REVISTA ROMÂNÅ DE STOMATOLOGIE – VOLUMUL LVIII, NR. 2, AN 2012134

BIOCHIMIE16PROTEINELE SALIVARE

Salivary proteins

Asist. Univ. Dr. Elena Rusu1, Dr. Violeta Hâncu1Disciplina Biochimie, Facultatea de Medicinå şi Medicinå Dentarå,

Universitatea „Titu Maiorescu“, Bucureşti

REZUMATSaliva joacă un rol important în procesele de digestie, de apărare a gazdei şi de lubrifi ere. Saliva conţine un amestec complex de proteine mucine, proteine bogate în prolină, glicoproteine salivare, lizozim, histatine, cistatine). Cea mai mare parte a acestora se întâlnesc şi în alte secreţii ale organismului uman. La nivelul cavităţii bucale, proteinele salivare îndeplinesc funcţii multiple. Cu toate că saliva conţine mai mulţi factori antibacterieni, cum ar fi lizozimul, fl ora bacteriană specifi că cavităţii orale nu este afectată semnifi cativ de prezenţa acestora. Lucrarea de faţă se axează pe prezentarea structurii şi rolului pe care îl au proteinele salivare în menţinerea sănătăţii cavităţii orale şi apărarea împotriva factorilor agresivi care pot induce apariţia diferitelor patologii specifi ce acestei zone.

Cuvinte cheie: saliva, proteine salivare, factori antibacterieni

ABSTRACTSaliva plays an important role in digestion, host defense, and lubrifi cation processes. Saliva contains a complex mixture of salivary proteins mucins, proline-rich proteins, salivary glycoproteins, lysozyme, histatins, cystatins). The most part of them was found in other fl uids of human organism. In oral cavity, salivary proteins complain multiple functions. Although saliva contains several antibacterial factors, such as lysozyme, the typical oral fl ora are not affected signifi cantly by them. This study focuses on the presentation of structure and role which have salivary proteins in the maintenance health of oral cavity and host defense against aggressive factors which can induce different pathologies who were specifi c to this site.

Key words: saliva, salivary proteins, antibacterial factors

Adresă de corespondenţă:Asist. Univ. Dr. Elena Rusu, Facultatea de Medicină şi Medicină Dentară „Titu Maiorescu“, Strada Gheorghe Petraşcu Nr. 67A Bucureştie-mail: elenarusu98@yahoo.com

INTRODUCERE

La nivelul cavităţii orale se găsesc o multitudine de factori defensivi specifi ci şi nespecifi ci. Factorii nespecifi ci de natură proteică includ unele mucine, proteine bogate în prolină, glicoproteine salivare, lactoferină, lizozim, histatine, cistatine şi peroxi-daze. Saliva conţine un amestec complex de pro-teine care se prezintă sub mai multe forme. Aceste izoforme au în general cel puţin o funcţie fi ziologică. Unele proteine care fac parte din familii diferite pot îndeplini aceeaşi funcţie.

Principalele glande salivare sunt glandele paro-tide, submandibulare şi submaxilare. În afară de

acestea, la nivelul cavităţii orale se găsesc şi glan-dele salivare mai mici situate pe mucoasa linguală şi la nivelul buzelor. Secreţia salivară normală este cuprinsă între 800 şi 1500 ml pe zi la adulţi, cu o medie de 1.000 ml). Conţinutul global în proteine la un fl ux scăzut este de aproximativ 2,2 g/l şi creşte direct proporţional cu acesta. Concentraţia pro-teinelor salivare în glandele parotide este de două ori mai mare decât în glandele submandibulare. Pro teinele au o concentraţie de 35 de ori mai mică în salivă comparativ cu concentraţia plasmatică, principalul lor rol în salivă fi ind cel antibacterian.

Proteinele salivare includ proteine sintetizate în glandele salivare glicoproteine şi enzime) sau de

REVISTA ROMÂNÅ DE STOMATOLOGIE – VOLUMUL LVIII, NR. 2, AN 2012 135

ori gine sanguină imunoglobuline, transferină, lipo-proteine, enzime). Din salivă au fost separate peste 20 de tipuri de proteine, cele mai multe dintre acestea găsindu-se în salivă sub formă de complexe cu calciu. În componenţa salivei intră două tipuri majore de secreţii proteice: o secreţie serică care conţine α-amilază – enzimă implicată în digestia amidonului) şi o secreţie mucoidă care conţine mucine implicate în lubrifi erea mucoaselor orale. Glandele parotide produc doar secreţii serice în timp ce glandele submandibulare şi submaxilare produc ambele tipuri de secreţii. În general, glandele salivare minore secretă mucus. Această lucrare se axează pe prezentarea structurii şi rolului pe care îl au proteinele salivare în menţinerea sănătăţii cavi-tăţii orale.

Proteine bogate în prolină PRPCele mai multe proteine salivare fac parte dintr-o

clasă mare de proteine care conţin în structură multe resturi de prolină proline-rich proteins PRP). Există mai mult de 20 de PRP prezente în saliva umană care sunt împărţite în două clase: proteine PRP având caracter acid sau acide şi PRP bazice şi glicozilate. Din punct de vedere structural, aceste proteine conţin în proporţie de 70-88% aminoacizii prolină, glicină şi glutamină. Proteinele PRP acide au capătul N-terminal extrem de acid. Regiunea re-petitivă a PRP este dominată de cei trei aminoacizi mentionaţi anterior. Structura primară a PRP acide este unică şi arată că aceste tipuri de proteine sunt diferite de altele. PRP sunt sintetizate de celulele acinare ale glandelor salivare, iar expresia fenotipică se afl ă sub control genetic. Aceste proteine cu un ca racter acid reprezintă 37% dintre proteinele sali-vare care aderă la suprafaţa dinţilor curaţi. Ele se ata şează de apatită printr-o legătură la capătul N-terminal, iar la capătul C-terminal se leagă de bacteriile orale şi pot iniţia formarea biofi lmului bacterian. De exem plu, tulpina serotip c a speciei Streptococcus mutans formează legături cu alelele PRH2 Pr1) mai mult decât alte tipuri de proteine salivare ataşate la suprafaţa dentară (9). PRP acide au capacitatea de a lega calciul prin legături foarte puternice, ceea ce indică faptul că ele au rol impor-tant în menţinerea concentraţiei calciului ionic salivar. Totodată, ele pot inhiba formarea hidroxia-patitei, fi ind evitată astfel formarea cristalelor de hidroxiapatită in vivo la nivelul suprafeţelor dentare (3). În această categorie de proteine intră PRP1 şi 3,

PIF-s, PIF-f, Db şi Pa. Proteinele Db infl uenţează aderarea bacteriilor asociate cariilor dentare (26). Proteinele PRP au rol de apărare împotriva tani-nurilor din alimentaţie, prin formarea unor complexe proteine-tanin. Astfel, aceste proteine previn sau reduc acţiunea taninurilor asupra structurilor orale (15).

Histatinele salivare sunt proteine care au con-ţinut crescut de histidină şi tirozină; ele au caracter neutru şi sunt secretate de glandele parotide şi submandibulare. Cele mai importante importante sunt histatinele 1, 3 şi 5. Aceste proteine au o struc-tură formată din 38, 32 şi respectiv 24 de resturi de aminoacizi şi conţin 7 resturi de histidină (17). Histatinele îndeplinesc roluri multiple la nivelul cavităţii bucale. Unul dintre cele mai importante efecte este cel antifungic, prin inhibiţia tranziţiei de la forma de drojdie la cea fi lamentoasă a speciei cu potenţial patogen Candida albicans (2). Efectul antifungic al histatinei 5 a fost evidenţiat şi asupra speciilor Aspergillus fumigatus şi Candida krusei (12), iar al histatinei 3 asupra speciei Candida dubliniensis (8). Histatina 5 este un inhibitor al enzimelor secretate de speciile bacteriene implicate în deteriorarea paradonţiului. Astfel, acest tip de histatină are rol protector la nivelul mucoaselor orale, prin participarea la inţierea reacţiilor imune la nivelul cavităţii orale (11). De asemenea, s-a demonstrat că aceste proteine bogate în histidină reprezintă o componentă importantă a sistemului de apărare al gazdei cu implicaţii majore în menţi-nerea sănătăţii orale. Studiile fl uorimetrice au arătat că histatina 5 induce formarea radicalilor liberi ai oxigenului atât în celulele speciei C. albicans, cât şi la nivel mitocondrial; nivelul ridicat de ROS a fost corelat cu moartea celulară a speciei patogene (13). Un alt efect foarte important al histatinelor mani festat la nivelul cavităţii bucale este acela de rol protector asupra suprafeţelor dentare, prin ab-sorbţia selectivă a hidroxiapatitei. Alături de cele-lalte proteine salivare PRP, staterină), histatinele îm pie dică precipitarea fosfatului de calciu din so-luţiile suprasaturate, având efect de menţinere a su-prafeţei lucioase a dinţilor (23).

Cistatinele sunt proteine care au acţiune inhi-bitorie asupra cisteinpeptidazelor. Acestea sunt un grup de enzime proteolitice care scindează legăturile peptidice prin intermediul unui rest reactiv de

REVISTA ROMÂNÅ DE STOMATOLOGIE – VOLUMUL LVIII, NR. 2, AN 2012136

cisteină la situsul catalitic. Ele sunt implicate în foarte multe reacţii biochimice care sunt corelate atât cu menţinerea stării de sănătate, cât şi cu factorii declanşatori ai diferitelor patologii, de exemplu catepsinele). Activitatea enzimatică a cisteinpepti-dazelor este controlată în mod normal de proteine inhibitoare cum ar fi α 2-macroglobulina şi cistatinele (4). Aceste molecule cu activitate inhibitorie au rolul de a proteja ţesuturile gazdei de procesele pro-teo litice a cisteinpeptidazelor de origine bacteriană, virală sau chiar de cele proprii organismului uman. Cistatinele formează un complex inhibitor cu cis-tein peptidazele, prin inhibiţie la substrat. În unele cazuri, legătura inhibitor-enzimă este foarte pu-ternică, încât inhibiţia poate deveni ireversibilă.

Există patru tipuri de cistatine: tip 1, 2, 3 şi 4 (7). Cistatinele salivare fac parte din tipul 2. Primele studii de izolare a cistatinelor salivare s-au realizat în anul 1986. Atunci au fost identifi cate 3 tipuri de cistatine salivare numite S, care aveau în structura lor 121 resturi de aminoacizi. Cele trei tipuri aveau o structură omoloagă în proporţie de 90%. În plus, 54% din acestă secvenţă era asemănătoare cu a cistatinei C, care a fost identifi cată în fl uidul cere-brospinal şi urină. Studiile din ultimii ani au arătat că saliva conţine cel puţin şapte tipuri de cistatine. Dintre acestea fac parte cistatina SN cu un caracter ne utru), 3 izoforme ale cistatinei cu caracter acid SA şi 3 sau 4 izoforme ale cistatinei cu caracter acid S (19). Cistatinele salivare inhibă activitatea cistein proteazelor şi au un rol important în procesele de mineralizare la nivelul suprafeţei dentare. Reglarea acţiunii proteinazelor produse de bacterii sau endo-gene are o importanţă deosebită în ceea ce priveşte etiologia bolii parodontale. Activitatea inhi bitorie manifestată de cisteina din structura cistatinei se manifestă prin controlul activităţii cisteinpro teina-zelor secretate de diferite specii bacteriene implicate în formarea plăcii dentare. De asemenea, cistatinele salivare sunt implicate în formarea in vivo a peliculei emailate de pe suprafaţa dentară, precum şi în pro-cesele de mineralizare ale acestei suprafeţe (1, 25).

Lizozimul este o proteină de dimensiuni mole-culare mici, cu multe sarcini pozitive şi este prezentă în marea majoritate a fl uidelor organismului uman. Această proteină catalizează hidroliza legăturii β-1,4 glicozidice dintre resturile de acid N-acetil-muramic şi N-acetilglucozamină din structura

pepti doglicanului, polimer care are o structură unică pentru peretele celular bacterian. În urma hidrolizei acestui polimer are loc liza celulară ra-pidă. Lizozimul are rol de barieră protectoare împo-triva colonizării şi infectării cu bacterii patogene (6). Lizozimul este probabil cea mai importantă proteină salivară cu rol de apărare care poate iniţia liza celulelor microbiene, această acţiune având ca efect desprinderea plăcii bacteriene. Astfel, lizo-zimul joacă un rol important în prevenirea acumu-lării plăcii dentare şi a mucoasei orale (18). Con-centraţia crescută a lizozimului salivar a fost aso ciată cu prevalenţa hipertensiunii arteriale, de oarece con-centraţia lizozimului salivar este într-o relaţie directă atât cu patogenitatea de natură infecţioasă, cât şi cu dereglări ale metabolismului glucidic. Având în ve-dere acest fapt, s-a studiat relaţia dintre lizozimul salivar şi procesele pro-infl amatorii implicate în ateroscleroză atât în ceea ce priveşte procesul infecţios, cât şi dereglările metabolice (22) şi rolul lizozimului plasmatic, nivelul acestuia fi ind un biomarker al bolii cardiovasculare (24).

Staterina salivară este o proteină care conţine 43 de resturi de aminoacizi. Capătul N-terminal are caracter polar şi include trei dipeptide care conţin serină, arginină şi acid glutamic. Capătul C-terminal reprezintă 2/3 din moleculă şi are caracter hidrofob, fi ind bogat în glicină, tirozină şi prolină. Cele două resturi de serină de la capătul N-terminal sunt fos-forilate. Staterina are caracter acid şi funcţionează ca un inhibitor al proceselor de cristalizare primare şi secundare a hidroxiapatitei. Această proprietate este determinată de caracterul acid al capătului N-terminal, care cuprinde resturile 1-15 de amino-acizi) care este fosforilat, iar aceasta are ca efect legarea staterinei de hidroxiapatită. În structura acestei proteine, după domeniul cu un caracter acid, urmează o regiune cu caracter bazic care are rol în absorbţia hidroxiapatitei (10, 16, 23). Staterina are capacitatea de a se lega de celulele speciei Fuso-bacterium nucleatum, bacterie care joacă un rol important în colonizarea plăcii dentare, ea repre-zen tând un factor care predispune la iniţierea bolii parodontale (14). De asemenea, a fost studiată ca-pa citatea de adeziune a acestei proteine la diferite specii bacteriene: Actinomyces spp., Prophyromonas gingivalis şi Candida albicans (22). Acestă funcţie este determinată de capătul C-terminal al staterinei,

REVISTA ROMÂNÅ DE STOMATOLOGIE – VOLUMUL LVIII, NR. 2, AN 2012 137

care manifestă o activitate inhibitorie în ceea ce priveşte dezvoltarea diferitelor specii bacteriene. Capătului N-terminal este implicat în menţinerea salivei la un nivel suprasaturat cu calciu şi fosfat pentru mineralizare, precum şi în inhibarea formării calculilor salivari.

Amilaza salivară este o enzimă secretată în prin cipal de glanda parotidă, atât în formă glico-zilată, cât şi sub formă neglicozilată. Această en-zimă catalizează hidroliza legăturii α-1,4 glicozidice din structura amidonului şi glicogenului, activitate enzimatică care este prezentă la ambele forme. pH-ul optim de acţiune al amilazei salivare este 6,8, fi ind activată de prezenţa ionilor de clor. Produşii rezultaţi în urma hidrolizei amidonului sunt glucoza şi maltodextrinele, compuşi care sunt substrate fermentative pentru foarte multe specii bacteriene ce populează cavitatea bucală. Cu excepţia funcţiei digestive, amilaza salivară are şi rolul de a se lega de unele specii bacteriene care se găsesc la nivelul cavităţii orale: Streptococcus gordonii, S. mitis genotip III şi S. oralis (5, 21). Această enzimă se leagă specifi c şi are o afi nitate crescută pentru mai multe specii orale de streptococi, dar nu şi pentru Streptoccocus mutans. Ea a fost identifi cată şi la nivelul peliculei emailate a dinţilor, precum şi în placa dentară.

Mucinele sunt proteine care fac parte dintr-o categorie mare de glicoproteine. Ele sunt compo-

nente multifuncţionale ale secreţiilor cavităţii orale, ale tractului gastrointestinal, ale aparatului respirator şi ale sistemului urogenital. Secreţiile glandelor sub man dibulare şi sublinguale umane conţin o mucină cu greutate moleculară mare numită MG1 > 1.000 kDa) şi o mucină cu greutate moleculară mică 150-200 kDa), MG2. Mucina MG2 este un monomer care prezintă cel puţin 2 forme izomere. Mucinele salivare sunt componente importante ale peliculei vâscoase care acoperă ţesuturile cavităţii orale. Ele formează un strat fi n de mucină, care nu este atacat de acizi sau de enzimele proteolitice. De asemenea, îndeplinesc rolul unei bariere selective care pro tejează ţesuturile orale de potenţiali factori nocivi proveniţi din mediul extern. Mucinele au rol în for marea bolului alimentar, fi ind implicate în lubrifi erea mucoaselor orale, asigură masticaţia, de glutiţia, vorbirea şi participă la formarea siste-melor tampon salivare.

CONCLUZII

Cea mai mare parte a proteinelor care se găsesc în salivă se întâlnesc şi în alte secreţii ale organis-mului uman. La nivelul cavităţii bucale, proteinele salivare îndeplinesc funcţii multiple. Ele au efect antibacterian, antifungic, au rol în fi xarea şi menţi-nerea calciului, în lubrifi erea mucoaselor, iniţierea unor procese digestive etc.

Al-Hashimi I., Levine M.J. 1. – Characterization of in vivo salivary-derived enamel pellicle. Arch. Oral Biol. 1989. 34. 289-295Baev D., Li X., Edgerton M. 2. – Genetically engineered human salivary histatin genes are functional in Candida albicans: development of a new system for studying histatin candidacidal activity. Microb. 2001. 147. 3323-3334Bennick A.3. – Salivary proline-rich proteins. Mol. Cell. Bioche. 1982. 45. 83-89Bobek L.A., Levine M.J. – 4. Cystatins-inhibitors of cysteine proteinase. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1992. 3. 307-332Chandhuri B., Paju S., Haase E.M., Vickerman M.M., Tanzer J.M., 5. Scannapieco F.A. – Amylase-binding protein B of Streptococcus gordonii is an extracellular dipeptidyl-peptidase. Infect. Immun. 2008. 76. 4530-4537 Deckers D.,Vanlint D., Callewaert L., Aertsen A., Michielis C.W.6. – Role of the lysozyme inhibitor Ivy in growth or survival of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa bacteria in HenEgg white and in human saliva and breast milk. Appl. Envir. Microbiol. 2008. 74. 4434-4439

Dickinson D.P.7. – Salivary SD-type) cystatins: over one billion years in the making but to what purpose? Crit. Rev. Oral Biol. Med. 2002. 13. 485-509Fitzgerald D., Coleman D.C., O’Connell B.C.8. – Susceptibility of Candida dubliniensis to salivary histatine 3. Antimicrob. Agent Chemother. 2003. 47. 70-76Gibbons R.J., Haz D.I.9. – Adsorbed salivary acid proline-rich proteins contribute to the adhesion of Streptococcus mutans JBP to apatic surfaces. J. Dent. Res. 1989. 68. 1303-1307Goober R., Goobes G., Shaw W.J., Drobnz G.P., Campbell C.T., 10. Stayton P.S. – Thermodynamic role of basic aminoacids in statherin recognition of hydroxyapatite. Biochem. 2007. 46. 4725-4733Gusman H., Travis J., Helmerhost E.J., Potempa J., Troxler R.F., 11. Oppenheim F.G. – Salivary histatin 5 is an inhibitor of both host and bacterial enzymes implicated in periodontal disease. Infect. Immun. 2001. 69. 1402-1408Helmerhost E.J., Reijnders I.M., van’t Hof W., Simoons-Smit I., 12. Veerman E. C.I., Nieuw Amerongen A.V. – Amphotericin-B and

BIBLIOGRAFIE

REVISTA ROMÂNÅ DE STOMATOLOGIE – VOLUMUL LVIII, NR. 2, AN 2012138

fl uconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrob. Agent Chemother. 1999. 43. 702-704Helmerhost E.J., Troxler R.F., Oppenheim F.G.13. – The human salivary peptide histatine 5 exerts its antifungal activity through the formation of reactive oxygen species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. 98. 14637-14642Johansson I., Bratt P., Hay D-I., Scheeckebier S., Stromberg N. 14. – Adhesion on Candida albicans, but not Candida krusei, to salivary statherin and mimicking host molecules. Oral Microbiol. Immunol. 2000. 5. 112-118Kim H-S., Miller D.D.15. – Proline-rich proteins moderate the inhibitory effect of tea on iron absobtion in rats. J. Nutr. 2005. 135. 532-537Masica D.L., Gray J.J.16. – Solution and adsorbed-state structural ensembles predicted for the statherin-hydroxyapatite system. Biophys. J. 2009. 96. 3082-3091Oppenheim F.G., Xu T., McMillan F.M., Levitz S.M., Diamond R.D., 17. Offner G.D., Troxler R.F. – Histatins, a novel family of histidine-rich proteins in human parotid secretion. Isolation, characterization, primarz structure, and fungistatic effects on Candida albicans. J. Biol. Chem. 1988. 263. 7472-7477Pollock J.J., Lotardo S., Gavai R., Grossbard B.18. – Lysozyme protease-inorganic monovalent anion lysis of oral bacteria strains in buffers and stimulated whole saliva. J. Dent. Res. 1987. 66. 467-474Qvarnstrom M., Janket S., Jones J.A., Nuutienen P., Baird A.E., nunn 19. M.E., Van Dyke T.E., Meurman J.H. – Salivary lysozyme and prevalent hypertantion. J. Dent. Res. 2008. 87. 480-484

Ramasubbu N., Reddy M.S., Bergey E.J., Haraszthy G., Soni S-D, 20. Levine M. J. – Large-scale purifi cation and characterization of the major phosphoproteins and mucins of human submandibular-sublingual saliva. Biochem. J. 1991. 280. 341-352Scannapieco F.A. – 21. Saliva-bacterium interactions in oral microbial ecology. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1994. 5. 203-248Sekine S., Kataoka K., Tanak M., Nagata H., Kawakami T., Akaji K., 22. Aimoto S., Shizeukuishi S. – Active domains of salivarz statherin on apatic surfaces for binding to Fusobacterium nucleatum cells. Microbiol. 2004. 150. 2373-2379Stayton P.S., Drobny G.P., Shaw W.J., Long J.R., Gillbert M.23. – Molecular recognition at the protein-hydroxyapatite interface. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 2003. 14. 370-376Vahitha B., Salam A., Ramrakha P., Krishnan U., Owen D.R., 24. Shalhoulb J., Davies A.H., Tang T.Y., Gillard J.H., Boyle J.J., Wilkins M.R., Edwards R.J. – Identifi cation and assesment of plasma lysozyme as a putative biomarker of atherosclerosis. Artherioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2010. 30. 1027-1033Yao Y., Berg E.A., Costello C.E., Troxler R.F., Oppenheim F.G. 25. – Identifi cation of protein components in human acquired enamel pellicle and whole saliva using novel proteomocs approaches. J. Biol. Chem. 2003. 278. 5300-5308Zakhary G.M., Clark R.M., Bidichandani S.I., Owen W.L., Slayton 26. R.L., Lavine M. – Acidic proline-rich proteins Db and caries in young children. J. Dent. Research. 2007. 86. 1176-1180