MedicinaMedicina regenerativaregenerativasisi inginerieinginerie tisularatisulara

IngineriaIngineria tesuturilortesuturilor moimoi

Sistemul vascular al corpului uman este alctuit dintr-un marenumr de vase care asigur transportul sngelui prin ntregulsistem circulator. Numai prin intermediul acestei reeleextinse de artere, vene i capilare este posibil:meninerea funcionalitii celulare (creterea i dezvoltarea),absorbia nutrienilor eseniali (vitamine i minerale),reglarea homeostaziei celulare (ndeprtarea produilor demetabolism).

Ingineria tisulara a vaselor de sange

Sistemul vascular, n ciuda unor diferene complexeregionale i de organ, prezint o organizarehistologic unitar.La modul general, marea majoritate a vaselorsangvine este alctuit din trei regiuni histologicedistincte.Fiecare regiune conine proporii variabile de celulemusculare netede i elastin.

Staturi din care este constituit tesutul vascular:-intima, in constitutia careia se gasesc celule endoteliale;-media, care contine celule musculare;-adventicea

Schema unei artere musculare

Tunica intern, de obicei cea mai subire dintre cele trei tunici, estealctuit dintr-un singur strat de celule endoteliale aezate pe omembran bazal (lamina bazal). Sub aceasta exist un strat deesut de legtur subendotelial, fibro-elastic i un strat organizat allaminei elastice interne care asigur stabilitatea i flexibilitateacelulelor endoteliale. De asemenea n strns legtur cu celuleleendoteliale se afl celulele perivasculare denumite pericite.

Figura 2. Descrierea schematic a direciei de curgere a sngelui n sistemul circulator. n partea de jos a figurii sunt prezentate diferenele structurale generale dintre artere i vene. Ambele vase sangvine prezint tunica intern, tunica medie i tunica extern dar proporia relativ de celule musculare netede, fibre elastice i colagen prezint variaii semnificative

Celule endoteliale (contactul direct cu sngele) ndeplinesc unrol critic n toate aspectele homeostaziei tisulare.Celulele endoteliale-regleaz tonusul vascular interacionnd cu componentelesistemului nervos periferic- sunt implicate n procesele de tromboliz i coagulare.-sunt implicate n procesele inflamatorii i imunologice avndastfel un rol important n patogenia aterosclerotic precum i nafeciunile vasculare ocluzive.

Membrana celulelor endoteliale este alctuit la exterior dintr-un strat glicoproteic (glicocalix). Acesta asigur, n condiiifiziologice, formarea unei bariere locale ncrcate electric careprevine migrarea transendotelial a celulelor din snge precumi a proteinelor plasmatice.

Tunica medie este alctuit preponderent din celulemusculare netede i fibre de elastin.-Straturile celulare prezint tendina de a fi din ce n ce maiorganizate n arterele mari datorit rolului pe care-lndeplinesc n micarea unor volume mari de snge.- Un strat comun acestei regiuni a vasului sangvin estelamina elastic extern care asigur suportul structural.

Stratul extern al unui vas sangvin este reprezentat de tunicaextern (adventicea). Acest strat este alctuit aproape ntotalitate din esut de legtur fibro-elastic.

Componenta arterial i venoas a sistemului cardiovascular

Sngele oxigenat care se ntoarce de la plamni este ejectat dinventricolul stng al cordului n reeaua arterial. Arterele pot ficlasificate, funcie de diferenele histologice, n dou tipuri distincte:elastice i musculare.

Arterele elastice (conductoare) sunt prezente n apropiereacordului i a altor organe asociate cu deplasarea unor volume maride snge. Aceste tipuri de artere, cum ar fi aorta, sunt alctuite dinmai multe straturi de membran elastic perforat fiind n consecinadaptate ntr-un mod particular modificrilor pe care le presupundeplasrile unor volume mari de snge. Natura elastic a pereiloracestor vase sangvine asigur amortizarea oscilaiilor mari careapar n curgerea sngelui fiind responsabil astfel de omogenizareamicrii sngelui la distan de cord.

Funcia arterelor musculare (distribuitoare) este de aasigura distribuia rapid i complet a sngelui ctre toateorganele i esuturile. n timp ce natura pereilor acestorartere este predominant muscular, studiile histologice aupus n eviden faptul c acestea conin fibre elasticediscontinui n interiorul stratului de celule musculare netede.Bifurcarea continu a arterelor conduce la formareaarteriolelor. Funcia acestora este de a reduce viteza decurgere a sngelui din arterele mai mari. Aceast reducereeste necesar pentru a preveni afectarea capilarelor (vasefragile care realizeaz conexiunea dintre arborele vascularareterial i sistemul venos).

Capilarele la rndul lor realizeaz reglarea microcirculaiei prinintermediul unor interaciuni complexe cu hormoni ineurotransmitori eliberai din sinapsele simpatice. Acesteinteraciuni au drept rezultat modificarea tonusului musculaturiinetede din peretele arteriolar.

Tranziia de la arborele vascular arterial la sistemul vascular esterealizat prin intermediul reelei capilare. Din punct de vederehistologic capilarele sunt lipsite de prezena musculaturii netede. nalctuirea lor intr un singur strat de celule endoteliale (cu grosimeade 0,25 m) care se afl pe o membran bazal. Capilarul estenconjurat de pericite sau celule Rouget. Acestea variaz cadistribuie n paturile vasculare.

Suprafaa total generat de capilarele din corpul umaneste de 1000 m2 (suprafaa unui teren de tenis). La nivelulacestei suprafee mari a patului capilar are loc schimbul denutrieni, substane solubile i ap ntre snge i esuturilenconjurtoare.

Schimbul de ap i substane are loc de obicei ca urmare adifuziei simple conform gradientului de concentraie,presiunii hidrostatice i osmotice. Pot fi deosebite mai multetipuri de capilare: continui, fenestrate i discontinui.

Capilarele continui prezint un endoteliu continuu istratul membranei bazale. Sunt ntlnite n mareamajoritate a organelor cum ar fi: cord, plaman, rinichii creier.

Capilarele fenestrate sunt de obicei mai rar ntlnitei se gsesc la nivelul organelor endocrine precum ila nivel glomerular. Aceste capilare sunt perforate depori cilindrici, stabili din punct de vedere anatomic, cudiametrul ntre 75 i 100 . Aceti pori restricioneaztransferul proteinelor dar permit transferul relativ liberal apei i al soluilor.

Capilarele discontinui (sinusoide) sunt ntlnite numai lanivelul organelor nalt specializate cum ar fi ficatul i organeleformatoare de snge cum ar fi mduva osoas i splina. Poriimari dintre celulele endoteliale din cazul acestor capilare(1500-2000 ) permit realizarea schimbului de constituenicelulari ntre snge i esuturi.

Returul sngelui spre cord prin sistemul venos ncepe prinmicarea sa prin venulele postcapilare care concresc pentrua forma vene mai mari. Tranziia de la capilare la vene estemarcat de reapariia gradual a celulelor musculare neteden tunica medie a peretelui vascular precum i a unui strat decolagen i fibre elastice n adventice.Diametrul venelor variaz ntre 1 10 mm i unele vene, cum ar fi celelocalizate la nivelul membrelor inferioare ale corpului, conin valvesemilunare unidirecionale care previn acumularea sngelui n extremiti.Att venele mici ct i cele mijlocii prezint un nivel ridicat al celulelormusculare n tunica medie n timp ce venele mari conin o cantitateridicat de esut de legtur n acest strat.

Proprieti fizice ale vaselor sangvineUtiliznd dinamica fluidelor se poate descrie scderea vitezei de curgere a sngeluiodat cu scderea diametrului vaselor sangvine. Daca se consider c sngele curgeprintr-un vas sangvin cu raza r, la presiunea P pe unitatea de lungime L i inndcont de faptul c odat cu scderea razei vaselor sangvine suprafaa de seciune asistemului vascular crete se poate scrie relaie matematic:QB = VC x Aunde QB este debitul sangvin, VC este viteza de curgere i A este aria seciunii.Totui curgerea sngelui prin vase nu este uniform (nu este laminar). Din acestmotiv, ntr-o situaie ideal n care curgerea sngelui este uniform de-a lungulvasului, confrom mecanicii fluidului (legea Newton) viteza are tendina s fie maimare de-a lungul axei centrale a vasului i mai mic la nivelul pereilor. Datoritfaptului c viteza de curgere vaiaz de-a lungul sistemului vascular, n determinarearezistenei la curgere sunt implicai mai muli factori. Aceti factori includ: diferenade presiune P inregistrat la capetele vasului sangvin, raza r i lungimea L aleacestuia, vscozitatea sngelui . Astfel debitul sangvin printr-un vas poate fiexprimat (legea Poiseuille) conform ecuaiei:

LQB 8/Pr4

Conform legii Starling curgerea fluidului de-a lungulendoteliului este rezultatul echilibrului realizat ntre forelehidrostatice responsabile de deplasarea fluidului spre spaiileextravasculare i presiunea oncotic ce se opune micriifluidului din capilare. Astfel aceast ipotez implic faptul cdiferena dintre presiunea capilar (PC) i presiuneahidrostatic tisular (PT) este echivalent cu diferena dintrepresiunea oncotic a plasmei dizolvate (p) i a proteinelortisulare (T):PT - PC = p - T.

Boala aterosclerotic cardiovascular ramne principalacauz de mortalitate n lumea occidental. Aceast boalproduce reducerea localizat a fluxului sangvin prin artere,evolund pn la obstrucia complet a vasului afectat.

Solutie: utilizarea unei grefe artificiale sau a venei safen.n mod curent, n operaiile care presupun restabilirea fluxuluisangvin printr-un vas cu diametrul mai mic de 6 mm seutilizeaz autogrefe de ven safen. n cazul arterelor coronarese utilizeaz grefa arterial autolog (artera toracic intern,artera gastroepiploic, artera epigastric inferioar, arteraradial).

Alogrefele crioconservate au fost de asemenea utilizatepentru by-pass-ul arterelor coronare dar ratele mari de ocluziei problemele legate de apariia anevrismelor au condus lalimitarea utilizrii lor la situaiile n care nu sunt disponibilegrefe autologe. Funcionarea corespunztoare a acestor grefenaturale este pus pe seama prezenei celulelor endotelialeviabile pe suprafaa luminal.Dei utilizarea autogrefelor venoase sau arteriale conduce laobinerea de rezultate bune, ea nu este lipsit de prezenactorva dezavantaje:necesitatea efecturii unui numr ridicat de procedurichirurgicale care sporesc riscurile i costurile operaiei nansamblu. n plus, grefele venoase prezint perei subiri i potfi deteriorate n cursul transplantrii n sistemul arterial. Existtotui situaii n care, funcie de natura bolii vasculare, prezenaamputaiilor sau a recoltarilor anterioare de esut, pacienii nuprezint vene corespunztoare grefrii.

Biomateriale utilizate pentru realizarea protezelor vasculare

Poliuretanii

Cea mai simpla reprezentare a PU este liniara fiind de forma:

unde R2 reprezinta un lant hidrocarbonatat iar R este o hidrocarbura care continegruparea OH.

Proteze vasculare nebiodegradabilen ultimii ani au fost dezvoltate mai multe proteze vasculare din PU

modificati n scopul prevenirii biodegradarii, reducerii caracterului trombogenic sipentru a le mbunatati proprietatile legate de ingineria tisulara. Acestea includChronoflex, Chronoflex modificat, Thoratec (grefa de acces vascular), PU acoperitcu L-lactida, PU policarbonat, Thoratec-ePTFE, Corvita, Pulsetec.

Proteza MyoLink ramforsata (a); modificarile diametrului intern al unei grefe MyoLink

de 4 mm pe parcursul uni ciclu cardiac

Poli(etilentereftalatul) si poli(tetrafluoretilena)

Cele mai utilizate materiale n chirurgia cardiovascularamoderna sunt poli(etilentereftalatul) (denumirea comercialaDacron) si poli(tetrafluoretilena) (denumirea comerciala Teflon).Complicatiile cele mai severe legate de utilizarea acestui tip debiomateriale sunt formarea trombilor si infectiile bacteriene.

Grefe sintetice Functioneaza pentru

diametre mari(6-10 mm) Dificultati la inlocuirea

diametrelor mici(3-5 mm)

de ce??? Tromboza

Inginerie tisularaInginerie tisulara??

Celule Celule endoteliale Celule musculare Fibroblaste & miofibroblaste Celule modificate genetic Celule stem

Suport Sintetic (PET, ePTFE, PGA, PLA, PU)

Natural (colagen) Matrice biologica decelularizata

Stimulare mecanica Sisteme de curgere pulsatile Deformatie longitudinala ciclicaFactori de semnal Factori de crestere

(bFGF, PDGF, VEGF)Citokine

StructuraStructura

Celule se pot modela si reorganiza in gel colagenic Colagen crestere rezistenta prin diferite tehnici

(prealiniere magnetica, glicare, antrenare mecanica)

Solicitari mecanice ciclice Solicitari mecanice ciclice (antrenare mecanica)(antrenare mecanica)

Straturi autoansamblabileStraturi autoansamblabile

Arhitectura 3D adecvata Rezistenta mecanica buna Dezavantaje: sursa de celule,

necesita> 2 luni pentru realizare

Principiul de realizare a autogrefelor de vase de snge

Suport colagenic

Celulele endoteliate se dezvolta mult mai usor pe materialecolagenice sau compozite cu laminina dect pe alte tipuri deproduse, asa cum se poate observa din datele prezentate in tabelul3.

Tabelul 3. Durata de formare a structurii tubulare endoteliale pe diferitesubstraturi

Tip celule Substrat Timp de formare ObservatiiSEC Matrigel 6h Nici o invazie in gelSEC Colagen I +laminina 8h factor de crestere suplimentar

HUVEC Matrigel 8hHUVEC Matrigel + trombina 18h Efect al trombinei numai la

concentratii mai mici de 2%HUVEC Fibrinogen proteolizat 1 sapt.BAEC Copolimer cu grupe de

acid fenilboranic4 sapt. Nu se formeaza structura

tubularaBAEC Alchil-celuloza 10zile Necesitatea unoi hidrofobicitati

avansateBAEC Colagen I 4zileSEC- celule endoteliale sinusoidale; HUVEC- celule endoteliale umane; BAEC- celuleendoteliale provenite din aorta bovina.

S-au efectuat de asemenea studii de imobilizare a colagenului pe materialesintetice, n scopul mbunatatirii adeziunii celulelor endoteliale si cresteriihemocompatibilitatii materialelor sintetizate. Literatura de specialitate consideraca cea mai performanta metoda de hemocompatibilizare este acoperirea corpurilorstraine cu celule endoteliale, genernd astfel suprafete hibride

Fixarea celulelor endoteliale pe implant prin intermediul

colagenului

Ingineria tisulara in sistemul nervos

Eforturile ingineriei tisulare in sistemul nervos au ca obiective:o inlocuirea functiei unui component neuroactiv lipsa;o salvarea sau regenerarea unui tesut neural vatamat;o stimularea elementelor de cuplare neurale.

Furnizarea de molecule neuroactive sistemului nervosExista cteva modalitati de proiectare a unor sisteme care pot furniza acesti factori. Pentru aceasta trebuie luate in considerare:

stabilitatea factorilor;dozajul necesar;solubilitatea;tesutul tinta;posibilele efecte secundare.

Principalele modalitati utilizate sunt:Pompele prezinta inconveniente legate de faptul ca trebuie rencarcate la fiecare 4 saptamni si sunt susceptibile la formarea de depozite de substante neuroactive, la infectii si apar probleme la difuzie.

Sisteme polimere cu eliberare lenta a moleculelorAcestea sunt matrici polimerice ce include moleculele necesare

si pe care le elibereaza lent prin difuzie o anumita perioada de timp.Exemple de sisteme polimere utilizate:-poli(etilen vinil acetat);-elastomeri siliconici;-poliesteri;-microsfere din poli(acid lactic-acid glicolic)

Dezavantajul acestor sisteme il reprezinta faptul ca permit incarcarea cu o cantitate limita de molecule neuroactive precum si faptul ca ritmul de cedare este ajustat de catre polimer.

Transplantul de celuleAcest mod de eliberare a moleculelor neuroactive se poate

realiza in urmatoarele maniere:1) transplantul celulelor primare autologeAceasta tehnica presupune procurarea celulelor primare de la gazda, proliferarea lor daca este necesara generarea unei cantitati de tesut, modificarea prin inginerie genetica(daca este cazul) si apoi transplantate inapoi la donor, intr-o zona apropiata.Dezavantajul principal il constituie faptul ca nu intotdeauna este posibil sa se procure tesut autolog.

2) Transplantul de tesut fetalUnul dintre avantajele unui astfel de sistem il reprezinta abilitatea acestuia de a supravietui si de a se integra in creierul adultului gazda. Transplantul de tesut neural fetal alogen poate fi util in tratarea bolii Parkinson.

3)Transplantul de tesut xenogenic (exogen) incapsulat- realizarea unor capsule cu pori suficient de mari pentru ca nutrientii saajunga la tesutul transplantat si sa permita eliberarea factorilorneuroactivi, dar cu o marime suficient de mica pentru a impiedicapatrunderea in tesutul transplantat a moleculelor si celulelor

Incapsularea tesutului xenogenic in membrane polimere semipermeabile

Implicarea inginerie tisulare in optimizarea tehnicii de incapsulare presupune:

a) tipul si configuratia membranei de incapsulare.Un factor important ce determina marimea dispozitivului il reprezinta difuzia oxigenului spre celulele incapsulate, astfel inct distanta dintre sursa de oxigen si miezul intern al tesutului transplantat sa fie minima. Marimea si configuratia dispozitivului influenteaza si cinetica de eliberare a moleculelor neuroactive, timpul de raspuns fiind mai mic in capsulele mari cu peretii membranei mai grosi.Avantajul principal al acestor sisteme il constituie faptul ca nu au nevoie de un solvent organic in formarea capsulelor si pot fi mai putin citotoxice, insa rezistenta mecanica si stabilitatea lor in mediul ionic fiziologic este discutabila.

b) Alegerea celulelor si tesuturilor pentru incapsulare.Se utilizeaza trei tipuri de celule: postmitotice, liniare si care se divid lent.

c)

b) Matricile pentru incapsulare pot fi clasificate in urmatoarele tipuri:- polielectroliti reticulati, solutie de colagen sau granule poroase;- derivati ai matricii extracelulare, cum ar fi Matrigel;- hidrogeluri biosintetice.

Matricea are ca functii:- prevenirea formarii unor mari agregate celulare care conduc la dezvoltarea necrozelor centrale ca o consecinta a insuficientei oxigenului si a accesului de nutrienti;- permit ancorarea celulelor;- pot induce diferentierea celulelor.

Reconstructia tisulara. Regenerarea nervuluiIn studiul mecanismului de baza al regenerarii nervilor periferici s-

au utilizat canale sintetice de ghidare a nervilor pentru intensificareaprocesului de regenerare. Canalele de ghidare pot simplifica reparareacapetelor(terminatiilor) si pot fi utile in intreruperile lungi ale nervilor.

Exemplu de canale de ghidare a nervilor

Canalele de ghidare au rolul:-reduc tensiunea pe linia suturii;

- protejeaza regenerarea nervului de infiltratii;- directioneaza axonii spre tintele periferice(distale).

Optimizarea si intensificarea regenerarii nervului se pot realiza prin: proprietatile canalului, matricea care umple canalul, celulele insamntate in lumenul canalului si sudarea axonilor indusa polimeric.

Canalele de ghidare a nervilor pot fi:1) peretele canalului:- polimeri inerti: elastomer siliconic, PVC, polietilena.- polimeri permeabili: copolimer de acrilonitril si clorura de vinil, colagen, PTFEe;- polimeri resorbabili: acid poliglicolic, acid poli-L-lactic, colagen;- polimeri incarcati electric: poliviniliden fluorura(piezoelectric), PTFE;- polimeri cu eliberare a factorilor trofici: copolimer etilena-acetat de vinil.2) Matricea lumenului poate fi:- fibrina;- suport colagen-glicozoaminoglicani.3) Celule insamntate pentru suportul trofic:-celule Schwann.

Utilizarea eficienta a proprietatilor canalului de ghidare ia in considerare:1)Suprafata canalului- microgeometriaMorfologia nervilor periferici care se regenereaza este modelata de catre microgeometria suprafetei canalelor polimerice de ghidare. Canalele cu peretii interiori netezi dau nastere la matrici de fibrina longitudinale, organizate, rezultnd lanturi nervoase mobile cu numerosi axoni mielinizati. Canalele cu suprafata interna rugoasa dau nastere unei matrici de fibrina neorganizata cu fascicule nervoase difuze intr-un tesut conjunctiv slab ce umple intregul lumen. 2) Proprietatile electrice.Regenerarea in vivo urmeaza sectiunea leziunii in sistemul nervos periferic si poate fi sporita prin curenti galvanici produsi in canalele siliconice prevazute cu mansoane de electrozi.3) Eliberarea factorilor bioactivi din peretele canaluluiCanalele polimere de ghidare pot fi incarcate cu diferiti factori care sporesc regenerarea nervilor. Factorul de crestere al fibroblastelor, eliberat dintr-un canal de ghidare pe baza de copolimer etilena- acetat de vinil faciliteaza regenerarea nervilor periferici de-a lungul nervului afectat.4)Peretele canalului resorbabilOdata cu terminarea regenerarii, canalul dispare fara interventie chirurgicala. Astfel de comportament au cele obtinute din acid poliglicolic si, respectiv, din poli-L-lactic acid. Aceste canale trebuie insa sa-si mentina proprietatile mecanice timp de 4-12 saptamni, iar produsele lor de degradare sa nu interfere cu procesul de regenerare a nervului.