raport Ştiin Ţific de etap · insuficient ă a unor medicamente antibacteriene noi [1,2]. pe...

HEAL inSiDE – Etapa 1 1 / 36

RAPORT ŞTIINŢIFIC DE ETAPĂ

Contract nr. 99 ⁄ 2018, cu titlul „ Design de peptide antimicrobiene cu potenţial

terapeutic ridicat: predicţie in silico şi validare experimentală” (HEAL inSiDE)

PN-III-P1-1.1-TE-2016-0032

Etapa 1

Această etapă are 3 obiective împărţite în 10 activităţi. Deoarece acest document

constituie un raport al activităţii ştiinţifice, obiectivele 1.1 şi 1.3, marcate în gri, sunt

doar enumerate. Obiectivul ştiinţific al acestei etape este 1.2, având 4 activităţi.

Raportul ştiinţific este împărţit în următoarele secţiuni: (1) Introducere, (2)

Rezumatul etapei, (3) Descrierea ştiinţifică şi tehnică, cu subsecţiunile: (3.1)

Programe şi modele utilizate, (3.2) Simulări atomistice, (3.3) Simulări coarse-

grained, (4) Concluzii etapă şi (5) Bibliografie. Sumar activităţi:

Obiectiv 1.1 Planificarea activităţilor ştiinţifice şi administrative

Activitate 1.1.1 Planificarea activităţilor administrative

Activitate 1.1.2 Organizarea de întâlniri de grup regulate în scopul: (i) identificării

potenţialelor probleme ştiinţifice; (ii) planificării activităţilor

ştiinţifice viitoare

Activitate 1.1.3 Actualizarea paginii web a proiectului

Obiectiv 1.2 Studiul membranelor model prin metode atomistice şi

moleculare (CG). Identificarea unui model simplu şi al unuia

complex pentru membrane bacteriene şi de mamifer

Activitate 1.2.1 Pregătirea sistemelor atomistice simple şi complexe de modele

membranare bacteriene şi de mamifer

Activitate 1.2.2 Simularea sistemelor şi studiul dinamicii, a legăturilor de hidrogen,

precum şi a distribuţiei atomilor/grupurilor de atomi de-a lungul

normalei la membrană.


Activitate 1.2.3 Analiza rezultatelor obţinute şi propunerea de modele

membranare atomistice bacteriene şi de mamifer (simple şi

complexe).

Activitate 1.2.4 Validarea modelelor membranare propuse prin simulări

moleculare/coarse-grained (CG).

Obiectiv 1.3 Diseminare rezultate proiect

Activitate 1.3.1 Diseminare rezultate în cadrul întâlnirilor regulate ale grupului

Activitate 1.3.2 Diseminare rezultate prin participare la conferinţe şi publicaţii

Activitate 1.3.3 Întocmire raport ştiinţific de etapă, concluzii şi prespective


� 1. Introducere

Conform datelor furnizate de Organizaţia Mondială a Sănătăţii rezistenţa

antimicrobiană este în creştere şi reprezintă o ameninţare tot mai mare la adresa

sănătăţii publice [1]. Una din prinicipalele cauze este determinată de dezvoltarea

insuficientă a unor medicamente antibacteriene noi [1,2].

Pe lângă potenţialului terapeutic ridicat, peptidele antimicrobiene naturale prezintă

acţiune bactericidă, antiinflamatoare şi anticancer, cu selectivitate ridicată pentru

celulele bacteriene în comparaţie cu cele de mamifer [3,4]. Cu toate acestea,

posibilitatea ca bacteriile să dezvolte diferite strategii de rezistenţă bacteriană

(modificări în sarcina de suprafaţă) împotriva activităţii peptidelor naturale sugerează

necesitatea unor noi abordări în design-ul unor noi peptide antimicrobiene. Creşterea

siguranţei şi eficacităţii noilor medicamente este esenţială pentru noile peptide

(extrase din fragmente de proteine şi din biblioteci peptidice sau concepute în mod

secvenţial).

Abordările de cercetare ale peptidelor

antimicrobiene pot fi clasificate în 3

categorii [5]: bazate pe şablon

(peptidele sunt tratate ca secvenţe de

aminoacizi, limitate la proprietăţile lor

individuale, cum ar fi hidrofobicitatea,

încărcarea / sarcina electrică etc.),

modele privind relaţia cantitativă

structură-activitate, QSAR (analize

numerice care descriu relaţiile dintre

proprietăţile peptidelor ca intrări şi activitatea biologică ca ieşire, limitată de funcţia

utilizată) şi studiile biofizice (modelare moleculară bazată pe energie liberă, dinamică

moleculară etc., limitată de scală, modele de membrane).

Fig. 1. Inserarea peptidelor antimicrobiene în membrană [5]


� 2. Rezumatul etapei

Prima etapă a acestei etapă totalizează 10 activităţi (enumerate pe primele două

pagini ale acestui raport), pentru atingerea a 3 obiective principale: (O1.1)

Planificarea activităţilor ştiinţifice şi administrative; (O1.2) Studiul membranelor

model prin metode atomistice şi moleculare (CG). Identificarea unui model simplu şi

al unuia complex pentru membrane bacteriene şi de mamifer (parte ştiinţifică);

(O1.3) Diseminarea rezultatelor intermediare obţinute în această etapă.

Sumarul activităţii ştiinţifice de etapă (O1.2) este următorul:

Activităţile pentru studiul membranelor model sunt: (i) simulări la nivel

atomistic (3.2), care au avut ca ţintă (a) modelarea mai multor modele

membranare plasmatice atât bacteriene, cât şi de mamifer, (b) obţinerea de

sisteme stabile simple şi complexe şi (c) caracterizarea acestora.

Scopul acestor simulări a fost de a pregăti (ii) simulările la nivel semi-atomistic

sau coarse-grained (3.3). Acestea au fost folosite pentru a identifica cele mai

bune modele de membrane plasmatice bacteriene şi de mamifer, fiecare în

două variante de complexitate: (a) model simplu şi (b) model complex.

Descrierea detaliată a activităţilor este realizată la secţiunea 3, începând cu

prezentarea programelor şi metodelor care au fost folosite pentru a obţine modelele

membranare menţionate mai sus (3.1).

Raportul ştiinţific de etapă se încheie cu câteva concluzii majore asupra rezultatelor

obţinute, precum şi o listă de referinţe folosite în acest raport.


� 3. Descrierea ştiinţifică şi tehnică

3.1. Programe şi modele utilizate

NAMD [6] – cod de dinamică moleculară care este proiectat pentru paralelizarea

eficientă a simulărilor de sisteme biomoleculare de largi dimensiuni. NAMD este

accesibil pentru utilizare gratuită, pentru o perioadă nelimitată de timp şi este bazat

pe un design modern şi tehnologii de programare avansate. Versiunile recente ale

codului (NAMD 2.12 – NAMD2.13) includ accelerări semnificative pe partea de

paralelizare a codului folosind setul de instrucţiuni CUDA ale motoarelor grafice

(GPU).

GROMACS [7] – cod de dinamică moleculară proiectat în principal pentru

biomolecule (proteine, lipide), dar este utilizat şi în studiul altor sisteme (polimeri).

Permite paralelizarea mult mai eficientă a simulărilor coarse-grained.

VMD [8] – program de vizualizare şi modelare dezvoltat pentru sisteme

biomoleculare, eficient în pregătirea configuraţiilor iniţiale şi postanaliza traiectoriilor

NAMD/GROMACS.

CHARMM [9, 10] – câmp de forţe atomistic al cărui calcul al energiei potenţiale se

realizează după descrierea de mai jos:

( ) ( ) [ ] ( )

( )

2 2 2

0 0 0

12 6

21,3 1,3

0

1 cos( )

2

b

i j ij ij

ij ub

i, j i, jij ij ij

U k b b k k n k

q q r rk b b

r r r

θ ψ ωθ θ ψ δ ω ω

εε −

= − + − + + − + −

+ + − + −

∑ ∑ ∑ ∑

∑ ∑ ∑

bonds angles dihedrals impropers

min min

atoms atoms Urey Bradley

MARTINI [11] – câmp de forţe semi-atomistic / coarse-grained (CG) care modelează

ca o singură particulă 4 sau 3 atomi grei împreună cu atomii de hidrogen aferenţi.

Câmpul de forţe Martini 2 a fost rafinat în mai multe etape prin îmbunătăţirea

câmpului pentru proteine, apă şi ioni (a fost dezvoltat inclusiv câmp de forţe polarizat

[12]) şi extinderea acestuia asupra unui număr impresionant de lipide [13-16].

Tcl/Tk – limbaj de scripting foarte eficient în generarea de structuri în format

PDB/GRO şi pentru analiza datelor obţinute din postanaliza VMD. Limbajul este


compatibil cu VMD şi astfel poate fi folosit şi în cadrul postanalizei traiectoriilor în

VMD.

Python [17] – limbaj de programare avansat uşor de utilizat de tip iterativ, imperativ

şi cu un interpretor interactiv.

Microsoft Excel – utilitar de analiză rapidă a fişierelor de tip bază de date în mod

text.


3.2. Simulări atomistice

În aceste simulări s-a urmărit obţinerea de modele membranare plasmatice

bacteriene şi de mamifer.

Metode

Construcţia membranei.

Tab. 1. Detalii simulări. Componenţa lipidică a bistraturilor folosite în simulările atomistice.

ATOMISTIC MAMIFER

simplu (bistrat simetric) fosfatidilcolină

strat superior strat inferior

POPC 144 144 ternar (bistrat simetric) strat superior strat inferior

fosfatidilcoline + colesterol DPPC 50 50 DLiPC 30 30 CHOL 20 20

simplu (bistrat asimetric) strat superior strat inferior fosfolipide + colesterol

DPPC 33 22 DLiPC 25 23 POPE 10 26 CHOL 32 29

simplu (bistrat asimetric) strat superior strat inferior fosfolipide + colesterol (4X) (4X) (4X)

DPPC 132 88 DLiPC 100 92 POPE 40 104 CHOL 128 116 complex (bistrat asimetric) strat superior strat inferior

fosfolipide (neutre + încărcate) + sfingomielină + colesterol

DPPC 10 12 DLiPC 26 5 POPE 10 24 PSM 24 10 DOPS 0 18 CHOL 32 29 complex (bistrat asimetric) strat superior strat inferior

fosfolipide (neutre + încărcate) + sfingomielină + colesterol

(4X)

(4X) (4X)

DPPC 40 48 DLiPC 104 20


POPE 40 96 PSM 96 40 DOPS 0 72 CHOL 128 116

BACTERIAN simplu (bistrat simetric)

fosfolipide neutre + încărcate strat superior strat inferior

DOPC 122 122 DOPG 22 22

ternar (bistrat simetric) fosfolipide (neutre + încărcate)

+ cardiolipină

strat superior strat inferior

PVPE 90 90 PVPG 5 5 PVCL2 5 5

Au fost studiate prin simulări atomistice modelele membranare plasmatice (vezi

Tabelul 1) de mamifer (simetric simplu/ternar, asimetric simplu/complex) şi

bacteriene (simetric simplu/ternar) (vezi Figura 2). Structura iniţială a fost construită

cu ajutorul Membrane Builder [18].


Fig. 2. Reprezentări ale sistemele atomistice model alese în urma analizelor de mai jos: (sus) de mamifer (stânga) simetric simplu (fosfatidilcolină) – POPC(mov); (dreapta) simetric ternar (fosfatidilcoline+cholesterol) – DPPC(albastru),DLiPC

(roz),CHOL (alb) şi (jos) bacteriene (stânga) simetric simplu (fosfolipide neutre+încărcate) – DOPC(verde), DOPG(magenta); (dreapta) simetric ternar

(fosfolipide (neutre+încărcate)+cardiolipină) – PVPE (cyan), PVPG (galben), PVCL2 (albastru)

Construcţia sistemului.

Sistemele atomistice au fost solvatate (model TIP3P [19]) şi neutralizate cu ajutorul

ionilor de sodiu si clor pentru a avea concentraţia molară de 0.15 mol/L.

Câmpul de forţe.

În simulările atomistice au fost folosite câmpul de forţe CHARMM C36 [9] şi câmpul

de forţe atomistic CHARMM pentru sfingomielină [10].

Protocoale de simulare.

Simulările au fost realizate cu programul de dinamică moleculară NAMD [6]. Acesta

foloseşte integratorul Verlet pentru propagarea poziţiilor şi vitezelor atomilor. În toate

simulările am utilizat pasul de integrare de 2 fs, distanţa de tăiere folosită a fost de

12 Å, iar funcţia de comutare a fost setată la 9 Å pentru toate interacţiunile de scurtă

distanţă. Cu excepţia interacţiunilor electrostatice, care au fost actualizate la fiecare

al doilea pas, toate celelalte interacţiuni au fost actualizate la fiecare pas. Pentru a

minimiza efectele de margine au fost aplicate condiţii de periodicitate, iar


interacţiunile electrostatice de lungă distanţă au fost tratate folosind metoda Particle

Mesh Ewald (PME) [20]. Temperatura a fost fixată la 300 K folosind un termostat

Langevin [21, 22] cu un coeficient de amortizare de 5 ps-1.

Tab. 2. Detalii de simulare. Mărimea sistemelor/timpul de simulare. ATOMISTIC MAMIFER Componenţă bistrat Număr atomi Timp simulare POPC 65496 >70 ns DPPC:DLiPC:CHOL (4X) 178095 100 ns DPPC:DLiPC:POPE: CHOL 42011 100 ns DPPC:DLiPC:POPE: CHOL (4X) 157480 300 ns DPPC:DLiPC:POPE:PSM:DOPS:CHOL 38563 100 ns DPPC:DLiPC:POPE:PSM:DOPS:CHOL (4X)

165317 300 ns

BACTERIAN Componenţă bistrat Număr atomi Timp simulare DOPC:DOPG 66340 >70 ns PVPE:PVPG:PVCL2 45504 100 ns

Protocolul următor a fost folosit în toate simulările: a) sistemele au fost minimizate

10.000 de paşi aplicând restricţii următorilor atomi: fosfor (k = 2.5 kcal mol-1 Å-2),

atomii de oxygen ai apei şi ionii (k = 0.1 kcal mol-1 Å-2), b) 150 ps warmup de la 0 K a

300 K, cu creşterea temperaturii cu 3 K la fiecare ps. Au fost aplicate restricţii:

atomilor de fosfor (k = 1 kcal mol-1 Å-2), atomii de oxygen ai apei şi ionii (k = 0.1 kcal

mol-1 Å-2), c) 350 ps echilibrare la temperature de 300 K, cu restricţii aplicate atomilor

de fosfor (k = 0.1 kcal mol-1 Å-2), d) timpul aferent fiecărei simulări a fost sintetizat în

Tabelul 2.


Rezultate şi discuţii

Distribuţiile grupurilor de atomi

Distribuţiile grupurilor de atomi au fost determinate cu ajutorul plugin-ului de analiză

Density Profile Tool [23] din programul VMD [8]. Distribuţia grupurilor de atomi de-a

lungul normalei la membrană au fost obţinute împărţind membrana în felii de 1 Å

grosime. Centrul bistratului lipidic este situat la z=0, fiind reprezentate profilele

separat pentru cele 2 straturi. Toate grupurile de atomi enumerate din legendă

conţin doar atomii grei.

Fig. 3. Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană pentru bistrat

de mamifer simetric simplu (fosfatidilcolină)

Primul bistrat lipidic de mamifer considerat este un bistrat simplu care are în

componenţă lipide POPC. Distribuţiile indică că apa pătrunde în bistratul lipidic până

la regiunea unde sunt situate grupările glicerol, cozile lipidice formate din grupările

metil fiind hidrofobe (vezi Fig. 3) în concordanţă cu datele experimentale [24, 25].



de mamifer simetric ternar (fosfatidilcoline + cholesterol)

Bistratul lipidic terţiar este gradul următor de complexitate considerat. În Fig. 4 este

reprezentată distribuţia grupurilor de atomi aferente bistrat de mamifer simetric

format din lipidele DPPC, DLiPC şi colesterol. Moleculele de cholesterol sunt situate

mai adânc în bistrat, în comparaţie cu fosfatidilcolinele. Lipidele DPPC au 2 lanţuri

saturate fiind prezente doar legături simple, spre deosebire de lipidele DLiPC care

prezintă lanţuri nesaturate.



de mamifer asimetric simplu (fosfolipide + colesterol)

Distribuţia grupurilor de atomi reprezentată în Fig. 5 indică că în membrana

asimetrică alcătuită din 4 componente DPPC, DLiPC, POPE şi colesterol, lipidele

POPE sunt inserate mai adânc în bistrat, în comparaţie cu DPPC şi DLiPC. La fel ca

în studiile experimentale RMN [26], grupările PC sunt situate perpendicular pe planul

membranar, iar grupările PE sunt situate paralel cu acesta.

Putem observa ca localizarea colesterolului depinde nu doar de stratul în care se

situează, ci şi de compoziţia celuilalt strat, deoarece bistratul asimetric se comportă

ca o entitate unitară care este consituită din 2 straturi care comunică între ele.



de mamifer asimetric complex (fosfolipide (neutre+încărcate)+sfingomielină+colesterol)

Pentru a crea un model cât mai realist, am studiat prin simulări atomistice o

membrană asimetrică cu compoziţia celor 2 straturi diferite (DPPC, DLiPC, POPE,

PSM, DOPS şi cholesterol). În cadrul separaţiei de fază, faza ordonată este bogată

în cholesterol şi lipide PSM, din acest motiv studiul bistratului asimetric este esenţial

în caracterizarea membranelor de mamifer. Comportamentul lipidelor POPE (vezi

Fig. 6) inserate mai adânc în membrană este acelaşi ca în cazul bistratului de

mamifer asimetric simplu (vezi Fig. 5).


Fig. 7. Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană bistrat bacterial

simetric simplu (fosfolipide neutre + încărcate)

Un model consacrat alcătuit din fosfolipide (neutre + încărcate) a fost folosit în

simulări atomistice pentru a studia membrana interioară E. coli. Lipidele utilizate sunt

DOPC (dioleoilfosfatidilcolină) şi DOPG (dioleoilfosfatidilglicerol) (vezi Fig. 7). Acest

model este utilizat pe scară largă, iar distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul

normalei la membrană este în concordanţă cu datele experimental obţinute prin

RMN de Heller [27].


Un model mai complex alcătuit din fosfolipide (neutre + încărcate) şi cardiolipină (CL)

a necesar în simulările atomistice pentru a simula membrana interioară E. coli. Au

fost utilizate lipidele PVPE, PVPG şi PVCL2, lipidele CL fiind inserate mai adânc în

bistratul lipidic, în comparaţie cu fosfolipidele (vezi Fig. 8).

În continuare, urmărim în acest studiu comparativ relaţia dintre modelele

membranare (amestecuri simple, respectiv terţiare de mamifer şi bacteriale) şi

sistemele naturale.

Fig. 8. Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană bistrat bacterial

simetric ternar (fosfolipide (neutre + încărcate) + cardiolipină)


Grosimea bistratului lipidic

Proprietăţile structurale generale ale bistratului lipidic, cum e grosimea stratului

lipidic (măsurată ca distanţa medie dintre atomii de fosfor dintre cele două straturi),

sunt importante pentru a determina atât timpul necesar echilibrării acestuia, cât şi

parametri termodinamici (cum ar fi modulul izotermic de compresibilitate a suprafeţei

bistratului). Astfel, se observă uşor că pentru ajunge într-o stare de echilibru stabil

este nevoie de mai mult timp pentru sistemele cele mai complexe, şi mai puţin

pentru cele simple (vezi Fig. 9 şi 10). În cazul bistraturilor model pentru membrane

de mamifer, cel complex simetric şi asimetric (negru şi roşu) se comportă la fel, iar

cel ternar (verde) este foarte similar (44 Ǻ vs. 46 Ǻ şi 45 Ǻ, respectiv). Bistratul

simplu POPC (albastru în Fig. 9) este însă sensibil mai subţire (39 Ǻ). Pentru a

menţine avantajele unui model extrem de simplu (monostrat), dar şi pentru a pentru

a obţine (cel puţin la nivel mecanistic) comportamentul bistratului de mamifer cu

minimul necesar, am hotărât să studiem în profunzime modelele de mamifer (a)

POPC (simplu simetric) şi, respectiv (b) DPPC:DLiPC:CHOL 5:3:2 (ternar simetric).

Fig. 9. Grosimea bistraturilor de mamifer studiate


Fig. 10. Grosimea bistraturilor bacteriene studiate

În cazul modelelor bistrat bacteriene am continuat, în mod similar cu cele de

mamifer, studiul aprofundat al modelelor bistrat simplu simetric (DOPC:DOPG 85:15)

şi complex simetric (PVPE:PVPG:PVCL2 90:5:5). Grosimile bistraturilor

corespunzătoare celor două modele (vezi Fig. 10) sunt uşor mai apropiate decât în

cazul modelelor de mamifer (39 Ǻ vs. 43 Ǻ).


Legăturile de hidrogen

Una din analizele cele mai importante care indică gradul de reactivitate al unui bistrat

este studiul legăturilor de hidrogen inter- şi intra-lipidice [28]. Această analiză indică

legăturile de hidrogen intra-lipidice (legăturile de hidrogen pe care o moleculă le

formează cu ea însăşi) şi inter-lipidice (legăturile de hidrogen pe care o moleculă de

formează cu alte molecule). Pentru a înţelege în amănunţime comportamentul /

mecanismul dinamicii lipidice a bistraturilor propuse ca model, cea din urmă va fi

împărţită în ceea ce urmează în interacţiunile dintre molecule lipidice de acelaşi tip şi

în molecule lipidice de tipuri diferite. În figurile de mai jos este indicată frecvenţa

apariţiei legăturilor de hidrogen pe moleculă, pentru diferite lipide în diferite bistraturi.

Fig. 11. Legăturile de hidrogen în bistratul de mamifer simetric simplu (fosfatidilcolină)

Modelul cel mai simplu al unei membrane de mamifer, analizate şi folosite atât în

simulări, cât şi în experimente precedente [28, 29] este bistratul simetric cu

monocomponenta de fosfatidilcolină cu două cozi lipidice, una saturată (palmitoil –

16:0) şi una mononesaturată (oleoil – 18:1): POPC. Acesta l-am denumit bistratul de

mamifer simetric simplu. Numărul mic de legături de hidrogen pe molecula de POPC

(atât intra-, cât şi inter-molecular) indică un grad scăzut de reactivitate al bistratului

de POPC, în concordanţă cu rezultatele obţinute anterior [28].


Fig. 12. Legăturile de hidrogen în bistratul de mamifer simetric ternar

(fosfatidilcoline + cholesterol)

Următorul model de complexitate care l-am folosit în acest studiu pentru modelele

membranare de mamifer, care prezintă acurateţe şi din punct de vedere al grosimii

bistratului, este bistratul lipidic cu compoziţie ternară DPPC:DLiPC:CHOL în

concentraţie 5:3:2. Legăturile de hidrogen studiate între capetele lipidice ale DPPC şi

DLiPC arată legături intra-lipidice pe moleculă rare, similare cu POPC (aprox. 5%),

dar cu stabilitate uşor mai ridicată. Legăturile de hidrogen inter-lipidice DPPC şi

DLiPC sunt mai puţine, dar cu stabilitate similară (şi la fel şi cu POPC), evidenţiând

importanţa capetelor lipidice la fel (PC-uri) în formarea acestor legături. Deşi

mobilitatea DPPC-urilor este mai mică faţă de cea a DLiPC-urilor, acestea au

legături inter-moleculare mai instabile.


Fig. 13. Legăturile de hidrogen în bistratul bacterial simetric simplu

(fosfolipide neutre + încărcate)

Cel mai simplu model de bistrat lipic bacterian folosit are două componente (un

fosfolipid neutru – fosfatidilcolină şi unul încărcat negativ – fosfatidilglicerol).

Amândouă cozile lipidice folosite au fost simplu nesaturate în aceeaşi poziţie (oleoil

– 18:1). Analiza rezultatelor legăturilor de hidrogen indică faptul că DOPG-urile nu

formează aproape deloc legături inter-moleculare (datorată şi concentraţiei scăzute –

15%). DOPC-urile formează legături inter-moleculare similare cu DLiPC-urile şi

POPC-urile, indicând importanţa capetelor lipidice. Pe de altă parte însă fiecare al

doilea DOPG formează legături intra-moleculare, indicând un grad extrem de ridicat

de reactivitate, datorat sarcinii capului lipidic PG. Această activitate se reflectă în

conexiunile şi cu vecinii de alt tip (DOPC) cu care formează legături de hidrogen

(aproximativ 10% din moleculele din bistrat).


Fig. 14. Legăturile de hidrogen în bistratul bacterial simetric ternar

(fosfolipide (neutre + încărcate) + cardiolipină)

Nivelul următor de complexitate folosit în a modela bistratul bacterian a fost cu trei

tipuri de molecule, toate având aceleaşi cozi lipidice: PV (similar cu PO, dar

nesaturaţia este cu două poziţii mai spre centrul bistratului V vs. O). PVPCL2-ul sunt

două cardiolipine legate şi împreună cu PVPG-ul prezintă un comportament similar

din punct de vedere al legăturilor de hidrogen mai ales datorită faptului că împreună

reprezintă doar 10% din moleculele din bistrat. Datorită sarcinii capetelor lipidice

stabilitatea acestora e crescută şi rămâne prezentă în toată simularea pentru ambele

molecule. PVPE-urile prezintă o legături de hidrogen intra-moleculare pe moleculă

uşor mai puţine, dar cu frecvenţă similară. Ca şi în cazul PG-urilor la membrana

simplă, concentraţia scăzută a moleculelor încărcate elimină practic formarea

legăturilor de hidrogen între acestea, însă se poate observa că aproximativ 10% din

molecule (ca în modelul simplu) formează legături de hidrogen inter-moleculare.

Fiecare al doilea PVPE formează legături inter-moleculare, cu frecvenţă destul de

ridicată. Având în vedere că acestea reprezintă 90% din bistrat, aceasta dă un nivel

ridicat de reactivitate al membranei model.


Concluzii

Ca primă activitate în cadrul etapei 1 al acestui proiect am urmărit construirea unei

varietăţi de sisteme biomoleculare care să modeleze în diferite grade de detaliu

membranele plasmatice de mamifer şi bacteriene. Aceasta s-a realizat prin

construirea la început a 4 modele membranare de mamifer de mărimi diferite sub

forma unor bistraturi lipidice, după cum urmează: simplă simetrică, complexă

simetrică, simplă asimetrică şi complexă asimetrică (Act.1.2.1).

Apoi a fost urmărită dinamica acestora chiar şi până la 300 ns pentru a analiza

evoluţia, stabilitatea structurală şi reactivitatea acestora (Act.1.2.2), urmărind

grosimea bistratului lipidic, distribuţia atomilor/grupurilor de atomi din bistrat, precum

şi legăturile de hidrogen intra-/inter-lipidice. În urma acestor analize am propus

folosirea modelului simplu simetric (format din POPC) şi a celui ternar simetric

(format din DPPC:DLiPC:CHOL în concentraţie 5:3:2). În mod similar am propus 2

modele şi pentru membrana plasmatică bacteriană: modelul simplu simetric (format

din DOPC:DOPG în concentraţie 85:15) şi modelul ternar simetric (format din

PVPE:PVPG:PVCL2 în concentraţie 90:5:5) (Act.1.2.3).


3.3. Simulări coarse-grained

Scopul simulărilor semi-atomistice (coarse-grained) au fost să extindă cele

atomistice la o scară mai mare (microsecunde) pentru a obţine validarea modelelor

atomistice şi propunerea modelelor moleculare (simple şi complexe), atât bacteriene,

cât şi atomistice ce vor fi folosite în simulările de peptide din cadrul acestui proiect.

Metode

Construcţia membranei.

Tab. 3. Detalii simulări. Componenţa lipidică a bistraturilor folosite în simulările coarse-grained.

COARSE-GRAINED MAMIFER

simplu (bistrat simetric) strat superior strat inferior fosfatidilcolină

POPC 961 961 ternar (bistrat simetric) strat superior strat inferior

fosfatidilcoline + colesterol DPPC 400 400 DIPC 288 288 CHOL 192 192

BACTERIAN simplu (bistrat simetric) strat superior strat inferior

fosfolipide neutre + încărcate DOPC 765 765 DOPG 135 135

ternar (bistrat simetric) strat superior strat inferior fosfolipide (neutre + încărcate)

+ cardiolipină

PVPE 810 810 PVPG 45 45 PVCL2 45 45

Modelele membranare plasmatice folosite în simulările coarse-grained (vezi Fig. 15)

sunt cele asupra cărora s-a decis aprofundarea studiului (simetrice simple/ternare)

de mamifer şi bacteriene (vezi Tab. 3). Coordonatele iniţiale din fişierele de input

au fost generate având ca referinţă structurile atomistice ale lipidelor. Raportul

compoziţiei lipidice din modelele coarse-grained este acelaşi cu cel din modelele

atomistice.


Fig. 15. Reprezentări coarse-grained ale sistemelor model alese: (sus) de mamifer

(stânga) simetric simplu (fosfatidilcolină) – POPC(mov); (dreapta) simetric ternar (fosfatidilcoline+cholesterol) – DPPC (albastru), DLiPC (roz), CHOL (alb) şi (jos) bacteriene (stânga) simetric simplu (fosfolipide neutre+încărcate) –

DOPC(verde), DOPG(magenta); (dreapta) simetric ternar (fosfolipide (neutre+încărcate)+cardiolipină) – PVPE (cyan), PVPG (galben), PVCL2 (albastru)

Construcţia sistemului.

Sistemele coarse grained au fost solvatate (MARTINI water [11]) şi neutralizate cu

ajutorul ionilor de sodiu şi clor pentru a avea concentraţia molară de 0.15 mol/L.

Câmpul de forţe.

Câmpul de forţe MARTINI [11] a fost folosit în toate simulările coarse-grained.


Protocoale de simulare.

Programul Gromacs versiunea 5.1.4 a fost utilizat în toate simulările efectuate,

folosind un pas de integrare de 20 de fs. Un ansamblu NPT a fost folosit la 1 bar şi

301 K. Presiunea constantă a fost menţinută de o cuplare slabă semi-izotropă,

folosind un timp de relaxare de 12 ps. Temperatura constantă a fost menţinută prin

cuplarea separată a proteinei cu membrana şi a apei cu ionii la o baie termică de

301 K folosind un timp de relaxare de 1 ps. Dupa minimizarea şi echilibrarea

membranelor, fiecare simulare a fost rulată un timp efectiv de 32 µs (4 ori mai mare

decât timpul de simulare). Detalii despre sisteme (mărimea sistemelor/timpul de

simulare) sunt sintetizate în Tabelul 4.

Tab. 4. Detalii de simulare. Mărimea sistemelor/timpul de simulare. COARSE-GRAINED MAMIFER Componenţă bistrat Număr particule Timp simulare POPC 37470 8 µs DPPC:DIPC:CHOL 35326 8 µs

BACTERIAN Componenţă bistrat Număr particule Timp simulare DOPC:DOPG 34854 8 µs PVPE:PVPG:PVCL2 37602 8 µs


Rezultate şi discuţii

Distribuţiile grupurilor de bead-uri

Distribuţiile grupurilor de bead-uri coarse-grain (CG) au fost determinate cu ajutorul

plugin-ului de analiză Density Profile Tool [23] din programul VMD [8]. Distribuţia

grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană au fost obţinute împărţind

membrana în felii de 1 Å grosime. Centrul bistratului lipidic este situat la z=0, fiind

reprezentate profilele separat pentru cele 2 straturi.

Fig. 16. Distribuţia bead-urilor/grupurilor de bead-uri de-a lungul normalei la

membrană pentru bistrat de mamifer simetric simplu (fosfatidilcolină)

Primul bistrat lipidic de mamifer considerat este cel simplu, care are în componenţă

lipide POPC. Distribuţiile indică că apa pătrunde în bistratul lipidic până la regiunea

unde sunt situate grupările glicerol, cozile lipidice formate din grupările metil fiind

hidrofobe (vezi Fig. 16). Acestea sunt în concordanţă foarte bună cu distribuţiile

obţinute din simulările atomistice (vezi Fig. 3).


Fig. 17. Distribuţia grupurilor de bead-urilor/grupurilor de bead-uri de-a lungul

normalei la membrană pentru bistrat de mamifer simetric ternar (fosfatidilcoline + cholesterol)

Bistratul lipidic terţiar este varianta complexă considerată. În Fig. 17 este

reprezentată distribuţia grupurilor de bead-uri CG aferente bistratului de mamifer

simetric format din lipidele DPPC, DLiPC şi colesterol. Moleculele de cholesterol

sunt situate mai adânc în bistrat, în comparaţie cu fosfatidilcolinele. În plus faţă de

simulările atomistice, gruparea sterol a colesterolului se regăseşte şi în centrul

bistratului. Aceasta se datorează aranjării acestei molecule între cele două straturi şi

chiar a migrării lor dintr-un strat în celălalt, fenomen care nu se poate observa pe

scale de timp mici (sub microseconde) explorate la nivel atomistic. Lipidele DPPC au

2 lanţuri saturate fiind prezente doar legături simple, spre deosebire de lipidele

DLiPC care prezintă lanţuri nesaturate. Astfel, distribuţiile grupărilor CG regăsesc pe

cele atomistice şi explorează la scale mari de timp şi conformaţii neexplorabile de

către simulările atomistice.


Fig. 18. Distribuţia bead-urilor/grupurilor de bead-uri de-a lungul normalei la membrană

bistrat bacterial simetric simplu (fosfolipide neutre + încărcate)

Un model consacrat alcătuit din fosfolipide (neutre + încărcate) folosit în simulări

atomistice pentru a studia membrana plasmatică a E. coli. a fost bistratul (DOPC şi

DOPG). Am reprodus simulările atomistice la nivel CG cu lipidele în aceeaşi

concentraţoe 85:15 (vezi Fig. 18). Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei

la membrană este în concordanţă cu cele obţinute din simulările atomistice (Fig. 7).


Fig. 19. Distribuţia bead-urilor/grupurilor de bead-uri de-a lungul normalei la membrană

bistrat bacterial simetric ternar (fosfolipide (neutre + încărcate) + cardiolipină)

Modelul ternar bacterian alcătuit din fosfolipide (neutre + încărcate) şi cardiolipină

(CL), stabilit în simulările atomistice pentru a modela membrana plasmatică E. coli.,

a fost realizat cu un bistrat simetric PVPE:PVPG:PVCL2 90:5:5. Simulările CG arată

că distribuţia bead-urilor reproduce din nou foarte bine (vezi Fig. 19) pe cele din

simulările atomistice (Fig. 8).


Concluzii

În cadrul acestei subsecţiuni am folosit câmpul de forţe semi-atomistic / molecular /

coarse-grained (CG) Martini pentru a putea extinde simuările atomistice la sisteme

cu un ordin de mărime mai mari şi scale de timp 2-3 ordine de mărime. Acestea sunt

necesare pentru a putea explora acţiunea peptidelor asupra modelelor membranare

la aceste scale de timp. Astfel, aceste modele trebuie să valideze modelele

atomistice prin verificarea stabilităţii structurale folosind distribuţia de bead-uri şi

compararea acestora cu distribuţia grupurilor de atomi din simulările atomistice.

Rezultatele simulările CG au arătat că: (i) câmpul Martini este adecvat pentru

folosirea simulărilor CG la scale de timp extinse; (ii) modelele CG păstrează

stabilitatea structurală a modelelor atomice propuse la subsecţiunea precedentă,

validând aceste 4 modele (câte una simplă şi una complexă pentru membrane

plasmatice model de mamifer şi bacteriene) (Act.1.2.4).


� 4. Concluzii etapă

Secţiunea corespunzătoare raportului ştiinţific (3) a atins toate activităţile ştiinţifice

propuse în cadrul etapei 1, ajungând la următoarele concluzii:

• s-au folosit modele iniţiale atomistice multiple (de la cele mai simple la

cele mai complexe) şi s-au rulat peste 1.2µs de simulări pentru a stabili

modelele ce vor fi folosite în identificarea peptidelor antimicrobiene.

• în urma unei analize complexe a simulărilor atomistice am propus două

modele pentru membrana de mamifer: (i) simplă simetrică (bistrat

POPC) şi (ii) ternară simetrică (bistrat DPPC:DLiPC:CHOL 5:3:2) şi

două modele pentru membrana plasmatică bacteriană: (i) simplă

simetrică (bistrat DOPC:DOPG 85:15) şi (ii) ternară simetrică (bistrat

PVPE:PVPG:PVCL2 90:5:5).

• modelele propuse au fost validate structural prin simulări semi-

atomistice / coarse-grained folosind câmpul de forţe Martini pe sisteme

cu un ordin de mărime mai mari şi pe scale de timp 2-3 ordine de

mărime mai mari.

Rezultatele favorabile obţinute în prima etapă permit proiectul să avanseze la

activităţile din etapele următoare.


� 5. Diseminări etapă

Conferinţe internaţionale

1. M. Bacalum, M. Radu, I. Turcu, ”In silico studies on the dynamics and

energetics of histidine-modulated arginine- and tryptophan-based peptides in

membrane models”, International Conference on Analytical and

Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences (IC-

ANMBES), 23-25 May 2018, Braşov, Romania.

(prezentare poster)

2. L. Janosi, G. Necula, M. Bacalum, M. Radu, I. Turcu, ”Molecular modeling of

histidine-modulated arginine-/ tryptophan-based peptides: dynamics and

energetics”, 15th National Conference of Biophysics (CNB), 7-10 September 2018, Bucureşti, Romania.

(prezentare poster)


� 6. Bibliografie

[1] WHO, Antimicrobial resistance: global report on surveillance, WHO Lib.Cat.-in-Pub.Data (2014).

[2] Silver, L.L., Clin. Microbiol. Rev., Challenges of antibacterial discovery, 24 71 (2011).

[3] Hancock, R.E., H.G. Sahl, Nat. Biotechnol., Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies, 24, 1551 (2006).

[4] Fosgerau, K., T. Hoffmann, Drug Discov. Today, Peptide therapeutics: current status and future directions, 20, 122 (2015).

[5] Fjell, C.D., J. A. Hiss, R. E. Hancock, G. Schneider, Nat. Rev. Drug Discov., Designing antimicrobial peptides: form follows function, 11, 37 (2012).

[6] J. C. Phillips, R. Braun, W. Wang, J. Gumbart, E. Tajkhorshid, E. Villa, C. Chipot, R. D. Skeel, L. Kale, K. Schulten, J. Comput. Chem., Scalable molecular dynamics with NAMD.26, 1781 (2005).

[7] H.J.C. Berendsen, D. van der Spoel and R. van Drunen, Comput. Phys. Commun., GROMACS: A Message-Passing Parallel Molecular Dynamics Implementation, 91 (1995) 43.

[8] W. Humphrey, A. Dalke, K. Schulten, J. Molec. Graphics, VMD: Visual molecular dynamics,14 (1996) 33.

[9] J. B. Klauda, R.M. Venable, J.A. Freites, J.W. O’Connor, D.J. Tobias, C. Mondragon-Ramirez, I. Vorobyov, A.D. MacKerell, Jr., R.W. Pastor, Update of the CHARMM all-atom additive force field for lipids: validation on six lipid types, J. Phys. Chem. B, 114 (2010) 7830.

[10] R.M. Venable, A.J. Sodt, B. Rogaski, H. Rui, E. Hatcher, A.D. MacKerell, Jr., R. W. Pastor, J.B. Klauda., Biophys J., CHARMM All-Atom Additive Force Field for Sphingomyelin: Elucidation of Hydrogen Bonding and of Positive Curvature, 107(1) (2014), 134.

[11] S. J. Marrink, H.J. Risselada, S. Yefimov, D.P. Tieleman and A. H. de Vries, J. Phys. Chem. B, The MARTINI Force Field: Coarse Grained Model for Biomolecular Simulations, 111 (2007) 7812.

[12] Semen O. Yesylevskyy, Lars V. Schäfer, Durba Sengupta, and Siewert J. Marrink, PLoS Comp. Biol., Polarizable Water Model for the Coarse-Grained MARTINI Force Field, 6(6) (2010), e1000810

[13] S.J. Marrink, A.H. de Vries, T.A. Harroun, J. Katsaras, S.R. Wassall, J. Am. Chem. Soc., Cholesterol shows preference for the interior of polyunsaturated lipid membranes, 130(1) (2008),10.


[14] H.J. Risselada, S.J. Marrink, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., The molecular face of lipid rafts in model membranes, 105(45) (2008), 17367.

[15] C.A. Lopez, Z. Sovova, F.J. van Eerden, A.H. de Vries, S.J. Marrink, J. Chem. Theory Comput., Martini force field parameters for glycolipids, 9(3) (2013), 1694.

[16] H.I. Ingólfsson, M.N. Melo, F.J. van Eerden, C. Arnarez, C.A. López, T.A. Wassenaar, X. Periole, A.H. De Vries, D.P. Tieleman, S.J. Marrink, J. Am. Chem. Soc., Lipid organization of the plasma membrane, 136(41) (2014), 14554.

[17] G. van Rossum and J. de Boer, CWI Quarterly, Interactively Testing Remote Servers Using the Python Programming Language, 4 (1991), 283.

[18] E.L. Wu, X. Cheng, S. Jo, H. Rui, K.C. Song, E.M. Dávila-Contreras, Y. Qi, J. Lee, V.Monje-Galvan, R.M. Venable, J.B. Klauda, W. Im, J. Comput. Chem., CHARMM-GUI Membrane Builder Toward Realistic Biological Membrane Simulations, 35 (2014), 1997.

[19] Jorgensen, W. L.; Chandrasekhar, J.; Madura, J. D.; Impey, R. W.; Klein, M. L. J. Chem. Phys., Comparison of simple potential functions for simulating liquid water, 79 (1983) , 926.

[20] U. Essmann, L. Perera, M. L. Berkowitz, T. Darden, H. Lee, L. G. Pedersen, J. Chem. Phys., A smooth particle mesh Ewald method, 103 (1995), 8577.

[21] S. E. Feller, Y. Zhang, R. W. Pastor, J. Chem. Phys., Constant pressure molecular dynamics simulation: The Langevin piston method, 103 (1995), 4613.

[22] G. J. Martyna, D. J. Tobias, M. L. Klein, J. Chem. Phys., Constant pressure molecular dynamics algorithms, 101 (1994), 4177.

[23] Giorgino T., Comput. Phys. Comm., Computing 1-D atomic densities in macromolecular simulations: The density profile tool for VMD, 185(1) (2014) 317.

[24] N. Kucerka, Y. F. Liu, N. J. Chu, H. I. Petrache, S. T. Tristram, J. F. Nagle, Biophys. J., Structure of fully hydrated fluid phase DMPC and DLPC lipid bilayers using X-ray scattering from oriented multilamellar arrays and from unilamellar vesicles, 88 (2005) 2626.

[25] K. Gawrisch, H. C. Gaede, M. Mihailescu, S. H. White, Eur. Biophys. J., Hydration of POPC bilayers studied by 1H-PFG-MAS-NOESY and neutron diffraction, 36 (2007) 281.

[26] M. C. Phillips, E. G. Finer, H. Hauser, Biochim. Biophys., Differences between conformations of lecithin and phosphatidylethanolamine polar groups and their effects on interactions of phospholipid bilayer membranes, 290 (1972), 397.

[27] H. Heller, M. Schaefer, J. Phys. Chem., Molecular dynamics simulation of a bilayer of 200 lipids in the gel and in the liquid crystal phase, 97, (1993) 8343.


[28] L. Janosi, A. A. Gorfe, J. Chem. Theory Comput., Simulating POPC and POPC/POPG Bilayers: Conserved Packing and Altered Surface Reactivity, 6(10) (2010), 3267.

[29] Kucerka, N.; Tristram-Nagle, S.; Nagle, J. F., J. Membr. Biol., Structure of fully hydrated fluid phase lipid bilayers with monounsaturated chains, 208 (2005), 193.

Director de proiect Data: 30.11.2018

Dr. Lorant JANOSI

raport Ştiin Ţific de etap · insuficient ă a unor medicamente antibacteriene noi [1,2]. pe...

Documents