1

RAPORT STIINTIFIC SINTETIC TE49/2011 – perioada 05.10.2011 – 02.12.2013 –

Proiectul a abordat fluxul de lucru intr-o maniera dinamica, adaptand permanent compozitiile si metodologiile, alegand la sfarsitul unei activitati, pentru a fi testata ulterior, doar solutia care a dat rezultate optime. O1. Prepararea pulberilor de biosticla cu compozitii inovative (grad de realizare: 100%)

Primul obiectiv al proiectului – „Sinteza de tipuri variate de pulberi de sticle bioactive, cu coeficienti de dilatare termica (CTE) apropiati de cei ai implanturilor de titan”, care vor fi utilizate ulterior pentru fabricarea tintelor catod – a fost indeplinit in totalitate. In cadrul stagiilor de lucru efectuate la Departamentul de Ingineria Materialelor si Ceramicelor - Universitatea din Aveiro - Portugalia, au fost sintetizate, beneficiind de bogata experienta a grupului de cercetare condus de Prof. José M.F. Ferreira, o serie de 5 compozitii inovative de sticle bioactive cu potential biocompatibil demonstrat (Tabel I). Mentionam, ca primul stagiu de lucru intreprins in cadrul proiectului TE49/2011 a permis si redactarea si semnarea unui acord bilateral de colaborare inter-institutionala intre INCDFM si Universitatea din Aveiro (intitulat: “Development of a New Generation of Highly Biocompatible Dental Titanium Implants Functionalized by Sputtering Techniques with Novel Bioactive Glass Materials”). Sticlele bioactive (BG) cu compozitie diferita au fost fabricate printr-o tehnologie clasica. Pulberi de puritate inalta (>99,5%) de SiO2 si CaCO3, si reactivi chimici precum 4MgCO3•Mg(OH)2•5H2O, H3BO3, Na2CO3, CaF2, ZnO şi NH4H2PO4 s-au utilizat (dupa caz) la prepararea celor 5 compozitii BG. Loturi de amestecuri omogene (~100 g), obtinute prin macinarea cu bile au fost preincalzite la 1000°C timp de 1 h pentru decarbonizare si apoi topite in aer in creuzete de Pt la 1400°C timp de 1 h. Fritele de sticla au fost obtinute prin racirea rapida a topiturilor in apa foarte rece. Pentru a obtine pulberi fine, fritele au fost uscate si apoi macinate utilizand o moara cu viteza mare. O dimensiune medie a particulelor de pulbere de ~15 μm a fost estimata (cu ajutorul unui aparat tip Coulter LS 230, utilizand modelul optic Fraunhofer). Daca intr-o prima etapa coeficientii de dilatare termica au fost estimati empiric pe baza modelului propus de Zhao si colaboratorii [1], in etapa a III-a s-a reusit determinarea experimentala (din curbele de dilatometrie) a acestui parametru decisiv in vederea sintetizarii de filme subtiri fiabile.

Tabel I: Compozitia (in concentratii masice) pulberilor de biosticla preparate in cadrul proiectului TE49/2011. Tip BG / Compozitie

(wt. %) SiO2 CaO P2O5 MgO CaF2 Na2O B2O3 ZnO CTE200-400°C (10-6/°C)

Perioglas 45.00 24.50 6.00 – – 24.50 – – ~15.0 BGA 46.06 28.66 6.22 8.83 5.70 4.53 – – ~10.4 BGB 40.08 29.10 6.32 8.96 5.79 4.59 5.16 – ~10.7 BGC 38.84 33.98 13.37 13.04 0.77 – – – ~9.4 BGD 32.00 27.50 22.50 18.00 – – – – ~9.8 BGE 37.80 33.06 13.02 10.04 0.76 – – 5.32 ~9.3

Au fost deci sintetizate formulatii chimice BG atat cu, cat si fara elemente alcaline. Desi sistemele compozitionale clasice, din care face parte si 45S5, si-au dovedit, relativ, eficacitatea in tratament in cadrul a numeroare teste clinice (in vitro in culturi de celule osteogenice si in vivo pe model animal), una dintre cele mai importante probleme asociate acestei biosticle este rata foarte mare de solubilizare, datorata in principal continutului mare de Na. Acesta determina resorbtia rapida care ar putea afecta in mod negativ echilibrul remodelarii osoase naturale si in particular procesul fiziologic vital al angiogenezei, determinand formarea unui spatiu intre implant si tesut. In mod tipic cele mai multe compozitii BG contin concentratii importante de oxizi alcalini (Na2O, K2O). Desi incorporarea acestor oxizi alcalini reprezinta un avantaj tehnologic pentru producerea sticlelor bioactive, coborand punctul de topire al sticlei, el reduce eficacitatea functionala in vivo a materialului. Sticlele continand metale alcaline

2

in cantitati mari, sunt susceptibile la incorporarea de molecule de apa prin osmoza, conducand in final la degradarea ireversibila a materialului. De asemenea, aspect deosebit de important din prisma obiectivelor proiectului, aceste sisteme clasice BG nu sunt adecvate utilizarii pentru acoperirea implanturilor metalice, deoarece prezinta nativ coeficienti de dilatare termica (CTE) mari cauzati de aceeasi prezenta in concentratii mari a oxizilor alcalini. Tocmai acest parametru joaca un rol fundamental in fezabilitatea fabricarii de acoperiri de biosticla pe implanturi de titan cu siguranta in exploatare. O diferenta mare intre coeficientii de dilare termica ai suportului implantologic de titan sau aliaje de titan (CTE200-400°C=9.2–9.4x10-6/°C) si BG, conduc la tensiuni mecanice mari in filmul BG, care pot determina chiar delaminarea acestuia. In Fig. 1 sunt prezentate comparativ spectrele FTIR ale pulberilor BG sintetizate impreuna cu spectrul unei pulberi comerciale patentate de L.L. Hench: Bioglass® (avand compozitia in procente masice: SiO2=45, CaO=24.5, Na2O=24.5, P2O5=6, si comercializata sub numele de Perioglas de compania NovaBone). Se observa ca pulberile de biosticla preparate prezinta o structura puternic depolimerizata, datorita prezentei unei concentratii mari de modificatori de retea (Ca, Mg, Na). Diferentele de alura si pozitie a principalelor benzi de vibratie sunt determinate de compozitiile diferite ale biosticlelor care genereaza evidente modificari structurale in matricea de silica. Generic, termenul formatori de retea este adoptat pentru oxizii capabili de a forma sticle (in cazul nostru SiO2). Ionii de oxigen care actioneaza in retea ca punti de legatura intre unitatile structurale sunt numiti „bridging oxygens” (BO). In afara de formatori de retea, biosticlele contin si oxizi care nu participa la formarea retelei si care sunt numiti modificatori de retea. Exista trei actiuni principale ale modificatorilor de retea in biosticlele silicatice: i) ruperea legaturilor Si-O-Si si crearea de ioni de oxigen nelegati („non-bridging oxygens”, NBO); ii) cresterea gradului de coordinatie a oxigenului; iii) o combinatie a primelor doua. Fiecare ion alcalin creaza un NBO, fiecare ion alcalino-pamantos creaza 2 NBO. Prezenta modificatorilor de retea, conduce astfel la cantitati mari de NBO, care scad gradul de conectivitate al sticlei, si induc o solubilitate mai mare a biosticlei in mediile apoase, determinanta pentru rapiditatea proceselor de bioactivitate [2]. Configuratia locala in vecinatatea atomilor de siliciu este exprimata ca Qn (n=0–4), unde n este numarul de BO.

Toate spectrele IR au reliefat o banda centrala larga cu doua maxime puternice pozitionate la ~1010 cm-1 (stretching Si-O in unitatile Q3) si ~910 cm-1 (stretching Si-O in unitatile Q2), si un umar de intensitate redusa situat la ~870 cm-1 (stretching Si-O in unitatile Q1). O banda de intensitate mai mica corespunzand vibratiilor bending Si-O-Si a fost identificata la ~740 cm-1. In regiunea spectrala 1400–400 cm -1 pot fi manifestate si vibratiile specifice gruparilor fosfat (unitatile Q2, Q1 si Q0), greu insa de identificat in situatia de fata, atat din cauza concentratiei mici de pentaoxid de fosfor a pulberilor preparate, cat si a suprapunerii in regiunea de numere de unda analizata a benzilor mult mai intense a modurilor de vibratie ale tetraedrilor silicat [3].

Figura 1: Spectrele FTIR comparative corepunzatoare pulberilor BGA, BGB, BGC si BGD preparate in cadrul proiectului

TE49/2011 si a pulberii Perioglas comerciale.

3

O2&3. Depunerea filmelor de biosticla pe implanturi de titan cu geometrie 3D prin metoda pulverizarii magnetron in regim de radiofrecventa (RF-MS). Solutii inovative la nivel mondial de preparare a structurilor tip implant BG/Ti cu aderenta mare (grad de realizare: 90%) Realizarea tintelor catod

Tintele de biosticla au fost obtinute prin presarea usoara la rece (forta 50 N) in port-tinte de titan a pulberilor de BG preparate. S-au obtinut astfel tinte avand grosimea de 4 mm si diametrul de 110 mm.

Prin eliminarea procesului clasic de sinterizate al tintelor, si utilizarea procedeului neconventional dar simplu descris mai sus, deriva urmatoarele avantaje: i) eliminarea riscului de fisurare a tintei in timpul descarcarii (fenomen frecvent intalnit la utilizarea tintelor ceramice rigide); si ii) posibilitatea reasamblarii tintei cu usurinta; se poate astfel utiliza acelasi material pentru un numar mult mai mare de depuneri, cu efecte benefice asupra eficientei economice. Prin reasamblare se poate elimina totodata una dintre dificultatile majore in pulverizarea magnetron, si anume, variatiile de stoichiometrie de la un ciclu de depunere la altul, determinate de fenomenele de pulverizare preferentiala a elementelor mai usoare, care vor conduce la o modificare progresiva a compozitiei superficiale a tintei. Prepararea filmelor subtiri de BG prin RF-MS

In cadrul etapelor de optimizare s-au utilizat ca substraturi de depunere piese plane patrate (10x10 mm2) din titan gr.1. In vederea determinarii ratelor de depunere corespondente conditiilor de lucru folosite (prin elipsometrie spectroscopica), au fost efectuate si depuneri in paralel pe substraturi de Si(100).

Premergator introducerii lor in camera de depunere substraturile au fost degresate si apoi spalate succesiv in acetona si respectiv alcool iso-propilic timp de 10 minute intr-o baie ultrasonica Nahita 610/6. Inaintea procesului de depunere propriu-zisa s-a realizat o corodare a substraturilor timp de 10 minute intr-o plasma de argon produsa de un plasmatron cu filament de wolfram in vederea indepartarii impuritatilor remanente si/sau straturilor de oxid nativ. Parametrii tehnologici optimizati pentru procesul de corodare in situ al substraturilor au fost: timp corodare=10 minute, presiune de argon=0.3 Pa, putere=200 W si tensiune de polarizare=0.4 kV.

Tintele de depunere au fost de asemenea pre-pulverizate inaintea fiecarui ciclu de depunere in conditii identice procesului de depunere propriu-zis ulterior, in vederea indepartarii eventualelor reziduuri, activarii suprafetei acestora si stabilizarii proceselor de pulverizare.

Pe parcusul etapelor de optimizare s-a utilizat o plaja larga de distante de lucru (tinta-substrat) situate in intervalul 20–60 mm. Procedura de depunere a inceput prin realizarea initial in incinta de lucru a unui vid de 10−3 Pa, ulterior, presiunea de lucru dorita fiind obtinuta prin introducerea gazelor de lucru (Ar sau amestecuri Ar+O2). Filme BG au fost astfel preparate in regim de radio-frecventa (1.78 MHz) la presiuni diferite in atmosfere de lucru inerte si reactive. Temperatura maxima a substraturilor in timpul depunerii a ajuns la ~150°C, filmele obtinute fiind amorfe.

Principalii parametri de lucru RF-MS (presiune totala, compozitie atmosfera de lucru, distanta tinta-substrat) au fost baleiati in cautarea regimului de lucru favorabil potentarii proprietatilor mecanice (aderenta, duritate, elasticitate) si biologice ale filmelor BG obtinute.

Analize compozitionale

Au fost efectuate studii de evaluare a transferului stoichiometric tinta-substrat pentru sistemele BG propuse. Compozitiile filmelor BG au fost determinate prin spectroscopie dupa dispersie de energie (EDS). In Fig. 2 sunt reprezentate concentratiile oxidice ale filmelor determinate pe baza analizelor elementale EDS in comparatie cu compozitia tintelor BG. Pentru o evaluare mai clara a evolutiilor compozitionale cu presiunea de lucru, s-au efectuat reprezentari doar pentru oxizii comuni formulatiilor chimice BG utilizate. Rezultatele EDS pentru B si F nu au fost luate in calcul din cauza acuratetei scazute a acestei tehnici de caracterizare pentru elementele usoare. In filme s-au remarcat in general variatii similare ale elementelor constitutive ale tintelor BG functie de conditiile de lucru RF-MS. S-a observat ca o crestere a presiunii de lucru (argon pur) la 0.4 Pa favorizeaza in general imbunatatirea stoichiometriei filmelor BG.

4

Figura 2: Evolutia profilelor concentratiilor oxidice cu presiunea de lucru pentru formulatiile chimice BGA, BGB si

BGE. Bara de eroare reprezinta abatarea medie patratica estimata din masuratori EDS realizate pe cinci probe preparate in conditii identice.

Solutii inovative de augmentare a aderentei la substrat a filmelor BG

O aderenta puternica la interfata acoperire biofunctionala – implant metalic reprezinta un factor critic in vederea realizarii implanturilor moderne de succes, a stabilitatii acestora pe termen lung si a sigurantei lor in operare. Conform obiectivelor propuse, in cadrul proiectului au fost cautate si introduse solutii tehnologice pentru cresterea aderentei filmelor BG (atat cu CTE compatibili cu Ti, cat si mai mari). Solutiile de crestere a aderentei la substrat au urmat trei directii: (i) tratamente in plasma (corodare) a substraturilor metalice de depunere si baleierea conditiilor de pulverizare; (ii) introducerea de straturi intermediare cu gradient de compozitie chimica tip BGxTi1-x (x=0–1); si (iii) inducerea de fenomene puternice de inter-difuzie, prin tratamente termice special concepute, in vederea nucleerii unor faze mixte BG-Ti la interfata substrat metalic-acoperire de biosticla.

(i) In cazul BG cu CTE≈Ti (ex. BGA) au fost baleiati principalii parametri de lucru RF-MS (presiune si compozitie gaz de lucru), in cautarea regimului de sinteza favorabil potentarii atat a proprietatilor mecanice (aderenta, duritate, elasticitate), cat si asa cum se va vedea mai tarziu, si a raspunsului biologic a filmelor BG obtinute. Pentru acest studiu au fost preparate filme BGA in conditiile mentionale in Tabelul II.

Tabel II: Conditiile de depunere a filmelor de biosticla preparate utilizand pulberea tip BGA, in vederea evaluarii mecanice si biologice.

Cod proba

Atmosfera de lucru (procente volumetrice)

Presiune totala (Pa)

Distanta tinta-substrat (mm)

Grosime film (nm)

BG3 100% Ar 0.3 25 ~1000 BG4 100% Ar 0.4 25 ~1000

BG3O1 90%Ar+10%O2 0.3 25 ~1000 BG3O2 80%Ar+20%O2 0.3 25 ~1000

Analize de microscopie electronice de transmisie in sectiune transversala (XTEM) Toate filmele BG au avut o morfologie compacta si uniforma, arhetipala pentru materialele vitroase. In Fig. 3 este prezentata o imagine tipica de XTEM pentru filmele de biosticla simplu-depuse.

5

Figura 3: Imagine XTEM tipica a unui film de BGA (0.4 Pa) depus pe substrat de titan.

Analize compozitionale elementale EDS Rezultatele analizei EDS sunt prezentate in Tabelul III. Asa cum a fost stipulat anterior variatia conditiilor de depunere induce modificari compozitionale. Si in cazul utilizarii unei distante tinta-substrat de 25 mm si a unei atmosfere de lucru inerte (Ar), realizarea depunerilor la presiune de lucru mai mare (0.4 Pa) are un rol benefic asupra stoichiometriei transferului tinta-substrat. Insa, trebuie notat ca cea mai apropiata compozitie de tinta BGA a fost obtinuta prin utilizarea unei presiuni partiale de oxigen (suficient de mica pentru a nu produce fenomenul de otravire a a tintei): presiune totala de 0.3 Pa, dilutie de oxigen in argon 10% (Tabel III). La presiuni partiale de oxigen mai mari, procesul de otravire al tintei conduce la capturarea elementelor alcaline si alcalino-pamantoase in tinta, in timp ce fluorul, elementul cel mai electronegativ (deci cu afinitatea cea mai scazuta pentru oxigen) este depus preferential (Tabel III). Tabel III: Compozitia chimica in procente atomice a tintei catod si a filmelor BG depuse prin RF-MS. Valorile au fost determinate prin EDS in cazul filmelor, si calculate pe baza compozitiei nominale in oxizi pentru pulberea tinta. Eroarea experimentala a valorilor prezentate a fost mai mica de 5%.

Element chimic Tinta BGA BG3 BG4 BG3O1 BG3O2 Si 39.1 40.0 44.0 40.0 38.0 Ca 29.7 26.0 30.0 32.0 27.0 P 5.2 2.0 2.0 2.5 3.0

Na 7.4 10.5 5.0 5.5 7.5 Mg 11.2 12.5 11.0 11.0 10.5 F 7.4 9.0 8.0 9.0 14.0

Masuratori spectrometrice FTIR Spectroscopia FTIR este o unealta deosebit de importanta care ne poate oferi date despre relatiile structurale din biosticle. Masuratorile FTIR (Fig. 4a) au indicat o structura puternic depolimerizata, dominata de benzile de vibratie ale tetraedrilor Q2 (SiØ2O2

2−) (~930 cm−1) si Q3 (SiØ3O2−) (~1020 cm−1), si datorata cantitatii mari de modificatori de retea din filme (Tabel III). BG4, BG3O1 si BG3O2 au cele mai intense vibratii asociate Q3. Acest fapt impreuna cu modificarea pozitiei acestei benzi IR la numere de unda mai mari (~1030 cm−1) sustin o polimerizare mai crescuta a retelei acestor filme. Desi din punct de vedere stoichiometric cea mai mare asemanare cu materialul din tinta e intalnita in cazul lui BG3O1, masuratorile FTIR arata ca transferul legaturilor nu este intotdeauna conditionat de stoichiometrie ci mai degraba de conditiile de depunere, filmul BG3 fiind cel mai apropiat structural de tinta catod BGA (Fig. 4a). Caracterizari de spectroscopie de fotoelectronice de raze X (XPS) Tehnica XPS aduce informatii suplimentare, care, impreuna cu datele FTIR, prezinta o imagine mai clara asupra structurii legaturilor din filmele BG. Prin XPS se poate determina concentratia relativa de BO si NBO din biosticle. Spectrele XPS ale probelor studiate sunt prezentate in Fig. 4b. Un numar minim de componente a fost ales pentru deconvolutia si fitarea peak-urilor O 1s. S-au utilizat trei functii Voigt pentru componentele O 1s, cu o functie aditionala situata la energii mari de legatura, atribuita apei adsorbite (cunoscut fiind caracterul higroscopic al

6

biosticlelor ce contin elemente alcaline). Aceasta din urma componenta a fost evidentiata doar pentru filmele BG3, BG4 si BG3O1. Componentele atribuite BO si NBO sunt dominante, cu atomii BO prezentand energii de legatura mai mari. Al treilea peak, denumit de noi „Ox”, ar putea fi asociat legaturilor de oxigen generate in clusterii ortofosfatici, posibilelor legaturi P−O−Mg si P−O−Ca [4], si/sau unor specii tetraedrice „MgO4” [5]. Deci, in concordanta cu masuratorile FTIR (Fig. 4a), si analizele XPS (Fig. 4b) sustin ca filmul BG3 are reteaua cea mai depolimerizata si configuratia legaturilor chimice cea mai asemanatoare cu tinta.

Figura 4: (a) Spectrele FTIR si (b) Spectrele XPS de inalta rezolutie ale nivelului O 1s pentru tinta catod BGA si filmele BG/Ti

pulverizate in diferite conditii.

Caracterizarea nano-mecanica si testarea aderentei film-substrat prin metoda „pull-out” Evolutia proprietatilor mecanice in functie de adancimea de indentare este prezentata in Fig. 5. Valorile nominale ale duritatii si elasticitatii au fost selectate utilizand cunoscuta regula de 10% a adancimii de indentare din

7

grosimea totala a filmului [6], pentru a elimina sau macar diminua influenta substratului. Valorile obtinute pentru a doua adancime de indentare (~100 nm) au fost luate in calcul pentru a eluda rugozitatea substratului si a nu depasi cei 10% din grosimea totala a filmului (Tabel II). Valorile de duritate cele mai mari au fost obtinute pentru BG4 (5.7±0.9 GPa), iar cele mai scazute pentru BG3 (1.6±0.6 GPa).

Figura 5: Evolutia proprietatilor nanomecanice cu adancimea de penetrare in film functie de: (a) presiunea de depunere, si (b)

compozitia atmosferei de lucru. Se poate observa un antagonism al efectelor concentratiilor Ca si Na asupra duritatii (Fig. 6a). Concentratiile mai mari de Ca cresc duritatea, in timp ce concentratiile mari de Na o reduc (Fig. 4a). Introducand oxigen in atmosfera de depunere apare o imbunatatire a duritatii (Fig. 6b). O dependenta similara poate fi observata si pentru modulul de elasticitate (Fig. 6b). Cele mai bune rezultate privind elasticitatea au fost obtinute pentru BG4 (76.7±12 GPa), in timp ce valoarea cea mai mica a fost observata pentru BG3 (26.4±8.9 GPa) (Fig. 5). Utilizarea oxigenului in atmosfera de depunere in diferite dilutii, mentinand presiunea totala la 0.3 Pa, a condus la imbunatatirea valorilor duritatii pana la 4.8±0.9 GPa pentru BG3O1 si 5.1±1.7 GPa pentru BG3O2, si concomitent a valorilor elasticitatii pana la 71.2±15.3 GPa pentru BG3O1 si 75±19.8 GPa pentru BG3O2. Se poate observa deci ca introducerea a 10% O2 in atmosfera de depunere conduce la corectarea proprietatilor nesatisfacatoare obtinute pentru filmul BG3. Valorile medii ale duritatii si elasticitatii obtinute pentru filmele BG4, BG3O1 si BG3O2 sunt similare celor raportate pentru straturi considerabil mai groase (de zeci sau sute de micrometri), sintetizate prin tehnici de depunere din familia plasma spray [7–9]. Valorile duritatii pentru filmele BG4, BG3O1 si BG3O2 sunt asemanatoare structurilor „bulk” de biosticla, in timp ce modulul de elasticitate este considerabil mai mare [10].

8

Figura 6: (a) Influenta concentratiei de Ca si Na asupra duritatii filmelor BG depuse in atmosfera inerta; (b) Influenta dilutiei de oxigen in argon din camera de depunere asupra duritatii (simboluri goale) si modulului de elasticitate (simboluri pline) al

filmelor BGA/Ti. Putem deci conchide ca configuratia legaturilor din filmele BG, indusa pe de o parte de compozitia acestora si pe de alta parte de conditiile fizice de depunere, joaca un rol important asupra proprietatilor nanomecanice. Un film BG mai putin depolimerizat (dominat de specii Q3) a condus la valori mai mari ale duritatii si modulului de elasticitate (vezi BG4, BG3O1 si BG3O2). In mod contrar depolimerizarea slabeste reteaua prin modificarea raportului BO/NBO, conducand la lanturi lineare conectate slab prin forte de atractie intre cationi si atomii NBO [11]. Un grad mai mare de conectivitate a fost raportat cand s-a substituit CaO sau Na2O cu CaF2 [12,13]. Incorporarea fluorului in BG nu depolimerizeaza reteaua de silicat deoarece legaturile Si-F nu sunt favorizate [14]. In schimb se cunoaste ca F poate creste conectivitatea unei biosticle „consumand” cationii modificatori de retea si conducand la o scaderea concomitenta a numarului de NBO [13]. F se leaga preferential de ionii de Ca2+ fata de cei de Na+, mai ales cand concentratia de CaF2 introdusa in sticla este mare [12,15]. Probabilitatea formarii CaF2 in filmele BG creste cu marirea concentratiei de Ca si/sau F, conducand la o retea mai polimerizata, precum cea regasita in cazul BG4, BG3O1 si BG3O2. Aceast fenomen este sugerat de analizele FTIR (Fig. 4a) si XPS (Fig. 4b). Pe de alta parte, cresterea concentratiei de Si (cazul BG4) (Tabel III), determina o crestere a concentratiei de BO din material, si deci, de asemenea are ca efect augmentarea gradului de polimerizare a retelei. Chiar daca concentratia P este scazuta si creste doar usor de la o proba la alta (Tabel III), rolul ei nu ar trebui ignorat cu desavarsire. Speciile predominante de ortofosfat formate de P in biosticle pot indeparta trei molecule de modificatori de retea [13,15], si astfel sa determine conservarea numarului de BO. Pe de alta parte P poate creste conectivitatea retelei prin formarea de legaturi cross-link P−O−Si [16]. O fracturare de tip adeziv s-a produs sistematic la interfata BG/Ti in timpul testelor de aderenta „pull-out” (realizate conform standardului ASTM D4541–09e1), filmul de biosticla fiind detasat in intregime de pe substratul de titan. Masuratorile de aderenta au demonstrat o aderenta buna pentru toate filmele BGA preparate (Fig. 7), mai mare de minima de 51 MPa impusa de standardul international (ISO 13779–2/2008) in vigoare privind acoperirile tip implant [17].

9

Rezultatele cele mai bune de aderenta au fost obtinute pentru BG4 (62.67±8.62 MPa). Cresterea cu 10% a concentratiei O2 in atmosfera de depunere nu a produs nici un efect asupra aderentei filmului, insa concentratia de 20% O2 a produs o usoara descrestere a aderentei (de la 58.9 MPa pentru BG3O1, la 51.2 MPa pentru BG3O2) (Fig. 7). Aceste valori ale aderentei sunt tipice pentru straturile subtiri depuse prin pulverizare in camp magnetron (RF-MS), si sunt superioare filmelor BG depuse prin alte tehnici (ex. sol-gel, plasma spray) [18,19].

Figura 7: Histograma variatiei valorilor de aderenta „pull-out” inregistrate pentru filmele BGA/Ti.

(ii) In cazul BG cu CTE>Ti (ex. Perioglas), filmele simplu-depuse prin RF-MS prezenta valori de aderenta

scazute (~30 MPa), situate sub minima impusa de standardele in vigoare pentru acoperiri implantologice (>51 MPa) [17]. In acest caz s-a studiat posibilitatea eliminarii interfetei gradate dintre Ti si BG prin fabricarea unor structuri multistrat cu strat tampon cu gradient de compozitie (gradate), de tipul BG/BGxTi1-x/Ti. Straturile tampon cu gradient de compozitie BGxTi1-x (x=0–1) au fost realizate prin metoda co-pulverizarii in regim de radio-frecventa din doua tinte (Ti si BG) amorsate la o putere de lucru egala (~80 W). Substraturile au avut in timpul depunerii stratului tampon o miscare planetara controlata lenta de la tinta Ti catre tinta BG (Fig. 8). Prin aceasta procedura tehnologica un strat de tranzitie cu compozitie chimica graduala Ti BG se formeaza pe substratul de Ti, capabil sa elimine interfata abrupta dintre cele doua materiale chimic si structural diferite, cu un impact asupra bunei aderente dintre substratul metalic si filmul biofunctional de BG depus ulterior pe suprafata stratului gradat. Grosimile straturilor gradate au fost variante in plaja 50–100 nm. In Fig. 8b este prezentata si o imagine care surprinde transgresia substratului intre cei doi catozi in vederea depunerii stratului intermediar de aderenta cu gradient de compozitie BGxTi1-x.

Figura 8: (a) Reprezentare schematica a procesului de co-pulverizare in plasma magnetron;(b) Secventa din procesul de

depunere a unor straturi tampon de aderenta cu gradient de compozitie chimica.

10

Cele mai bune rezultate de aderenta au fost obtinute utilizand un strat tampon de aderenta BGxTi1-x avand o grosime de ~70 nm, si un tratament termic post-depunere, aplicat structurilor complete multistrat BG/BGxTi1-x/Ti, efectuat la 650°C/2h in aer (temperatura situata in apropierea punctul de cristalizare al Perioglas). La temperaturi de tratament mai mici, nu s-a observat o imbunatatire semnificativa a aderentei, in schimb ce la temperaturi mai mari de 650°C, intervin fisuri in film si chiar fenomene de delaminare locala.

Masuratorile de difractie de raze X in incidenta razanta (GIXRD) efectuate pe structurile BG/BGxTi1-x/Ti, au confirmat natura amorfa a filmelor dupa depunere (Fig. 9). O faza de sub-oxid de titan, Ti3O (ICDD: 73-1583) a fost relevata in diagramele RX ale probelor BG/Ti simplu-depuse, sugerand oxidarea superficiala a substratului de Ti. Structura BG a cristalizat prin tratamentul termic aplicat (650°C/2h), principalele faze cristaline identificate fiind Na4Ca4Si6O18 (combeit) [ICDD: 75-1687], CaSiO3 (wollastonit) [ICDD: 42–550] si Na3PO4 [ICDD: 76-202]. Pentru toate probele analizate a fost evidentiat un semnal puternic provenind de la substratul de Ti [ICDD: 44-1294]. Dupa tratamentul termic, liniile Ti au prezentat o deplasare spre unghiuri mici, simultan cu un fenomen puternic de largire. Mai mult, sub-oxidul de Ti a disparut, fiind inlocuit de doua faze de dioxid de Ti bine cristalizate, anatas [ICDD: 21-1272] si rutil [ICDD: 21-1276].

Figura 9: Difractogramele GIXRD (α=2°) pentru BG/BGxTi1-x/Ti (x=0–1), inainte si dupa tratamentul termic (=Na4Ca4Si6O18

(combeit); =Na3PO4; O=CaSiO3 (wollastonit); =TiO2-rutil; =TiO2-anatas; ?=sub-oxizi de titan si =Ti). Masuratorile de aderenta au fost realizate prin metoda „pull-out” (urmand protocolul descris in ASTM

D4541–09e1). O analiza statistica a fost realizata pe loturi test de cate 10 probe cu si fara strat tampon gradat. Pentru structurile abrupte Perioglas/Ti, ruperea a survenit la interfata film–substrat la o valoare medie de ~30 MPa.

O imbunatatire remarcabila a aderentei (~50 MPa) a fost obtinuta in cazul structurilor multistrat BG/BGxTi1-x/Ti (x=0–1) tratate termic post-depunere la 650°C. Rezultatul confirma ca solutia tehnogica aleasa (combinarea metodelor de pulverizare si co-pulverizare magnetron) de introducere a unui strat tampon de interfata cu gradient de compozitie chimica, urmata de procesare termica, este viabila si eficienta. Cristalizarea biosticlei insa nu este in general de dorit, deoarece contribuie la scaderea solubilitatii in vitro, si deci la o capacitate de biomineralizare mai diminuata. La acest moment, putem conchide ca rezultatele de aderenta obtinute pentru structuri BG cu CTE mai mare decat al titanului, prin introducerea straturilor cu gradient de compozitie, sunt satisfacatoare. In etapa urmatoare vor fi realizate o noua serie experimente de modelare a arhitecturii gradientului de compozitie a stratului tampon, in vederea evaluarii finale a posibilitatii de obtinere de proprietati de aderenta bune, fara necesitatea unui tratament termic post-depunere la temperaturi ridicate.

(iii) In cadrul etapei a II-a/2012 s-a propus o solutie prospectiva de imbunatatire a aderentei filmelor BG la implantul metalic prin inducerea interdifuziei (formarea de faze tip siliciura de titan) la interfata strat BG-substrat Ti prin procesari termice post-depunere. Filmele au fost depuse la presiunea de 0.4 Pa Ar, utilizand pentru inceput un sistem compozitional mai simplu (BGD) avand temperatura de tranzitie vitroasa (Tg) la 718°C. In cadrul acestor studii a fost evaluat suplimentar si rolul unui un alt parametru de lucru important: distanta tinta-substrat (35 mm – BGD-a si 55 mm – BGD-b). Prin cresterea distantei tinta-substrat, compactitatea filmului scade si creste permeabilitatea fata de oxigen in timpul tratamentelor termice post-depunere.

11

Tratamentele termice aplicate la temperaturi usor mai mari (cu ~20–60°C) decat temperatura de tranzitie vitroasa (Tg) ofera energia de activare necesara promovarii si inducerii fenomenelor de interdifuzie la interfata Ti-BG si formarea cu succes de compusi inter-metalici tip TixSiy (TiSi, Ti5Si3, Ti5Si4) (Fig. 10a), dar si a rutilului (TiO2) ca faza secundara.

Figura 10: Diagramele XRD inregistrate in geometrie θ–θ pentru: (a) substratul de titan tratat termic si filmele BGD inainte si dupa tratamentul termic la 750°C/2h; si (b) filmele BGA si BGB tratate termic la 700°C/2h (=TiO2 (rutil) – ICDD#01-089-

4920; =Ti5Si3 – ICDD#00-029-1362; =Ti5Si4 – ICDD#00-027-0907; =TiSi – ICDD#00-017-0424; =MgSiO3 – ICDD#01-075-1627).

Formarea fazelor inter-metalice a imbunatatit semnificativ aderenta filmului, cu ~57% in cazul structurilor

mai dense si mai „etanse” BGD-a (de la 38.2±2.96 MPa pentru structurile simplu-depuse la 60.3±4.6 MPa pentru structurile tratate termic), si cu ~25% in cazul structurilor mai putin dense si mai „permeabile” BGD-b (de la 31.5±3.95 MPa pentru structurile simplu-depuse la 39.4±4.1 MPa pentru structurile tratate termic). Permeabilitatea mai mare fata de oxigen a structurilor BGD-b a condus la formarea unei cantitati mai mari de TiO2 in timpul tratamentului termic. Algoritmul tehnologic propus conduce la procese de interdifuzie foarte similare si atunci cand este aplicat si pentru alte formulatii chimice BG (ex.: BGA si BGB) (Fig. 10b). Valorile de aderenta sunt similare sau chiar mai mari decat cele impuse pentru aplicatiile medicale care suporta incarcari mecanice mari [17], rezultatele putand fi astfel considerate foarte promitatoare.

Primele biofunctionalizari de implanturi dentare cu geometrie 3D (suruburi) Rezultatele incurajatoare conferite de testele mecanice prezentate mai sus, cat si de cele biocompatibilitate

ce vor fi prezentate mai jos, au justificat aplicarea retetelor de sinteza RF-MS optimizate pentru acoperirea de implanturi cu geometrie 3D. S-a utilizat un motor de vid pas cu pas calibrat sa induca o viteza de rotatie mica substratului cu geometrie complexa in plasma magnetron. Implanturile (3D) tip surub (pivot dentar) au fost acoperite in conditii identice placutelor (2D), fiind insa rotite in plasma cu o viteza de 1.5 rot/min, in vederea asigurarii unei bune calitati a stratului BG de functionalizare atat din punctul de vedere al uniformitatii compozitional-structurale cat si al grosimii. In Fig. 11 este prezentata o fotografie comparativa a unui implant tip surub de titan biofunctionalizat cu filme tip BGA (0.4 Pa Ar) in cadrul proiectului prin tehnica RF-MS si a unui implant simplu de Ti. In Fig. 12 sunt prezentate imagini de microscopie electronica de baleiaj (SEM) tipice acoperirilor BG depuse pe suruburi de Ti cu suprafata rugoasa, filmul copiind fidel relieful substratului metalic. Un strat de BG cu grosime de 1 µm este suficient pentru acoperirea continua si omogena chiar si a unui astfel de profil complex, asa cum au aratat cartografiile elementale EDS (Fig. 13).

In faza IV a proiectului se vor introduce aceste implanturi in os prin tehnica de implantologie orala umana si se vor observa efectele acestui proces asupra filmelor depuse. In cazul aparitiei unor probleme acestea se vor inlatura prin optimizarea in continuare a parametrilor de depunere si a tratamentelor post-depunere.

12

Figura 11: (a) Secventa din procesul de biofunctionalizare prin RF-MS a unui implant dentar 3D (tip surub); (b) Imagini

comparative a unui surub de Ti simplu si a unui surub de Ti biofunctionalizat cu BG prin RF-MS.

Figura 12: Imagini SEM ale unui implant de Ti acoperit cu BGA (0.4 Pa) prin RF-MS: (a) imagine de ansamblu; (b)

imagine de detaliu.

Figura 13: Cartografii elementale EDS realizate pe suprafata filmului BGA depus pe implantul dentar.

13

O4. Testarea in vitro a capacitatii de biomineralizare a structurilor BG in solutii SBF si DMEM (grad de realizare: 80%) Proiectul si-a propus atat dezvoltarea unui traseu de lucru de la cercetare inovativa la produs, cat a abordarea unor teme fundamentale de mare importanta. Acoperirile biofunctionale implantologice BG trebuie sa prezinte capacitatea de biomineralizare in vitro si in vivo, prin procese de degradare controlata si inducerea cresterii de straturi de hidroxiapatita [HA, Ca10(PO4)6(OH)2], dar si de alti fosfati de calciu (Ca-P) concomitent cu regenerarea de os nou. Una dintre paradigmele clasice in domeniul materialelor tip BG o reprezinta mecanismul de biomineralizare in vitro in solutie fiziologica simulata Kokubo (SBF, simulated body fluid) [20] propus la inceputul anilor 1990 de inventatorul acestor tipuri de materiale Larry Hench [2]. In mecanismul bioactivitatii in SBF teoretizat de Hench, este presupusa o disolutie rapida a biosticlei, generata de un schimb rapid intre ionii de Na+ si Ca2+ din sticla si ionii de H+ si H3O+ din fluidul biomimetic, care va initializa o rupere a legaturilor Si-O-Si din structura BG si formarea ulterioara a gruparilor silanol, avand drept consecinta o modificare importanta de pH-ului la interfata proba-fluid, gruparile de silanol policondensand si conducand la formarea unui strat bogat in silica la suprafata BG, pentru ca prin suprasaturarea solutiei in ioni de Ca si P, sa fie stimulate fenomene precipitare, nucleatie si crestere Ca-P, culminand cu obtinerea unui strat gros si rugos de hidroxiapatita carbonatata cristalina. Mecanismul a fost teoretizat pentru probe „bulk” (pulberi, pastile presate), in care saturatia mediului este realizabila intr-un volum mic de solutie. Nu acelasi lucru se poate afirma si despre filmele BG cu grosimi submicronice. In plus in mediul intern, circulatia este continua, si tinde sa nu permita o realizarea suprasaturaratiei. In cadrul testelor preliminare de bioactivitate in SBF s-a observat necesitatea prezentei in structura filmului BG a unei concentratii mari de modificatori de retea si implicit a unei structuri mai depolimerizate, in vederea inducerii unei biomineralizari puternice la suprafata implantului: formarea unui strat gros si cristalin de HA carbonatata in contact cu mediile fiziologice simulate. Pentru structurile BGB, acest deziderat a fost obtinut la presiunea de lucru de 0.4 Pa. Mecanismul bioactivitatii pentru structurile care au condus la ratele de biomineralizare cele mai mari a fost studiat in detaliu, prin monitorizarea fizico-chimica (SEM, FTIR, GIXRD si EDS) la intervale temporale crescatoare. Pentru interogarea atat a capacitatii biomimetice de biomineralizare a filmelor BG-MS, cat si a aplicabilitatii modelului cinetic de bioactivitate propus de Hench [2], au fost efectuate teste in vitro in SBF pe structurile BGB sintetizate la 0.4 Pa. Monitorizarea modificarilor structurale si compozitionale in vitro a filmelor BG in timpul imersiei in SBF a confirmat doar in linii mari modelul clasic al bioactivitatii [2]. Interactiile care au avut loc in timpul testelor in vitro au condus la modificarea continua a morfologiei filmelor BG. Dupa 3 zile de imersie, clusteri nodulari bogati in Ca s-au format uniform pe suprafata filmelor BG. Aparitia acestor formatiuni insulare (Fig. 14c), poate fi explicata prin fluctuatiile concentratiilor de ioni din regiunea solutiei adiacente suprafetei filmelor BG.

Figura 14: Evolutia morfologiei suprafetei filmelor BGB cu timpul de imersie in SBF evidentiata prin SEM (bara=2μm).

14

Eliberarea cationilor din BG va determina cresterea pH-ului in volumul solutiei adiacente suprafetei filmului, concomintent crescand si electronegativitatea suprafetei, asa cum au aratat si Lu si colaboratorii [21], schimband valoarea potentialului zeta. Aceste conditii favorizeaza nucleatia fazelor Ca-P pe aceste suprafete. Procesul are loc gradual, clusterii incep sa creasca, pana cand vor fuziona formand ramuri cu alura fractalica (Fig. 14d), si in final se va forma un film dens CaO–P2O5, care va intra intr-un proces de restructurare-cristalizare dupa ~15 zile. Analizele SEM, realizate dupa 7, 15 si 30 de zile de imersie (Fig. 14d-f), au confirmat o dezvoltare continua a stratului format biomimetic, in final obtinandu-se un strat HA cristalizat, ale carui cristalite alungite cresc orientate preferential (Fig. 14f si Fig. 15c). Analizele FTIR (Fig. 15a-b) sunt in deplin acord cu observatiile SEM (Fig. 14) si EDS (Fig. 15d). In plus, prin FTIR s-a evidentiat ca filmul apatitic crescut in conditii biomimetice este imbogatit in carbonat (benzile IR de la ~1430 cm−1), sugerand biomineralizarea in vitro unei faze de HA carbonatata. Dupa cele 30 de zile de imersie, prin GIXRD au fost puse in evidenta liniile caracteristice HA (Fig. 15c) cu intensitatea liniei (002) semnificativ crescuta comparativ cu fisa de referinta ICDD: 9-0432, demonstrand tendinta de crestere preferentiala c-axis a cristalitelor (in acord cu observatiile SEM). O dimensiune medie de cristalit de ~35 nm a fost determinata utilizand formula lui Scherrer. Raportul Ca/P obtinut pentru stratul format in vitro a fost de ~1.77, sugerand de asemenea formarea unei forme de HA carbonatate de tip B, tipica osului uman, si demonstrand astfel capacitatea de biomineralizare excelenta a filmelor subtiri BGB.

Figura 15: Spectre FTIR pentru tinta catod si filmele BGB simplu-depuse (as-dep) (a) si testate in vitro timp de 1, 3, 7, 15 si 30

zile (b). Difractogramele GIXRD ale filmului BGB simplu-depus si testat in SBF timp de 30 de zile (= Hidroxiapatita –ICDD#9–432; = TiH1.7 – ICDD#40–1244) (c). Evolutia concentratiei elementale EDS cu timpul de imersie in SBF (d).

Nucleatia omogena (precipitarea) a hidroxiapatitei (HA) in conditii biomimetice are loc spontan intr-o solutie suprasaturata in componentii chimici ai HA. Nucleatia heretogena, pe de alta parte, are loc la nivelul suprafetei probei. Atat nucleatia omogena cat si cea heterogena a HA sunt considerate in competitie in timpul imersarii in SBF. Datorita grosimii mici de film BG (~500 nm), chiar si in cazul solubilizarii totale a filmului, cantitatea de BG care ar putea fi eliberata in SBF ar fi de doar cateva micrograme, insuficient pentru suprasaturarea solutiei. Deci, se poate specula ca procesele de bioactivitate in cazul filmelor noastre ar fi guvernate preponderent nu

15

de suprasaturarea mediului SBF in Na, Ca, si P si precipitarea inerenta de faze Ca-P, ci de evolutia pH-ului la interfata film BG-solutie, energia suprafetei si interactiunile electrostatice dintre suprafata incarcata negativ a probei si cationii si anionii din fluidul tisular sintetic aflat in proximitatea suprafetei BG. In cadrul proiectului prezentam o reintepretare ipotetica a procesului clasic de biomineralizare in vitro, necesar explicarii mai fidele a fenomenologiei bioactivitatii filmelor subtiri de BG, bazat pe efectului dublului strat electric, fara insa a clama validitatea sa absoluta. Efectul de dublu strat electric se refera la doua straturi paralele cu sarcini opuse inconjurand un obiect (proba BG) imersata intr-o solutie (SBF). Numarul mare de grupari hidroxil aflate pe suprafata probei BG in primele stagii de imersare pot juca rolul de situri de nucleatie. Astfel, primul strat, cu sarcina negativa, este format din legaturile Si-OH− generate in timpul primelor interactii chimice ale suprafetei BG cu fluidul. Ionii de Ca2+ impreuna cu anioni, precum (HPO4)2−, sunt prezenti in spatiul electrolitic incarcat situat in vecinatatea suprafetei imbogatite in grupari silanol polimerizate. Al doilea strat va fi compus din ionii de calciu atrasi de aceasta suprafata prin forta Coulomb, ecranand electric primul strat. Acest al doilea strat poate fi observat in primele stagii de imersie, ca un film difuz slab conectat de cel bogat in silica, constand din ioni liberi de calciu care se deplaseaza in fluid sub actiunea atractiilor electrice. Cum anionii de (HPO4)2− interactioneaza si reactioneaza cu acest al doilea strat, nucleatia heterogena a stratului de CaO–P2O5 incepe, acesta ancorandu-se progresiv in suprafata probei, si, in timp, prin incorporarea de diferiti ioni (Na+, OH−, F−sau (CO3)2−), cristalizeaza intr-un strat mixt de fluor-hidroxiapatita carbonatata. Astfel, se poate considera ca nucleatia heterogena este mecanismul dominant care determina cresterea chimica a HA in cazul filmelor subtiri BG. O a doua paradigma este reprezentata de testarea potentialului bioactiv al unui material (definit prin capacitatea lui de a genera prin procese bio-chimice cresterea unui strat de hidroxiapatita carbonatata, similar compozitional si structural fazei minerale a osului) in medii fiziologice simulate SBF. In anul 1990, T. Kokubo a introdus aceasta solutie sintetica care reproduce doar compozitia anorganica a mediilor fiziologice (in speta plasma sangvina). Datorita simplitatii metodei de preparare chimica a solutiei SBF, cat si a protocolului de testare in vitro, acestea au fost rapid receptate de comunitatea stiintifica din domeniul biomaterialelor si utilizate la scara larga (din anul 1990 pana acum au fost publicate un numar de ~15.000 de articole stiintifice ISI (conform bazei de date ISI Thomson Web of Science: 2013.10.23). In plus, in anul 2007, acest protocol atat de popular a fost standardizat: ISO/FDIS 23317) [22].

Asadar, astazi a devenit clasica testarea bioreactivitatii diferitelor tipuri de BG prin abordarea acestui proces complex in maniera simplista propusa de Kokubo si ISO/FDIS 23317: introducerea biomaterialului in SBF pentru perioade variabile de timp, la temperatura 37°C in atmosfera normala [20,22]. La nivelul sitului de implantare insa, se realizeaza procese complexe: sangerare/coagulare, inflamatie, reparatie tisulara, iar interactia complexa mediu intern-implant nu poate fi preconizata reducand toate aceste fenomene la interactia componentei anorganice a unui volum mic de solutie cu suprafata implantului. In plus, mediul intern are o compozitie net diferita de cea a SBF (o solutie pur anorganica cu o compozitie de electroliti similara plasmei), continand pe langa electroliti, si o multitudine de substante organice: glucide, aminoacizi, oligopeptide, proteine, lipide, hormoni, etc. Al doilea aspect de mentionat este reprezentat de mentinerea pH-ului. Mediul intern are un pH de ~7.35, iar presiunea partiala a CO2 dizolvat in lichidul intercelular este de ~5 kPa. Acest aspect este de importanta critica pentru mentinerea pH-ului pe termen lung a unui fluid cu compozitie de electroliti asemanatoare plasmei. Mentinerea pH-ului la nivelul fiziologic nu produce modificarea ionizarii unor proteine din mediul intern si modificarea concomitenta a proprietatilor acestora. De asemenea in mediul intern alcalinizarea extrema pana la pH=9 este irealizabila si daunatoare pentru celulele care s-ar afla in acest spatiu. In mecanismul bioactivitatii in SBF a BG, teoretizat de Hench [2], modificari importante de pH-ului solutiei de testare ca urmare a fenomenelor de disolutie-hidroliza-condensare, sunt prezentate ca generator al fenomenelor de nucleatie si formare a straturilor HA de biomineralizare. Toate aceste aspecte pun la indoiala metodologia clasica de testare a bioactivitatii materialelor prin simpla testare in SBF.

Proiectul si-a propus abordarea acestei paradigme si testarea comparativa a filmelor BG nu doar in solutii SBF (urmand protocolul standardizat ISO) ci si intr-o serie de noi medii care sa simuleze cat mai fidel mediul fiziologic uman. Mediul intern este cel mai bine simulat cu ajutorul unor solutii complexe de substante organice si anorganice, folosite pentru cultivarea celulelor in vitro. Acestea creaza un mediu care mimeaza cvasi-perfect compozitia fluidului intercelular. Mediile complete de cultura ce permit dezvoltarea celulelor in mod armonios in vitro contin si o fractiune din proteinele ce se regasesc in plasma tocmai pentru a se apropia cat mai mult de componenta fluidului intercelular. De aceea consideram ca mediile de cultura pentru celule reprezinta cea mai buna alegere pentru a simula in vitro, in conditii cat mai apropiate de cele intalnite in vivo, comportamentul acoperirilor de biosticla.

Am realizat in paralel astfel teste privind comportamentul in SBF, in mediu de cultura simplu (DMEM,

16

Dulbecco's Modified Eagle Medium) si in mediul de cultura DMEM complet (DMEM-C) cu 10% ser fetal bovin si L-glutamina, atat in atmosfera normala cat si cu 5% CO2. Incubarea s-a realizat la 37°C in atmosfera umeda timp de 30 zile. Acest experiment a fost coroborat, cu testarea de de filme BG cu continut diferit de SiO2. Este unanim recunoscut rolul acestui formator de retea in guvernarea ratei de disolutie a BG in medii apoase. Au fost sintetizate filme de BGC cu continut controlat de SiO2, prin utilizarea unei tinte de biosticla BGC (Table I). Au fost depuse la presiunea optimizata (0.4 Pa Ar) filme din tinta simpla, cat si filme dintr-o tinta identica pe care au fost fixate pe zona de maxima eroziune placute de SiO2 amorf (10x10 mm2). Functie de tinta si de numarul de placute de SiO2 amorf fixate pe aceasta, seriile de filme BG preparate au primit urmatoarele coduri: BGC (tinta simpla), BGC-3SiO2 (tinta cu 3SiO2) si BGC-5SiO2 (tinta cu 5SiO2). Compozitia filmelor a fost determinata prin EDS, fiind prezentata in Tabelul IV. Filmele astfel sintetizate au fost analizate inainte si dupa testarea in vitro timp de 30 zile prin spectroscopie FTIR si micro-Raman, GIXRD si SEM-EDS.

Tabel IV: Compozitia chimica in oxizi (procente masice) a tintei catod si a filmelor BGC depuse prin RF-MS.

Observatie: Datorita cantitatii reduse F nu a putut fi cuantificat. Oxid Tinta BGC Film BGC Film BGC-3SiO2 Film BGC-5SiO2 SiO2 39 44.4 48.6 56.7 CaO 34.1 32.5 30.3 20.8 P2O5 13.4 7.1 6.8 7.1 MgO 13.5 16 14.3 15.4

Tabelul IV prezinta compozitia comparativa a tintei de depunere simple si a filmelor BGC. Se poate remarca un relatie antagonista intre concentratia de SiO2 si cea de CaO a filmelor. Cu cresterea raportului SiO2/BGC al tintei de depunere in zona de eroziune maxima, continutul de SiO2 in filme creste progresiv, concentratia de CaO scazand proportional, in timp ce pentru P2O5 si MgO nu sunt inregistrate modificari semnificative. Se demonstreaza astfel ca reteta propusa in proiect de crestere a continutului de SiO2 in filme este eficienta. Cresterea progresiva a continutului de silica a filmelor a determinat o augmentare a gradului de polimerizare al filmelor depuse (Fig. 16). Spectrele FTIR (Fig. 16) indica nu doar o crestere evidenta in intensitate a benzii corespunzatoare vibratiilor Si-NBO (Q3), ci si o deplasare spre numere de unda mari a acesteia cu continutul de SiO2.

Figura 16: Spectrele FTIR ale tintei catod BGC si ale filmelor simplu-depuse BGC (tinta simpla), BGC-3SiO2 (tinta cu 3SiO2) si

BGC-5SiO2 (tinta cu 5SiO2). Analizele FTIR (Fig. 17a) si GIXRD (Fig. 18) au relevat ca toate probele imersate in SBF timp de 30 de

zile in atmosfera normala au indus cresterea unui strat gros de hidroxiapatita slab cristalizata (Fig. 17a vs. Fig. 17d).

17

Si probele imersate in SBF, dar mentinute in incubatorul cu atmosfera cu 5% CO2, au condus la cresterea unui strat de HA, insa mai subtire si mai putin structurat.

Aria integrala a benzii de stretching ν3(PO4)3- poate fi aproximata cu masa straturilor (legea Beer-Lambert) de fosfat de calciu crescute chimic in mediile de testare in vitro, constituindu-se astfel intr-un indicator al gradului de bioreactivitate al filmelor. Se remarca, asa cum era de asteptat, ca un continut mai scazut de silica si implicit un grad de depolimerizare mai mare se reflecta intr-un strat de fosfat de calciu mai gros (Fig. 17a,b,c) Acest fenomen este mai pregnant in cazul testelor realizate in SBF (aria BGC simplu > BGC-3SiO2 > BGC-5SiO2) (Fig. 17a).

Probele imersate in mediu de cultura DMEM au condus la procese de “biomineralizare” mai lente, dupa 30 de zile de imersie, probele prezentand un strat de fosfat de calciu amorf, asa cum au relevat caracterizarile FTIR (Fig. 17b,c) si GIXRD (Fig. 18), prezentate mai jos. Un grad de polimerizare crescut a retelei BG conduce la o rata de solubilizare scazuta a filmelor BG (atat in SBF, cat si in DMEM si DMEM complet), modurile de vibratie corespunzatoare stratului originar BG putandu-se discrimina mai usor atunci cand continutul de silica al filmelor este mai mare (Fig. 17a,b,c). Astfel filmele BGC-5SiO2 au prezentat cea mai scazuta bioreactivitate in vitro (Fig. 17a,b,c). Testarea acestora in DMEM-C a produs cele mai mici modificari structurale fata de structura initiala a filmului depus prin RF-MS (Fig. 16 vs. Fig. 17c).

Pe de alta parte intensitatile benzilor de vibratie IR (Fig. 17a,b,c) sugerau ca in cazul testarii in vitro in medii tip DMEM si DMEM complet, procesele de bioactivitate nu sunt atat de rapide precum cel intalnite in cazul testarii in SBF.

Figura 17: (a,b,c) Spectrele FTIR ale filmelor simplu-depuse BGC (tinta simpla), BGC-3SiO2 (tinta cu 3SiO2) si BGC-5SiO2

(tinta cu 5SiO2) testate in (a) SBF, (b) DMEM, (c) DMEM complet. (d) Spectrul FTIR al unei pulberi de hidroxiapatita stoichiometrica cristalina (Sigma-Aldrich).

18

Figura 18: Difractogramele GIXRD (α=2°) ale filmului BGC simplu-depus testat in SBF, DMEM si DMEM complet timp de 30

de zile. Analizele de microscopie SEM (Fig. 19) realizate ulterior au confirmat intru totul ipotezele noastre. In

cazul testelor in vitro in SBF, morfologia filmelor BGC se schimba dramatic, dupa 30 de zile de imersie constand dintr-o matrice cu aspect coralic compusa din cristale aciculare (avand un raport Ca/P estimat prin EDS in plaja 1.3 – 1.5, sugerand o HA sub-stoichiometrica) pe care cresc formatiuni CaP sferulitice cu dimensiuni de 1.5 – 2.5 µm, avand cu un raport Ca/P situat in intervalul 1.6 – 1.8 (deci foarte aproape de valoarea stoichiometrica teoretica a HA). Aceste formatiuni sferulitice sunt tipice morfologiei de crestere a straturilor de hidroxiapatita biomimetice [2].

Atunci cand concentratia de silica a filmelor BGC creste se obtin populatii mai reduse de formatiuni CaP sferulitice (Fig. 19), procesele de biomineralizare fiind deci mai putin accentuate, asa cum a fost sugerat anterior si de analizele FTIR (Fig. 17a).

Figura 19: Evolutia morfologiei suprafetei filmelor BGC simplu-depus, BGC-3SiO2 si BGC-5SiO2 dupa 30 de zile de imersie in

SBF functie de procentul de silica, evidentiata prin SEM.

19

In cazul filmelor BGC testate in vitro timp de 30 de zile in DMEM si DMEM complet au fost evidentiate morfologii ale suprafetelor radical diferite fata de cele obtinute in SBF dupa aceeasi perioada de imersie. In cazul testelor realizate in DMEM, a putut fi remarcata prezenta unor noduli sferoidali (avand diametre de 0.40 – 0.55 µm) agregati in lanturi fractalice crescute pe o matrice cu morfologie relativ neteda (Fig. 20-randul de sus). Aceste formatiuni sunt similare celor observate in cazul filmelor BGB dupa 7 zile de imersie in SBF (Fig. 14d), si demonstreaza astfel latenta proceselor de bioactivitate in DMEM. In cazul testelor realizate in DMEM complet (Fig. 20-randul de jos), procesele de biomineralizare sunt doar intr-un stadiu incipient, pe suprafata probelor putand fi remarcata prezenta unor noduli sferoidali cu dimensiuni mult mai mici (avand diametre de 0.15 – 0.30 µm), izolati si cu o densitate mai redusa decat in cazul probelor testate in DMEM.

Figura 20: Imagini SEM ale filmelor BGC dupa 30 de zile de imersie in DMEM (randul de sus) si DMEM complet (randul de

jos). Cu ajutorul spectroscopiei micro-Raman (diametru spot≈1 µm) s-a reusit evaluarea structurala a agregatelor

sfedoidale intalnite pe suprafata filmelor BG dupa testarea in vitro in cele trei tipuri de medii (Fig. 21). Comparativ sunt prezentate si spectrele Raman (in cele doua regiuni de interes) ale unei pulberi de hidroxiapatita cristalina stoichiometrica (Fig. 21b,d).

In cazul testelor realizate in SBF, agregatele sferoidale constau dintr-o hidroxiapatita cu un grad redus de cristalinitate (Fig. 21a,c), fiind evidentiate benzile Raman specifice acestui tip de structura. In cazul testelor realizate in DMEM (Fig. 21e) si DMEM complet (Fig. 21f), agregatele sferoidale sunt compuse tot din fosfat de calciu, insa alura spectrelor indica atat diferente structurale importante, cat si un grad de ordonare mult diminuat. In plus, doar in cazul probelor evaluate in medii DMEM se remarca si prezenta unei benzi suplimentare, situate la ~861 cm-1, si care poate si asociata cu vibratii moleculare specifice unor amino acizi precum glutamina, serina, sau treonina [23].

20

Figura 21: Spectrele Raman ale probele BGC simplu-depuse testate in (a,c) SBF, (e) DMEM, (f) DMEM complet, si (b,d) a unei

pulberi de hidroxiapatita stoichiometrica cristalina (Sigma-Aldrich), in doua regiuni spectrale: 750–350 cm-1 (a,b) si 1150–750 cm-1 (c,d,e,f).

Se sugereaza astfel ca prezenta aminoacizilor si/sau a proteinelor in mediile de testate in vitro determina un

proces de biomineralizare mai lent, dupa 30 de zile de imersie stratul de fosfat de calciu fiind intr-un stadiu incipient de structurare, spre deosebire de testele SBF, unde aceeasi perioada de incubatie in vitro a permis cresterea mai rapida in grosime a acestuia concomitant cu structurarea si cristalizarea sa intr-o faza de tip hidroxiapatita. Una dintre explicatiile posibile rezida in valorile de pH mai mici atinse de solutiile DMEM in timpul testarii fata de solutia SBF. Pe de alta parte prezenta aminoacizilor si a unor proteine serice poate determina prin procese de adsorbtie la nivelul suprafetei implantului formarea unui strat organic protector [24] care poate juca un rol important

21

in stoparea mai timpurie a disolutiei filmului BG in mediu, determinand o latenta a proceselor de bioactivitate. Astfel se explica de ce au fost observate in mediile DMEM modificari structurale reduse in cazul filmelor cu continut crescut de silica, care deja imprima materialului rate mai mici de solubilizare in medii apoase

In cazul SBF aflat in atmosfera normal la 30 zile pH-ul a ajuns pana la valori de 9.5. In cazul SBF aflat in atmosfera cu 5% CO2 pH-ul a crescut la 7.8. Acest fapt demonstreaza ca verificarea biocompatibilitatii unui material prin imersia in SBF in atmosfera normala, nu este un test de incredere, intrucat nu reproduce cu fidelitate conditiile intalnite in vivo.

De asemenea, mediul de cultura pentru celule in atmosfera normala s-a comportat analog SBF-ului virand treptat spre mediu intens alcalin ajungand la pH≈9. Mediul de cultura mentinut in incubator in conditii atmosferice homeostazice a prezentat insa un pH constant de 7.3, similar celui real din corpul uman.

Rezultatele noastre de pana acum sugereaza ca mai potrivite pentru testarea capacitatii de biomineralizare in vitro sunt testele realizate in medii DMEM in conditii homeostazice, deoarece testele clasice, dar populare, de imersare in SBF, pot, de multe ori, forta fenomenele de bioactivitate prin cresterea pH-ului. De asemenea trebuie mentionat ca solutia clasica SBF [22] este deja din preparare suprasaturata fata de elementele componente ale hidroxiapatitei, iar la variatii mici ale concentratiei ionilor de Ca2+ si (PO4)3-, precipitarea HA poate fi spontana. Testele in SBF pot deci conduce la rezultate fals-pozitive.

Rezultatele prezentate in aceasta sectiune fac parte dintr-un studiu amplu care a vizat Obiectivul 4 al proiectului. Acest studiu va fi diseminat printr-un articol stiintific, care se afla la acest moment in stadiu de redactare, si care va fi finalizat si trimis la o revista ISI in perioada imediat urmatoare. In cazul biosticlelor cu grad de depolimerizare inalt, procesele in vivo pot genera o puternica disolutie a acoperii implantologice, putand determina astfel un contact direct implant metalic-mediu biologic adiacent. De aceea, in cadrul proiectului a fost trasat un obiectiv suplimentar: gasirea unei retete tehnologice de preparare de straturi tampon cu o buna aderenta la substrat si un caracter bioinert avand drept rol protectia substratului metalic impotriva coroziunii determinate de mediile tisulare. Materialul propus pentru fabricarea straturilor tampon a fost carbonul tip diamant (DLC, diamond-like carbon).

Am preparat in cadrul proiectului prin depunere chimica in vapori asistata de plasma (PECVD) straturi subtiri tip DLC (~300 nm) utilizand aceeasi presiune totala de lucru (15 Pa) si trei dilutii de metan in argon: D20 (20%CH4+80%Ar), D60 (20%CH4+80%Ar) si D100 (100%CH4). In general straturile subtiri DLC prezinta o aderenta nativ scazuta din cauza continutului mare de C-sp3 care determina tensiuni puternice in film. In cadrul proiectului buna aderenta a filmelor de DLC (~60 MPa) a fost obtinuta prin introducerea unui strat intemediar cu gradient de compozitie chimica tip the TixTiC1-x (x=0–1), preparat prin co-pulverizare magnetron din doua tinte (Ti si TiC), urmand protocolul tehnologic descris mai sus (O3-ii, Fig. 8a).

A fost testata capacitatea straturilor DLC de a reprezenta o bariera inerta eficienta intre mediul intern si

substratul metalic. Filmele DLC sintetizate au fost caracterizate multiparametric pentru evidentierea structurii, aderentei, si interactiunii cu fluide biologice: sange, plasma sangvina, precum si o cultura de plachete sangvine. S-a determinat atat timpul partial de tromboplastina activata (aPTT) ca exponent al coagularii cat si capacitatea de interactie cu celulele umane prin verificarea aderarii plachetelor sangvine. Aderarea celulelor la aceasta suprafata este scazuta asa cum se observa din testul Western-blot realizat pentru investigarea aderarii plachetelor la suprafetele anterior mentionate (Fig. 22). S-a demonstrat ca filmul de D100 conduce la o interactie scazuta cu proteinele din mediul intern si de asemenea induce o coagulare scazuta a sangelui pe suprafata sa comparativ cu celelalte suprafete (Ti, D20, D60) (Fig. 23).

22

Figura 22: Aderarea plachetelor sangvine la suprafetele de Ti si DLC.

Figura 23: Graficul corelarii intre aPTT si aderarea plachtelor sangvine la suprafetele de DLC si Ti .

23

O5. Testarea in vitro pe model celular a biocompatibilitatii, toxicitatii si capacitatii de inducere a diferentierii (grad de realizare: 70%)

Teste preliminare de citocompatibilitate in culturi de celule fibroblaste

Celule fibroblaste 3T3 au fost utilizate pentru a verifica biocompatibilitatea filmelor BGA (Tabel II) in termeni de aderenta, proliferare si citotoxicitate. S-a folosit Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM–F12) cu 10% ser fetal de vital, 100 UI ml−1 penicilina si 100 µg ml−1 streptomicina (toate materialele au fost achizitionate de la Sigma Aldrich, SUA). Pe scurt, 1.5*104 celule cm−2 au fost insamantate pe suprafetele de Ti acoperite cu BGA precum si pe suprafete de Ti si policarbonat (PC) cu acoperire pentru culturi celulare. Celulele au fost mentinute la 37°C intr-un incubator pentru culturi celulare, in atmosfera umeda cu 5% CO2. Test de aderenta: la 2 h dupa insamantare, celulele au fost spalate de 2 ori cu mediu de cultura DMEM–F12 si incubate cu saruri de metil-tetrazoliu (MTS). Absorbanta a fost citita la 490 nm dupa o ora de incubare. Numarul de celule a fost cuantificat prin MTS in conformitate cu specificatiile producatorului (Promega Corp., SUA, Cat. No. G3582). Proliferarea a fost studiata la 30 ore dupa insamantare prin incubarea cu MTS dupa 2 spalari cu mediu de cultura. La 30 ore mediul de cultura a fost colectat pentru a se determina activitatea lactat dehidrogenazei (LDH) provenita din celulele moarte in acest interval (in conformitate cu indicatiile producatorului kitului, Promega Corp., SUA, Cat. No. G1780). LDH este o enzima prezenta in citoplasma celulelor, iar prezenta ei in mediul de cultura este direct proportional cu numarul de celule moarte aflate in mediu. Pentru fiecare experiment s-au folosit cvadruplicate. Pentru testele de aderenta si proliferare absorbtiile au fost convertite in numar relativ de celule pe baza unei scale obtinute pe acelasi tip celular.

Aderenta a fost studiata la 2 ore dupa insamantare, in momentul in care celulele au inceput etalarea, cu indepartarea celulelor neaderate. Numarul de celule a fost cuantificat prin tehnica MTS. Rezultatele cele mai bune au fost obtinute pentru filmele BG4 aproape toate celulele insamantate aderand (rezultate chiar mai bune decat cele pe substratul de policarbonat cu suprafata speciala aderenta celulelor) (Fig. 24). Rezultate bune au fost obtinute pentru toate filmele BGA, in timp ce suprafetele de Ti au prezentat cea mai slaba aderenta, doar aprox. 45% din celule aderand in cele 2 ore.

Figura 24: Histograma rezultatelor de aderenta si proliferare celulara pe suprafata filmelor BGA.

Proliferarea celulara a fost studiata la 24 h dupa etalarea completa a celulelor (aprox. la 6 ore de la

insamantare, in total la 30 ore de la insamantare). Cele mai bune rezultate au fost oferite de policarbonatul cu suprafata aderenta care a prezentat o crestere a numarului celular cu 140%. Numarul de celule pe suprafata de titan a fost egal cu cel de celule insamantate. Toate probele de BGA au prezentat proliferare excelenta generand cresteri de peste 80% in cazul BG4 si BG3O2, cel mai scazut procent de proliferare fiind inregistrat pentru BG3 (~57%).

Efectul toxicitatii filmelor de BGA asupra celulelor a fost investigat prin determinarea activitatii LDH (lactat dehidrogenaza) in mediul de cultura la 24 ore dupa insamantare. Doar celulele crescute pe titan au prezentat o rata de 3.5% celule moarte, celelalte suporturi de cultura ramanand sub limita de sensibilitate si discriminare a testului.

24

Pe baza analizelor FTIR (Fig. 4a), XPS (Fig. 4b) si EDS (Tabel III) si testelor de biocompatibilitate (Fig. 24) se poate afirma ca filmul de biosticla cu cea mai depolimerizata retea si continutul de Na cel mai mare are biocompatibilitatea mai scazuta decat filmele ce contin Na in proportie de ~5% si au o retea mai polimerizata. Se poate conchide asadar ca o biocompatibilitate buna se obtine printr-o echilibrare structurala si compozitionala: suficienta depolimerizare pentru a permite interactia benefica cu fluidele biologice si o cantitate de sodiu moderata. Biosticlele cu conectivitate scazuta sunt predispuse dizolvarii rapide determinand o crestere a concentratiei unor elemente alcaline si alcalino-pamantoase in mediul biologic inconjurator. Aceasta poate conduce la cresterea locala a pH-ului si o biocompatibiliate mai scazuta.

Teste preliminare de biocompatibilitate in culturi de celule osteogenice

Rezultatele incurajatoare obtinute prin testele in vitro in solutii fiziologice simulate in cazul BGB (Fig. 15), au fost sustinute si de primele teste in vitro in culturi de celule osteogenice (linia celulara SaOs2). A fost selectata pentru testarea biologica structura BGB 0.4 Pa. Modul in care interactioneaza celulele cu suprafetele BGB a fost studiat in vitro prin testari de tip MTS si ALP (activitatea fosfatazei alcaline). Testele MTS realizate dupa 48 ore de la insamantare au relevat valori mai crescute pentru controlul standard (PC) decat pentru suprafetele BGB (Fig. 25-in verde). Rezultatele ALP (Fig. 25-in rosu) insa, au relevat o activitate net crescuta in cazul suprafetelor BGB. Prin combinarea celor doua rezultate se poate postula ca in timp ce suprafetele standard de cultura stimuleaza proliferarea celulara (absorbtie mai crescuta la test MTS), filmele BGB stimuleaza cu precadere diferentierea celulara catre fenotipul osteoproductiv (activitatea ALP mai crescuta).

Figura 25: Rezultatele testelor MTS (a) si ALP (b) efectuate dupa 48h de incubare a celulelor osteogenice SaOs2.

Teste complexe de biocompatibilitate in culturi de celule stem Scopul principal al proiectului este reprezentat de crearea unor implanturi, cu biocompatibilitate excelenta

si cu durata de viata prelungita (in conditiile in care durata medie de viata a implanturilor este de ~15 ani). In vederea realizarii acestui deziderat au fost testate succesiv filme BG sintetizate prin RF-MS, prin proceduri in vitro in medii diferite ce mimeaza compozitia fluidului intercelular, precum si teste utilizand culturi celulare cu diverse fenotipuri (fibroblaste si celule osteoformatoare) pentru a testa aderenta, citotoxicitatea, proliferarea celulara si diferentierea pe aceste acoperiri.

Rezultatele in vitro in culturi de celule fibroblaste si osteosarcom au relevat un potential biocompatibil deosebit a structurilor optimizate (BGA si BGB), justificand continuarea studiilor prin testarea lor biologica complexa in culturi de celule stem. Deoarece consideram ca filmele subtiri de biosticla sunt potrivite aplicatiilor implantologice dentare, echipa de cercetare a proiectului TE49/2011 si-a concentrat atentia asupra testarii biologice complexe in culturi de celule stem specifice, extrase din pulpa dentara. In conditiile aplicarii unor presiuni constante asupra implantului la suprafata os implant si la nivelul osului din imediata vecinatate a implantului, mecanismele de reparare si regenerare a osului trebuie sa functioneze la parametri optimi. Diferentierea terminala a celulelor stem din tesutul osos vecin implantului in celule osteoformatoare, va conduce pe termen lung la o lipsa a celulelor osteo-formatoare si in acest fel scaderea cantititatii si calitatii acestui tesut. Posibilitatea mentinerii fenotipului de celula stem si lipsa diferentierii terminale a acestora consideram ca este cheia obtinerii implanturilor cu durata lunga de viata ce nu mai necesita reinterventie. In cadrul etapei a III-a, utilizand metode avansate de biologie celulara si moleculara, am urmarit extragerea

25

de celule stem din pulpa dentara (DPSC) – procedura realizabila de laboratoarele cu multa experienta in domeniul culturilor celulare – pentru a investiga modul in care se dezvolta, prolifereaza si se diferentiaza o cultura de celule stem pe filmele de BG sintetizate in cadrul proiectului. Procedura de extractie a celulelor stem a fost realizata in laboratorul de culturi celulare al Centrului de Cercetari Stiintifice Medico Militare.

Molari III sanatosi, inclusi care prezentau indicatie de extractie, au fost prelevati intregi fara deschiderea camerei pulpare avand consimtamantul pacientului deplin informat (in acord cu prevederile declaratiei de la Helsinki, revizia a 6-a produsa de World Medical Association la Intrunirea a 59-a de la Seoul 2008). Au fost transportati la 4°C in laboratorul de culturi celulare in cca. 30 minute. Suprafata a fost dezinfectata cu alcool 70% si cu apa oxigenata. Molarii au fost procesati in mediu steril in hota pentru culturi celulare: au fost taiati steril cu o freza diamantata efectuandu-se periodic racirea prin spalare cu ser fiziologic steril. Dupa deschiderea camerei pulpare a fost recoltata pulpa dentara si maruntita la fragmente cu dimensiunea de 0.5 mm. Acestea au fost supuse digestiei enzimatice timp de 1 ora la 37°C, intr-o solutie continand 2 mg/ml colagenaza tip I si 1 mg/ml dispaza, dizolvate in Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS). La fiecare 10 minute s-a efectuat o disociere mecanica prin vortexare si trecere prin pipeta Pasteur. Dupa digestia enzimatica supernatantul a fost prelevat si centrifugat la 250xg timp de 5 min. Supernatantul a fost indepartat si celulele resuspendate in mediu de cultura complet pentru DPSC (Minimum Essential Medium Eagle-alpha modification, cu 15% ser fetal bovin, Glutamax 1x si L-acid ascorbic) trecute printr-o sita cu diametrul dochiurilor de 40 µm. Celulele au fost plasate in incubator cu atmosfera umeda si 5% CO2, la 37°C.

Dupa 24 ore mediul a fost schimbat si celulele examinate. Ulterior mediul de cultura a fost schimbat la 48 de ore. La 14 zile sau la atingerea confluentei de 80% s-a efectuat cate un pasaj. S-a verificat prin imunofluorescenta prezenta DPSC (identificand markerii STRO1, CD90, CD146). Pulpa dentara este un mediu complex ce cuprinde multiple tipuri celulare: celule endoteliale, pericite, celule stem celule mezenchimale, fibroblaste din nisa celulelor stem. Prin procedura de obtinere a culturii primare toate aceste tipuri celulare vor fi cultivate. Pentru a obtine o cultura cu un grad crescut de DPSC s-a trecut la separarea imunomagnetica a celulelor din cultura. Dupa atingerea unui numar suficient de celule, acestea au fost desprinse cu tripsina si incubate cu bile magnetice pe care au fost adsorbiti anticorpi CD90 si CD146 conform protocolului producatorului (Myltenyi Biotec, Germania).

Figura 26: Fluorescenta pentru markeri celulari realizata pe cultura DPSC pre- si post-separare: CD90 pre- (a) si

post-separare (b), CD146 pre- (c) si post-separare (d). ( cu verde - markerii celulari CD90 si respectiv CD146, cu albastru- nucleii celulari contracolorati cu DAPI).

26

Dupa incubarea timp de 30 min la 37°C s-a adaugat buffer de separare si celulele au fost centrifugate la

250xg, supernatantul indepartat, pentru elutia bilelor necuplate. Celulele au fost resuspendate in buffer de separare si trecute prin coloana de separare cuplata la dispozitivul magnetic. Dupa spalarea coloanei cu HBSS s-a adaugat o fractie de 2 ml de HBSS a fost indepartata coloana din dispozitivul magnetic si s-a obtinut fractia de celule pozitive pentru CD90 si CD146 (Fig. 26). Celulele au fost centrifugate la 250xg, supernatantul indepartat si au fost resuspendate in mediu de cultura complet si introduse in incubator. Dupa atingerea unui grad de nucleatie si proliferare suficient pentru conducerea experimentelor in triplicat celulele au fost pasate si insamantate pe substraturile de Ti acoperite prin RF-MS cu BGA (0.4 Pa) (asa cum a fost propus in O3-iii), pe substraturi control de titan simplu de grad medical, precum si pe substraturi de policarbonat cu suprafata speciala pentru culturi celulare. Asa cum a fost aratat mai sus, structurile BGA (0.4 Pa) simplu-depuse sunt cele care au oferit cele mai bune rezultate mecanice si de citotoxicitate. S-a investigat la 4 zile si la 10 zile proliferarea, morfologia si prin imunofluorescenta gradul de diferentiere celulara prin expresia markerilor STRO1 si CD90. In Fig. 27 sunt prezentate la 96 de ore de dezvoltare celule insamantate pe controlul Ti marcate cu verde pentru CD90 (a) si rosu pentru STRO1 (b). Se observa o usoara disparitie a markerului de celula stem mezenchimala (MSC) din pulpa dentara concomitenta cu diferentierea. Spre deosebire de celulele crescute pe Ti, celulele cultivate pe suprafata BGA s-au dezvoltat bine, avand un fenotip mai apropiat de MSC original, intensitatea expresiei STRO1 (c) si a CD90 (d) ramanand la nivele crescute.

Figura 27: Imagine de imunofluorescenta indirecta prezentand celule stem mezenchimale din pulpa dentara dezvoltate pe Ti si pe suprafete acoperite cu BGA la 96 de ore de la insamantare: expresia CD90 la celule cultivate pe Ti (a); expresia STRO1 la

celule cultivate pe Ti (b); expresia CD90 la celule cultivate pe suprafete acoperite cu BG (c); expresia STRO1 la celule cultivate pe suprafete acoperite cu BGA (d). Marirea originala: 200X.

La 10 zile s-a constatat la celulele cultivate pe titan, scaderea progresiva a markerilor CD90 si STRO1, si o buna proliferare (Fig. 28a,b,c), in timp ce la celulele crescute pe suprafata de BG s-a constatat mentinerea caracterului stem si chiar generarea de sfere de celule stem ce prezinta in grad crescut expresia markerilor CD90 si STRO1 (Fig. 28c,d,e). Aceasta demonstreaza buna biocompatibilitate a acoperirilor BGA si mentinerea caracterului nediferentiat al celulelor stem din pulpa dentara.

27

Figura 28: Imagine de imunofluorescenta indirecta prezentand celule stem mezenchimale din pulpa dentara dezvoltate pe Ti si pe suprafete acoperite cu BGA dupa 10 zile de cultivare: nucleii celulari la celule cultivate pe Ti (a); expresia CD90 la celule

cultivate pe Ti (b); expresia STRO1 la celule cultivate pe Ti (c); nucleii celulari la celule cultivate pe suprqfete cu acoperire BGA (c); expresia CD90 la celule cultivate pe suprafete acoperite cu BGA (e); si expresia STRO1 la celule cultivate pe suprafete

acoperite cu BGA (f). Marirea originala: 20X pentru a,b,c si 10X pentru d,e,f. In privinta proliferarii, numaratoarea nucleilor celulari pe 10 campuri alese aleator si 1000 celule minim, nu a evidentiat diferente majore intre substratul de Ti si filmul BGA, la 10 zile in ambele cazuri atingandu-se confluenta totala. In prezent (2013.12.02), testele in vitro in culturi de celule stem sunt in desfasurare, avand orizontul de finalizare fixat pentru sfarsitul anului curent. Certificarea cantitativa a prezentei markerilor pentru celule stem: notch, CD90 si CD146, se va realiza prin Western-blot. Se va investiga prezenta markerilor de celula stem in cultura si se va compara cantitatea intre probele acoperite cu biosticla (simplu-depuse si tratate termic pentru cresterea aderentei la substrat) si probele control de titan si policarbonat. Pentru ultima etapa a proiectului, echipa de cercetare va definitiva testarea in vitro in culturi de celule stem, care va oferi un indicator predictiv relevant asupra potentialului biologic a filmelor BG optimizate si va demara teste mecanice reale (inserarea prin insurubare “la rece” in mandibula de porc asomat, a suruburilor biofunctionalizate cu BG, prin tehnica si cu instrumentele folosite in implantologia orala umana). In cazul in care acoperirile vor avea de suferit in urma acestui proces se va incerca optimizarea procesului de depunere 3D si a tratamentelor post-depunere pentru obtinerea de implanturi cu acoperiri subtiri rezistente la stresul mecanic al implantarii.

Prin prisma datelor obtinute in acest proiect, care modifica perceptia clasica asupra conceptului de bioactivitate al acoperirilor subtiri implantologice, ne propunem si indeplinirea unui obiectiv tehnologic suplimentar proiectului: identificarea grosimii minime necesare pentru un film BG pentru a putea induce cu succes cresterea in conditii biomimetice de straturi groase si rugoase de HA capabile sa stimuleze legatura cu osul, dar sa elimine si riscul de disolutie dramatica si pierderea chiar si temporara a celui de-al doilea rol a stratului BG de biofunctionalizare (bariera de difuzie a ionilor de titan ai substratului in organism). Un alt obiectiv suplimentar pentru etapa IV/2014, este reprezentat de cautarea de noi colaborari, in vederea realizarii testarii in vivo pe model animal a implanturilor 3D biofunctionalizate prin RF-MS cu straturi de biosticla, pentru a investiga in mod realist comportamentul acestor dispozitive medicale. De asemenea se va urmari in cadrul ultimei etape (IV/2014) diseminarea rezultatelor studiilor aflate acum la un nivel de dezvoltare avansat, prin prezentari orale la conferinte internationale, si publicare de articole ISI in jurnale cu factor de impact ridicat si vizibilitate mare.

28

O6. Consolidarea unui nucleu de tineri cercetatori cu rezultate foarte bune in domeniul de cercetare al biomaterialelor (grad de realizare: 80%)

Proiectul de cercetare a permis cristalizarea unui nucleu de tineri cercetatori din domenii diferite (1 inginer stiinta materialelor, 1 medic-biolog, 2 fizicieni) care conlucreaza fluid intr-un domeniu de cercetare inter-disciplinar complex. In viitor, intentionam sa largim orizontul stiintific al echipei de cercetare atragand si alti tineri din tara, din domenii de activitate complementare care vor permite marirea ariei de expertiza. Echipa creata este doar punctul de plecare pentru stabilirea de colaborari intre mai multe colective ce vor conduce la atingerea masei critice necesare dezvoltarii unor proiecte de mare anvergura. Se vor aborda astfel si alte studii de la concept la productie, dedicate materialelor biocompatibile tip implant, senzorilor biologici, sau testarilor in vitro si in vivo. Se va incerca si stabilirea de noi conexiuni cu cercetatori din institutii de profil din strainatate, pe baza colaborarii deja existente in cadrul proiectului, si experientei acumulate pe parcursul cercetarilor realizate.

Activitatea de diseminare publicistica va continua, pe langa cele 7 articole ISI publicate sau acceptate spre publicare in perioada 2012–2013 (care deja indeplinesc obiectul trasat in propunerea de proiect), echipa de cercetare a proiectului mai deja lucreaza la inca 3 manuscrise previzionate a fi trimise la jurnale ISI din domeniu pana la sfarsitul lunii martie 2014. In plus, asa cum prevede planul de activitati al proiectului, dupa vor fi selectati algoritmii tehnologici de biofunctionalizare cu grad inovativ, se va redacta si depune o cerere de brevet.

Prin optimizarea in continuare a procesului tehnologic de preparare a structurilor BG prin RF–MS, cu implicatii directe asupra compozitiei, structurii, ranforsarii interfetelor metal-sticla si obtinerii inaltei reproductibilitati si standardizarii procesului tehnologic va deveni posibila abordarea acoperirilor biofunctionale implantologice din punct de vedere comercial. Se va realiza astfel un deziderat al cercetarii moderne: cuplarea cercetarii inovative cu productia.

Director proiect, Dr. George Stan

29

Articole ISI publicate/acceptate: • 01. C. Berbecaru, G.E. Stan*,^, S. Pina, D.U. Tulyaganov, J.M.F. Ferreira, The bioactivity mechanism of

magnetron sputtered bioglass thin films, APPL SURF SCI 258 (2012) 9840–9848; http://dx.doi.org/10.1016/j.apsusc.2012.06.039.

• 02. A. Chiriac, G.E. Stan*,^, B. Iliescu, I. Poeata, The influence of host bone substrate in titanium mesh cranioplasty, DIG J NANOMATER BIOSTRUCT 8 (2013) 729–735; http://www.chalcogen.infim.ro/729_Chiriac.pdf.

• 03. G.E. Stan*,^, A.C. Popa^, A.C. Galca, G. Aldica, J.M.F. Ferreira, Strong bonding between sputtered bioglass-ceramic films and Ti-substrate implants induced by atomic inter-diffusion post-deposition heat-treatments, APPL SURF SCI 280 (2013) 530–538; http://dx.doi.org/10.1016/j.apsusc.2013.05.022.

• 04. A.C. Popa^, G.E. Stan*,^, M.A. Husanu^, I. Pasuk^, I.D. Popescu, A.C. Popescu, I.N. Mihailescu, Multi-layer haemocompatible diamond-like carbon coatings obtained by combined radio frequency plasma-enhanced chemical vapor deposition and magnetron sputtering, J MATER SCI – MATER MED 24 (2013) 2695–2707; http://dx.doi.org/10.1007/s10856-013-5026-y.

• 05. A.C. Popa^, V.M.F. Marquez, G.E. Stan*,^, M.A. Husanu^, A.C. Galca, C. Ghica, D.U. Tulyaganov, A.F. Lemos, J.M.F. Ferreira, Nanomechanical characterization of bioglass films synthesized by magnetron sputtering, acceptat la THIN SOLID FILMS (2013); http://dx.doi.org/10.1016/j.tsf.2013.10.104.

• 06. A. Visan, D. Grossin, N. Stefan, L. Duta, F.M. Miroiu, G.E. Stan^, M. Sopronyi, C. Luculescu, M. Freche, O. Marsan, C. Charvilat, S. Ciuca, I.N. Mihailescu*, Biomimetic nanocrystalline apatite coatings synthesized by matrix assisted pulsed laser evaporation for medical applications, acceptat la MATER SCI ENG B (2013); http://dx.doi.org/10.1016/j.mseb.2013.11.007.

• 07. L. Duta, A.C. Popa^, F. Miculescu, I.N. Mihailescu*, Ultra high molecular weight polyethylene acetabular cups functionalized with bioactive glass coatings synthesized by pulsed laser deposition, acceptat la ROM REP PHYS (2013).

Participari Conferinte Internationale: • 01. G.E. Stan#,^, A.C. Popa^, I. Pasuk^, A.C. Galca, G. Aldica, J.M.F. Ferreira, Bioactive glass-based sputtered

thin films: technological algorithms for adherence improvement, EMRS Spring Meeting, 2012 May 14-18, Strasbourg, France.

• 02. G.E. Stan#,^, M.A. Husanu^, A.C. Popa^, I. Pasuk^, A.C. Popescu, I.N. Mihailescu, Multi-layer haemocompatible diamond-like carbon coatings with increased functionality, EMRS Spring Meeting, 2012 May 14-18, Strasbourg, France.

• 03. G.E. Stan#,^, A.C. Popa^, A.C. Galca, G. Aldica, J.M.F. Ferreira, Strong bonding between sputtered bioglass thin films and Ti-substrate induced by atomic inter-diffusion post-deposition heat-treatments, EMRS Spring Meeting, 2013 May 27-31, Strasbourg, France.

• 04. G.E. Stan^, A.C. Popa#,^, V.M.F. Marquez, A.F. Lemos, J.M.F. Ferreira, Structural properties and mechanical performance of bioglass films deposited onto Ti-substrates by magnetron sputtering, EMRS Spring Meeting, 2013 May 27-31, Strasbourg, France.

LEGENDA: *autor corespondent #autor prezentator ^membru echipa de cercetare TE49/2011 Activitati Didactice:

• 2012: Andreea-Alexandra NILA, anul 3 de studiu, Facultatea de Chimie Aplicata si Stiinta Materialelor, Universitatea POLITEHNICA Bucuresti, a realizat in INCDFM (11.06.2012 - 28.08.2012) un stagiu de practica POSDRU (nr. contract 90/2.1/S/58108) intitulat “FILME NANO-STRUCTURATE DE HIDROXIAPATITA SI BIOSTICLA CU POTENTIAL BIOCOMPATIBIL DEPUSE PRIN METODA PULVERIZARII IN PLASMA MAGNETRON: OBTINERE SI CARACTERIZARE", sub coordonarea Dr. George Stan (director de proiect TE49/2011).

• 2013: Loredana TIMOFTE, anul 4 de studiu (terminal), Facultatea de Stiinta si Ingineria Materialelor, Universitatea POLITEHNICA Bucuresti, a efectuat (01.03.2013 - 01.07.2013) studiile de cercetare din cadrul Lucrarii sale de Licenta intitulata: “DEPUNERI DE FILME SUBTIRI PRIN METODA PULVERIZARII MAGNETRON UTILIZAND UN NOU SISTEM COMPOZITIONAL DE STICLE BIOCOMPATIBILE”, sub coordonarea stiintifica a Dr. George Stan (INCDFM, director de proiect TE49/2011) si Conf.Dr. Sorin Ciuca (UPB-SIM).

30

REFERINTE BIBLIOGRAFICE: [1] Y. Zhao, M. Song, J. Liu, Surf. Interface Anal. 40 (2008) 1463. [2] L.L. Hench, J. Am. Ceram. Soc. 74 (1991) 1487. [3] G. Socrates, Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies—Tables and Charts, John Wiley & Sons Ltd, 2007. [4] M. Magallanes-Perdomo, A.H. De Aza, I. Sobrados, J. Sanz, P. Pena, Acta Biomater. 8 (2012) 820. [5] R.G. Hill, D.S. Brauer, Acta Biomater. 7 (2011) 3601. [6] H. Buckle, In: J.W. Westbrook, H. Conrad (Eds), American Society for Metals, Metal Park OH, 1973. [7] C.Y. Tang, C.P. Tsui, Dj. Janackovic, P.S. Uskokovic, J. Optoelectron. Adv. Mater. 8 (2006) 1194. [8] A. Cattini, L. Łatka, D. Bellucci, G. Bolelli, A. Sola, L. Lusvarghi, L. Pawłowski, V. Cannillo, Surf. Coat. Technol. 220 (2013) 52. [9] M. Monsalve, H. Ageorges, E. Lopez, F. Vargas, F. Bolivar, Surf. Coat. Technol. 220 (2013) 60. [10] J.R. Jones, A. Clare, Bio-Glasses: An Introduction, John Wiley & Sons Ltd, 2012. [11] Y.C. Fredholm, N. Karpukhina, R.V. Law, R.G. Hill, J. Non-Cryst. Solids 356 (2010) 2546. [12] D.S. Brauer, N. Karpukhina, R.V. Law, R.G. Hill, J. Mater. Chem., 19 (2009) 5629. [13] A. Pedone, T. Charpentier, M.C. Menziania, J. Mater. Chem. 22 (2012) 12599. [14] J.K. Christie, A. Pedone, M.C. Menziani, A. Tilocca, J. Phys. Chem. B. 115 (2011) 2038. [15] D.S. Brauer, A. Al-Noaman, R.G. Hill, H. Doweidar, Mater. Chem. Phys. 130 (2011) 121. [16] F. Fayon, C. Duée, T. Poumeyrol, M. Allix, D. Massiot, J. Phys. Chem. C 117 (2013) 2283. [17] ISO 13779-2, Implants for Surgery: Hydroxyapatite – Part 2: Coatings of Hydroxyapatite, 2008. [18] L. Peddi, R.K. Brow, R.F. Brown, J. Mater. Sci. Mater. Med. 19 (2008) 3145. [19] G. Goller, Ceram. Int. 30 (2004) 351. [20] T. Kokubo, H. Kushitani, S. Sakka, T. Kitsugi, T. Yamamuro, J. Biomed. Mater. Res. 24 (1990) 721. [21] H.H. Lu, S.R. Pollack, P. Ducheyne, J. Biomed. Mater. Res. 51 (2000) 80. [22] ISO/FDIS 23317, Implants for Surgery - In Vitro Evaluation for Apatite-forming Ability of Implant Materials, 2007. [23] G. Zhu, X. Zhu, Q. Fan, X. Wan, Spectrochim. Acta Part A 78 (2011) 1187. [24] T.A. Mahmood, J.E. Davies, J. Mater. Sci. Mater. Med. 11 (2000) 19.

Director proiect, Dr. George Stan