rezumatul tezei de doctorat - usamv cluj- · pdf filecu o serie de leziuni precum gastrita...
TRANSCRIPT
1
UUNNII VVEERRSSII TTAATTEEAA DDEE ŞŞTTII II NNŢŢEE AAGGRRII CCOOLL EE ŞŞII MM EEDDII CCII NNǍǍ VVEETTEERRII NNAARRǍǍ
CCLL UUJJ -- NNAAPPOOCCAA
–– ŞŞCCOOAALLAA DDOOCCTTOORRAALLĂĂ ––
FFAACCUULL TTAATTEEAA DDEE MM EEDDII CCII NNǍǍ VVEETTEERRII NNAARRǍǍ
MM AARRII AANN TTAAUULL EESSCCUU
RREEZZUUMM AATTUULL TTEEZZEEII DDEE DDOOCCTTOORRAATT
PPAATTOOLL OOGGII AA GGAASSTTRRII CCĂĂ LL AA AANNII MM AALL EELL EE DDEE CCOOMM PPAANNII EE ÎÎ NN
II NNFFEECCŢŢII AA CCUU DDII FFEERRII TTEE SSPPEECCII II DDEE HHEELLII CCOOBBAACCTTEERR
CCOONNDDUUCCǍǍTTOORR ŞŞTTII II NNŢŢII FFII CC
PPRROOFF.. UUNNII VV.. DDRR.. CCOORRNNEELL CCĂĂTTOOII
CCLLUUJJ--NNAAPPOOCCAA
-- 22001111 ––
2
REZUMAT
Infecţia cu H.pylori reprezintă una dintre cele mai frecvente infecţii bacteriene la om, fiind
răspândită în întreaga lume. S-a demonstrat că infecţia gastrică cu această bacterie este asociatã
cu o serie de leziuni precum gastrita erozivã, ulcerul peptic şi gastrita cronicã activã. De
asemenea este strâns corelată cu dezvoltarea adenocarcinomului gastric şi a limfomului MALT.
Diferite specii de Helicobacter cu localizare gastrică au fost identificate frecvent la animale, mai
ales la câini şi pisici, ele fiind prezente atât la câinii asimptomatici (60-100%) cât şi la cei cu
simptome de vomã cronicã (74-90%). Speciile gastrice de Helicobacter la câini includ H. felis,
H. Bizzozeronii, H. salomonis şi H. heilmannii. Coinfecţia cu una sau mai multe specii
bacteriene, uzual H. bizzozeronii şi H. heilmannii se întâlneşte la 15-20 % dintre câini (Kenneth
şi colab., 1999). Infecţia naturală la câine cu Helicobacter pylori este controversată. Chiar dacă
majoritatea autorilor o contestă, există autori care identifică bacteria pe baza tehnicii PCR
(Buczolits şi colab., 2003; Ogawa şi colab., 2005). Infecţia gastrică cu o serie de specii de
Helicobacter este de asemenea frecventă la pisici, fiind cuprinsă între 86-100%. La pisici au fost
identificate speciile: H. felis, H. heilmannii, H. pamatensis şi H.pylori (Handt şi colab., 1994).
Prezenţa bacteriilor H. pylori, H. heilmannii şi H. felis la câine, pisică şi om conform
literaturii de specialitate motivează studiul în direcţia investigării prevalenţei şi a mecanismelor
de patogenitate ale infecţiei cu H. spp la câini şi pisici ca şi posibile surse de infecţie cu
Helicobacter la om.
Structura cercetãrilor. Teza cuprinde un numãr de 272 de pagini, şi este structuratã în
conformitate cu prevederile legale actuale; în conţinutul acesteia sunt inserate un numãr de 172
de figuri (imagini, grafice, diagrame) şi 43 de tabele. În partea I sunt prezentate cele mai
importante şi concludente date din literatura de specialitate, referitoare la aspectele
etiopatogenetice ale infecţiei gastrice helicobacteriene la om, câine şi pisicã, principalele leziuni
gastrice asociate acestei infecţii, modalitãţi de diagnostic şi aspecte privind infecţiile
experimentale cu Helicobacter spp. la diferite animale de laborator. În partea a II-a sunt
prezentate cercetãrile proprii ce au vizat patologia gastricã spontanã asociatã infecţiei
helicobacteriene la câine şi pisicã (capitolele II.2, II.3, II.4 şi II.5), patologia gastricã
helicobacterianã comparatã la om, câine şi pisicã (capitolul II.6) şi în final patologia gastricã
experimentalã cu H.pylori la cobai (capitolul II.7). Partea bibliograficã cuprinde un numãr de
227 de titluri de lucrãri ştiinţifice din literatura de specialitate autohtonã şi strãinã.
3
Scopul acestor cercetări a fost de a evalua atât infecţia gastrică spontană cu diferite specii
bacteriene aparţinând genului Helicobacter la câine şi pisică sub aspect epidemiologic şi
patogenetic, cât şi infecţia gastrică experimentală cu H.pylori la cobai sub aspectul mecanismelor
patogenetice de la nivel gastric şi a sensibilităţii bacteriene in vivo faţă de un nou protocol
terapeutic ascociat cu probiotice.
Patologia gastricã spontãnã
În capitolul II.2. intitulat ,,Particularitãţi epidemiologice şi morfologice ale
gastropatiilor spontane la câine şi pisicã” sunt descrise principalele leziuni gastrice prezente la
cadavrele de câini şi pisici necropsiate în cadrul Disciplinei de Anatomie Patologicã pe perioada
1 octombrie 2007 - 1 august 2010 şi corelaţiile dintre aceste leziuni şi infecţia helicobacterianã.
Dintr-un număr total de 643 de câini, 73 (11.35 %) au prezentat leziuni gastrice la
examenul necropsic, iar în cazul pisicilor dintr-un număr total de 133 de cadavre, 25 (18.79 %)
au prezentat leziuni gastrice la examenul necropsic.
Evaluând categoriile de vârstă la care s-au dezvoltat leziunile gastrice, s-a observat faptul
că la câine leziunile cronice inclusiv polipii gastrici au părut la adulţi şi la câinii în vârstă mai
ales între 6-10 ani, respectiv peste 11 ani. La pisici nu a existat o uniformitate a leziunilor
gastrice la anumite vârste, cele mai frecvente fiind leziunile acute întâlnite între 3 luni şi 11 ani.
La câini, s-a observat faptul cã infecţia gastrică cu H.spp creşte proporţional cu vârsta, fiind
maximă la categoria de vâstã cuprinsă între 10-15 ani (100%), aspect întâlnit de asemenea şi la
pisici.
Gastrita erozivă acută a fost identificatã atât la câini (n=8/73 cazuri; 10.95%) cât şi la
pisici (n=8/25 cazuri; 32%), aceasta fiind caracterizatã prin necroze superficiale ale mucoasei
gastrice cu infiltrat neutrofilic discret. În 3 cazuri am descris dilataţie şi torsiune gastricã, în douã
dintre ele fiind prezentã şi infarctizarea mucoasei gastrice. Gastritele hemoragice au fost
evidenţiate în 4 cazuri (la doi câini şi la două pisici); trei din acestea au fost asociate intoxicaţiei
cu anticoagulante, iar în cel de-al patrulea caz, s-a confirmat anaerobiozã (caracter necrotic).
Ulcerele gastrice au fost prezente în 8/73 cazuri (10.95%) la câini, iar la pisici în 11/25
cazuri (44%), acestea fiind caracterizate prin leziuni unice sau multiple de necroză cu
discontinuitate tisulară şi lipsa de substanţă (mucoasă gastrică şi/sau alte straturi ale peretelui
4
gastric), având o morfologie cu aspect crateriform (escavat). Ulcerele cronice s-au deosebit de
cele acute prin prezenţa unor margini indurate, albicioase, răsfrânte peste cavitate.
Gastrita cronică a fost descrisã la 37/73 de câini (50.68%) şi la 3 pisici din 25 (12%), ca o
îngroşare neuniformã a mucoasei gastrice, uneori cu aspect de circumvoluţiuni cerebrale
(hipertrofia gigantã). La câine, în urma cuantificãrii intensităţii inflamaţiei cronice s-a observat
faptul că 21/37 (56.75%) din indivizi au prezentat gastrite cronice de gradul I, 10/37 (27.02%) au
fost cu gastrite de gradul 2 şi 6/37(16.21%) cu gastrite de gradul 3. Microscopic au fost
diagnosticate urmãtoarele tipuri: gastrită cronică superficială, gastrită cronică difuză, gastritã
cronicã atroficã, gastritã cronicã hipertroficã şi gastritã cronicã limfoid folicularã. De asemenea
au fost prezente şi o serie de leziuni preneoplazice, precum metaplazia intestinalã incompletã,
atrofia glandularã şi displazia epitelialã.
La câini, contrar literaturii de specialitate, corelarea gradului de colonizare bacteriană cu
markerii histopatologici ai inflamaţiei de la nivelul antrului, a relevat o semnificaţie statisticã
între densitatea bacteriană şi leziunea acutã (p<0.01), cronicã (p<0.01) şi modificările
preneoplazice (p<0.01). La pisici, s-a observat că în regiunea pilorică a stomacului densitatea
bacteriană cu H.spp se asociază cu severitatea infiltratului inflamator acut (p<0.01). Nu există
corelaţii semnificative statistic cu gradul hiperplaziei foliculare. La nicio pisică nu s-au observat
leziuni de tip metaplazic şi/sau displazic.
Polipii gastrici au fost prezenţi doar la câini la 15/73 de cazuri, aceştia fiind descrişi într-
un capitol ulterior. Neoplasmele gastrice au fost identificate la câini în 5 din 73 de cazuri
(6.84%), iar la pisici într-un singur caz din 25 (4%). La câine, tumorile gastrice au fost clasificate
astfel: adenocarcinom in situ (n=1), adenom tubulo-papilar (n=1), leiomiom (n=3). La pisică a
fost identificată o singură formaţiune tumorală gastrică reprezentată de un limfom MALT.
Examenul microscopic a evidenţiat în structura tumorilor epiteliale şi a limfomului MALT o
infecţie helicobacterianã severã.
Clinic, leziunile gastrice au dezvoltat o serie de simptome precum dilataţia rapidă a
stomacului cu torsiune gastrică, moarte subită în cazul intoxicaţiei cu anticoagulante, vomă
cronică (8/15 cazuri), pierderea greutăţii corporale (5/15 cazuri) şi sindrom de retenţie gastrică
(2/15 cazuri) în polipoza gastrică, hematemeză, melenă şi anemie în ulcerele gastrice acute şi/sau
cronice. În cele mai multe cazuri de gastrită cronică şi eroziuni gastrice proprietarii nu au relatat
simptome de suferinţă gastrică la animale. La animalele cu adenocarcinom gastric, limfom
5
digestiv şi neoplasme mezenchimale gastrice au fost relatate simptome precum vomă cronică,
diaree, slăbire progresivă şi sindrom de retenţie gastrică.
Numărul animalelor identificate cu infecţie helicobacterianã în urma examenului
histopatologic a fost de 62/71 de câini (87.32 %) şi 23/25 (92%) de pisici, procente
asemănătoare fiind relatate şi de către unii autori, precum Weber în 1958, Henry în 1987 şi Eaton
în 1996. Helicobacterii gastrici au fost prezenţi în toate regiunile stomacului, mai frecvent în
regiunea antrului piloric la câini (58/71; 81.69%) şi în regiunea corpului gastric (23/25; 92%) la
pisici.
Studiul de faţă a scos în evidenţă rolul infecţiei cu Helicobacter spp. în dezvoltarea
leziunilor gastrice la câine şi pisică. În al doilea rând s-a observat faptul cã leziunile de gastritã
cronicã helicobacterianã sunt asociate cu o serie de modificãri preneoplazice, acestea
reprezentând zone de dezvoltare a cancerului gastric asociat infecţiei cu H.spp, mai ales la câine.
În capitolul II.3. intitulat ,,Metode de diagnostic în infecţia gastricã spontanã cu
Helicobacter spp. la câine şi pisicã” sunt prezentate datele unui studiu comparativ între diferite
metode invazive utilizate în diagnosticul infecţiei gastrice cu Helicobacter spp. la câine şi pisicã.
Au fost utilizate doar metode invazive, ce au necesitat prelevarea de mucoasã gastricã, deoarece
studiul s-a realizat exclusiv pe cadavre de câini şi pisici.
Metodele utilizate în diagnosticul infecţiei cu Helicobacter se clasifică în funcţie de
indicatorul de infecţie urmărit astfel: metode directe, ce vizează identificarea bacteriei din
biopsiile de mucoasă gastrică sau din cultura de bacterii (examenul morfologic, citologic,
bacteriologic şi molecular - genetic) şi metode indirecte, care se bazează fie pe identificarea
anticorpilor induşi de prezenţa bacteriei, fie pe determinarea produşilor rezultaţi în urma
activităţii ureazei bacteriene (testul respirator, examenul serologic şi testul ureazic rapid din
biopsii gastrice). Lipsa unui consens în literatura de specialitate în ceea ce priveşte
diagnosticarea infecţiei gastrice helicobacteriene la câine si pisică, precum şi lipsa unui “protocol
de aur”, standard, similar celui de diagnostic al infecţiei cu Helicobacter pylori la om, ne-a
determinat să recurgem la aceast studiu ce are ca şi scop identificarea infecţiei gastrice cu
Helicobacter spp. la câini şi pisici prin diferite metode de diagnostic invazive.
6
Compararea metodelor de diagnostic între ele sub aspectul sensibilităţii şi specificităţii,
respectiv identificarea infecţiei gastrice cu Helicobacter pylori prin tehnica imunohistochimică
reprezintă principalele obiective ale studiului de faţă.
Pentru examenul citopatologic, testul ureazei şi examenul histopatologic au fost utilizate
fragmente de mucoasă gastrică (probe) recoltate din cele trei regiuni ale stomacului (cardia, corp
şi antru) provenite de la 71 de cadavre de câini şi 25 de pisici. Pentru examenul microbiologic
cultural au fost recoltate probe de la 20 cadavre de câini şi 10 cadavre de pisici. Pentru metoda
Giemsa s-au folosit 20 de probe de la câini şi 10 de la pisici, iar pentru tehnica
imunohistochimică cu Ac anti-Hpylori au fost utilizate 30 de probe de la câini şi 10 de la pisici.
Pentru analizarea eficienţei diferitelor metode de diagnostic s-au luat în considerare
următoarele aspecte: Sn (%) , Sp (%), VPP (%) şi VPN (%).
Infecţia helicobacteriană a fost identificată în fragmentele de mucoasã gastricã prelevate
de la cadavrele de câini şi pisici prin toate metodele de diagnostic utilizate în acest studiu, dar în
procentaje diferite.
În cazul utilizării testului ureazei, interpretarea pozitivităţii infecţiei cu Helicobacter spp.
urează pozitive s-a realizat la diferite intervale de timp, acestea fiind asociate diferitelor grade de
infecţie de la 1 la 4 astfel: gradul 0 (negativ la 48 de ore), gradul 1 (pozitiv la 48 de ore), gradul 2
(pozitiv la 24 de ore), gradul 3 (pozitiv la 4 ore), gradul 4 (pozitiv la 1 oră). Prin această metodă,
infecţia helicobacteriană a fost evidenţiată la 66/71 de câini (92.95%) şi la 100% din pisici.
Identificarea infecţiei şi aprecierea rapidă a numărului de organisme bacteriene spiralate
aparţinând genului Helicobacter de la nivel gastric s-au realizat în urma examinării lamelor cu
amprente de pe suprafaţa mucoasei gastrice din diferite regiuni. Bacteriile ce aparţin genului
Helicobacter s-au colorat în albastru intens în cazul coloraţiei Diff Quick-Panoptic, fundalul
fiind deschis la culoare. În cazul coloraţiei Gram, bacteriile fiind negative s-au colorat în nuanţe
de roşu (acidofile). Prin aceastã metodã infecţia helicobacterianã a fost identificatã la un numãr
de 66/71 de câini (92.95%) şi 21/25 de pisici (84%), obţinându-se rezultate asemãnãtoare testului
ureazei. Helicobacterii gastrici au fost evidenţiaţi la câini într-un procent de 7.5% în regiunea
cardiei, la 57.74% în regiunea corpului gastric şi la 87.32% în regiunea antrului piloric. La pisici
prin intermediul examenului citopatologic, helicobacterii gastrici au fost evidenţiaţi în regiunea
cardiei la 20% din indivizi, în corpul gastric la 84% şi în regiunea pilorică la 76% din cazuri.
7
La câini, raportându-ne la examenul citopatologic, am observat că testul ureazei are o
sensibilitate excelentă (100%), dar specificitatea acestuia variază de la 55.55% la nivelul antrului
până la 96.96% la nivelul cardiei. Acest lucru se poate datora prezenţei la nivelul celor două
regiuni gastrice şi a altor microorganisme producătoare de urează, precum Proteus, Citrobacter,
Enterobacter şi Staphylococcus, determinând rezultate fals pozitive. Valoarea predictivă (-) a TU
este de 100%, ceea ce face ca acesta să fie recomandat de primă intenţie ca mijloc de diagnostic,
o valoare negativă excluzând infecţia, iar o valoare pozitivă necesitând confirmare prin testul
citologic. La pisici sensibilitatea TU este crescută, dar specificitatea variază între 50 şi 100 %,
cu valori mici în antru, unde pot fi întâlnite şi alte microorganisme producătoare de urează, ceea
ce face să crească numărul testelor fals pozitive. Valoarea TU constă în VPP de 100% putând fi
folosit ca şi prim test screening, o valoare negativă determinând excluderea infecţiei, iar o
valoare pozitivă presupune continuarea demersului diagnostic pentru investigarea infecţiei cu
H.spp
Examenul histopatologic ca şi metodă de diagnostic a infecţiei cu Helicobacter spp. a
utilizat fragmente de mucoasă gastrică fixate în formol 10% la pH neutru, apoi incluse în
parafină şi colorate ulterior cu HE şi TM. Bacteriile ce aparţin genului Helicobacter s-au colorat
în nuanţe de roşu şi/ sau albastru intens pe suprafaţa epiteliului foveolar sau în lumenul glandelor
gastrice, la polul apical al celulelor, sub stratul de mucus. Morfologia polimorfă a bacteriilor a
determinat în acest caz limitarea la un diagnostic de gen bacterian, respectiv Helicobacter spp.,
diferenţierea speciilor între ele urmând a se realiza prin metode specifice. Prin aceastã metodã,
infecţia helicobacterianã a fost identificatã într-o proporţie de 87.32% (62/71) la câini şi 92% la
pisici (23/25). La câine, specificitatea examenului histopatologic utilizat în scopul identificării
infecţiei gastrice helicobacteriene a avut valori cuprinse între 80 şi 100% în funcţie de regiunea
gastrică. La pisică sensibilitatea examenul histopatologic este crescută, iar specificitatea este
moderată între 50 şi 100%, explicată prin distribuţia parcelară a infecţiei cu H.spp. şi lotul
constituit dintr-un număr mic de animale. Identificarea infecţiei gastrice cu H.spp pe secţiuni
histologice are o valoare predictivă pozitivă crescută, dar un test negativ nu exclude infecţia cu
H.spp, deoarece distribuţie este parcelară.
Microbiologic, s-au izolat şi identificat bacterii spiralate aparţinând genului Helicobacter
de la 6/20 dintre câini, doar din regiunea pilorică. Nu s-a putut realiza izolarea bacteriilor
gastrice de la pisici pe medii de cultură. Pe mediul cu agar selectiv s-au izolat bacterii de la 6
8
cazuri, pe mediul Agar Mueller-Hinton cu supliment selectiv de la 2 cazuri, iar pe mediul Agar
Columbia cu sânge de cal lacat şi supliment selectiv, de asemenea de la 2 cazuri.
Tehnica Giemsa a confirmat infecţia cu Helicobacter spp. în toate cazurile unde a fost
identificată şi prin coloraţii uzuale, marcând astfel organismele spiralate în albastru închis.
Probele negative la coloraţiile uzuale au fost negative şi prin această metodă. Bacteriile marcate
cu Giemsa sunt polimorfe din punct de vedere al mărimii şi al numărului de spire, fapt ce infirmă
utilizarea strictă a acestei metode în scopul identificării bacteriei H.pylori.
Pentru tehnica imunohistochimică s-au utilizat anticorpi primari policlonali anti-
Helicobacter pylori. Probele utilizate pentru acestă metodă au fost pozitive la examenul
histopatologic. Bacteria, H. pylori a fost identificată ca un organism spiralat, marcat brun, cu
dimensiuni de aproximativ 3-5/0,5 µm pe suprafaţa epiteliului şi în lumenul glandelor la 6 câini
(20%) şi 4 pisici (40%) din cazurile luate în studiu, acestea fiind confirmate ulterior prin tehnica
PCR. Bacteriile de dimensiuni mari şi cu spire multiple nu au fost marcate prin această metodă.
Certitudinea existenţei acestei bacterii, Helicobacter pylori, la câine şi pisică, dată de
pozitivitatea unor teste superioare de diagnostic, concluzioneazã faptul cã aceste animale pot
reprezenta o sursă de infecţie helicobacteriană pentru om.
În capitolul II.4. intitulat ,,Identificarea diferitelor specii de Helicobacter din biopsiile
gastrice provenite de la câini şi pisici prin intermediul tehnicii moleculare PCR” ne-am propus
să identificăm trei dintre principalele specii de Helicobacter prezente la câini şi pisici, dintr-o
serie de fragmente de mucoasã gastricã cu leziuni la acest nivel, prin intermediul tehnicii PCR
utilizând primeri specifici pentru H. pylori, H. felis şi H. heilmannii.
Identificarea infecţiei cu H.pylori şi corelarea acesteia cu leziunile gastrice dezvoltate sunt
obiectivele principale ale acestui studiu, mai ales în contextul în care infecţia cu această bacterie
la câine este contestată de literatura de specialitate. Prezenţa acestei bacterii la câine şi pisică
poate explica una din sursele de infecţie cu Helicobacter pylori la om, concluzionând faptul că
această bacterie are potenţial zoonotic.
Pentru acest studiu au fost utilizate fragmente de mucoasã gastrică provenite de la 15
cadavre de câini şi 15 cadavre de pisici cu leziuni gastrice. Probele au fost recoltate separat din
cele trei regiuni ale stomacului (cardia, corp gastric şi antrum) în tuburi Eppendorf şi apoi
introduse la congelator la -70 ºC. Pentru acest studiu au fost prelevate probe gastrice numai de la
9
animalele ce au fost pozitive la testul rapid al urezei, astfel încât un alt obiectiv urmãrit în acest
studiu este reprezentat de corelarea pozitivitãţii testului ureazei cu rezultatele PCR. Extracţia şi
purificarea ADN-ului s-a realizat în cadrul disciplinei de Anatomie Patologicã, iar amplificarea
şi interpretarea datelor s-au realizat la disciplina de Genetică, din cadrul Facultăţii de
Horticultură, USAMV Cluj-Napoca.
Din cele 15 probe provenite de la câini, s-au identificat 4 cazuri pozitive cu H. pylori şi 8
cazuri pozitive cu H.heilmannii, în timp ce bacteria H. felis nu a fost identificată în aceste probe.
Cu toate că în urma examenului histopatologic am evidenţiat prezenţa bacteriilor
Helicobacter felis-like, tehnica PCR nu a confirmat această bacterie. Acest lucru se explică prin
faptul că bacteriile evidenţiate aparţin altor specii helicobacteriene. În cazul biopsiilor gastrice
provenite de la pisici, din cele 15 probe utilizate s-au identificat 5 cazuri pozitive cu H. pylori, 7
cu H. heilmannii şi 9 cu H. felis.
La pisici, coinfecţia bacteriană cu mai multe specii de Helicobacter a fost identificată în 6
cazuri, astfel o dublă infecţie între H. felis şi H. pylori s-a observat în 2 din 15 cazuri, coinfecţia
bacteriană între H. pylori şi H. heilmannii a fost identificată în alte 2 din 15 cazuri, iar coinfecţia
între H. felis şi H. heilmannii a fost prezentă într-un singur caz din 15. Tripla infecţie bacteriană
cu H. felis, H. heilmannii şi H. pylori a fost identificată de asemenea într-un singur caz din 15.
La câini, coinfecţia bacteriană cu mai multe specii de Helicobacter a fost identificată într-un
singur caz între H. pylori şi H. heilmannii. Helicobacterii au fost identificaţi în doar două din
cele trei regiuni ale stomacului de unde au fost recoltate probele.
În medicina veterinară, termenul care se foloseşte frecvent pentru a denumi bacteriile
spiralate de la nivelul stomacului de la animale, mai ales de la carnivore este de GHLO (Gastric
Helicobacter - Like Organism). Pentru acest lucru mulţi dintre autori asociază leziunile gastrice
întâlnite la carnivore cu GHLO şi nu cu diferite specii de Helicobacter chiar dacă au fost
identificate prin tehnici superioare precum IHC sau/şi PCR. Contrar acestui lucru, noi credem că
este inoportun să folosim termenul de GHLO pentru helicobacterii gastrici atâta timp cât am
utilizat o tehnică superioară de diferenţiere a acestor bacterii. Asocierea leziunilor gastrice cu o
specie bacteriană şi nu cu genul bacterian nu face altceva decât să confirme faptul că numai
anumite specii de Helicobacter au importanţă patogenetică asupra mucoasei gastrice. Mai mult
decât atât se pot relata date importante despre tipul de leziune gastrică indusă de către o anumită
10
specie de Helicobacter, plecând de la premiza că există diferenţe între speciile de Helicobacter
în ceea ce priveşte patogenitatea.
Leziunile gastrice au fost prezente atât în regiunea pilorică cât şi în zona corpului gastric.
Gastritele acute, gastritele cronice active şi inactive, ulcerul gastric şi limfomul MALT sunt
leziunile histopatologice întâlnite la nivel gastric la pisicile şi câinii din acest studiu. La câine
infecţiile gastrice cu Helicobacter pylori şi Helicobacter heilmannii au fost asociate cu gastrite
acute şi cronice întâlnite atât în regiunea pilorică cât şi în regiunea fundică. La pisică infecţiile
gastrice cu H. felis, Helicobacter pylori şi Helicobacter heilmannii au fost asociate cu gastrite
acute şi cronice, ulcere gastrice şi limfom MALT, întâlnite atât în regiunea pilorică cât şi în
regiunea fundică. Helicobacter felis nu a fost asociat cu leziuni acute la nivel gastric la pisici,
această infecţie fiind asociată cu gastrite cronice, ulcer gastric cronic şi limfom MALT atât în
regiunea fundică cât şi în cea pilorică. Din acest punct de vedere datele obţinute corespund cu
cele din literatura de specialitate.
Cu toate că au fost prezente atât la câine cât şi la pisică o serie de leziuni gastrice în care nu
am identificat helicobacteri gastrici (H. felis, H.pylori, H. heilmannii) prin tehnica PCR, nu se
poate afirma faptul că aceste leziuni nu au fost induse de Helicobacter spp., deoarece s-au folosit
primeri doar pentru 3 specii bacteriene. Cunoscând faptul că mucoasa gastrică la câine şi pisică
este colonizată şi de alte specii bacteriene aparţinând genului Helicobacter, cum ar fi H.
bizzozeroni, H. canis, H. rappini, H. billis, apariţia leziunilor gastrice s-ar putea pune şi pe
seama acestora. Mai mult decât atât, nu se poate exclude implicarea unor factori precum
hiperaciditatea, alimentaţia, substanţele medicamentoase, agenţii biotici nonbacterieni şi
dismetaboliile în dezvoltarea acestor leziuni gastrice.
În urma acestui studiu am pus în evidenţă prezenţa bacteriei Helicobacter pylori la câini,
bacterie contestată ca fiind prezentă în stomacul acestora. Prezenţa acesteia la câine poate explica
una dintre sursele de infecţie cu Helicobacter pylori la oameni, proprietari de câini şi nu numai.
Prezenţa infecţiei cu H. pylori la pisică corespunde datelor din literatura de specialitate.
În capitolul II.5. intitulat ,,Polipii gastrici şi infecţia helicobacterianã la câine” ne-am
propus în primul rând să evaluãm aspectele epidemiologice, morfologice macroscopice şi
histologice ale formaţiunilor polipoase gastrice întâlnite la câini, precum şi realizarea unei
corelaţii între aceştia şi infecţia helicobacterianã, aspect neîntâlnit în literatura de specialitate.
11
La oameni, polipii gastrici, mai ales cei de naturã hiperplazicã sau regenerativã sunt
frecvent întâlniţi, în schimb la câine aceştia se întâlnesc sporadic. Dacã la oameni, gastrita
cronicã helicobacterianã reprezintã locul de dezvoltare al polipilor gastrici, la câine nu este
relatatã o astfel de corelaţie, lucru care ne-a determinat sa extindem aria de cercetare şi în aceastã
direcţie.
Studiul s-a realizat pe un număr de 15 cadavre de câini (8 masculi şi 7 femele), ce au
prezentat la examenul necropsic formaţiuni polipoase la nivelul stomacului. Dintre aceştia, 6 au
fost eutanasiaţi la cererea proprietarilor, iar ceilalţi 9 câini au murit din diverse cause.
Clinic, conform anamnezei relatate de cãtre proprietari, aceştia au prezentat vomă cronică
(8/15 cazuri), pierderea greutăţii corporale (5/15 cazuri) şi sindrom de retenţie gastrică (2/15
cazuri), simptome ce au indicat o leziune cronică la nivelul stomacului. La 14 câini, formaţiunile polipoase au fost întâlnite în regiunea pilorică a stomacului, iar
la un câine la nivelul joncţiunii dintre corpul gastric şi regiunea pilorică a fost identificat un polip
solitar. Polipii gastrici au fost identificaţi ca şi formaţiuni solitare (8 cazuri) sau multiple (7
cazuri). Dimensiunea polipilor a fost cuprinsă între 0.5 şi 3 centimetri, cu o medie de 1.2 cm.
Examenul histopatologic a diagnosticat 11 formaţiuni polipoase hiperplazice, 2 polipi
inflamatori, 1 polip adenomatos şi o formaţiune polipoasă având ca şi structură o hiperplazie
fibro-musculară în jurul unei zone limitate de mineralizare distrofică, trădând în acest sens
leziunea de polip propriu-zis.
În structura polipilor gastrici au fost observate o serie de leziuni preneoplazice, precum
metaplazia intestinală şi displazia epitelială a mucoasei gastrice. Într-un singur caz s-a identificat
neoplazie gastrică, încadrată ca şi adenom tubulovilos.
La 10 din 15 cazuri au fost observate leziuni de gastritã cronicã hipertroficã, iar în alte
douã cazuri deformarea peretelui gastric s-a datorat tumorilor de naturã mezenchimalã.
Identificarea infecţiei helicobacteriene s-a realizat în 14 cazuri prin intermediul testului
ureazei, citologiei, histologiei cu coloraţii uzuale şi metodei Giemsa. În urma examenului
imunohistochimic pentru investigarea infecţiei cu H. pylori utilizând Ac policlonali anti-H.
pylori, s-a demonstrat prezenţa acestor bacterii la 3 din 15 cazuri.
Infiltratul inflamator cu mononucleare si rare neutrofile, atrofia glandulară, proliferarea
ţesutului conjunctiv fibros în corionul mucoasei, hipertrofia foliculilor limfoizi, prezenţa
celulelor Goblet în epiteliul foveolar şi displazia joasă epitelială reprezintă principalele
12
modificări histologice evidenţiate în fragmentele de mucoasă prelevate din apropierea
formaţiunilor polipoase gastrice de la câini. La nivelul fragmentelor de mucoasă gastrică din
jurul polipilor hiperplazici şi inflamatori, testul corelativ Kendall, a scos în evidenţă o
semnificaţie statistică între gradul de colonizare cu GHLO şi infiltratul cu celule mononucleare,
atrofia glandulară, metaplazia intestinală şi hiperplazia/hipertrofia foliculilor limfoizi (p<0.01);
pe de altă parte testul Kendall a evidenţiat lipsa unei semnificaţii statistice (p>0.05) între gradul
de colonizare cu GHLO şi infiltratul inflamator cu neutrofile, necroza tisulară şi displazia
epitelială.
În fragmentele de mucoasă gastrică din jurul polipului adenomatos, testul Kendall a
evidenţiat o corelaţie semnificativă statistic între gradul de colonizare cu GHLO şi infiltratul cu
celule mononucleare, hiperplazia foliculilor limfoizi şi displazia epitelială (p<0.01).
Studiu actual scoate în evidenţã faptul cã polipii gastrici s-au dezvoltat pe fondul unor
gastrite cronice de naturã helicobacterianã.
Capitolul II.6. intitulat ,,Aspecte comparative ale infecţiei gastrice spontane cu
Helicobacter spp. la om, câine şi pisică” a urmãrit investigarea infecţiei cu Helicobacter pylori
la o serie de pacienţi umani ce s-au prezentat la Clinica Medicală III Cluj-Napoca cu suferinţe la
nivel gastroduodenal. Rezultatele obţinute în urma acestui studiu au fost comparate cu cele de la
câine şi pisică relatate în capitolele anterioare.
Obiectivele studiului sunt reprezentate de evaluarea leziunilor gastrice la pacienţii umani
induse de infecţia cu Hp, compararea diferitelor metode de diagnostic în cazul infecţiei cu Hp,
corelarea gradului de infecţie bacteriană cu intensitatea lezională gastrică şi în final realizarea
unui studiu comparativ al infecţiei gastrice cu Hp la om, câine şi pisică sub aspectul etiologiei,
patogenezei şi a metodelor de diagnostic. Prin aceste date comparative între patologia gastrică
asociată infecţiei cu Hp la om şi animale, dorim să scoatem în evidenţă modele patogenetice
asemănătoare, utile pe viitor în studiul carcinogenezei.
Studiul s-a realizat pe un număr de 32 de pacienţi, 15 B şi 17 F cu vârste cuprinse între 21
şi 69 de ani cărora li s-a identificat H.pylori prin testul respirator cu uree marcată C14. Toţi
pacienţii au fost pozitivi la testul respirator. Aceştia, ulterior au fost examinaţi prin EDS. Prin
această metodă s-a examinat mucoasa esofagiană, gastrică şi duodenală în scopul identificării
diferitelor leziuni inflamatorii sau neoplazice de la acest nivel şi efectuarea de biopsii de
13
mucoasă gastrică (regiunile fundică şi pilorică) pentru testul ureazei, microbiologie,
histopatologie, imunohistochimie (Ac policlonali anti-H.pylori) şi PCR (primeri specifici pentru
H.pylori, genele VacA şi CagA).
În cazul EDS, din cei 32 de pacienţi, 4 au fost identificaţi cu leziuni cronice şi 5 cu
leziuni acute, 23 de pacienţi neprezentând leziuni la nivel gastric. La testul ureazei din 32 de
pacienţi, 29 dintre aceştia au fost pozitivi şi 3 negativi.
În urma examenului histopatologic realizat pe cele 19 biopsii gastrice s-au evidenţiat o
serie de leziuni la acest nivel, 16 dintre ele pledând pentru gastrită cronică activă de diferite
grade. În alte două biopsii s-a evidenţiat metaplazie intestinală incompletă, iar într-o singură
biopsie s-a constatat displazie epitelială joasă. Evaluând atât intensitatea lezionalã de la nivel
gastric cât şi gradul de colonizare bacterianã, am observat cã nu a existat o corelaţie
ssemnificativã statistic între aceste douã caracteristici.
În urma IHC, utilizatã pentru investigarea infecţiei cu H.pylori, s-a demonstrat prezenţa
acestor bacterii marcate cromogen la toate cele 19 cazuri, având o intensitate variată de
colonizare a mucoasei gastrice.
Amplificarea PCR pentru H.pylori, cu aceleaşi secvenţe de nucleotide utilizate pentru
câine şi pisicã, s-a realizat la toate cele 4 culturi bacteriene luate în studiu. Amplificarea PCR
pentru gena cagA (297bp) s-a realizat la toate cele patru probe iniţiale, în timp ce pentru gena
vacA (259 bp) amplificarea s-a realizat la 3/4 pacienti.
În comparaţie cu omul, la care cele mai multe studii epidemiologice se fac în direcţia
bacteriei H. pylori, la animale majoritatea studiilor epidemiologice includ identificarea de
Helicobacter spp. Chiar dacă este un studiu comparativ, este normal să găsim o incidenţă mai
mare a infecţiei helicobacteriene la câini şi pisici decât la om, tocmai din această perspectivă.
Dacă la om am evidenţiat H. pylori în toate cele 32 de biopsii gastrice, la animale am
identificat această bacterie la un număr mic de animale (la câine 4 cazuri pozitive cu H. pylori/15
biopsii gastrice, iar la pisică 5 cazuri pozitive cu H. pylori/ 15 biopsii), în contradicţie cu
literatura de specialitate care infirmă prezenţa acestei bacterii mai ales la câine.
Din biopsiile gastrice provenite de la pacienţii umani nu s-au identificat şi alte bacterii
spiralate din genul Helicobacter, precum H. felis şi H.heilmannii, bacterii de asemenea cu
potenţial patogen pentru om. În schimb, la câini şi pisici am identificat aceste două bacterii prin
intermediul tehnicii PCR. La câini, coinfecţia bacteriană cu mai multe specii de Helicobacter a
14
fost identificată în 6 cazuri, astfel o dublă infecţie între H. felis şi H. pylori s-a observat în 2 din
15 cazuri, coinfecţia bacteriană între H. pylori şi H. heilmannii în alte 2 din 15 cazuri, iar
coinfecţia între H. felis şi H. heilmannii a fost prezentă într-un singur caz din 15. La pisici,
coinfecţia bacteriană cu mai multe specii de Helicobacter a fost identificată într-un singur caz,
între H. pylori şi H. heilmannii.
În cazul infecţiei gastrice cu H. pylori la om, majoritatea leziunilor au fost de ordin
cronic, în schimb la câine şi pisică leziunile inflamatorii asociate infecţiei gastrice cu
Helicobacter spp. au fost variate, dar asemănător pacienţilor umani, au predominat leziunile
cronice. Gastritele erozive, ulcerele gastrice, gastritele cronice şi neoplasmele gastrice au fost
identificate la câinii şi pisicile luate în studiu. Gastritele cronice, din punct de vedere
histopatologic au coincis cu cele descrise de literatura de specialitate la om şi animale.
Leziunile gastrice induse de H.pylori au fost prezente atât în regiunea pilorică cât şi în
corpul gastric. La câine, infecţiile gastrice cu H. pylori şi H. heilmannii au fost asociate cu
gastritele acute şi cronice, întâlnite atât în regiunea pilorică cât şi în regiunea fundică. La pisică,
infecţiile gastrice cu H. felis, H. pylori şi H. heilmannii au fost asociate cu gastritele acute şi
cronice, ulcerul gastric şi limfomul MALT, acestea fiind întâlnite atât în regiunea pilorică cât şi
în cea fundică.
Atât la animale cât şi la om se pot utiliza o serie de metode de diagnostic în infecţia
gastricã cu Helicobacter spp. Dacă testul respirator se realizează cu dificultate la animale, la om
sensibilitatea testului variază între 90-98 %, iar specificitatea atinge 99-100%. Utilizat la
pacienţii umani de la care au fost recoltate biopsiile gastrice pentru acest studiu, testul respirator
a fost pozitiv la toate cele 32 de cazuri. Nu am putut utiliza metode non-invazive ca şi tehnici de
diagnostic, deoarece studiul s-a realizat doar pe cadavre de câini şi pisici.
Examenul citopatologic nu a fost utilizat la pacienţii umani luaţi în studiu; în practica
medicală, mai ales în clinici nu se utilizează acest test rapid, în schimb se preferă testul ureazei.
Contrar acestui lucru la câine şi pisică diagnosticul citopatologic poate fi considerat metoda
,,gold standard” de identificare a infecţiei gastrice helicobacteriene. Prin acest test am evidenţiat
helicobacterii gastrici la câini într-o proporţie de 92.95% şi de 84% la pisici.
Sensibilitatea testului ureazei raportată la examenul cultural a fost de 90%. Specificitatea
testului este de 100% numai când virarea culorii mediului este urmărită până la 4 ore. La om
utilizarea acestui test pe cele 32 de biopsii gastrice a avut o specificitate de 100% şi o
15
sensibilitate de 97%. Specificitatea crescută a testului rapid al ureazei la oameni se explică prin
faptul că mucoasa gastrică este colonizată în cele mai multe cazuri doar de Helicobacter pylori.
La câini şi pisici, raportându-ne la examenul citopatologic, la testul ureazei am observat o
sensibilitate excelentă, dar specificitatea a variat de la 55.55% la nivelul antrului până la 96.96%
la nivelul cardiei. Acest lucru poate fi explicat prin prezenţa la nivelul corpului şi a antrului a
altor microorganisme producătoare de urează.
H. pylori este foarte dificil de identificat din biopsiile gastrice prin examenul
histopatologic, deoarece are dimensiuni foarte reduse (2-4/0.5um). Din acest motiv necesită
coloraţii speciale precum coloraţia Giemsa şi/sau imunohistochimia cu anticorpi anti - H. pylori.
La câine şi pisică histopatologia cu coloraţii uzuale, inclusiv tehnica Giemsa a identificat o serie
de bacterii polimorfe din punct de vedere al dimensiunii şi al numărului de spire, ceea ce ne
obligă să spunem că diagnosticul este de H. spp şi nu de infecţie cu H. pylori.
Imunohistochimia a scos în evidenţã în toate cele 19 biopsii gastrice luate în studiu de la
pacienţii umani prezenţa bacterie H.pylori pe suprafaţa epiteliului foveolar şi în glandele
gastrice. Sensibilitatea IHC raportată la testul respirator şi la testul ureazei s-a dovedit în acest
caz de 100%. La câine, IHC a identificat prezenţa bacteriei H.pylori la 6/30 (20%), iar la pisicã
la 4/10 indivizi (40%), toate aceste cazuri fiind confirmate prin tehnica PCR.
La om, dorită faptului că mucoasa gastrică este colonizată în aproape toate cazurile numai
de H. pylori, se poate utiliza cu succes un anticorp primar policlonal anti H.pylori. La animale,
îndeosebi la câini şi pisici datorită prezenţei unui număr crescut de specii de Helicobacter la
nivel gastric, pentru tehnica imunohistochimică se indică utilizarea de anticorpi primari
monoclonali pentru Helicobacter pylori. Aceşti anticorpi au ca şi scop evitarea reacţiilor
nespecifice date de alte specii de Helicobacter, precum H. felis, H. heilmannii, H. canis şi H.
bizozzeronii.
Astfel, pentru diagnosticul de certitudine al infecţiei cu Helicobacter pylori ne-am propus
să utilizăm o tehnică mult mai superioară, precum tehnica PCR. Din cele 4 culturi bacteriene
izolate de la pacienţii umani, am obţinut rezultate pozitive pentru H. pylori în toate cazurile.
Aceleaşi culturi, au fost negative pentru H. felis şi H.heilmannii.
Prin intermediul aceloraşi primeri utilizaţi la om am identificat infecţii helicobacteriene
gastrice cu H.pylori, H.felis şi H.heilmannii la câini şi la pisici.
16
Un factor important de virulenţă este considerat produsul genei vacA, respectiv citotoxina
vacuolizantă, care determină vacuolizarea citoplasmatică a celulelor ţintă atât în vivo, cât şi în
vitro. Deşi toate tulpinile au această genă, doar 50-60% sunt capabile să determine vacuolizarea
citoplasmatică a celulelor epiteliale. Un alt factor de virulenţă este proteina CagA (proteină
asociată citotoxicităţii), care este codificată de către gena cagA, prezentă la 60-70% din tulpinile
de H. pylori. Probele din culturi bacteriene la care s-a amplificat gena cagA alela s2 au fost
pozitive la trei din patru pacienţi. De asemenea am obţinut o bandă de amplificare la 300 bp la o
probă la care am folosit primer-ul vacA de 259 pb (posibil produs nespecific). Spre deosebire de
om, la câini şi pisici cele 2 gene vac A şi cagA nu s-au putut identifica din biopsiile gastrice.
Pe lângă particulariţăţile specifice întâlnite în cazul infecţiei gastrice cu Helicobacter spp.
la om, câine şi pisică, în acest studiu am evidenţiat o serie de similitudini privind etiologia,
patogeneza, gastropatiile comune asociate infecţiei şi metodele de diagnostic utilizate în scopul
detectării acestor bacterii de la nivelul stomacului.
Pe baza aspectelor evidenţiate în acest studiu referitoare la infecţia comună cu H. pylori la
om, câine şi pisică putem afirma faptul că aceste animale de companie pot reprezenta potenţiale
surse de infecţie helicobacteriană pentru om şi viceversa.
Capitolul II.7. intitulat „ Infecţia gastrică experimentală cu Helicobacter pylori la
cobai - aspecte patogenetice şi tratament” reprezintã ultima parte de cercetãri proprii din cadrul
tezei de doctorat.
Scopul studiul de faţă a constat în inducerea infecţiei gastrice cu Helicobacter pylori
cagA şi vacA pozitive la cobai şi evidenţierea modificărilor histologice, hematologice şi
biochimice ce apar în cursul terapiei de eradicarea a acestei infecţii prin administrarea unei triple
medicaţii (Omeprazol, Rifaximină, Amoxicilină) şi probiotice (Enterolactis).
Pentru acest studiu s-a folosit un număr de 20 cobai (Cavia porcellus) dintre care 10
masculi şi 10 femele, cu o vârsta la începutul experimentului de aproximativ 3 luni.
Tulpinile de H.pylori au fost izolate din 4 culturi bacteriene obţinute din biopsii gastrice
umane, provenite de la patru pacienţi infectaţi. După obţinerea culturilor, acestea au fost tipizate
prin tehnica PCR, toate patru fiind cagA/vacA+. Pentru infecţie s-au utilizat suspensii cu o
densitate de 108 UFC/ml (1 MF).
17
Infectarea s-a realizat cu H. pylori cagA/vacA+ la 15 dintre cobai, pe cale orală cu sonda
esofago-gastrică. S-a adminstrat câte 1 ml din suspensia bacteriană, trei zile consecutiv. Anterior
infecţiei, pe perioada celor trei zile de administrare a bacteriilor cât şi o zi după infecţie s-a
administrat Omeprazol (1 mg/kg m.c). După 14 săptămâni s-au recoltat fecale, individual de la
fiecare cobai infectat, pentru confirmarea infecţiei prin metoda PCR utilizând primeri specifici
pentru Helicobacter pylori.
În urma confirmării infecţiei helicobacteriene am recurs la realizarea unui protocol de
eradicare a acesteia, utilizând o serie de substanţe medicamentoase (Amoxicilina, Rifaximina,
Omeprazolul) şi probiotice, sub diferite scheme terapeutice, astfel: la un lot infectat cu Hp s-a
administrat probiotice înainte cu 5 zile şi în timpul tratamentului cu antibiotice, iar la celãlalt lot
infectat cu Hp s-a administrat probiotice doar în timpul terapiei cu antibiotice. Dupã tratament,
cobailor li s-au prelevat sânge pentru determinãri biochimice şi hematologice şi apoi au fost
sacrificaţi pentru prelevare de porţiuni de mucoasã gastricã, acestea urmând a fi investigate
histopatologic, citopatologic, microbiologic, imunohistochimic şi prin PCR cu scopul evaluãrii
leziunilor gastrice şi confirmãrii eradicarii infecţiei helicobacteriene.
Datele obţinute au fost prelucrate statistic cu ajutorul testului IST (Independent sample
test) pentru eşantioane independente, considerându-se valori semnificative statistic p (pragul de
semnificaţie statistică) < 0.05. Testul ,,IST” verifică dacă există diferenţe semnificative între
două grupuri comparate în ceea ce priveşte mediile variabilelor dependente analizate. Modelul
experimental a fost realizat cu acordul comisiei de bioetică a FMV Cluj-Napoca.
Infecţia gastrică cu H. pylori a fost realizată cu succes la toate animalele, aceasta fiind
confirmată după un interval de 14 zile postinfecţie prin metoda PCR.
Hematologic, s-a evidenţiat o creştere a leucocitelor totale, a limfocitelor şi a neutrofilelor
la cobaii infectaţi faţă de martori, dar fără o semnificaţie statistică (p>0.05). În acelaşi sens s-a
observat o diminuare a acestor parametri după ambele protocoale de tratament, dar numai în
cazul neutrofilelor a avut o semnificaţie statistică (p< 0.05, între lotul infectat şi cel tratat cu
antibiotice fără premedicaţie anterioară cu probiotice). De asemenea la cobaii trataţi a existat un
număr semnificativ mai redus de trombocite (posibil efectul secundar al Rifaximinei) faţă de cei
netrataţi (p<0.01 între lotul HP+ netrat şi cel tratat cu premedicaţie probiotică), iar între cele
două loturi tratate nu au existat diferenţe semnificative statistic (p>0.05).
18
Biochimic, au fost urmăriţi o serie de markeri specifici pentru afecţiunile gastrice şi
îndeosebi hepatice, apărute consecutiv infecţiei cu H. pylori precum şi a tratamentului cu
antibiotice. S-a observat o creştere a GOT şi GPT la lotul infectat şi netratat faţă de lotul martor
(Hp-), având semnificaţie statistică numai în cazul enzimei GPT, unde p<0.05. Tot referitor la
valoarea acestor enzime s-a observat că după tratament GPT-ul scade şi se încadrează în limitele
fiziologice la ambele loturi supuse diferenţiat tratamentului, valoarea fiind mai redusă dar fără
semnificaţie statistică în cazul lotului de cobai premedicat cu probiotice. Contrar cu acest lucru
GOT-ul a crescut la lotul tratat cu antibiotice şi fără premedicaţie probiotică faţă de lotul tratat cu
premedicaţie probiotică (p<0.05). Acelaşi lucru s-a întâmplat şi cu fosfataza alcalinã (PA).
Necropsic, la nivelul stomacului la cobaii din lotul infectat cu H.pylori şi netratat (lot
M+) au fost evidenţiate eroziuni gastrice multiple difuze (n=2) şi hiperplazia mucoasei gastrice.
Evaluarea prezenţei bacteriei H.pylori de la nivelul fragmentelor de mucoasã gastricã
provenite de la lotul infectat şi netratat s-a realizat prin urmãtoarele examene: microbiologic
cultural, examenul citopatologic, testul rapid al ureazei, examenul histopatologic cu coloraţii
uzuale şi Giemsa, imunohistochimie şi tehnica PCR.
Prin examenul microbiologic s-a izolat şi identificat H.pylori după 7 zile de la incubaţie
la 2/5 indivizi din lotul de cobai infectat şi netratat. Activitatea ureazică a fost prezentă la 3 cobai
din lotul infectat cu Hp şi netratat, iar examenul histopatologic, nu a evidenţiat în nici un caz
prezenţa bacteriei H. pylori. Imnunohistochimia cu Ac anti-Hp a identificat infecţia
helicobacterianã la doi cobai din lotul infectat şi netratat, fiind negativã pentru celelalte loturi.
Prin intermediul tehnicii PCR s-a obţinut amplificarea secvenţelor de ADN bacterian
pentru H.pylori la 4/5 cobai din lotul A (infectat cu Hp şi netratat). La cobaii din lotul martor
negativ şi din loturile B şi C (infectate şi tratate diferenţiat) nu s-au obţinut produşi de
amplificare pentru Hp, fapt ce explică eradicarea infecţiei cu Hp după tratament.
Histologic, la cobaii din lotul martor negativ (neinfectat) nu au existat leziuni gastrice. În
comparaţie cu acest lot, la cobaii infectaţi cu Hp dar netrataţi (lot A) s-au observat gastrite
cronice active, iar media gradului inflamator gastric a fost unul redus spre moderat.
În cazul lotului de cobai B (infectat cu Hp şi tratat fară premedicaţie probiotică) nu au
fost evidenţiate leziuni de inflamaţie gastrică. La indivizii din lotul C (infectat cu Hp şi tratat cu
antibiotice şi premedicaţie probiotică) au fost evidenţiate leziuni gastrice cronice active discrete.
19
Din punct de vedere statistic nu am obţinut diferenţe semnificative între loturile
experimentale (p>0.05) cu privire la intensitatea lezională de la nivel gastric.
În ceea ce priveşte cuantificarea apoptozelor şi diviziunilor celulare, s-a observat faptul
că la indivizii din loturile infectate cu H.pylori există un număr mai mare de apoptoze şi
diviziuni celulare faţă de cobaii din lotul martor negativ (p=0.028).
Studiul de faţă a demonstrat faptul că infecţia la cobai pe cale orală cu Hp izolat de la om,
determină leziuni gastrice cronice active şi induce procese de apoptoză şi proliferare celulară ce
se pot diminua după eradicarea infecţiei. De asemenea, prin intermediul acestui studiu am
elaborat un nou protocol de combatere a infecţiei gastrice cu H. pylori introducând astfel un nou
antibiotic, Rifaximina, precum şi o premedicaţie cu probiotice, lucru ce a dus la reducerea
efectelor secundare produse de antibiotice.
Concluzii generale
1. Studiul a evidenţiat faptul că infecţia gastrică helicobacteriană este frecvent întâlnită la
câine şi pisică, de cele mai multe ori evoluând cronic şi asimptomatic.
2. La câini leziunile asociate infecţiei helicobacteriene au fost reprezentate de gastrite
cronice şi polipi gastrici, iar la pisici de gastrite acute erozive şi ulceroase.
3. Studiul a scos în evidenţă atât la câine cât şi la pisică o corelaţie semnificativă între
gradul de colonizare helicobacteriană şi intensitatea lezională de la nivel gastric, mai ales
la nivelul regiunii pilorice.
4. Prin intermediul tehnicilor IHC şi PCR s-a pus în evidenţã prezenţa diferitelor specii de
Helicobacter (H.pylori, H. heilmanii si H. felis) cu importanţã patogeneticã şi în acelaşi
timp zoonoticã.
5. Polipii gastrici antrali au fost întâlniţi la un numãr relativ mare de câini (n=15) contrar
literaturii de specialitate, cei mai mulţi fiind de naturã hiperplazicã.
6. Leziunile de polipoză gastrică prin intermediul focarelor de metaplazie/displazie
epitelialã pot reprezenta zone de dezvoltare a cancerului gastric la câine; identificarea
unui polip adenomatos benign confirmã acest lucru.
20
7. Prezenţa infecţiei helicobacteriene în polipii inflamatori, hiperplazici şi adenomatoşi
aduce un argument în plus în ceea ce priveşte etiologia acestor leziuni la câine, aspect
nedescris în literatura de specialitate.
8. Prezenţa gastritelor cronice helicobacteriene în zonele adiacente polipilor gastrici scoate
în evidenţã faptul cã aceştia din urmã se dezvoltã pe fondul unei injurii cronice tisulare cu
o regenerare atipicã a mucoasei gastrice produse de infecţia cu GHLO.
9. Testul ureazei, examenul citopatologic, histopatologia cu coloraţii uzuale şi metoda
Giemsa se pot utiliza cu uşurinţă în diagnosticul infecţiei gastrice cu Helicobacter spp. la
câine şi pisică.
10. Prin intermediul metodelor imunohistochimice şi moleculare de diagnostic s-a evidenţiat
prezenţa infecţiei gastrice cu H. pylori la câini, aspect încă contestat în literatura de
specialiate.
11. În acest studiu s-au evidenţiat o serie de similitudini între om, câine şi pisică privind
etiopatogeneza infecţiei gastrice helicobacteriene, precum şi metodele de diagnostic
utilizate în scopul detectãrii acesteia.
12. Pe baza aspectelor evidenţiate în acest studiu referitoare la infecţia comună cu H. pylori
la om, câine şi pisică, putem afirma faptul că aceste animale de companie reprezintă
potenţiale surse de infecţie helicobacteriană pentru om şi viceversa.
13. Introducearea Rifaximinei alături de probiotice în schema clasică de tratament a infecţiei
gastrice helicobacteriene poate reprezenta pe viitor un nou protocol terapeutic în această
direcţie la om, câine şi pisică.