1

1. INTRODUCERE

Folosirea enzimelor in calitate de catalizatori pentru transformarea unor

compusi nenaturali este cunoscuta de peste 100 de ani.

Enzimele erau folosite:

- neseparate (in celule sau organite)

- izolate ca substante purificate sau nu.

Obiectul cercetarilor de acum 100 de ani era elucidarea cailor meta-

bolice si determinarea mecanismelor reactiilor enzimatice.

In anii 1970 a inceput utilizarea enzimelor ca si catalizatori pentru

transformarea compusilor organici si a cunoscut o dezvoltare deosebita pana

in 1990. Ca rezultat al acestor cercetari s-au publicat peste 13000 de articole

in diverse domenii ale sintezei chimice organice.

In acest fel chimistii organicieni “puri” au facut pasul greu de a accepta

sa paseasca peste “prapastia” dintre stiintele biochimice si chimia organica

clasica, iar medodele biochimice sunt o cale anexa pentru sinteza clasica a

unui compus organic.

In acest fel numarul articolelor privind sinteza asimetrica a unor

compusi organici enantiomeri puri utilizand metode biocatalitice a crescut de

la 0 in 1970 la aproape 15% din articolele publicate in 1990.

2

Frecventa utilizarii enzimelor in biotransformari este prezentata in schema urmatoare:

(1) lipaze utilizate pentru esterificare, aminoliza, hidroliza

(2) esteraze pentru hidroliza de esteri

(3) proteaze pentru hidroliza amidelor, esterilor si sinteza de peptide

(4) nitrilaze pentru hidroliza nitrililor

(5) alte hidrolaze pentru hidroliza epoxizilor, derivatilor halogenati,

esterilor fosforici

(6) oxidoreductaze pentru reducerea aldehidelor, cetonelor

(7) peroxidaze si oxigenaze pentru biohidroxilare, sulfoxidare,

epoxidare, dihidroxilare, peroxidare

(8) liaze pentru sinteza cianhidrinelor, aciloinelor si condensarilor

aldolice

(9) transferaze pentru grupe glicozil

(10) izomeraze pentru zaharuri, racemizari si rearanjari tip Claisen

3

2.1 AVANTAJELE BIOCATALIZATORILOR

a) Enzimele sunt catalizatori foarte eficienti Viteza de reactie pentru transformarile catalizate de enzime creste de 108 – 1010 ori in comparatie cu reactia neenzimatica. Pentru unele transformari se observa si cresteri mai mari (1012) iar aceste cresteri sunt mult peste cele obtinute cu catalizatori neenzimatici. Ca urmare, cantitatea de enzima folosita este foarte mica (de ordinul 0.1 – 1% respectiv 10-3 – 10-4% moli) ceea ce face ca acesti catalizatori sa fie mult mai convenabili din punct de vedere economic.

b) Enzimele sunt acceptate din punct de vedere al protectiei mediului

Biocatalizatorii sunt reactivi care sunt total biodegradabili, neafectand mediul inconjurator.

c) Enzimele actioneaza in conditii blande

Enzimele reactioneaza la pH cuprins intre 5 si 8, majoritatea preferand pH = 7, iar intervalul de temperatura fiind 20 - 40oC. Temperatura optima la care functioneaza enzimele este 30oC. In acest fel sunt reduse reactiile chimice secundare ca exemplu: descompunerea, izomerizarea, racemizarea sau rearanjari de schelet, care au loc in mod curent in prezenta catalizatorilor traditionali.

d) Enzimele sunt compatibile intre ele

In acelasi balon pot avea loc o serie de reactii enzimatice care au nevoie de conditii de reactie similare. Astfel, reactiile secventiale (in care produsul de reactie al primei reactii devine substrat pentru a doua reactie catalizata de alta enzima) sunt posibile utilizand sisteme multienzimatice evitand degradarea unui intermediar instabil care in aceste conditii nu mai trebuie separat. Mai mult, un echilibru chimic nefavorabil poate fi deplasat spre formarea produsului dorit daca se lucreaza cu un sistem multienzimatic corespunzator.

e) Enzimele nu sunt legate de mediul lor natural Multe enzime pot fi catalizatori pentru transformarea unor compusi organici nenaturali si nu este necesar ca mediul de reactie sa fie apa. Daca este

4

avantajos pentru procesul enzimatic, mediul apos poate fi adesea inlocuit cu unul organic.

f) Enzimele pot cataliza un spectru larg de reactii

Ca si ceilalti catalizatori, enzimele accelereaza o reactie chimica, dar nu actioneaza asupra echilibrului termodinamic al reactiei. Enzima accelereaza in egala masura si reactia directa si reactia inversa a echilibrului chimic. Astfel, procesele enzimatice sunt echivalente reactiilor organice cunoscute. De exemplu: - hidroliza / sinteza esterilor, amidelor, lactonelor, lactamelor,

eterilor, anhidridelor acide, epoxizilor sau nitrililor; - oxidarea / reducerea alcanilor, alchenelor, hidrocarburilor

aromatice, alcoolilor, aldehidelor si cetonelor, etc - aditia / eliminarea apei, amoniacului, acidului cianhidric; - halogenarea / dehalogenarea - alchilarea / dealchilarea - carboxilarea / decarboxilarea, etc.

Sunt cunoscute cateva exceptii importante pentru care nu s-au gasit reactii echivalente in natura: exemplu: rearanjarea Cope. Dar sunt cunoscute rearanjari [3,3] sigmatropice (ex. rearanjarea Claisen). Pe de alta parte, unele enzime catalizeaza reactii imposibile in conditii clasice: exemplu: hidroxilarea hidrocarburilor alifatice. Enzimele prezinta trei tipuri majore de selectivitate:

- Chemoselectivitatea: Are loc atunci cand o enzima actioneaza asupra unei singure grupe functionale lasand netransformate celelalte grupe functionale (fapt adesea imposibil in prezenta catalizatorilor obisnuiti). In acest fel nu se obtin produsi secundari si purificarea produsului de reactie este mai simpla.

- Regio- si diastereoselectivitatea: Datorita structurii lor

tridimensionale, enzimele pot sa faca distinctie intre grupele functionale care sunt situate in regiuni diferite ale aceleiasi molecule – substrat.

- Enantioselectivitatea: Toate enzimele sunt formate din L-aminoacizi si din aceasta cauza sunt catalizatori chirali. Ca urmare, orice tip de chiralitate prezent in molecula substrat este recunoscuta la formarea complexului enzima-substrat. Astfel un substrat prochiral poate fi transformat intr-un produs optic activ printr-un proces de desimetrizare cand ambii enantiomeri ai unui amestec racemic reactioneaza cu viteze diferite, obtinandu-se produsi in proportii diferite.

5

Aceasta proprietate a enzimelor numita “specificitate” reprezinta cea mai importanta caracteristica pentru utilizarea in reactii selective si asimetrice. Aceasta proprietatea a enzimelor a fost remarcata inca din 1898 de Emil Fischer (care a fost preocupat foarte mult de stereochimia zaharurilor). Toate transformarile biochimice care se desfasoara intr-un organism viu sunt catalizate de enzime. Majoritatea dintre ele prezinta o selectivitate inalta si respecta chiralitatea substratului. Este clar ca un compus bioactiv (de uz farmaceutic sau agrochimic) va avea efecte biologice diferite daca prezinta activitate optica. Cei doi enatiomeri se vor comporta ca doua substante diferite. Izomerul cu activitatea cea mai ridicata este numit “eutomer”, in timp ce enantiomerul sau cu activitate redusa este numit “distomer”. Activitatea distomerului poate fi si toxica sau nula. Raportul intre activitatile celor doi enantiomeri este definit ca “ raport eudismic”. In Tabelul 2.1 sunt prezentate activitatile unor enantiomeri. Tabelul 2.1: Efecte biologice ale unor enatiomeri Nr.crt. Numele

compusului Enantiomer

R Actiune Enantiomer

S Actiune

1 Penicilamina COOH

CH NH2

C SHH3C

CH3

R

toxic COOH

CH2N H

C SHH3C

CH3

S

acid (2S)-2-

amino-3-metil-3-sulfanil

butanoic

antiartritic

anticis- teinurie

2 Alcool terpenic CH3

H3C CH3

OH

H

miros de liliac

CH3

H3C CH3

OH

H

miros de pipa

3 Asparagina

COO

CH NH3

CH2

CONH2

R

gust amar COO

CH3N H

CH2

CONH2

S

gust dulce

6

De aceea trebuie sa fie privite cu suspiciune medicamentele sau

pesticidele care se vand ca racemice. In 1990, pe piata se vindeau ca amestecuri racemice peste 89% din cele 537 de medicamentele chirale, iar in cazul pesticidelor 92% din cei 480 de agenti chirali. Ca urmare, in 1992 US Food and Drug Administration (FDA) a adoptat o legislatie prin care obliga companiile farmaceutice producatoare sa separe compusii chirali obtinuti ca racemice, astfel incat sa se comercializeze numai enantiomerul activ farmaceutic.

2.2 DEZAVANTAJELE BIOCATALIZATORILOR A) Enzimele sunt intr-o singura forma enantiomera

Deaorece nu este posibila obtinerea unei enzime “imagine in oglinda” din

D-aminoacizi, este imposibil sa se schimbe mersul reactiei enzimatice prin alegerea unui catalizator chiral clasic. In acest caz este de urmat o cale complexa si incerta pentru a gasi o enzima cu selectivitate stereochimica inversa. Totusi, uneori acest lucru e posibil.

B) Enzimele necesita parametrii limitati de operare

Avantajul de a lucra cu enzime in conditii blande de reactie devine uneori un dezavantaj. Daca reactia decurge foarte lent in conditiile optime de temperatura si pH, este necesara o alta abordare. Tehnica obisnuita de a creste selectivitatea prin scaderea temperaturii de reactie este limitata in cazul transformarilor enzimatice. In cazul unor enzime, activitatea catalitica este buna chiar si in gheata.

C) Enzimele au activitate catalitica maxima in apa

Apa este putin utilizata ca solvent in sintezele organice datorita punctului de fierbere ridicat si caldurii de vaporizare foarte mari. In plus, majoritatea compusilor organici au o solubilitate mica in apa. Exista totusi o cale si anume utilizarea unor solventi organici compatibili cu enzimele.

D) Enzimele sunt legate cu cofactori naturali

Este iarasi un paradox de neexplicat: desi enzimele sunt extrem de flexibile pentru a accepta substrate nenaturale, ele sunt legate exclusiv de cofactorii lor naturali care servesc ca si transportori redox, exemplu NAD(P)H sau de energie chimica (ATP). Majoritatea “reactivilor biologici” sunt molecule relativ instabile si sunt foarte scumpe. De aceea utilizarea lor in cantitati stoechiometrice este dezavantajoasa. Din pacate, ei nu pot fi

7

inlocuiti cu compusi mai ieftini obtinuti prin sinteza. Pentru a eficientiza astfel de procese enzimatice se incearca reciclarea cofactorilor acolo unde este posibil. E) Enzimele sunt predispuse la inhibitie

Multe reactii enzimatice sunt predispuse la inhibitie cu substratul (prin saturare) sau cu produsul de reactie, astfel ca scade eficienta enzimei. Daca inhibitia cu substratul poate fi controlata prin mentinerea unei concentratii joase a substratului prin modul de adaugare, inhibitia cu produsul de reactie este foarte greu de controlat. Este necesara eliminarea graduala a produsului de reactie prin metode care sa nu afecteze celelalte etape biocatalizate.

F) Enzimele produc alergii

Enzimele pot produce reactii alergice, dar daca sunt privite ca si substante chimice obisnuite si manevrate corespunzator, pot fi utilizate cu succes in biotransformari.

2.3 UTILIZAREA ENZIMELOR versus SISTEME CELULARE

Starea fizica a biocatalizatorilor care se folosesc in biotransformari poate fi foarte diversa. Trebuie stabilit daca se foloseste enzima izolata, mai mult sau mai putin purificata, enzima sau microorganismul in care se gaseste, in stare libera sau imobilizata. Aceasta decizie depinde de mai multi factori:

a) tipul reactiei; b) daca cofactorii trebuie reciclati; c) scara la care are loc biotransformarea.

Este nevoie de o echipa multidisciplinara (biochimist, microbiolog si inginer biotehnolog) pentru a stabili caile de sinteza enzimatica pentru diferite produse finale pornind de la diverse substante chimice. Astfel de sinteze, care necesita multe etape biochimice, se refera la etape fermentative sau procese de sinteza enzimatica completa (novo syntheses) in sens biologic.

Argumentele pro si contra referitoare la o biotransformare sunt prezentate in Tabelul 1.2.

Biotransformarile care au loc in prezenta unor microorganisme pornesc de la molecule organice relativ complexe care sunt transformate printr-o etapa sau cateva etape biochimice in produsul final utilizand potentialul enzimatic al microorganismului de a transforma un compus organic nenatural.

8

Tabelul 2.2: Argumente pro si contra pentru folosirea enzimelor izolate versus siteme celulare

Biocatalizator Forma Argumente Pro Argumente Contra

- aparatura simpla, prelucrare simpla, productivitate mai buna

este necesara reciclarea cofactorului

dizolvate in apa

activitate ridicata a enzimei

posibile reactii secundare, substratele lipofile sunt insolubile, prelucrarea necesita extractie

suspendate in solventi organici

reactie usor de condus, usor de prelucrat, substrate lipofile solubile, recuperarea usoara a enzimei

enzime cu activitati reduse

Enzime izolate

imobilizate recuperarea usoara a enzimei

pierderea activitatii in timpul imobilizarii

- nu este necesara reciclarea cofactorului

echipament scump, necesita lucrul cu volume mari la prelucrare, productivitate mica, toleranta redusa la solventi organici, reactii secundare date de un metabolism necontrolat

cultura in crestere

activitati mari cantitate mare de biomasa, multi produsi secundari, dificultate de a controla procesul

celule in repaos

prelucrare usoara, putini subprodusi

activitati catalitice reduse

Celule

celule imobilizate

posibilitatea refolosirii celulelor

activitati catalitice reduse

9

Pentru a distinge intre un astfel de proces si fermentatia tipica, unde

sunt implicate mai multe enzime, se utilizeaza termenul de “enzimare” (enzymation). Caracteristicile enzimarii versus fermentatie sunt prezentate in Tabelul 2.3.

Tabelul 2.3: Caracteristicile “enzimarii” si “fermentatiei” Enzimare Fermentare microorganism celule in repaus celule in crestere

tipul reactiei scurta, catalizata lunga, proces vital

numarul etapelor de reactie

cateva multe

numarul enzimelor active

cateva multe

materia prima substrate surse de carbon si de azot

produsul natural sau nenatural numai natural

toleranta concentratiei ridicata scazuta

izolarea produsului de reactie

usoara complicata

subprodusi cativa multi

10

3. Clasificarea enzimelor. Nomenclatura Clasificarea enzimelor în funcŃie de reacŃia pe care o catalizeazã este

prezentatã în Tabelul 3.1.

Tabelul 3.1: Clasificarea enzimelor în funcŃie de tipul reacŃiei pe care o catalizeazã

Numele enzimei ReacŃia catalizatã

Dehidrogenaze Dehidrogenarea unui substrat cu transferul

hidrogenului la o moleculã diferitã de oxigen Hidroxilaze Hidroxilarea unui substrat la care participã

oxigen molecular ca donor Kinaze Transferul unei grupe fosfat de la o

trifosfatnucleotidã (ATP) la un substrat Mutaze Migrarea unei grupe fosfat de la o poziŃie la

alta în aceeaşi moleculã Oxidaze Oxidarea unui substrat cu oxigen molecular

ca donor Oxigenaze Incorporarea unei molecule de oxigen cu

ruperea oxidativã a unei legãturi C - C Fosfataze Hidroliza unui ester fosforic Sintetaze Condensarea a douã molecule simultan cu

hidroliza unei trifosfonucleotide (ATP) Transferaze Transferul unei grupe funcŃionale de la un

substrat la altul Nomenclatura enzimelor se face în mai multe moduri:

a) Denumire comunã

Se pãstreazã denumirile comune deşi acestea nu precizeazã acŃiunea

enzimei într-un anumit tip de reacŃie.

Exemplu: pepsina, tripsina, ureaza, etc.

b) O altã denumire puŃin mai precisã constã în folosirea numelui

substratului + numele reacŃiei catalizate + sufixul “azã”:

Exemplu: malatdehidrogenaza