C, D, E.

The research undertaken aimed at analysis of epidemiological indicators of tuberculosis infection using descriptive epidemiology techniques - conducted for the frequency and dynamic knowledge of tuberculosis outbreaks analyzed. The results of this study show that only one county is free and the rest faced a low risk of TB in cattle.

II.II. ASPECTS OF ANALYTICAL EPIDEMIOLOGY

In order to establish causal relationships in tuberculosis in cattle, we considered it important to identify circumstances that facilitate transmission of disease and increased risk and its evolution in animal populations.

In this regard we appeal to quantify risk by analyzing the statistical association between illness and age factor that may intervene in its evolution. The relative risk was expressed by calculating odds ratio (OR), the formula used in epidemiological investigations such as CASE-Mart (Thomas and col., 1998; Bouyer and col., 1994, Thrusfield, 2007). Statistical validity of the results, that the odds ratio value was expressed according to the 95% confidence interval (CI 95%) and the index of probability p, calculated by using Fischer Test in categorical ANOVA analysis system - program GraphPad InStat (Schwartz, 1992; Motulsky, 2004).

For this investigation we have consider age a major risk factor because of the average relative risk, expressed by odds ratio. To its value was in the period 2004-2005, with a 2.21 confidence interval (CI 95%) of between 1.15 and 6.09 and indicate a probability p 0.01 (statistically significant) during 2006-2008, the odds ratio was 3.25, confidence interval (CI 95%) as an index 2,15-10,21 with probability p = 0.01 (statistically significant).

23

Table 1 The classification of the cattle in order to quantify the “age” risk factor (2004-2008).

II.III. MYCOBACTERIUM BOVIS EVALUATION OF THE EFFECTS INDUCED IMMUNE SYSTEM OF BOVINE

The study was carried on a representative sample of 79 cattle from private households or farms in northwestern Transylvania. The breed of cattle was local (90%) and 10% Holstein and indigenous breeds mixed.

In this experiment tests were performed to detect an immune-mediated non-specific reactivity (total number of white blood cells, determining the leucocytes formula and phagocytosis activity, assays of total immunoglobulin and circulating immune complexes) and specific (gamma IFN dosing and monitoring blastization activity.

II.III.1.1.1. Total number of withe blood cells Dynamics of the total number of leukocytes in bovine reagents can be seen in figure 1

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

1 2 3 4

who

le le

ucoc

ytes

P NCL

Figure 1. Graphic interpretation of whole leukocyte counts to P and NCL bovines

Analizated factors

A:calves 6w –6m with tuberculosis

B: calves 6s -6 l with negative skin

test 2004 - 2005

2006 - 2008

2004 - 2005

2006 - 2008 Age 6 weeks -

6 monts 18 15 4125 4015 C: Bovine with

tuberculosis D: bovine with

negative skin test 2004 - 2005

2006 – 2008

2004 - 2005

2006 - 2008

Bovine over 6

monts 143 73 101.575 175532

24

If the reagents placed bovine NCL (inconclusive), the average total number of leukocytes counted on one mm3 of blood fall into the normal range of species (7680) were not statistically significant (p> 0.05) in the reagents P (positive) that is well above the upper limit (9060) ((p <0.01) values are statistically signifiance.

In correlation with skin reactivity the results obtained from the total number of leukocytes is apparent that the bovine P and NCL is a positive correlation between changes but is not guaranteed statistically (p> 0.05) in any category of cattle react.

II.III.1.1.2. Determination of leucocyte formula

As can be seen from table 2 exist positive correlation between total leukocyte and subpopulation neutrophils, eosinophils, bazolphils being provided mathematical correlation (p <0.01) but the correlation is negative to monocytes and neutrophils statistically insignificant (p> 0, 05).

Table 2 Means and standard deviations values of all leucocyte subcategories to P and NCL bovines

Categories of leucocytes Categories N E B L M

Total no of

leucocytes Mean 27,6 2,7 2,25 61,4 7,7 8170 St.dev. 3,2 2,1 1,09 3,17 2,83 0,885 rLt- % 0,190 0,186 0,320 0,484 0,01 -

II.III.1.1.3. Determination of the fagocytosis activity

Variants of this test for carbon particles embed in vitro are presented in Table 3. The comparative assessment of the results for the two exposure times, one may note that the

dynamics that incorporation rate of carbon particles is similar to 20 or 40 minutes, realizing the proportional decrease. It is possible therefore that increased phagocytic activity to take place in positive cattle in the first 20 minutes of contact with ink. Bovine and avian tuberculin stimulation led to a decrease in phagocytic activity.

25

Table 3

Experimentale Variants Experimentale Variants

Blood (ml)

Ink (μl)

Tb-Ta (μl)

Mixture in NaCl 9%

Variant (M) 0,5 1,5 - 100

Variant (Tb) 0,5 1,5 6 100

Variant (Ta) 0,5 1,5 6 100

II.III.1.1.4. Quantitative detection of the whole gammaglobulines

The result obtain of the quantitative detection of the whole gammaglobulines are in Table 4.

Table 4 The total gammaglobulins values for samples of diferent TCS reactivity categories.

Criteries Positive Inconclusive Negative Mean 0,183 0,157 0,138

Std. Dev. 0,005 0,054 0,049

Following the results obtained, it is noted that although the differences are not significant (the insured and mathematically, p> 0.05) serum positive animals are higher than concentrations recorded at the other two groups (recontrol and negative). This suggests that infection M.bovis induces an increase in total immunoglobulin.

II.III.1.1.5. Quantitative detection of the circulatin immune complex

Values obtained from assays of circulating immune complexes have not been clearly regarding positive group and the group recontrol while negative values are only slightly smaller. However, the evolution parameter is similar to that of immunoglobulin.

Because differences between groups are so small it's hard to say whether tuberculosis infection significantly influence the formation of circulating immune complexes in cattle. However, higher values, constantly occurring in the positive group, suggesting this possibility.

II.III.2.1. MONITORING OF THE ACTIVITY OF BLAST TRANSFORMATION LEUCOCYTES

26

Test results of processing of this the experiment found in Table 5. After as you can see was obtained for a version control blast index of 76.63 and 98.66 for PHA of the animals

reacted positively.

Table 5 Stimulation incidators in blast transformation test to Positive and Inconclusive bovines

Categories Pozitive

M PHA Alc E. ang.E.

purp. TA TB

Mean 76,63 98,664 61,765 73,135 56,266 92,966 70,80

Recontrol

Mean 82,10 86,765 85,890 91,576 75,030 85,599 92,37

St. Dev. 9,844 16,801 15,350 10,940 16,170 10,805 7,459

For samples stimulated the highest value was obtained from E. angustifolia (73.13), followed by E. purpureea (58.26). On stimulation with specific preparations (avian tuberculin and bovine tuberculin) were obtained as expected the highest values of blast indices 70.80 to 92.96 respectively. The category recontrol the highest value was obtained after stimulation with Tb (average over 90.00) followed by E. angustifolia with an average of 91.567 and the choice of working values were always higher than the positive animals.

II.III.2.2. QUANTITATIVE DETECTION OF GAMMAINTERFERON AND THEIR PRACTICE SIGNIFICANCE

In determining significance in the diagnosis of tuberculosis and dosing gamma IFN estimate its practical importance in the study were taking a number of 79 cattle. After conducting TCS (simultaneously balancing test), the unit of origin, 104 cattle were placed in category recontrol and 45 in the positive category. The results revealed the following categories of animals: • TCS cattle reacted positively and positive Bovigam • TCS cattle reacted positively and negatively Bovigam • TCS inconclusive and Bovigam cattle reacted positively • TCS inconclusive and cattle reacted negatively Bovigam • Cattle reacted positively to you and negative Bovigam • NCL cattle reacted positively to the TU and Bovigam • NCL cattle reacted negatively to you and Bovigam

Following the results obtained, we can say that the test is rather Bovigam diagnostic value

of diagnostic group than individual.

27

II.IV. COMPARATIVE EVALUATION OF IDENTIFICATION TUBERCULOSIS INFECTION TEST TO STUDIES BOVINE IN PERIOD 2004-2008

Investigations were carried of in cattle that were made and immune tests. Individuals

tested belonged to different categories of flows, most adult animals, dairy cows, with generally good state of maintenance.

II.IV.2. MATCHING TEST RESULTS OF HYPERSENSITIVITY WITH THOSE OF DOSING GAMMAINTERFERONE IN DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS

Analysis of correlation coefficients obtained suggests a weak correlation between positive skin test and Bovigam test results, whether positive or negative, obtained for stimulation with bovine tuberculin. These results are somewhat paradoxical, because the answer would have expected greater, as in the case of blast transformation test, boost with this type of tuberculin. Correlations set to boost tuberculin skin reaction and flu are similar, their significance was p <0.001 and proportional variation suggests the possibility of replacing the two tests with each other.

II.IV.3. CORRELATION BETWEEN HUMORAL IMMUNE EFFECTORS (IMMUNO- GLOBULIN AND CIRCULATING IMMUNE COMPLEX) WITH SKIN HYPERSENSITIVITY TESTS AND DOSING GAMMAINTERFERONE

The analysis results are found for positive TCS concentrations immunoglobulin category is statistically significantly correlated (p <0.001) both skin test results and with levels determined by optical density Bovigam.

Immunoglobulin concentration correlates with positive test results and Bovigam case recontrol category by TCS (r = 0.63, p <0.05).The statistical significance of correlation between CIC and metering equipment that TCS is Bovigam p <0.001.

Results from assays of CIC is positively correlated (r = 0.54) as for immunoglobulin concentration Bovigam results for TCS recontrol lot.

II.V. MICRORSCOPICAL AND PATHOLOGICAL ASPECTS OF SAMPLES TAKEN FROM BOVINE SLAUGHTERED FOR DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS

Pathological samples were from 69 cattle reagents which were to be slaughtered in order to confirm the diagnosis of tuberculosis. Sampling took place at slaughterhouses. Mycobacteria was revealed and isolated from nasal secretions from a ingle bovine tuberculosis.

28

Figure 2. Microscopic appearance of mycobacterium in nasal secretions

Figure 3. Cultural aspect of the nasal secretions of sick cattle for tuberculosis

Cattle from which the culture had a maximum response to tuberculin test and examination by cutting lung pathological anatomic resulting in a discharge foul-cheese in large amount. Following histopathological examination and bio testing (the guinea pig) has confirmed bovine tuberculosis on cattle taken in the study.

Figure 4. Cazeo-purulent collections combined with atelectazia of the apical lobe

Figure 5. Pulmonary hemorrhage and intense emphysema.

29

Figure 6. Retromamarian node hypertrophy, changes the section.

After necropsy and histopathological examination were reported numerous injuries that

were specific / specific for other diseases, which simultaneously developed with tuberculosis infection or skin test reactivity caused allergic sending cattle to slaughter without causing them to be sick with tuberculosis. Of the 69 cattle slaughtered at 17 (21.24%) was not subsequently confirmed tuberculosis.

Figure 7. Granulomatous pleuritis with epiteloide cells without caseous necrosis

Figure 8. Epitelioid granuloma with Langhans cells in the center, necrotic lymphadenitis (tracheobronhial node) (ZN, 400x).

Figure 9.The presence of extremely large number of BAAR.bacilli at a mediastinal limphonodule

30

II.VI. EPIDEMIOLOGICAL PROFILE OF TUBERCULOSIS IN ILL PERSONS INTHE NORTHWESTERN TRANSYLVANIA COUNTIES IN THE PERIOD 2004-2008

Investigations based on descriptive epidemiology methods have been developed over 5 years (2004-2008), data is centralized and processed in the graphic form of indicators of impact. Calculation of incidence was performed using known formulas for calculating the Fisher test using the ANOVA analysis system categories included in the program GraphPad InStad 3.0. (Thomas, 1996; Thrusfeild, 2007). Results can be seen in Table 6

Table 6 The level of incidence in the studied cunties in the years 2004-2008.

Year Incidence(%000) 2004 93,9 2005 89,2 2006 92,6 2007 94,1 2008 145,8

Investigations conducted in 5 counties in the Northwest region of Transylvania revealed

that epidemiology of the cases of tuberculosis in the investigated area is found in the general situation throughout Romania territory.

The incidence of the period under study fluctuated quite high especially in 2008 145.8% 00. This effect does not necessarily reflect the actual number of illnesses during the trial because the case definition of tuberculosis has undergone major changes leading to erroneous calculation of key indicators of the incidence of a particularly long period of time.

II.VII. INVESTIGATION OF METHODS OF DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS IN MAN

Tests were performed on blood samples from 23 children and 27 adults admitted to Pneumology Hospital Leon Daniello Cluj. Blood samples from children were collected from all subjects that made the allergic test. Adults tested were aged between 25 and 65. 13 came from a number of urban and from rural the rest.

As additional laboratory tests were performed: determination of hemoglobin (classical method), ht (the capillaries), ESR, total leukocyte, red blood cells (spectrophotometrically), fibrinogen, C-reactive protein (precipitation in capillary tube).

Analyzed laboratory results show that they are useful in assessing the active or inactive tuberculosis, in assessing therapeutic effectiveness in assessing the active or inactive tuberculosis, in assessing therapeutic effectiveness (germ criterion is not always possible) as the assessment of any adverse effects of treatment and monitoring of associated diseases.

31

II.VIII. IMMUNOLOGICAL INVESTIGATIONS ON FACTORS INVOLVEMENT INCURRED IMMUNITIES AND MECHANISMS OF INFECTION IN ADULTS AND

CHILDREN TUBERCULOSIS In this experiment were used immunoassay same as those used in cattle. To highlight the effects induced by infection with M .tuberculosis human body have assessed the effects on specific cell-mediated immune reactivity and nonspecific. The results obtained in BCG vaccinated children were comparable to those of adult cattle but were much higher.

II.VIII.3.INFECTION WITH MYCOBACTERIUM BOVIS WITHIN THE HUMAN POPULATION

All persons admitted and investigated the Leon Daniello Pneumology Hospital Cluj has undergone all the tests covered in the isolation and identification of mycobacteria strain responsible for the existing pathology. Were investigated in 2965 people who came from different living environments with different cultures and different ages.

After examining the cultural characteristics of colonies identified on culture media seeded with pathological material from each individual patient basis, tubercular bacilli were identified in the species M. tuberculosis var. hominis in 98%, the remaining 2% were M. africanum and a person M. kansas (this mycobacteria is considered non tuberculosis). In this context it is possible that cattle are a source of Mycobacterium tuberculosis to humans in conditions in which they can be healthy without express anything suggestive clinical or allergology. Birişescu (1991) believes that human bacillus does not cause illness in livestock but Dunn (1995) reported lung infection in mice both with and with the bovine strain of human.

020406080

100120

M. tuberculosis M. africanum

%

%

Figure 11.Incidence of Mycobacterium strains in individuals investigated

Due to such progress can not exclude the risk of zoonotic that it is diseased cattle. This is

because, in the diagnosis of bovine tuberculosis (as required by law) are not included and biochemical tests, the cattle can be infected with M. africanum and M. bovis not only being present.

32

CONCLUSIONS

• Bovine tuberculosis is present in human and bovine and human populations are responsible for large economic losses and serious illness with dramatic repercussions in children and adults.

• Skin tests allowed the ranking of individuals tested on categories (positive, negative

and inconclusive, for cattle, respectively for positive and negative for children), in terms of tuberculin sensitivity.

• Judeţele luate în sudiu se onfrntă cu un risc scăzut de tubercuoză unele păstrându-şi chiar indemnitatea pe perioada evaluată.

• Counties taken in study presented a low risk for tuberculosis some even retain the

allowance during the period evaluated.

• Monitoring the TB in the calculation of epidemilogical indexes showed that several

counties in the northwestern Transylvania face a high risk of contracting tuberculosis among the cattle and human population. In humans the incidence is high in urban areas compared to that in rural areas.

• Tests used to diagnose TB - laboratory: TU, TSC and / or EIAs are standard methods,

but their specificity and sensitivity are uncertain.

• Data collection, use storage and processing techniques and biostatistics would provide

a more effective strategy for prevention and control of tuberculosis in cattle if the human DOTS model would be followed.

• Analysis of the incidence of Mycobacterial strains was possible only in the Cluj

County, where in consultation archive microbiological laboratory of the Leon Daniello Pneumology Hospital Cluj was found that M. tuberculosis has been isolated for more than 98% remaining disease is caused by contamination with M. africanum and M. kansasi. These results do not exclude but M.bovis's zoonotic potential.

• Evaluarea liniei albe leucocitare a demonstrat implcaţia acestora în protecţia imună

antituberculoasă.

• Evaluation of the Leucocytes showed their involvement in tuberculosis immune

protection. • Lack of responsiveness to bovine NCL could be attributed to physiological changes

associated with age or immune absence of pathogenic mycobacterium.

33

• A positive allergic skin test is accompanied by increased concentrations of

circulating immunoglobulin. Levels of this parameter is increased in children compared to cattle, but the highest value was obtained in the absence of skin reaction (IDR-BK +).

• Analyzing the concentrations of circulating immune complexes (CIC) finds that class-

dependent trends are similar to those of immunoglobulin case, the chain is: class positive, recontrol category, the negative category. In children, this parameter is much reduced levels compared with cattle, probably due to activation of complex elimination.

• Test embed carbon particles would be helpful in tracking phagocytic activity,

dependent on skin reactivity. Although compared with healthy group, phagocytic activity in animals reacted to the tuberculin test is lower, bovine tuberculin seems to have a slight stimulating effect. Bovine tuberculin most intensive work in children IDR + BK negative (group "healthy"). Tuberculin has the effect lots BK +.

• Following the mean values obtained in the blast transformation test indicates that

spontaneous lymphocytic blastisation is reduced, but close to the normal, characteristic species. In vitro cell reactivity in children is much higher, those of BK + lots of indicators showing values lower than the batch IDR + BK negative. Most intense reactions to meet BK-group.

• Extractul de E. angustifolia exercita activitate stimulatoare, uneori chiar mai accentuata decat indicele spotan. În dozele ţi condiţiile experimentale utilizate, acest extract poate fi indicat drept compus complex cu efect imunostimulator celular atăt la bovine cât şi la copii.

• Extracts of E. angustifolia carries stimulating, sometimes more pronounced than

spontaneous index. The doses and experimental conditions used, this extract may be given as a complex compound having cell immuno-stimulating effect both in cattle and children.

34

SELECTIVE BIBLIOGRAPHY

Abe C. (2003) - Multidrug-resistant tuberculosis Nippon Rinsho. 2003 Mar;61 Suppl 3:202-6. Review

Acha PN, Szyfres B. (2006) Zoonotic tuberculosis. In: Zoonoses and communicable diseases common to man and animals. 2nd edition. Washington: Pan American Health Organization/World Health Organization; Scientific Publication No. 503.

Ambrus W. (2007) - Acid-resistant microorganisms: Mycobacteria, Nocardia, Rhodococci, chemical composition, biological properties antigenic structure. Probl. Tuberk;(5):54-8. Rewiew

Adetunde I.A. (2007) – The Mathematic models of the dynamical Behaviour of tuberculosis Disease in the Upper East of the Northen Part of Ghanna: a case study of Bawten, Research Journal of Applied Sciences 2(9):943-946

Alito A., McNair J., Girvin R.M., Zumarraga M., Bigi F., Pollock J.M., Cataldi A (2003) - Identification of Mycobacterium bovis antigens by analysis of bovine T-cell responses after infection with a virulent strain; Braz J Med Biol Res, Volume 36(11) 1523-153

Bajaj G., Rottan A., Ahmad P.(2000) – Circulating immune complexes in tuberculosis- an indicator of activity. Indian Journal of Pediatrics, 57(2):203-7

Barlan I., Bahceciler N.N., AkidisM., Akdis C.A. (2006) – Bacillus Calmette-Guerin, Mycobacterium bovis, as a immunomodulator in Atopic diseasse; Immunol Allergy Clin North Am., May 26(2):365-77

Barnes P.F., Grisso C.L., Abrams J.S., Band H., Rea T.H., Modlin R.L.(2002) – Gamma delta T lymphocytes in human tuberculosis. J.Infect-Dis; 165(3):506-12

Bob Michell (2007). Not a single one of the 1543 nasal mucosal samples including those from the 32 reactors found to have lung lesions - proved positive for M.bovis -Veterinary Times, March 2006, by, BVetMed.

Boesen H. (1995) - Human T-cell responses to secreted antigen fractions of M.tuberculosis. Infection and Immunity. 63(4): 1491

Bryce M. Buddlea,_, Margot A. Skinnera,y, D. Neil Wedlocka, Geoffrey W. de Lislea, H. Martin Vordermeierb, R. Glyn Hewinson (2005) - Cattle as a model for development of vaccines against human tuberculosis Tuberculosis (2005) 85, 19–24.

Buddle B.M., Rhodes S.G., Hewinson R.G., Vordermeier H.M. (2000) – Bovine tuberculosis : immune responses in the peripheral blood and at the site of active disease. Immunology vol. 99, issue 2, p. 195

Calmette A., Guerin C., Negre I., Bocquet A. (1927) – Sur la vaccination preventive des enfants noveau - ne,s contre la tuberculose par le BCG. Annu. Inst. Pasteur (Paris) 3 : 201-208 ;

Cauchoix B., Chanteau S., Rasolfo V., Ralamboson M. (2002) - Bacteriological follow-up of tuberculosis treatment: a comparative study of smear microscopy and culture results at the second month of treatment;Int J Tuberc Lung Dis. Oct; 6(10):909-12

Chambers M.A., Vordermeier H.M., Whelan A. (2003) - Vaccination of mice and cattle with plasmid DNA enconding the Mycobacterium bovis antigen MPB83. Clinical Infectious Diseases, vol.30, p. S283-S287

Charles O. Thoen, James H. Steele, Michael J. Gilsdorf; (2008) - Mycobacterium Bovis Infection in Animals and Humans (Second Edition) Blackwell Publishing

Chen L., Wang L., Zganiacz A., Xing, Z. (2004) – Single intranasal mucosal bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun ; 72(1) : 238-46 ;

35

Ciofu Carmen, Racoveanu I.(1998) – Multiresistent Mycobacterium bovis pediatric infection treated with Quinolone and Cycloserine-case report; ERS Viena, p.2427, pg. 368s.

Cornuy J, Fitting JW, Beer V, Chave JP.(2008) Mycobacterium bovis and AIDS. AIDS ;5:1038-9 .

Cosivi O, Meslin F-X, Daborn CJ, Grange JM.(2000) The epidemiology of Mycobacterium bovis infection in animals and humans, with particular reference to Africa. Scientific and Technical Review 1995;14:733-46.

Costan Adriana (2007) – Cercetări comparative privind utilizarea unor teste de diagnostic în tuberculoza bovină, teză de doctorat,

Flynn J.L. (2001) - Immunology of tuberculosis. Annu. Rev. Immunol. 19 : 93-129; Grange J.M. (1998) - The Mycobacteria; Microbiology and microbial infections, Ed. by

Topley and Wilson, vol.2: 110-117 Herman V., Cătană N., Paşcu Corina, Costinar L. (2004)- Planul de luptă în

tuberculoza bovină; Lucrări ştiiţifice USAMVB, Seria C, vol. XLVI-XLVII;pag. 332-336 Liebana E., Aranaz A., Mcnair A., Pollock J.M. (2001) – Cellular interactions in bovine

tuberculosis release of active mycobacteria by antigen stimulated T cells. Immunology, vol. 99(January), issue 1, page 23;

Marina Spinu, Monica Pop, Carmen D. Sandru, Gheorghe F. Brudasca (2005) - Humoral immune changes induced by differentiated treatment in varioous stages of human tuberculosis, European Respiratory Journal, vol. 26 supplement 49, p 4156, 656s

Mihaela Raduta, Monica Pop, Mihaela Carstoniu (2006) – Dinamica formelor severe de tuberculoza in randul copiilor din Cluj Napoca, in intervalul 1996-2005 Al 19-lea Congres National de Pneumologie, Cluj Napoca, 4-6.05

Monica Pop, R.Rajnoveanu, M.Man, C.D.Zamora, M.Goron (2006) – Evaluarea incidentei tuberculozei extrapulmonarein jud. Cluj in anul Al 18-lea Congres al Societatii Romane de Pneumologie, Sibiu, 22-24 aprilie, 2004

Mureşan V, Cîrstoniu M., Monica Pop. Analiza principalilor indicatori epidemilogici ai endamiei TBC în teritoriul arondat dispensarului TBC Cluj Napoca în 1998. Al XVI-lea Congres Naţional de Pneumologie, pag.235, Poiana Braşov,28-30 oct.1999.

Pop Monica (2002) Tuberculosis, Ed.Medicala Universitara Iuliu Hatieganu Cluj Napoca, p.261

Whelan A.O., McCorry T., Welsh M.D., McNair J., Hewinson R.G., Vordermeier H.M., Pollock J.M. (2005) – Shedding of Mycobacterium bovis in the nasal mucus of cattle infected experimentally with tuberculosis by the intranasal and intratracheal routes; Vet Rec. 2005 Nov 12;157(20):613-8. 1;157(26):849;

WHO/HTM/TB/2005.349.WHO Report 2005, 2008. Global Tuberculosis Control, Surveilance, Planning, Financing.