Comportamentul mioglobinei în diferite

medii de pH prin spectroscopie UV-vis

Pălăcean (Muntean) Ioana Mirela IMPM II

1.Introducere

Mioglobina este o proteină globularǎ formatǎ dintr-un singur lanț de 154 de

aminoacizi conținând o grupare hem înfasurat de o apoproteină. Este format din opt alfa-

helixuri și un miez hidrofob.

Hemoglobina (care conţine fier) este transportorul de oxigen în sângele animalelor,

iar mioglobina asigură stocarea oxigenului.

Printre proteinele transportoare de oxigen se numără: hemoglobina (Hb),

mioglobina (Mb), citoglobina (Cgb), neuroglobina (Ngb).

Partea responsabilă de legarea oxigenului în globine este un centru de fier coordinat

de porfirină şi care este denumit hem (Figura 1).

Fig. 1 Hemul

Structura tridimensională a hemului. Ionul de Fe++ este reprezentat de sfera gri

centrală; N albastru O roşu, C bleu H alb

În procesele respiratorii, oxigenul este legat de către hemoglobină în plămâni,

transportat prin sânge până la muşchi, unde este cedat mioglobinei, pentru a fi depozitat şi

utilizat.

2. Materiale şi metode

Pentru a determina comportamentul mioglobinei în diferite medii, s-a ales ca

metodă de investigare spectrometria UV-vis. Această metodă este aplicabilă deoarece

mioglobina absoarbe în acest domeniu, datorită posibilităţii tranziţiilor electronice π-π*, din

învelişul proteic, respectiv din hem (datorită legăturilor duble conjugate), şi a tranziţiilor

electronice metal-ligand.

Domeniul util de colectare a spectrelor UV-vis este 260-800 nm, observându-se un

maxim în jur de 280 nm, datorat materialului proteic, mai exact aminoacizilor aromatici.

De asemenea mioglobina prezenta un maxim de absorbţie la aproximativ 407-409 nm

bandă numită Soret sau γ şi în domeniul Vis două benzi datorate tranziţiilor metal-ligand.

Colectarea spectrelor se face în soluţii diluate, pentru a se încadra în condiţiile de

liniaritate a legii Lambert-Beer, însă concentraţia trebuie să fie suficient de mare pentru a

obţine un spectru clar, cu absorbanţele cuprinse în intervalul 0.1-1 unităţi.

Etapele sunt:

Se prepară soluţii tampon pentru valorile de pH 2-13.

Se pregăteşte o soluţie – stoc de mioglobină

Se înregistrează spectrele UV-vis ale mioglobinei ferice în domeniul de pH

2-13

Se explică diferenţele (sau lipsa lor) între spectrele de mai jos, şi se

calculează valoarea pKa

Prepararea soluţiilor tampon

În cadrul experimentelor efectuate în decursul laboratorului, s-a utilizat mioglobină

ferică din inimă de cal şi următorii reactivi: acetat de sodiu, fosfat de potasiu, citrat de

sodiu CAPS.

S-au preparat soluţii tampon de concentraţie 0.2 M (200 mM) şi pH=2-13.

Soluţiile tampon se prepară în apă de cea mai înaltă puritate posibilă.

Soluţiile astfel obţinute, se etichetează şi se păstrează în sticle, de preferinţă închise

la culoare şi la rece. Înainte de a fi folosite, trebuie aduse la temperatura camerei.

Prepararea soluţiei de mioglobină

Pentru metaloproteinele din clasa mioglobinei se recomandă păstrarea în stocuri de

1-5 mM, dacă sunt în soluţie.

Într-un tub Eppendorf s-a preparat aproximativ 1,5 ml soluţie stoc de mioglobină,

dizolvând proteina în apă într-un volum egal de apă. Agitarea soluţiei s-a realizat cu grijă

pentru a evita denaturarea proteinei. Soluţia de mioglobină se pastreaza la rece.

Înregistrarea spectrelor UV-vis ale mioglobinei ferice

Pentru înregistrarea spectrelor, a fost nevoie de un spectru UV-vis, o cuvă de 1 ml,

pipete de tip Eppendorf cu volum reglabil şi soluţiile tampon preparate la pH-uri de: 2-13.

Înainte de colectarea spectrelor, aparatul a fost calibrat cu etalonul de soluţie

tampon de pH corespunzător fiecărei probe. După calibrarea aparatului au fost adăugaţi în

cuvă 10 μl de mioglobină. Concentraţia mioglobinei în cazul fiecărei probe a fost aceeaşi.

Colectarea spectrelor s-a făcut în soluţii diluate, pentru a se încadra în condiţiile de

liniaritate a legii Lambert-Beer. La lungimea de undă maximă λ, s-a citit absorbanţa

soluţiei; aplicându-se legea lui Lambert-Beer:

A=ε*l*c,

Înainte de a înregistra orice spectru, trebuie să facem linia de zero a aparatului cu o

soluţie tampon sau apă, aceasta fiind soluţia blanck. Astfel, injectăm în cuvă soluţia tampon

pentru pH=6, pe care o aşezăm în spectrometru şi înregistrăm spectrul. Extragerea probelor

din soluţiile stoc s-a făcut de fiecare dată cu un vârf de pipetă nou de tip Eppendorf.

Rezultatele au fost prelucrate în Excel.

3. Rezultate şi discuţii

Influenţa pH-uluiLa pH-uri mici se observă o scădere bruscă a absorbanţelor, ceea ce ne indică

denaturarea proteinei. În cazul acestor probe, concentraţiile relativ mari de protoni 10 -1 –

10-4 M, afectează legăturile de hidrogen intramoleculare care se rup, distrugând structura

terţiară a proteinei. Odată cu creşterea pH-ului şi implicit scăderea excesului de protoni din

soluţie, legăturile dintre lanţurile de aminoacizi nu mai sunt afectate de prezenţa H+. În

acest caz, intensitatea benzii Soret înregistrată este in jurul valorii de 400nm . In (figura 2)

Fig. 2 Spectre UV-vis ale mioglobinei ferice

În domeniul 600-650 nm spectrele se intersectează într-un punct, numit punct

isosbestic, care indică prezenţa în probe a două specii aflate în echilibru (Figura 3).

Fig.3 Punctul isosbestic

Pentru determinarea pKa, s-a reprezentat grafic absorbanţa corectată soluţiei în

funcţie de pH, valoarea acesteia fiind determinată din grafic. Absorbanţa corectată s-a

calculat folosind formula:

Ac = Ai - Amin

Ac – absorbanţa corectată, Ai – absorbanţa la pHi, Amin – absorbanţa minimă în

intervalul de pH 5-12, la aceeaşi lungime de undă. Este de preferat alegerea lungimii de

undă la care se calculează pKa să fie aleasă din zona în care benzile nu se suprapun, şi

diferenţele de absorbanţă sunt sesizabile, cum ar fi banda Soret.

Lungimea de undă aleasă a fost 408 nm.

Figura 4 .Determinarea pKa-ului mioglobinei

Modificările care apar la spectrele din domeniul de pH 5-13, sunt datorate tipului de

ligand al Fe2+ şi stării de spin a acestui centru metalic.

Pe domeniul de pH în care proteina este în stare nativă, pH>4, se poate defini o

constantă pKa similară constantei de aciditate din chimia analitică, care însă indică punctul

de echivalenţă dintre Fe în stare de spin înalt sau jos. Graficul din Figura 4 arată

dependenţa echilibrului [Fe-OH2] ↔ [Fe-OH] în funcţie de pH, iar pKa determinat este 13.

4. Concluzii

Din datele obţinute s-a observat că matricea proteică a fost distrusă doar la pH-uri

mici, în experimentul nostru la pH<5, însă prezenţa excesivă sau absenţa protonilor, în

soluţiile apoase, poate influenţa tăria ligandului, prin deprotonarea apei legată la fier.

Capacitatea de coordinare a metalului este influenţată de starea sa de oxidare, în

cazurile prezentate Fe în starea superioară de oxidare este hexacoordinat, iar în starea

inferioară fiind pentacoordinat.

La pH acid are loc denaturarea mioglobinei, în schimb la pH bazic nu se

denaturează .