09.03.2015

1

Metode de

analiz a genelor

Expresia genelor

ADN ARNm Protein Caracter

5-ATTGCAAGATTACCATGT-3 Catena codogen (netranscris)3-TAACGTTCTAATGGTACA-5 Catena anticodogen (transcris)

Transcripie

5-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3 ARNm

Translaie

Leu Ala Arg Leu Pro Cys polipeptid

Maturizare

Caracter fenotipic normal

Expresia genelor

ADNmut ARNmmut Proteinan Caracteran

5-ATTACAAGATTACCATGT-3 mutaie G4A3-TAATGTTCTAATGGTACA-5

Transcripie

5-AUUACAAGAUUACCAUGU-3 ARNmmut

Translaie

Leu Thr Arg Leu Pro Cys polipeptidan

Caracter fenotipic anormal

09.03.2015

2

Analiza genelor

Secveniere

PCR

Southern-blot

Hibridare in situ

ADN ProteineARN

Northern-blot

RTPCR

Hibridare in situ

Western-blot

Secveniere

Analiza funciei

Analiza

histochimic

Utilizarea tehnicilor de analiz a acizilornucleici n medicin

Analiza ADN:

depistarea mutaiilor genice diagnostic precis al bolilorgenetice (prenatal, postnatal precoce);

identificarea polimorfismului individual dactiloscopiegenomic (analiza filiaiei);

depistarea ADN strin (bacterian, viral) diagnosticul bolilorinfecioase i gradului de infectare.

Analiza ARNm:

analiza expresiei genice esut-specific;

evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice;

Depistarea agenilor infecioi (ribovirusuri).

Obinerea FR fragmentelor de restricie prinaciunea specific a ER (enzimelor de restricie)

09.03.2015

3

RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z

M

-

+

10 kb

8 kb

6 kb

4 kb

2 kb

12 kb

10 kb

6 kb

5 kb

2,5 kb

2,5 kb

10 kb

6 kb

5 kb

09.03.2015

4

PCR reacia de polimerizare n lan

Principiile PCR clonarea in vitro = amplificare

Replicare semiconservativ, repetat

Specificitatea primerilor sintetici pentru genaint

Hibridizarea ADN-int primer complementar:

Denaturare termic a ADN - de cercetat

Modificarea ciclic a temperaturii:

Denaturare

Renaturare

Sintez

Componentele necesare pentruclonarea in vitro (PCR):

ADN de cercetat

Primeri specifici secvenei de clonat

Complimentari secvenelor flancante

Taq-polimeraza ADN-polimeraz termostabil

Dezoxiribonucleozidtrifosfai (dNTP)

Instalaie de modificare ciclic a temperaturii:

- t de denaturare ADN

- t de renaturare (ADN+primer)

- t de polimerizare (elongarea catenelor noi de ADN)

Etapele tehnicii PCR

Denaturarea ADN la 96oC

A. Pregtirea amestecului cu toate componentele reactante

Rcirea pn la temperatura de renaturare a primerilor

Elongarea catenelor ADN la 72oC

B. Repetarea automat a procedurilor de denaturare-renaturare-elongare de 30-35 ori

C. Analiza produilor PCR- electroforeza

- colorarea

- interpretarea rezultatelor

09.03.2015

5

Extragerea ADN Pregtirea componentelor pentru

PCR

Amplificarea

ADN-int

Electroforeza

produilor PCR

Colorarea i vizualizarea produilor

PCR

Interpretarea

rezultatelor

Avantajele PCR

Metod rapid

Metod ieftin

Utilizarea cantitilor mici de material analizat

Nu necesit izotopi radioactivi

Interpretarea uoar a rezultatelor

Dezavantajele PCR

Necesitatea cunoaterii secvenei nucleotidiceamplificate

Necesitatea primerilor sintetici, specifici secveneianalizate

09.03.2015

6

Utilizarea PCR Identificarea inseriilor/deleiilor nucleotidice

Identificarea mutaiilor punctiforme(substituiile nucleotidice)

Identificarea expresiei genice (RT-PCR)

Dactiloscopia genomic (filiaie)

Identificarea agenilor infecioi

Identificarea gradului de infecie (quantitative PCR)

Identificarea produselor PCR n timp real (Real-Time PCR)

Identificarea inseriilor / deleiilor

Identificarea mutaiilor punctiforme

09.03.2015

7

Identificarea agenilor infecioi

Stabilirea paternitii (filiaiei)

09.03.2015

8

Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR

Dependena cantitii de produse amplificate de concentraia ADN genomic utilizat n PCR. S-a utilizat ADN n cantitate de: 1 0,5 g, 2 0,25 g, 3 0,1 g, 4 0,02 g

Concentraiile critice ale substanelor pentru inhibarea activitii Taq-polimerazei

Substana Concentraia critic

SDS >0.005% (m/v)

Fenol >0.2% (v/v)

Etanol >1% (v/v)

Isopropanol >1% (v/v)

CH3COONa >5 mM

NaCl >25 mM

EDTA >0.5 mM

Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR

Caracteristica primerilor utilizai n PCR

Gena Secvena Lungimea, baze % G+C Tm, oC

ACE5-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3 24 54 59

5-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3 25 48 58

AT1 R5-CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3 20 65 58

5-GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3 23 48 55

NOS5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3' 22 55 57

5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' 24 54 59

Dependena cantitii produselor PCR de temperatura de renaturare a primerilor. n condiiile PCR s-a utilizat: 1 toC optimal -5oC; 2 toC optimal; 3 toC optimal +5oC.

Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR

Dependena cantitii produselor PCR de concentraia ionilor Mg2+. Concentraia utilizat de MgCl2: 1 2,5mM; 2 5mM.

Dependena cantitii de ADN amplificat de numrul de cicluri PCR. 1 30 cicluri; 2 35 cicluri; 3 40 cicluri.

09.03.2015

9

Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE

Analiza electroforetic n gel de agaroz de 2% a produselor PCR rezultate din amplificarea ADN uman cu primeri corespunztori genei ACE.

M marcher al lungimii; 1 genotip I/D; 2 genotip D/D; 3 genotip I/I.

I

D

Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS

M 1 2 3

Rezultatele amplificrii ADN uman cu primeri corespunztori genei NOS. M marcher al lungimii; 1 genotip G/G; 2 genotip T/T; 3 genotip G/T.

G

T

Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R

Rezultatele amplificrii ADN uman cu primeri corespunztori genei AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I.

M marcher al lungimii; 1 genotip A/A; 2 genotip A/C

A

C

09.03.2015

10

Tehnica Real-time-PCR

ARMS-PCR

Utilizarea tehnicii microarray

Izolarea ARN din diferite esuturi

Izolarea ARNm

Amplificarea prin intermediul RT-PCR

Marcarea cu ageni fluoresceni

Hibridarea cu ADN fixat n micocipuri

Analiza rezultatelor

09.03.2015

11

Tehnica Southern-blot

Bazat pe RFLPs

Hibridizare cu sonde marcate

Cu transferul FR din gel-electroforez pe un suport solid (pe membrane de nitroceluloz)

Hibridarea acizilor nucleici

Unirea complementar a fragmentelor(moleculelor) de acizi nucleici:

ADN de cercetat cu

sonda oligonucleotidic

n reacie particip molecule monocatenare

Moleculele ADN-int sunt fixate

Moleculele-sonde sunt marcate radioactivsau fluorescent

Identificarea complexelor hibride se realizeaz prin intermediul autoradiografiei

Tehnica Southern-blot

Extragerea ADN Restriia ADN Electroforeza ADN

Denaturarea i

transferul ADN

pe membrane

AutoradiografiaHibridare cu sonda

Vizualizarea i

interpretarea

rezultatelor

09.03.2015

12

Utilizarea tehnicii Southern-blot

Identificarea inseriilor / deleiilor mari

Identificarea mutaiilor punctiforme ceafecteaz SR

Dactiloscopia genomic RFLPs

RFLPs i analiza genotipului

Electroforeza FR a 3 persoane A,B i C

Alela Normal cu 3 SR Alela mutant cu 2 SR, mutaie n SR2

B (Nm)

C (mm)

A (NN)

09.03.2015

13

Dezavantajele Southern-blot

Necesit cunoaterea hrii de restricie a genei int

Necesit cantiti mari de material biologic

Metod ndelungat, cu multe etape

Necesit izotopi radioactivi

Necesit materiale costisitoare

Avantajele Southern-blot

Este metod foarte precis

Nu necesit cunoaterea secvenei nucleotidiceanalizate

Nu necesit primeri sintetici

Tehnica Northern-blot

Extragerea ARN din esutul int

Electroforeza ARN ncondiii de denaturare

Transfer pe membran de nailon

Hibridarea cu sondamarcat

Autoradiografia

Tehnica Northern-blot

Extragerea ARN Electroforeza ARN

Transferul ARN

pe membrane

AutoradiografiaHibridare cu sonda

Vizualizarea i

interpretarea

rezultatelor

09.03.2015

14

Utilizarea tehnicii

Northern-blot

Identificarea expresiei genice nanumite esuturi, anumite condiii

Identificarea variantei de splicing a proARNm

Identificarea nivelului de expresie

Identificarea agenilor infecioi(ribovirusuri)

Identificarea nivelului

de expresie i a variantei de splicing

09.03.2015

15

Secvenierea ADN

Stabilirea secvenei de nucleotide

Metoda chimic (tehnica Maxam-Gilbert, 1973)

Metoda dideoxi (tehnica Sanger, 1975)

Metoda automat (cu utilizarea agenilorfluoresceni)

Tehnica dideoxi

Sinteza enzimatic a ADN

Utilizarea n paralela nucleotidelor ceconin deoxiribozi dideoxiriboz

Stoparea sintezei ncazul incorporriiddNTP

5-ATTACAAGATTACCATGT-3 catena codogen3-TAATGTTCTAATGGTACA-5 catena anticodogen (matri)

3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTAC-3

3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACAA-3

3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACAAG-3

3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACAAGA-3

3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACAAGATT-3

3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACA-3

3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACAAGAT-3

A, T, C, T ddNTP (2,3-ddNTP)

pentru stoparea sintezei

5-ATTA -- primer marcat P32

pentru ADN-polimeraz

A, T, C, T dNTP (2-dNTP)

pentru sinteza noilor catene

09.03.2015

16

5-ATTACAA-3

5-ATTACAAG-3

5-ATTACAAGA-3

5-ATTACAAGATT-3

5-ATTACA-3

5-ATTACAAGAT-3

5-ATTACAAGATTA-3

5-ATTACAAGATTACCA-3

5-ATTACAAGATTACCAT-3

5-ATTACAAGATTACCATG-3

5-ATTACAAGATTACCATGT-3

+

-A T C G

5-ATTAC-3

5-ATTACAAGATTAC-3

5-ATTACAAGATTACC-3 5-ATTACAAGATTACCATGT-3

A

T

G

C

Tehnica dideoxi

Extragerea ADN

Denaturarea ADN

Sinteza catenelor complementare utiliznd primeri marcai cu 32P n prezena dNTP i ddNTP

Electroforeza n condiii de denaturare

Vizualizarea fragmentelor marcate prin autoradiografie

+

-

(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)

09.03.2015

17

Metoda automat

Hibridarea

in situ

Pregtirea preparatelor de cromozomi

Denaturarea ADN

Hibridarea cu sonda marcat

Vizualizarea la microscopul optic

Hibridarea in situ cu

utilizarea preparatelor

de cromozomi metafazici

Hibridarea in situ cu

utilizarea preparatelor

cu nuclei interfazici

Hibridarea in situ pentru depistarea secvenelor ADN

09.03.2015

18

Hibridarea in situ cu

utilizarea probei sens (stnga)

i antisens (dreapta)

Hibridarea in situpentru depistarea secvenelor ARN

Analiza

histochimic

identificarea

proteinelor n esut

09.03.2015

19

Rolul practic al tehnicilor de analiz a acizilor nucleici:

Cercetare secvenierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinelor mutaiilor.

Depistarea persoanelor purttoare de mutaii patologice - prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naterii copiilor cu anomalii genetice sau manifestrii unor patologii severe.

Terapie genic (alegerea genei int, construirea vectorilor de gene etc.).

Depistarea ADN strin (viral sau bacterian) n diagnosticul bolilor infecioase.

Identificarea polimorfismelor individuale n analiza filiaiei, n criminalistic.