MICROORGANISME PRODUCATOARE DE ENZIME CELULOZOLITICE

Biomasa vegetal reprezint sursa major de carbon n ecosistemele terestre astfel c este fireasc presupunerea c multe dintre microorganismele care populeaz aceste ecosisteme s fie capabile s degradeze aceste substrate, deci s sintetizeze enzime de timpul celulazelor i hemicelulazelor.

Celuloza este un polizaharid complex, care este componenta principal a esuturilor vegetale i cel mai important compus cu carbon din sol i ape.

Celuloza este rspndit n materiile prime de origine vegetal (aproximativ 1/3) i n structura pereilor celulari ai fungilor.

Biodegradearea celulozei pana la dioxid de carbon si apa se numeste celulozoliza si este realizata de o mare varietate de microorganisme aerobe si anaerobe, apartind bacteriilor si ciupercilor.Toate aceste microorganisme sintetizeaza si elimina extracelular celulaza,un complex enzimatic constituit din mai multe componente.

Celuloza este un polimer neramificat de glucoz compus din uniti de anhidro D-glucoz unite prin legturi 1,4--D-glucozidice. Aceste legturi pot fi hidrolizate de ctre enzimele celulozolitice. De obicei celuloza este foarte rezistent la hidroliz datorit gradului ridicat de cristalinitate, rezultatul unei conformai lineare (paralele) care permite realizarea unor puternice legturi de hidrogen ntre gruprile OH ale lanurilor paralele vecine. In fibrele de celuloz regiunile cu structur nalt cristalin coexist cu regiunile cu structur amorf iar cele cu un raport favorabil zonelor cristaline prezint o rezisten crescut la aciunea enzimatic.

Celuloza, aa cum se gsete n natur este un homopolimer cu greutate molecular mare, insolubil i adesea n asociere intim cu lignina, hemiceluloza la nivelul peretelui celular vegetal fapt ce o face puin accesibil degradrii enzimatice (Robson i Chambliss, 1989).

Toate organismele care degradeaz celuloza cristalin secret sisteme enzimatice mai mult sau mai puin complexe care sunt alctuite din enzime cu diferite modaliti de aciune, specificitate de substrat i care acioneaz de obicei sinergic pentru a hidroliza celuloza. Cel mai bine studiat sistem celulazic este cel de la fungi (de la Trichoderma reesei), enzimele care l alctuiesc fiind grupate n trei categorii:

- exo-(-1,4-glucanaze sau celobiohidrolaze (EC 3.2.1.91.)

- endo-(-1,4-glucanaze sau endocelulaze (endoglucanaze)(EC 3.2.1.4.)

- (-glucozidaza sau celobiaza (EC 3.2.1.21.)

Aceste trei grupe de enzime acioneaz sinergic ducnd la hidroliza celulozei cristaline. Endoglucanazele determin ruperea legturilor interne ale lanului de celuloz, atacul fcndu-se la ntmplare i ducnd la formarea de oligozaharide. Efectul direct al acestui tip de enzime este fragmentarea lanului de celuloz cuplat cu o cretere slab a cantitii de zaharuri reductoare eliberate. De obicei, n complexele celulozolitice sunt cuprinse mai multe endoglucanaze care pot prezenta afiniti diferite pentru celo-oligozaharide cu lungimi variate. Spre deosebire de aceste, exoglucanazele (celobiohidrolazele) acioneaz la nivelul extremitilor nereductoare ale lanului de celuloz, elibernd glucoz sau celobioz (zaharuri reductoare) n cantitate crescut, lungimea lanului celulozic nefiind modificat semnificativ.

Acionnd individual, att endoglucanazele ct i celobiohidrolazele pot degrada regiuni restrnse ale lanului celulozic (cele cu structur amorf). Pentru a determina hidroliza regiunilor cu structur cristalin este necesar ca n amestecul enzimatic s fie prezente ambele tipuri de enzime.

In ceea ce privete -glucozidazele, acestea determin hidroliza celobiozei n dou uniti de glucoz. Dei aceste enzime nu sunt propriu-zis celulaze, ele particip la mbuntirea randamentului degradrii celulozei prin eliminarea inhibrii prin feedback a celulazelor realizat de obicei de celobioz (Robson i Chambliss, 1989).

Utilizarea a numeroase substrate i diverse tehnici de evideniere a activitii celulazice a dus la o comparare dificil a sistemelor celulozolitice de la diferite organisme. Mai mult, deoarece celulazele aflate n extracte brute prezint o suprapunere parial a specificitii de substrat, un studiu corect trebuie realizat n condiiile purificrii acestor enzime. In ultima vreme au fost obinute o serie de substrate celulozice care ar putea fi folosite ca substrate mai mult sau mai puin specifice pentru fiecare dintre componentele sistemului celulazic (Wood i Bhat, 1988). Cel mai utilizat procedeu de determinare a activitii enzimatice este msurarea cantitii de zaharuri reductoare eliberate n urma aciunii enzimelor asupra substratului. Astfel, substratele celulozice cu structur amorf sau cele modificate chimic cum sunt celuloza-azur, carboximetilceluloza(CMC), celuloza tratat cu acizi ("acid-swollen cellulose") sau trinitrofenil-carboximetilceluloza (TNP-CMC) sunt degradate n mod semnificativ i specific de ctre endoglucanaze dar, n unele situaii i celobiohidrolazele le pot hidroliza de i cu o eficien mai mic. In cazul utilizrii drept substrat a celulozei cu structur cristalin de tipul Avicelului (celuloz microcristalin), bumbacului sau hrtiei de filtru, pentru degradarea lor eficient este necesar un sistem celulazic complet, care s conin att endoglucanaz ct i celobiohidrolaz. De obidei, pentru a determina prezena ntr-un preparat enzimatic brut a ambelor tipuri de enzime se determin eliberarea de zaharuri reductoare n funcie de substrat. Astfel, endoglucanazele cauzeaz o cretere rapid a fluiditii (reducerea vscozitii) carboximetilcelulozei dar o eliberare sczut de zaharuri reductoare. In contrast, celobiohidrolazele nu modific fluiditatea substratului dar conduce la eliberarea unei cantiti mai mari de zaharuri reductoare. Cu toate acestea este dificil de precizat dac o celulaz este sau nu celobiohidrolaz deoarece nu exist un substrat specific pentru aceasta. Deshpande i colab., (1988) au artat ns c hidroliza unor compui cum ar fi metil-umbeliferil-celobiozid (MUC) sau p-nitrofenil-(-D-celobiozid (pNPC) ar fi un indiciu al activitii exo-(-1,4-glucanazice.

Exist n prezent numeroase date referitoare la bacterii celulozolitice dar muli autori consider c bacteriile produc doar endoglucanaze i nu un sistem celulazic complet. Dei cea mai acceptat teorie referitoare la modul de degradare a celulozei este cea bazat pe rezultatele cercetrilor efectuate asupra fungilor i care presupune c hidroliza eficient a substratelor celulozice se realizeaz n urma aciunii sinergice a endo- i exoglucanazelor, ea nu este aplicat bacteriilor. La acestea, modelul de degradare sugerat presupune c endoglucanazele care au ca substrat specific celo-oligozaharidele cu lungimi variate pot determina hidroliza celulozei cristaline dac ele se afl n concentraie mare sau dac se leag de fibrele de celuloz sau sunt grupate n imediata vecintate a acestora ("celulosomi") (Robson i Chambliss, 1989). Reuita unor laboratoare din lume de a izola i caracteriza celobiohidrolaze de la bacterii vine s contrazic n cazul speciilor respective teoria enunat mai sus (Creuzet i colab.,1983; Mac Kenzie i colab.,1984; Gardner i colab., 1987; Beguin, 1990; Ruttersmith i Daniel, 1991).

Celuloza ajuns n sol i n ape este transformat n timp, sub aciunea microorganismelor care produc enzime celulozolitice:

micromicete-ageni ai putrezirii,

bacterii aerobe i anaerobe.

Produii intermedieari de hidroliz sunt metabolizai n mod difereniat, n funcie de natura microorganismelor i de prezena/absena oxigenului din aer.

Degradarea aerob a celulozei se caracterizeaz prin formarea din celobioz sau glucoz, n prima etap, a hidroxiacizilor din care, prin oxidare, se elibereaz CO2 i H2O.

Dintre bacteriile aerobe care asimileaz celuloza fac parte bacterii cu forme spiralate aparinnd genurilor: Cytofaga, Cellvibrio, Cellulomonas. Importan industrial o au bacteriile din genul Cellulomonas, care pot fi cultivate aerob pe deeuri vegetale, pe hrtie .a., iar biomasa rezultat prin nmulire este valoroas prin coninutul ridicat n proteine (46,2%).

Dintre micromicete au activitate celulozolitic superioar specii ale genurilor:

Botryotinia, Fusarium, Mucor, Rhizopus, Trichoderma i Tricothecium.

Tulpini selecionate de micromicete ale genurilor Trichoderma i Aspergillus sunt

bune productoare de celulaze i sunt folosite industrial ca surse de enzime.

Degradarea anaerob a celulozei are loc permanent n sedimente i n mlul apelor, la fermentarea compostului, n rumenul erbivorelor, n profunzimea solului, n soluri inundate, lacuri termale.

n transformarea celulozei se pot distinge trei etape, n funcie de natura produselor de fermentaie.

Dup hidroliza celulozei la compui simpli, sub aciunea unei microbiote heterogene

alctuite din bacterii anaerobe i facultativ anaerobe din familiile Enterobacteriaceae,

Bacillaceae (genul Clostridium), se acumuleaz alcooli, acizi, CO2 i H2.

Produsele rezultate n acest stadiu sunt folosite de bacteriile acetogene productoare de acid acetic pe cale anaerob, n a doua etap.

n etapa a treia, denumit metanogen, sunt active bacteriile metanogene strict anaerobe din genul Methanobacterium cu speciile M.ruminantium, M.formicicum, M.mobilis, M.farkeri .a.

Bacteriile anaerobe pot folosi acidul acetic ca surs energetic i produc metan. Se apreciaz c 73% din metan rezult din acidul acetic format n faza acetogen.). La bacterii celulazele extracelulare se cupleaza prin agregare si formeaza complexe macromoleculare proteice numite celulosomi. Acestia sunt structuri caracteristice pentru bacteriilecelulozolitice, iar sinteza lor este determinata de activitatea a 14-18 gene. In celulosomi enzimele se agrega pentru a putea actiona mai eficient iar prin ei se actioneaza asupra fibrelor de celuloza. Uneori celulosomii formeaza niste structuri numite policelulosomi care se leaga de fibrilele de celuloza si o degradeaza mai eficient. Ei se pot desprinde de pe celulele bacteriene si de pe fibrele de celuloza, se pot disocia in celulosomi, iar acestia apoi in enzime libere. Un celulosom este alcatuit din:

-o parte centrala numita proteina majora

- o parte neenzimatica, la suprafata , avand rol de organizare a agregatului si de legare atat in celula bacteriana cat si de fibrila celulozica. Activitatea celulosomiilor consta in:

- mentinerea celulazelor grupate, fara o difuzie si dilutie a lor in mediul extern,

- in mentinerea bacteriilor legate de fibrele de celuloza si astfel se asigura activitatea biodegradativa a lor ,

-in asigurarea activitatii simultana in mai multe puncte de pe fibrele de celuloza

- si in mentinerea grupata a produsilor biodegratarii fara sa se piarda in mediul extern. Degradarea enzimatica a celulozei determina producerea de zaharuri solubile precum etanolul, acetona, butanolul, acidul acetic, acidul lactic si alti acizi organici. Pentru o activitate mai eficientamicroorganismeleactioneaza in asociatii. Exemple de asociatii sunt : Sporocytophaga myxococcoides si Flavobacterium;

Clostridium thermocellum si Clostridiumautotrophicum. In cazul ciupercilorcelulozoliticeactioneaza mai multe sisteme enzimatice si anume: exocelulazele, endoglucanazele,exoglucanazele, glucodiazele,celobiooxidazele, celobiohidrolazele,carboximeticelulazele, hidroxietilcelulazele, glucohidrolazele. Activitateamicroorganismelorcelulozoliticeeste influentata de o serie de factori. Astfel, in conditii de sol, pH-ul influenteaza direct favorizand activitatea fungilor, a bacteriilor ,iar la pH-ul alcalin a asociatiilor bacterii si fungii.Activitatea celulozolitica este influentata si de prezenta azotului in substrat prin stimularea acesteia.Temperatura influenteaza activitateamicroorganismelorcelulozoliticeca si umiditatea, compozitia amestecului de gaze si compozitia in lignina a tesuturilor vegetale si altor glucide. Degradarea celulozei de catremicroorganismeare si o serie de aplicatii biotehnologice ca: producerea de proteina, de biomasa furajera, de biopolimeri, de etanol, de indulcitori alimentari, de antibiotice, de acizi, de aminoacizi, acetona, butanol sau biogaz.

Printre bacteriile considerate a avea sisteme celulazice complexe, tipice se numr genurile Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora, Ruminococcus, Bacteroides, Erwinia i Acetobacter.

De asemenea, tulpini celulozilitice au fost identificate i n cadrul altor genuri de bacterii: Streptomyces, Rhizobium, Cellvibrio, Pseudomonas, Microbispora etc.

Acum aproximativ 200 de ani, genul Trichoderma a fost inclus ca taxon pentru a

denumi un grup special de fungi filamentoi nou descoperit. Abia dup 150 de ani, genul

Trichoderma a atras din nou atenia cnd s-a observat, n cursul celui de-al doilea rzboi

mondial, c specii aparinnd acestui grup (T. viride) sunt capabile s degradeze celuloza.

Ulterior, n cadrul grupului au fost identificate mai multe specii (T. viride, T. reesei, T.

harzianum, T. koningii etc.), dintre care unele s-au dovedit a fi extrem de eficiente n

degradarea substraturilor celulozice, iar altele, prin compuii produi inhib creterea unor

fitopatogeni.

In ultimii ani, fungii filamentoi din genul Trichoderma au fost supui unor studii

amnunite att n privina particularitilor morfologice, fiziologice, biochimice sau

genetice ct mai ales pentru identificarea, purificarea i utilizarea compuilor de interes

economic. Din acest punct de vedere, se poate spune c fungii filamentoi din genul

Trichoderma prezint un interes biotehnologic deosebit, fiind elaborate pn n prezent

numeroase tehnologii de obinere a unor substane biologic active sintetizate de acetia.