1

RRAAPPOORRTT ŞŞTTIIIINNłłIIFFIICC ŞŞII TTEEHHNNIICC

EEttaappaa IIIIII

22000088

CUPRINS

1. Obiective generale

2. Obiectivele fazei de executie

3. Rezumatul fazei

4. Descrierea stiintifica si tehnica

5. Concluzii

2

1. Obiective generale

Obiectivul general al proiectului de platforma (PYRAMID) propune crearea

infrastructurii necesare dezvoltarii cercetarilor in diagnosticarea precoce in patologia

maligna digestiva. Proiectul isi propune folosirea tehnicilor imagistice de ultima

generatie (autofluorescenta endoscopica, tomografie cu coerenta optica,

endomicroscopie confocala laser, etc.), generind crearea unui curent unificator, cu

integrarea cercetatorilor tineri in obiectivele si aria de cercetare FP7.

2. Obiectivele fazei de executie

In cadrul fazei de executie nr 3, derulata in intervalul 21/07/2008-15/12/2008, s-a

urmarit :

Testarea si realizarea de masuratori comparative ut ilizând dispozitivele

de tehnica medicala achizitionate in etapele anteri oare

3. Rezumatul fazei

Relevanta obiectivelor

Proiectul PYRAMID are ca scop completarea si dezvoltarea infrastructurii de

cercetare a UMF Craiova determinind, prin cresterea gradului de utilizare a

infrastructurii de cercetare existente si nou achizitionate, valorificarea potentialului si

a resurselor CDI in plan regional si national, respectiv participarea Centrului de

Cercetare in Gastroenterologie in colaborare cu Disciplinele de Patologie si Biologie

Moleculara, la programe nationale si internationale de cercetare. Proiectul va

favoriza astfel participarea cercetatorilor din UMF Craiova la organizatii stiintifice si

tehnice (ST) internationale, in special prin crearea unor structuri compatibile care sa

permita participarea la programul FP7.

3

De asemenea, au fost achizitionate o serie echipamente necesare dotarii

laboratorului de imagistica digestiva (sistem autofluorescenta endoscopica si

endomicroscopie confocala laser), laboratorului de patologie (linie de citologie

monostrat) si laboratorului de biologie moleculara (secventiator ADN).

Toate achipamentele mai sus menŃionate au fost testate în această etapă

asigurându-se punerea lor în funcŃiune şi utilizarea pentru cercetarea medicală.

Metodologia de implementare a fazei

1. Corelarea dintre obiective si buget : stabilirea unei corelari logice intre

obiectivele fazei, planul de actiune, programul de desfasurare al activitatilor si buget,

stabilirea unui permanent control asupra costurilor, cresterea nivelului de implicare

individuala, a initiativei si colaborarii pentru fiecare membru al echipei proiectului.

2. Tehnicile folosite: Stabilirea procedurilor interne de implementare a fazei,

respectarea locatiilor stabilite pentru implementarea proiectului, asigurarea logisticii

pentru desfasurarea activitatilor fazei, comunicarea permanenta in cadrul echipelor

de lucru si intre echipe, schimburile interactive de informare.

3. Procedurile de evaluare intern ă.

Directorul de proiect, a urmărit in permanenta derularea activitatilor, atingerea

obiectivelor si a rezultatelor fazei prin:

• Raportări lunare privind îndeplinirea activităŃilor propuse în limita timpului alocat

desfăşurării acestora;

• Monitorizarea rezultatelor;

• Evaluarea eficienŃei utilizării resurselor faŃã de rezultatele obŃinute.

Prin aplicarea metodologiei propuse s-a asigurat:

♦ Atingerea obiectivelor fazei;

♦ Corelatia dintre buget si actiunile fazei;

♦ Concordanta dintre programarea activitatilor si perioada de derulare;

♦ Evaluarea permanenta a activitatilor si a rezultatelor obtinute;

♦ Mobilizarea echipei proiectului.

4

Procedurile de achizitie

În această faza nu au fot prevăzute achiziŃii de echipamente.

4. Descrierea stiintifica si tehnica

TESTAREA APARATURII DE CERCETARE

Laborator de imagistica digestiva

Sistem de autofluorescenta endoscopica

Principiul autofluorescentei este bazat pe interactiunea dintre lumina cu o

anumita lungime de unda si fluoroforii din tesuturi. Sursele de lumina folosite includ

surse incoerente (ex. xenon) sau lumina laser monocromatica. Caracterul fluorescent

(profilul spectral) al fiecarui tesut este dependent de

compozitia biochimica si arhitectura morfologica. Cand un

tesut este iluminat cu lumina ultravioleta sau cu lungime de

unda joasa din spectrul vizibil obtinute dintr-o sursa laser sau

lampa cu filtru, este emisa de moleculele endogene

(fluorofori) tisulare o lumina fluorescenta cu o lungime de

unda mai mare. Aceasta autofluorescenta provine din

componentele tesutului conjunctiv (colagen, elastina), din

enzimele metabolismului celular (NADH, etc.), din produsii

biosintezei hemului (porfirine) si din lipopigmenti (lipofuscina,

ceride). Diferite lungimi de unda activeaza diferiti fluorofori,

fiecare emitand intr-o alta lungime de unda. Detectia leziunilor prin autofluorescenta

depinde de schimbarile in concentratia diferitilor fluorofori, modificarile arhitecturale

tisulare sau ambele, incluzand alterarea grosimii mucoasei sau circulatiei sangvine

care pot afecta intensitatea fluorescentei.

Pornind de la principiile mai sus menŃionate sistemul achiziŃionat în cadrul

programului de infrastrcutură PYRAMID a fost pus în funcŃiune şi s-au realizat

primele explorări pentru pacienŃi.

5

Endoscopie digestivă superioară în mod white light (clasic): aspect normal al

mucoasei gastrice

Endoscopie digestivă superioară cu autofluorescenŃă (acelaşi pacient): leziune de

aproximativ 2 cm cu aspect modificat al mucoasei adiacente

6

Endoscopie digestivă superioară în mod NBI (acelaşi pacient): permite o mai buna

caracterizare a aspectului mucoasei şi vascularizaŃiei

Cazul mai sus prezentat relevă importanŃa deosebită a examinărilor

endoscopice cu tehnici de ultimă oră. Examinarea în mod clasic, cu lumină albă nu a

evidenŃiat nici un aspect patologic al mucoasei gastrice în timp ce examinarea cu

autofluorescenŃă a evidenŃiat o leziune de aproximativ 2 cm. Examinarea

anatomopatologică a biopsiilor prelevate a pus diagnosticul de certitudine de cancer

gastric precoce (adenocarcinom) limitat la mucoasă.

Datorită diagosticului extrem de precoce, în stadiu curabil, realizat datorită

noilor tehnici imagistice endoscopice, această pacientă are excelente şanse de

supravieŃuire şi vindecare.

7

TESTAREA APARATURII DE CERCETARE

Laborator de imagistica digestiva

Sistem de endomicroscopie confocala laser

Principiul endomicroscopiei confocale laser este bazat pe integrarea unui

microscop confocal laser in virful unui endoscop conventional. In timpul endoscopiei

se foloseste apoi o raza laser care genereaza o unda de excitatie de 488 nm,

permitind obtinerea de sectiuni optice tisulare de

7 µm cu o rezolutie laterala de 0,7 µm si o

penetratie intre 0 si 250 µm. Avantajul major

consta in obtinerea unor imagini histologice in

vivo cu posibilitatea de a obtine biopsii ghidate.

Desi microvascularizatia, celulele individuale si

tesutul conjunctiv au vizibilitate buna,

diferentierea dintre displazia joasa si inalta nu

sunt inca posibile cu agenti de contrast topici de

tipul fluoresceinei, deoarece contrastul nu

penetreaza nucleii celulelor. Alti agenti de

contrast de tipul acriflavinei sunt folositi cu grija

deoarece au risc potential de activitate mutagenic.

Endomicroscopia confocala laser are

aplicatii multiple: screening-ul carcinomului

colorectal, in special postpolipectomie si in colita

ulcerativa, permitind diagnosticul unor neoplazii intraepiteliale cu acuratete mai buna

decit endoscopia conventionala. Supravegherea esofagului Barrett si a leziunilor

preneoplazice gastrice este de asemenea mai usoara cu microendoscopie confocala

laser. Desi confirmarea diagnosticului necesita inca examene anatomopatologice

conventionale, este posibila folosirea tehnicilor de telemedicina care permit

transmisia in timp real a datelor imagistice catre specialistii anatomopatologi, in

timpul examinarilor endoscopice de catre gastroenterologi.

Sistemul de endomicroscopie achiziŃionat a fost testat şi a început să fie

utilizat în cadrul procedurilor desfăşurate în cadrul Centrului de Cercetare în

Gastroenterologie şi Hepatologie Craiova.

8

Endoscopie digestivă inferioară: aspect normal al mucoasei

Endomicroscopie confocală laser la nivelul colonului (acelaşi pacient):

aspect normal al mucoasei (dispoziŃie regulată a criptelor colonice cu vizaulizarea

celulelor columnare şi caliciforme)

9

Endoscopie digestivă inferioară: formaŃiune tumorală ulcero-vegetantă situată la

nivelul rectului

Endomicroscopie confocală laser la nivelul colonului (acelaşi pacient): arhitectura

glandulara este pastrata, dar glandele sunt inegale, prolifereaza anarhic, tapetate de

epiteliu malignizat - structură de adenocarcinom de colon bine diferenŃiat

10

TESTAREA APARATURII DE CERCETARE

Laborator de Biologie Moleculara

Sistem de secventiere ADN

Sistemul automat de secven Ńiere Beckman Coulter CEQ 8000 permite

detecŃia mutaŃiilor, deleŃiilor şi ambiguităŃilor, detecŃia automată a heterozigoŃilor,

identificarea automată a alelelor cu scor SNP, instabilitatea microsateliŃilor, pierderea

heterozigoŃilor.

Specificitatea sistemul de secvenŃiere a fost evaluată prin analizarea secvenŃei

nucleotidice a unui fragment de ADN plasmidic cu secvenŃă cunoscută.

11

De asemenea au fost evaluate mutaŃiile de la nivelul codonului 12 al genei K-

ras la pacienŃii cu cancer colorectal. ADN-ul a fost izolat şi purificat atât din probe de

Ńesut tumoral provenind de la pacienŃii cu cancer colorectal, cât şi din materiile fecale

ale acestor pacienŃi. Un fragment de 82 de perechi de baze de la nivelul exonului 1,

care conŃine codonul 12, a fost apoi amplificat prin PCR. SecvenŃa fragmentelor

amplificate a fost apoi analizată cu ajutorul sistemului automat Coulter CEQ 8000.

12

O a doua componentă a sistemului achiziŃionat, luminometrul Glomax 20/20

(Promega), a fost utilizat pentru evaluarea calitativă a acizilor nucleici, în paralel cu

evaluarea prin spectrofotometrie (biofotometrul Eppendorf), real-time PCR (în

prezent dispunem de un sistem RotorGene 6200 + HRM de la compania Corbett) şi

cu ajutorul sistemului de fotodocumentare cu camera CCD (Syngene G:Box HR).

Mikro-Dismembratorul U (Sartorius), cu o viteză de agitare de 2000 min-1,

este utilizat în etapa iniŃială de omogenizare a izolării acizilor nucleici. Acest aparat

permite omogenizarea rapidă a probei în condiŃiile reducerii riscului degradării ADN,

ARN şi proteinelor, evitându-se utilizarea enzimelor şi reducând riscul degradării

probelor.

In cadrul laboratorului, aparatul a fost utilizat pentru omogenizarea probelor de

Ńesuturi recoltate de la pacienŃii cu cancer colorectal şi cancer gastric, în vederea

izolării şi purificării ARN-ului.

Pentru extracŃia şi purificarea acizilor nucleici, a fost achiziŃionat extractorul

automat Maxwell® 16 (Promega). Cu ajutorul extractorului automat, a fost izolat

ADN din 32 de probe de sânge şi ARN dintr-o probă de Ńesut malign colorectal.

ConcentraŃiile şi purităŃile acizilor nucleici, măsurate spectrofotometric, sunt redate în

tabelul de mai jos.

NR. crt. Proba ADN µg/ml ADN

260/280 ADN

260/230

1 SP110 48,06 1,72 1,15 2 SP111 35,90 1,81 1,22 3 SP112 44,18 1,88 1,29 4 SP113 44,76 1,80 0,98 5 SP114 27,17 1,75 1,00 6 SP115 36,37 1,65 1,13 7 SP116 43,38 1,77 1,26

8 25Reu 56,92 1,76 1,22

9 FB6 51,46 1,62 1,01 10 FB7 13,97 1,44 0,53 11 71 26,22 1,49 0,83 12 72 26,68 1,83 1,13 13 73 95,28 1,63 1,37 14 73 20,09 1,57 0,99 15 29 36,02 1,74 0,87 16 29 30,24 1,77 1,20 17 SP158 27,99 1,86 0,41

13

18 SP159 44,82 1,69 1,13 19 SP160 100,33 1,76 1,14 20 SP161 58,32 1,80 1,12 21 SP162 55,65 1,78 1,22 22 SP163 50,19 1,79 1,03 23 SP169 52,04 1,79 1,32 24 SP170 42,73 1,82 1,04 25 SP171 67,26 1,48 1,10 26 SP172 29,05 1,83 0,90 27 SP174 23,83 1,84 0,78 28 SP175 44,30 1,78 1,16 29 SP176 10,18 1,90 0,53 30 SP177 40,66 1,81 1,05 31 SP178 60,99 1,80 1,46

32 SP179 58,48 1,84 1,46

ARN µg/ml ARN

260/280 ARN

260/230 33 CRC5 15,2 1,09 0,23

TESTAREA APARATURII DE CERCETARE

Laborator de Patologie

Linie de citologie monostrat

Sistemul de analiza citologica este superior celorlalte sisteme existente in

dotarea serviciului de anatomie patologica din cadrul UMF Craiova prin marile

avantaje pe care le ofera:

� păstrarea viabilităŃii celulelor: celulele prelevate şi incluse în soluŃia de

conservare CYTOFAST îşi păstrează caracteristicile citologice

nemodificate, ceea ce permite recoltarea şi din zone izolate şi

prelucrarea probelor într-un laborator central.

� standardizarea metodei: recoltarea, conservarea şi depunerea celulelor

pe lamă sunt specifice metodei CYTOFAST şi au ca rezultat obŃinerea

de lame standardizate şi de foarte bună calitate.

� sensibilitate: metoda CYTOFAST asigură obŃinerea de probe

reprezentative, permitand citologului o interpretare mult mai rapidă şi

corectă a preparatului microscopic. Pe lângă etalarea celulelor în

monostrat, lamele păstrează şi contextul inflamator al probei, astfel

încât se poate pune un diagnostic complet. Metoda CYTOFAST

permite laboratorului efectuarea şi a unor teste complementare, din

14

aceeaşi probă, fără a fi necesară rechemarea pacientului pentru o nouă

recoltare.

15

TESTAREA APARATURII DE CERCETARE

Realizarea infrastructurii IT si a retelelor de cal culatoare

Pentru a stoca si prelucra imensa cantitate de informatie video achizitionata in

cadrul procesului de cercetare, a fost necesara dezvoltarea unui centru IT dotat cu

tehnica de calcul moderna si performanta si o infrastructura de comunicatii rapida.

Primul pas pentru realizarea acestui obiectiv a fost identificarea si amenajarea

interioara a unui spatiu dedicat activitatilor IT, localizat in aceeasi cladire si in

imediata vecinatate a Centrului de Gastroenterologie si Hepatologie si apoi

interconectarea lor prin conexiuni UTP Cat.5e de mare viteza (gigabit ethernet)

pentru a asigura intercomunicatia de banda larga intre cele doua puncte.

Apoi au fost instalate cele doua servere de stocare si comunicatii, sisteme

Hewlett-Packard special concepute pentru montarea in rack de 19". Serverele sunt in

configuratie quadcore XEON dualprocesor cu harddisk-uri ultrarapide SAS-sff 2.5"

hotpluggable setate in configuratie RAID pentru a asigura o siguranta sporita in

functionare. De asemenea au fost dotate cu surse redundante de tensiune, cu

alimentare dubla, atat directa cat si prin sursa UPS de mare putere. Cu ajutorul unor

patchcord-uri UTP a fost realizata atat conectarea la Centrul de Gastroenterologie si

Hepatologie cat si la reteaua locala a cladirii cu acces de banda larga la Internet.

Toate datele şi imagistica achiziŃionată în timpul examinărilor efectuate în

cadrul Centrului de Cercetare în Gastroenterologie şi Hepatologie sunt transferate şi

stocate în format digital pe serverele achiziŃionate prin acest program. În acest scop

16

au fost create baze de date cu acces foarte rapid pentru introducerea şi obŃinerea de

date despre pacienŃii înregistraŃi.

17

5. Concluzii

Proiectul PYRAMID va completa si dezvolta infrastructura de cercetare a UMF

Craiova determinind valorificarea potentialului si a resurselor CDI in plan regional si

national, respectiv participarea Centrului de Cercetare in Gastroenterologie in

colaborare cu Disciplinele de Patologie si Biologie Moleculara, la programe nationale

si internationale de cercetare.

In cadrul acestei faze au fost testate echipamentele necesare infrastructurii IT si

echipamentele de cercetare de inalta performanta conform descrierii de mai sus.

Director contract,

Prof. Univ. Dr. Adrian Săftoiu