monolisa™ anti-hcv plus version 3 1 placă - 96 72340 5 plăci - … · 2015-03-20 · 1...

1

Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 1 placă - 96 72340 5 plăci - 480 72341 KIT DE SCREENING PENTRU ANTICORPI ANTI-HCV (VIRUSUL HEPATITEI C) ÎN PLASMĂ UMANĂ SAU SER PRIN UTILIZAREA TEHNICII IMUNOENZIMATICE

883635 - 2013/09

2

CUPRINS

1. SCOPUL UTILIZĂRII

2. SUMAR ȘI EXPLICAȚIE

3. PRINCIPIILE PROCEDURII

4. REACTIVI

5. AVERTISMENTE ȘI PRECAUȚII

6. PROBE

7. PROCEDURA

8. LIMITĂRILE TESTULUI

9. CARACTERISTICI DE PERFORMANȚĂ

10. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE.

3

1. SCOPUL UTILIZĂRII Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 este un test imunoenzimatic calitativ indirect pentru detectarea infecțiilor cu virusul hepatitei C (HCV) bazat pe detectia anticorpilor anti-HCV în ser sau plasmă umană. Acest test de screening pentru hepatita C poate fi utilizat de laboratoarele de diagnostic și de băncile de sânge. 2. SUMAR ȘI EXPLICAȚIE Virusul hepatitei C (HCV) este un virus cu anvelopă ARN cu sens pozitiv (9.5 kb) din familia Flaviviridae. A fost izolat în 1989 și au fost identificate șase dintre genotipurile majore ale HCV. HCV este recunoscut ca fiind principala cauză a hepatitei virale non-A și non-B. Infecția HCV se caracterizează printr-o formă acută și o formă cronică ce poate conduce la ciroză și la carcinom hepatocelular. Screening-ul principal pentru hepatita C utilizează un test imunoenzimatic ELISA de generația a treia pentru detectarea anticorpilor anti-HCV. 3. PRINCIPIILE PROCEDURII Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 se bazează pe utilizarea unei faze solide preparate cu antigene purificate: trei proteine recombinate din regiunile nestructurale (NS3 și NS4), o peptidă din regiunea structurală (capsida) a virusului hepatitei C; si o fază lichidă (conjugat) ce contine anticorpi de șoarece anti- IgG uman cuplați cu peroxidază. Procedura de testare include următoarele etape de reacție: 1) Diluantul pentru probe (R6) și apoi probele și controalele (R3 și R4) sunt distribuite

în godeurile microplăcii. Dacă anticorpii anti HCV sunt prezenți, atunci aceștia se vor lega la antigenele fixate la faza solidă.

2) După incubarea de o ora la 37°C și o etapă de spălare, este adăugat conjugatul

(R7) ce conține anticorpii anti- IgG uman marcați cu peroxidază. Dacă IgG-ul uman este prezent, în urma reacției cu faza solidă, conjugatul anti- IgG uman se va lega la anticorpii umani.

3) După 30 de minute de incubare la 37°C și îndepărtarea prin spălare a conjugatului

enzimatic nelegat, prezența complexelor antigen-anticorp marcate cu peroxidază este evidențiată prin adăugarea substratului.

4) După 30 de minute de incubare în laborator, la temperatura camerei (18 - 30°C) și

dupa stoparea reacției, citirea va fi realizată cu ajutorul spectrofotometrului la 450/620-700 nm. Absorbanța măsurată pentru o proba permite detectarea prezenței sau absenței în acea proba a anticorpilor HCV pentru hepatita C. Intensitatea culorii este proporțională cu cantitatea anticorpilor HCV legați la faza solidă.

4

4. REACTIVI 4.1. Descriere

Etichetă de identificare Descriere Prezentare/Preparare

72340 72341

R1 Microplate

Microplacă 12 bandelete a câte 8 godeuri fiecare, acoperite cu antigene recombinante purificate (NS3, NS4) și cu o peptidă capsidă HCV. Număr de identificare specific = 94

1 placă Gata de utilizare

5 plăci Gata de utilizare

R2 Concentrated washing solution (20X)

Soluție de spălare concentrată (20X) Soluție NaCl trisaturată pH 7.4 Conservant: ProClin™ 300 (0.04%)

1 fiolă 70 ml

A se dilua

1 fiolă 235 ml

A se dilua

R3 Negative control

Control negativ Soluție tampon Tris- HCI, ce conține Albumină Serică Bovină (BSA) Conservant: ProClin™ 300 (0.1%)

1 fiolă 1 ml Gata de utilizare


R4 Positive control

Control pozitiv Ser uman ce conție anticorpi anti HCV, negativ pentru antigenul HBs și pentru anticorpii anti HIV-1 și anti HIV-2 diluați într-o soluție tampon Tris- HCI ce conține BSA și inactivată fotochimic Conservant: ProClin™ 300 (0.1%)

1 fiolă 1.5 ml Gata de utilizare


R6 Sample diluent Diluant pentru probe Tampon citrat; Culoare violet Conservant: Azidă de sodiu (<0.1%), Cosmocil® CQ (0.025%)


2 fiole 2 x 30 ml Gata de utilizare

R7 Conjugate Conjugat Anticorpi de șoarece anti- IgG umani / Peroxidază; Culoare verde. Conservant: ProClin™ 300 (0.5 %)



R8 Substrate buffer

Substrat Acid citric și soluție de acetat de sodiu, pH 4.0, ce conține H2O2 (0.015%) și dimetil sulfoxid (DMSO) 4%

1 fiolă 60 ml A se reconstitui

2 fiole 2 x 60 ml

A se reconstitui

R9 Cromogen: TMB solution (11X)

Cromogen: Soluție TMB Soluție ce conține 3.3’, 5.5’ tetrametilbenzidină (TMB)

1 fiolă 5 ml A se

reconstitui

2 fiole 2 x 5 ml

A se reconstitui

R10 Stopping solution

Soluție de stopare Soluție de acid sulfuric 1N



5

4.2. Condițiile de conservare și manipulare Kitul va fi păstrat la +2-8°C. Fiecare componentă a kitului va fi păstrată la o temperatură de +2-8°C și poate fi utilizată până la data de expirare indicată pe ambalaj (cu excepția cazului în care este specificat altfel). După deschidere și în absența contaminării, reactivii R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 și R10 conservați la 2-8°C pot fi utilizați până la data de expirare indicată pe etichetă. Identificare Conservare R1 După deschiderea ambalajului vacuumat, bandeletele cu godeuri vor fi

depozitate la o temperatură de +2-8°C și pot fi utilizate timp de 1 lună dacă sunt păstrate în ambalajul original, bine închis.

R2 Soluția de spălare diluată poate fi depozitată la o temperatură de +2-30°C timp de 2 săptămâni. Soluția de spălare concentrată (R2) poate fi depozitată la o temperatură de +2-30°C.

R8 + R9 După reconstituire, reactivii depozitati la întuneric pot fi utilizați timp de 6 ore la temperatura camerei (18-30°C).

5. AVERTISMENTE ȘI PRECAUȚII A se utiliza pentru diagnosticarea in vitro de către un cadru medical. 5.1. Precauții cu privire la sănătate și siguranță: • Acest kit de testare va fi manipulat numai de personal calificat, instruit cu privire la

procedurile de laborator și familiarizat cu potențialele pericole. Purtați îmbrăcăminte de protecție adecvată, mănuși, protecție pentru ochi/față și manipulați adecvat, conform Bunelor Practici de Laborator.

• Kitul de testare conține componente sanguine umane. Materialul de origine umană

utilizat la prepararea reactivului R4 (Control Pozitiv) a fost testat și a fost găsit nereactiv la antigenii de suprafață pentru hepatita B (HBs Ag) și la anticorpii împotriva Virușilor Imunodeficienței Umane (HIV-1 și HIV-2) și pozitiv pentru anticorpii anti-HCV. Controlul pozitiv R4 este inactivat prin încălzire. Nicio metodă de testare cunoscută nu poate oferi asigurări complete cu privire la absența agenților infecțioși. Prin urmare, toate derivatele din sânge uman, reactivii și probele de origine umană, vor fi manipulate ca și cum ar prezenta potențial de risc infecțios, cu respectarea Precauțiunilor Universale recomandate pentru agenții patogeni transmisibili prin sânge, după cum sunt acestea definite prin reglementările locale, regionale și naționale.

• Scurgeri biologice: Scurgerile de material de origine umana vor fi tratate ca având

potențial infecțios. Scurgerile care nu conțin acid vor fi decontaminate imediat, inclusiv zona de deversare, materialele și orice suprafețe sau echipamente contaminate, cu un dezinfectant chimic adecvat ce este eficient în cazurilor riscurilor biologice aferente probelor implicate (în mod obișnuit o diluție de înălbitor de uz casnic 1:10, 70-80% etanol sau izopropanol, un iodofor [prescum 0.5% Wescodyne™ Plus, etc.), și vor fi șterse până la uscare completă.

6

Scurgerile care conțin acid ar trebui să fie absorbite în mod adecvat (șterse) sau neutralizate, iar zona spălată cu apă și ștearsă până la uscare completă; materialele utilizate pentru absorbția scurgerilor pot necesita eliminare în calitate de deșeuri cu risc biologic. Apoi zona va fi decontaminată cu unul dintre dezinfectanții chimici.

ATENȚIE: În autoclavă nu vor fi plasate soluții ce conțin înălbitor! • Aruncați toate probele și materialele utilizate pentru efectuarea testului ca și cum

acestea ar conține agenți infecțioși. Deșeurile de laborator, chimice și cu risc biologic trebuie să fie manipulate și eliminate conform reglementărilor locale, regionale și naționale.

• Pentru recomandările și precauțiunile aferente anumitor componente chimice din

kitul de testare vă rugăm să consultați pictograma(ele) menționate pe etichete și informațiile furnizate la finalul instrucțiunilor de utilizare. Fișa de Siguranță (FS) este disponibilă pe www.bio-rad.com.

5.2. Precauții legate de protocol 5.2.1. Preparare Exactitatea rezultatelor depinde de implementarea corectă a următoarelor Bune Practici de Laborator: • Nu utilizați reactivi expirați. • Nu amestecați și nu asociați reactivi din loturi diferite în cadrul aceleiași runde de

testare. • Înainte de utilizare așteptați timp de 30 minute pentru ca reactivii să se stabilizeze

la temperatura camerei (18-30°C). • Denumirea testului, precum și numărul specific de identificare a testului, sunt

notate pe rama fiecărei microplăci. De asemenea, acest număr de identificare specific este menționat și pe fiecare bandeletă.

Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3: Număr de identificare specific = 94 Înainte de utilizare verificați numărul specific de identificare. Dacă numărul de

identificare lipsește sau este diferit de numărul specificat, corespunzător testării ce urmează a fi efectuate, atunci bandeleta nu va fi utilizată.

OBSERVAȚIE: Pentru soluția de spălare (R2, etichetă identificare: 20X culoare

verde), tampo substrat peroxidază (R8, etichetă identificare: tampon TMB, culoare albastră), cromogen (R9, etichetă identificare: TMB 11X, culoare violet) și soluție de stopare (R10, etichetă identificare: 1N culoare roșie), este posibilă utilizarea altor loturi decât cele conținute în kit, cu condiția ca în cadrul unei runde de testare să fie utilizat același lot. Acești reactivi pot fi utilizați cu câteva alte produse ale companiei noastre. Vă rugăm să contactați serviciul nostru tehnic pentru informații detaliate.

• Reconstituiți reactivii cu atenție, evitând contaminarea de orice fel. • Utilizați materiale din sticlă, bine spălate și clătite cu apă deionizată sau,

preferabil, utilizați materiale de unică folosință. • Nu permiteți uscarea plăcii în intervalul de timp dintre sfârșitul operațiunii de

spălare și distribuirea reactivilor.

7

• Reacția enzimatică este foarte sensibilă la ionii metalici. În consecință, nu permiteți niciunui element metalic să intre în contact cu diversele soluții de conjugat sau de substrat.

• Soluția de developare (tampon substrat + cromogen) trebuie să fie colorate în roz. Modificarea acestei culori roz la câteva minute după reconstituire indică faptul că reactivul nu poate fi utilizat și trebuie să fie înlocuit.

Soluția de developare poate fi preparată într-o tavă de plastic curată, de unică folosință, sau într-un recipient de sticlă ce a fost mai întâi prespălat cu 1N HCl clătit bine cu apă distilată și uscat. Acest reactiv va fi depozitat la întuneric.

• Nu utilizați niciodată același recipient pentru a distribui conjugatul și soluția de developare.

5.2.2. Prelucrare • Nu modificați procedura de testare. • Nu efectuați testul în prezența vaporilor reactivi (acizi, alcalini, aldehide) sau a

prafului ce ar putea modifica activitatea enzimatică a conjugatului. • Utilizați un nou vârf pentru pipetarea fiecarei probe. • Spălarea godeurilor este un pas esențial în cadrul procedurii: respectați numărul

recomandat de cicluri de spălare și asigurați-vă că toate godeurile sunt complet umplute și apoi că sunt golite complet. Spălarea incorectă poate conduce la rezultate eronate.

• Respectați cu strictețe procedurile de spălare descrise pentru a obține cele mai înalte peformanțe de testare. În cazul anumitor instrumente, ar putea fi necesară optimizarea procedurii de spălare (creșterea numărului de cicluri de pași de spălare și/sau a volumului de tampon de spălare pentru fiecare ciclu) pentru a obține un nivel acceptabil de densitate optică de fundal pentru probele negative.

• În cazul în care sunt necesare adaptari sau proceduri speciale vă rugăm să ne contactați.

6. PROBE Prelevați o probă de sânge conform practicilor curente. Testul va fi realizat pe ser sau plasmă nediluate (prelevate pe litiu heparinat EDTA , Citrat de Sodiu sau ACD). Probele ce conțin agregate vor fi purificate prin centrifugare înainte de testare. Particulele de fibrină sau agregatele suspedate pot determina rezultate fals pozitive. Probele vor fi depozitate la o temperatură de +2-8°C dacă testul este efectuat în termen de 7 zile sau pot fi congelate la -20°C. A nu se repeta mai mult de 3 cicluri de congelare/decongelare. Probele vor fi decongelate la temperatura camerei (18-30°C). Înainte de utilizare se recomandă omogenizarea acestora prin răsturnare. Probele cu un conținut de albumină mai mare de 120 g/l, cu un conținut de bilirubină 200 mg/l, probele ce conțin până la 33 g/l de trioleină și probele ce conțin până la 2 g/l de hemoglobină nu afectează rezultatele. Cu toate acestea, nu este recomandată utilizarea probelor contaminate hiperlipemice și hiperhemolizate. Dacă este necesară transportarea probelor, acestea vor fi împachetate conform reglementărilor în vigoare cu privire la transportul agenților etiologici și de preferință în condiții de congelare. Nu este recomandată încălzirea probelor.

8

7. PROCEDURA 7.1. Materiale necesare, dar care nu sunt furnizate • Apă distilată. • Hipoclorit de sodiu (înălbitor de uz casnic) și bicarbonat de sodiu. • Hârtie absorbantă. • Pelicule adezive. • Mănuși de unică folosință. • Ochelari de protecție. • Eprubete de unică folosință. • Pipete sau multipipete automate sau semiautomate, reglabile sau fixe pentru

măsurarea și distribuirea de volume de 50 μl, 80 μl, 100 μl, 200 μl și 1 ml. • Cilindri gradați cu capacitate de 10 ml, 200 ml și 1000 ml. Agitator de tip Vortex. • Spălător de microplăci automat, semiautomat sau manual. • Baie de apă, sau un incubator pentru microplăci echivalent, reglată la 37°C ± 1°C

(*). • Recipient pentru deșeuri cu risc biologic. • Cititor de microplăci dotat cu filtre de 450, 490 nm and 620-700 nm (*). (*) Vă rugăm să ne consultați pentru informații detaliate cu privire la echipamentul

recomandat de departamentul nostru tehnic. 7.2. Tipuri de reactivi 7.2.1. Reactivi gata de utilizare Reactiv 1 (R1): Microplacă Fiecare ramă suport ce conține 12 bandelete este împachetată într-un ambalaj de aluminiu sigilat. Tăiați ambalajul cu foarfeca sau cu bisturiul pe o lungime de 0.5 până la 1 cm deasupra sigiliului. Deschideți ambalajul și scoateți rama. Introduceți bandeletele neutilizate înapoi în ambalaj. Închideți ambalajul bine și depozitați-l corespunzător la o temperatură de +2-8°C. Reactiv 6 (R6): Diluant pentru probe A se omogeniza prin răsturnare înainte de utilizare Reactiv 7: Conjugat (R7) A se omogeniza prin răsturnare înainte de utilizare 7.2.2. Reactivi pentru reconstituire Reactiv 2 (R2): Soluție de spălare concentrată (20X) Diluați 1:20 în apă distilată pentru a obține soluția de spălare gata de utilizare. Preparați 800 ml pentru o placă de 12 bandelete. Reactiv 8 (R8) + Reactiv 9 (R9): Soluție pentru developare enzime Diluați 1:11 cromogen (R9) în Tamponul pentru Substrat (ex. 1 ml reactiv R9 + 10 ml de reactiv R8) întrucât sunt necesari și suficienți 10 ml pentru tratarea a 12 bandelete. Omogenizați.

9

7.3. Procedura de testare Procedura va fi respectată cu strictețe. A se utiliza seruri de control pozitiv și negativ pentru fiecare test pentru validarea calității testului. Vor fi respectate următoarele bune practici de laborator: 1. Stabiliți cu atenție distribuirea și planul de identificare al probelor. 2. Preparați soluția de spălare diluată R2. (vezi § 7.2) 3. Scoateți rama suport și numărul de bandelete necesar din ambalajul de protecție

(R1). Introduceți bandeletele neutilizate înapoi în ambalaj. Închideți ambalajul și depozitați-l la o temperatură de +2-8°C.

4. Distribuiți în godeuri în următoarea ordine (distribuire recomandată a placii): • 100 µl de diluant eșantion (R6) în fiecare godeu, apoi • 50 µl de control negativ (R3) in A1, • 50 µl de control pozitiv (R4) in B1, C1, D1, • 50 µl din prima probă în E1, • 50 µl din a doua probă în F1, etc.

Omogenizați amestecul cu cel puțin 3 aspirații sau cu un agitator pentru microplaci timp de 5 secunde. Dacă distribuirea eșantioanelor durează mai mult de 10 minute, este recomandată distribuirea controalelor pozitive și negative după eșantioanele ce ce urmează a fi testate.

În funcție de sistemul utilizat, puteți regla poziția sau ordinea de distribuire a controalelor.

OBSERVAȚIE: După distribuirea eșantioanelor, godeul ce conține eșantionul

(sau controlul) va căpăta o culoare violet, până la albastru. Este posibilă verificarea prezenței eșantionului în godeuri prin citire spectrofotometrică la 620 nm (vezi § 7.7).

5. Atunci când este posibil, acoperiți placa cu o nouă peliculă adezivă. 6. Incubați microplaca timp de 60 minute (± 5 min.) la 37°C ± 1°C. 7. Dacă este necesar, îndepărtați pelicula adezivă. Aspirați conținutul tuturor

godeurilor într-un recipient pentru deșeuri lichide și adăugați cel puțin 0,370 ml de soluție de spălare în fiecare godeu. Aspirați din nou și repetați spălarea de cel puțin 4 ori (vor fi realizate 5 spălări în total). Volumul rezidual trebuie să fie mai mic de 10 μl (dacă este necesar, uscați bandeletele prin pozitionare cu gura în jos pe hârtie absorbantă).

Dacă dispuneți de un spălător automat, respectați acelați ciclu de operare. 8. Distribuiți rapid 100 μl de soluție conjugat (R7) în fiecare godeu din cadrul plăcii. Agitați conjugatul înainte de utilizare. Dacă este posibil, acoperiți din nou, cu o

nouă peliculă, și incubați timp de 30 minute (± 5 min.) la 37°C ± 1°C. OBSERVAȚIE: Conjugatul are culoarea verde. Este posibilă verificarea prezenței

conjugatului în godeuri prin citire spectrofotometrică la 620 nm (vezi § 7.7). 9. Dacă este necesar, îndepărtați pelicula adezivă, goliți toate godeurile prin

aspirare și spălați de cel puțin 5 ori, după cum este descris mai sus. 10. Preparați soluția pentru developarea enzimelor (reactiv R8 + R9). 11. Distribuiți rapid 80 μl de soluție pentru developarea enzimelor (R8 + R9) în toate

godeurile. Permiteți poducerea reacției la întuneric timp de 30 minute (± 5 min.) la temperatura camerei (18 - 30°C). Nu utilizați peliculă adezivă în timpul acestei incubații.

10

OBSERVAȚIE: Distribuirea soluției de developare, de culoare roz, poate fi controlată vizual. (vezi § 7.7).

12. Adăugați 100 μl de soluție de stopare (R10) în aceeași ordine și în acelați ritm de

distribuire ca și în cazul soluției de developare. OBSERVAȚIE: Distribuirea soluției de stopare incolore poate fi controlată vizual

în această etapă de manipulare. Culoarea substratului, roz (în cazul eșantioanelor negative) sau albastru (în cazul eșantioanelor pozitive), dispare din godeuri, care devin incolore (în cazul eșantioanelor negative) sau galbene (în cazul eșantioanelor pozitive) după adăugarea soluției de oprire.

13. Ștergeți cu atenție baza fiecărei plăci. Așteptați cel puțin 4 minute după

adăugarea soluției de oprire, în termen de 30 de minute de la oprirea reacției, citiți densitatea optică la 450/620-700 nm utilizând un cititor de plăci.

14. Asigurați-vă de concordanța dintre citirea spectrofotometrică și citirea vizuală a plăcii, distribuirea și planul de identificare al probelor.

7.4. Control de calitate Utilizați controale pozitive (R4) și control negativ (R3) la fiecare efectuare a testului pentru validarea testării. (vezi §7.5). 7.5. Criterii de validare a testului Acest test este validat dacă sunt respectate condițiile de mai jos: 1. Pentru controlul negativ R3: Valoarea de absorbanță măsurată trebuie să nu fie mai mică decât 60% Valoarea cut-off: DO. < valoare cut-off x 0.6 2. Pentru anticorpii control pozitiv R4: 0,800 ≤ Medie DO. R4 ≤ 2,700 Dacă una dintre valorile individuale ale controlului pozitiv R4 diferă cu mai mult de 30% de valoarea medie, atunci nu luați în considerare valoarea și repetați calculul utilizând cele două valori de control pozitiv rămase. 7.6. Calcularea/interpretarea rezultatelor Valoarea cutoff este determinată cu controlul pozitiv R4: Calculați valoarea de absorbanță medie pentru controlul pozitiv R4. Calcularea Valorii cutoff (CO): CO= Medie DO R4 X0.4 Prezența sau absența anticorpilor anti-HCV este determinată prin calcularea absorbanței înregistrate la valoarea cutoff calculată pentru fiecare proba. Pentru fiecare proba se calculează următorul raport: Raport = DO a probei / Valoarea cutoff (CO) Probele cu o densitate optică mai mică decât valoarea cut-off sunt considerate a fi negative (raport < 1) cu Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3.

11

Rezultatele aflate imediat sub valoarea cut-off (CO-10 % < O.D. < CO, raport între 0.9 și 1) ar trebui, însă, să fie interpretate cu atenție. Este recomandată retestarea, în dublu exemplar, a probelor corespunzătoare atunci când sistemele și procedurile de laborator o permit. Probele cu o densitate optică mai mare sau egală cu valoarea cut-off (raport ≥ 1) sunt considerate a fi inițial pozitive de Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. Acestea ar trebui retestate în dublu exemplar înainte de interpretarea finală. Dacă după restestare valoarea raportului a cel puțin unuia dintre cele două duplicate este mai mare sau egală cu 1, atunci rezultatul inițial este repetabil și proba este declarat pozitiva cu Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. Dacă valorile raportului celor două duplicate sunt mai mici decât 1, atunci rezultatul inițial este nerepetabil, iar proba este declarat negativa. Probele care au fost retestate de două ori și au fost considerate negative cu Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3, dar cu o valoare apropiată de valoarea limită (raport între 0.9 și 1) vor fi examinate cu atenție. Este recomandată retestarea pacientului printr-o altă metodă sau a unei alte probe. În cazul unei densități optice foarte scăzute corepunzătoare probelor testate (DO negativă) și atunci când este controlată prezența probelor și a reactivului, rezultatele pot fi interpretate ca fiind negative. Este recomandată confirmarea probelor pozitive respectând algoritmii și recomandările naționale curente. 7.7. Verificarea spectrofotometrică a pipetării probei și a a conjugatului (opțional) Diluantul de proba (R6) și verificarea pipetării probei în timpul primei etape: Prezența simultană a (R6) și a eșantionului (sau a controlului) poate fi verificată printr-o citire spectrofotometrică la 620 nm. Fiecare godeu ce conține simultan (R6) și o proba (sau un control) trebuie să aibă o densitate optică mai mare de 0.800. OBSERVAȚIE: după adăugarea probei (R6) capătă culoarea violet până la albastru. Verificarea pipetării conjugatului (R7) în timpul primei etape OBSERVAȚIE: conjugatul (R7) are culoarea verde. Prezența conjugatului (R7) în godeuri poate fi controlată prin citire automată la 620 nm. Valoarea DO corespunzătoare fiecărui godeu trebuie să fie mai mare decât 0,300 (în mod obișnuit, o valoare mai mică decât aceasta indică o distribuire necorespunzătoare a conjugatului). Verificarea pipetării soluției de developare Este posibilă verificarea prezenței în godeu a soluției de developare roz prin citire automată la 490 nm. Un godeu cu soluție de developare trebuie să aibă o densitate optică mai mare decât 0,100 (o DO mai mică indică o distribuire necorespunzătoare a soluției de developare) Godeurile goale își modifică semnificativ culoarea de la incolor la roz după adăugarea soluției de substrat cromogen preparate.

12

8. LIMITĂRILE TESTULUI Ca urmare a reacțiilor imunologice diferite ale pacienților infectați cu virusul hepatitei C (în special în timpul seroconversiilor), pot fi observate unele diferențe de detectie între teste, în funcție de tipul de proteine antigenice utilizate. Prin urmare, un rezultat negativ în timpul unui test de screening nu exclude posibilitatea expunerii la infecția cu virusul hepatitei C. Conform literaturii de specialitate, purtătorii de HCV supuși unui tratament imunosupresor sau coinfectați cu HIV-HCV pot prezenta niveluri deosebit de scăzute de anticorpi, sub limita de detectare a testelor HCV. Orice tehnică ELISA poate produce reacții fals pozitive. Este recomandată verificarea specificității reacției oricărei probe care este identificat a fi repetat pozitiva conform criteriilor de interpretare ale kitului Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3, utilizând o metodă adecvată: un test ELISA de screening al anticorpilor anti-HCV sau un test imunoblot de detectie a anticorpilor anti-HCV pentru a dovedi prezența anticorpilor anti-HCV. Dacă este necesar, utilizați un test de biologie moleculară pentru a verifica prezența genomului HCV. Metoda colorimetrică pentru verificarea depunerii probelor și/sau conjugatului și/sau soluției de developare nu permite verificarea exactității volumelor de distribuire și evidențiază numai prezența probei și/sau a conjugatului si/sau a soluției de developare. Rata de răspunsuri eronate cu această metodă se află în strânsă legătură cu exactitatea sistemului utilizat (acumularea de CV-uri ale pipetărilor și citiri mai mari de 10% pot reduce semnificativ calitatea verificării). Utilizarea testului Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 nu este aprobată pentru probe cumulate (pooled) sau pentru probele diluate. In mod excepțional, pot fi văzute particule fine în diluantul pentru probe (R6), însă prezența acestora nu modifică calitatea reactivului. 9. CARACTERISTICI DE PERFORMANȚĂ 9.1. Măsurarea preciziei Reproductibilitatea și precizia intermediară au fost determinate prin utilizarea de probe cu concentrații de anticorpi anti-HCV diferite. Probele au fost testate de 30 de ori în timpul aceleiasi serii de testări pentru a fi determinată repetabilitatea. De asemenea, probele au fost testate în două replicate timp de 20 de zile, câte 2 teste pe zi. Au fost calculate valoarea medie a raportului, deviațiile standard și Coeficienții de Variație (CV).

13

9.1.1. Repetabilitate

Probe N Medie raporturi Deviatie standard CV %

Negative 30 0.12 0.006 4.5 Slab pozitive

anti-HCV 30 1.29 0.059 4.6

Slab pozitive anti-HCV 30 1.33 0.112 8.4

Puternic pozitive anti-

HCV 30 3.60 0.191 5.3

Coeficienții de variație obținuți pe probele pozitive sunt mai mici de 10%. 9.1.2. Precizie intermediară

Probe N Medie raporturi

Intra testare

Inter testare/operator Inter zile Reproductibilitate

totală

SD CV % SD CV % SD CV

% SD CV %

Negative 120 0.13 0.009 7.3 0.011 8.5 0.005 3.9 0.015 11.8 Slab pozitive anti-

HCV 120 1.40 0.053 3.8 0.119 8.5 0* N.A 0.130 9.3

Slab pozitive anti-HCV 120 1.48 0.082 5.6 0.120 8.1 0* N.A 0.145 9.8

Puternic pozitive anti-HCV 120 3.57 0.141 4.0 0.173 4.8 0* N.A 0.223 6.2

* Valoarea de variație negativă este estimată la 0. Coeficienții de variație obținuți pe probele pozitive sunt mai mici de 15%. 9.2. Performanțe clinice Performanțele Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 au fost determinate prin testarea probelor provenite de la donatori de sânge aleatori, de la pacienți spitalizați, de la pacienți cu infecții acute și cronice cu virusul hepatitei C, precum și de la pacienți cu semne clinice fără legătură cu infecția cu virusul hepatitei C. Studiile au fost realizate cu donatori de sânge din două locații, într-un spital și într-o locație Bio-Rad. 9.2.1. Specificitatea diagnosticului Studiul a fost realizat pe probe EDTA de ser și plasmă prelevate din două centre de donatori, de la donatori aleatori. De asemenea, a fost realizat un studiu de specificitate pe probele provenite de la pacienții spitalizați. Toate probele au fost testate cu testul anti-HCV marcat CE.

14

Tabelul 1: Testul de specificitate

Populație Locație Tip eșantion Număr Probe inițial

reactive (IR)

Probe repetat reactive

(RR)

Specificitate (%) Interval de încredere

95%

Donatori sânge

#1 ser* 2641* 2 2 2636/2638

#2 ser 537 1 1 536/537

plasmă 2002 4 1 2001/2002

#1 + #2 5180* 7 4 99.92%

5173/5177 99.80 – 99.98

Pacieni spitalizați #3 ser 502 0 0

100% 502/502 99.30 – 100.00

* 3 donatori cu rezultat nedeterminat in testul de referință au fost omiși din calcule. 9.2.2. Sensibilitate de diagnostic Sensibilitatea de diagnostic a fost studiată pe 559 probe provenind de la pacienți infectați cu virusul hepatitei C, dintre care 465 reprezentanți de genotipuri diferite(1, 2, 3, 4, 5, 6). Dintre acestea, 25 probe au fost prelevate de la pacienți cu 24 de ore înainte de efectuarea analizei. Tabelul 2: Genotipuri testate

Genotipuri 1

(1, 1a, 1a/b, 1b)

2 (2, 2a/c, 2a, 2b, 2b/3)

3 (3, 3a, 3b,

3c)

4 (4, 4a, 4a/c,

4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r)

5 (5, 5a)

6 (6, 6a,

6a/b, 6n) Total

N 230 51 107 63 8 6 465 Sensibilitatea diagnosticului pentru toate probele testate este 100% (559/559) cu un interval de încredere de 95% din [99.3-100%]. Probe ce provin de la pacienți cu infecție acută: De asemenea, a fost studiată sensibilitatea clinică pe 38 de paneluri de seroconversie comerciale (inclusiv 9 profiluri capsidă, 10 profiluri NS3 și 19 profiluri multiple) și a fost comparată cu un test de referință marcat CE. Dintre aceste 38 de seroconversii, 1 panel nu a fost detectat cu testul Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 sau cu testul de comparație. Pe cele 37 de paneluri detectate cu Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3, 11 seroconversii au fost detectate mai devreme, 25 au generat o detectie echivalentă, iar unul a rezultat intr-o proba întârziata. 9.3. Specificitate analitică/Studiu de reactivitate încrucișată 283 probe cu posibile interferente conținand anticorpi împotriva agenților patogeni ce ar putea duce la boli infecțioase (citomegalovirus, virusul Epstein Barr, VZV, virusul rujeolic, virusul rubeolei, virusul urlian, virusul herpes, virusul gripal, virusul hepatitei A, virusul hepatitei B, HIV 1/2, HTLV 1/2, sifilis, Toxoplasma gondii, Dengue,

15

Chagas), probe din grupul de risc (pacienți dializați, care suferă de ciroză non-hepatică, femei însărcinate, femei multipare) sau probe provenind de la pacienți cu tulburări de sistem imunitar (autoanticorpi, factor reumatoid, anticorpi anti-șoarece și mieloame) au fost testate cu testul Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. Nicio probă nu a fost găsită pozitivă cu testul Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. Specificitatea observată pe această populație țintă de 100% (283/283), a fost similară cu specificitatea probelor clinice. 9.4. Efectul cârlig Existența unui posibil efect cârlig a fost studiată prin testarea a 5 probe cu titruri ridicate la diluții diferite. Echivalența rezultatelor observate între probele nediluate și probele diluate indică absența efectului cârlig.

16

10. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE • ALBORINO F., BURIGHEL A., TILLER F.W., VAN HELDEN J., GABRIEL C.,

RAINERI A., CATAPANO R., STEKEL H. Multicenter evaluation of a fully automated third-generation anti-HCV antibody

screening test with excellent sensitivity and specificity. Med. Microbiol. Immunol. 2011, 200: 77–83. • BHARTIA A.R., LETENDREA S.L., WOLFSONA T. Clinical variables identify seronegative HCV co-infection in HIV-infected

individuals. J. of Clin. Virol. 2011, 52: 328–332. • CHEN-JI H., HWEI-LING P., CHIH-YU C. Improving Antigenicity of the Recombinant Hepatitis C Virus Core Protein via

Random Mutagenesis. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 2011: 359042. • CHING W.M., WYCHOWSKY C., BEACH M.J., WANG M., DAVIES C.L., CARL

M., BRADLEY D.W., ALTER M.S., FEINSTONE S.M., WAI-KUO SMIM J. Interaction of immune sera with synthetic peptides corresponding to the structural

protein region of hepatitis C virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, April 1992, 89: 3190-3194. • CHOO Q.L., RICHMAN K.H., HAN J.H., BERGER K., LEE C., DONG C.,

GALLEGOS C., COIT D., MEDINA-SELBY A., BARR P.J., WEINER A.J., BRADLEY D.W., KUO G. and HOUGHTON M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus.

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88: 2451-2455. • EASL EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection.

Journal of Hepatology. 2011, 55(2): 245-64. • NASOFF M.S., ZEBEDEE S.L., INCHAUSPE G., PRINCE A.M. Identification of an immudominant epitope within the capsid protein of hepatitis C

virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, June 1991, 88: 5462-5466. • RIDER P.J. and LIU F. Crosstalk between HIV and hepatitis C virus during co-infection. BMC Medicine.

2012, 10: 32. • Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and

treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39: 1147-1171.

• WIDELL A., BUSCH M. Exposed or not exposed - that is the question: evidence for resolving and abortive

hepatitis C virus infections in blood donors. Transfusion. 2009, 49: 1277-1281. • ZACHARY P., ULLMANN M., DJEDDI S., WENDLING M.-J., SCHVOERER E.,

STOLL-KELLER F., GUT J.-P. Evaluation of two commercial enzyme immunoassays for diagnosis of hepatitis C

in the conditions of a virology laboratory. Pathologie Biologie, 2004, 52 (2004): 511–516.

monolisa™ anti-hcv plus version 3 1 placă - 96 72340 5 plăci - … · 2015-03-20 · 1...

Documents