Metoda Lowry de determinare a proteinelor

Principiul metodeiDozarea proteinelor (domeniu 25 - 500 g) se bazeaza pe pe reducerea fosfomolibdatilor si fosfowolframatilor din reactivul Folin-Cioclteu de catre compusii fenolici din proteina (tirozina)[Lowry, 1959].

Reactivi1.Solutie enzimatica.2.Solutie alcalina A. Se dizolva 4 g NaOH, 10 g Na2CO3,0,2 g tartrat dublu de sodiu si potasiu n apa distilata si se aduce la 1 litru n balon cotat.3.Solutie B. Solutie CuSO40,5%.4.Reactiv alcalin de cupru. nainte de folosire se amesteca 50 mL solutie alcalina A cu 1 mL solutie CuSO4 0,5% B.5.Reactiv Folin-Cioclteu diluat cu apa 1:2 nainte de utilizare.6.Solutie etalon de albumina serica bovina (BSA) n apa distilata (1 mg/mL).AparaturaSpectrofotometru UV - VIS PG Instruments T 60U.

Trasarea curbei de etalonareSe iau cote parte din solutia etalon de BSA si se completeaza cu apa distilata la 0,2 mL. Se adauga n ordine 5 mL reactiv alcalin de cupru si 0,5 mL reactiv Folin. Se lasa la temperatura camerei 30 minute, apoi se citeste extinctia n functie de un martor obtinut n aceleasi conditii, dar cu nlocuirea solutiei de BSA cu apa distilata. Pentru siguranta determinarii se fac doua probe n paralel. Tabelul 1 si figura 1 contin datele obtinute la etalonarea solutiei de BSA prin metoda Lowry.

Reactia de culoareSe pipeteaza n ordine:0,1 mL proba (solutie enzimatica);0,1 mL apa distilata;5 mL sol A+B;0,5 mL reactiv Folin-Cioclteu (1:2).Se realizeaza un martor, nlocuind solutia enzimatica cu apa distilata. Se lasa 30 de minute la temperatura camerei si se citeste extinctia la 660 nm fata de martor.

Tabel 1.Curba de etalonare a solutiei de BSA prin metoda LowryNr. crt.BSA (mL)H2O (mL)EmediuEmediu-Emartor

1-0,2000,1270,000

20,0200,1900,1580,031

30,0400,1600,20650,079

40,0600,1400,2580,131

50,0800,1200,3120,185

60,1000,1000,3460,219

70,1200,0800,4250,298

80,1400,0600,4360,309

90,1600,0400,4880,361

100,1800,0200,45260,399

110,200-0,56050,424

Figura.1 Etalonarea solutiei de BSA prin metoda LowryEmed- Emartor= -0,021 + 2,23455 mg BSA

Calculul rezultatelorDin curba etalon se determina mg proteina n functie de extinctia probelor. Continutul n proteine se determina cu formula:p = c f[mg proteina/mL]

Solutie tampon TBETBE este o solutie tampon ce contine un amestec de acid boric, EDTA si THAM. In biologia moleculara, solutiile tampon TBE si TAE sunt utilizate deseori in proceduri ce include acizii nucleici, cea mai intalnita fiind electroforeza. Solutiile de THAM sunt solutii tampon eficiente pentru conditii de baza, care pastreaza ADN-ul deprotonat si solubil in apa. EDTA este un chelator de cationi bivalenti, in special de magneziu ( Mg2+). Deoarece acesti ioni sunt co-factori necesari pentru multe enzime, inclusiv nucleoze contaminate, rolul EDTA-ului este de a proteja acizii nucleici impotriva degradarii enzimatice. Dar din moment ce Mg2+ este de asemenea un co-factor pentru multe enzime utile care modifica AND-ul, cum ar fi enzimele de restrictie si AND-polimeraze, concentratia sa in solutii tampon TBE sau TAE este in general mentinuta la un nivel scazut (de obicei in jur de 1 mM).

Reteta:- 54 g THAM -27,5 acid boric -20 ml de EDTA 0.5

Solutie tampon TAE

TAE este o solutie tampon ce contine un amestec de THAM , acid acetic si EDTA. In bologia moleculara este utilizata in electroforeza, in gelul de agaroza folosit pentru separarea acizilor nucleici cum ar fi ADN si ARN. TAE are o capacitate de solutie tampon mai muca decat TBE si poate deveni usor epuizat, dar liniar, ADN-ul dublu catenar ruleaza mai rapid in TAE.

UtilizariEste utilizat atat ca tampon de functionare si in gelul de agaroza. TAE este folosit la diferite concentratii pentru a studia mobilitatea ADN- ului in solutie cu si fara NaCl. Cu toate acestea, concentratii mari de NaCl (si multe alte saruri) la o proba de ADN intarzie mobilitatea acestuia. Comparativ cu TBE, TAE ofera avantaje in aplicatii enzimatice ulterioar pentru proba de ADN.

PreparareEste preparat ca o solutie stoc 50x pentru folosirea in laborator. O solutie stoc 50x poate fi preparata prin dizolvarea a 242 g THAM in apa, adaugand 57, 1 ml acid acetic si 100 ml de EDTA de 500 mM si adaugand pana la volumul final de 1 l. Aceasta solutie stoc poate fi diluata 50:1 cu apa pentru a face o solutie de lucru 1x. Aceasta solutie 1x va contine 40 mM THAM, 20 mM acid acetic si 1 mM de EDTA.