institutul national de cercetare-dezvoltare in domeniul ... · lotul de şoareci vârstnici (lotul...

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare in domeniul Patologiei ~i ~ tiintelor Biomedicale "Victor Babe~"

Proiect PN-II-RU-PD-2012-3-0543

BJocarea receptorilor mineralocorticoizi 0 soJutie terapeutidi pentru prevenirea aparitiei nefropatiei diabetice ~i a influentei stresului oxidativ

Raport ~tiintific

Etapa 1 /04.12.2013

Elaborat de Avizat de

Ionel-Alexandru CHECHERITA Mihail Eugen l-llNESCU

2

OBIECTIVUL PROIECTULUI

OB 1. Investigarea consecinţelor morfologice ale schemelor teraputice aplicate (microscopie optica

şi electronică)

OB 2. Demonstrarea diferenţelor funcţionale la nivelul ţesutului renal în diverse condiţii terapeutice,

in vivo şi după prelevarea ţesutului.

OB 3. Investigarea modificării imunofenotipului după tratament vs control.

PACHETE DE LUCRU

PL 1. Monitorizarea fiziologică a animalelor pe parcursul terapiei

PL 2. Recoltarea şi procesarea ţesutului renal

PL 3. Evaluarea morfologică a ţesutului renal prin microscopie

PL 4. Monitorizarea funcţională a probelor de ţesut

PL 5. Imunofenotipare.

OBIECTIVUL ETAPEI 1

Realizarea modelului animal, recoltarea şi stocarea probelor biologice

ACTIVITĂŢI EXPERIMENTALE ETAPA 1

1. Constituirea loturilor de animale

2. Terapie

3. Monitorizarea animalelor pe parcursul terapiei

4. Sacrificarea animalelor

5. Recoltarea şi stocarea probelor biologice relevante

6. Cultivarea celulelor renale

7. Determinarea parametrilor hematologici ai animalelor la finalul terapiei.

ALTE ACTIVITĂŢI ETAPA 1

Elaborarea unui draft de articol în care sunt trecute în revistă datele din literatura de specialitate în

domeniul proiectului.

3

DESCRIEREA DETALIATĂ A ACTIVITĂŢILOR

Experimentele cu animale au fost făcute în acord cu legislaţia în vigoare şi normele

metodologice de lucru pe animale. Toate protocoalele experimentelor de studiu au fost aprobate

de Comisia de etică a INCD „Victor Babeş”.

1. Constituirea loturilor de animale

Animale: şoarecii transgenici Cg-Lepob /WiscJ, heterozigoţi Lepob, cu genotipul

at/at Lepob/Lepob tf/tf, sunt şoareci diabetici cu hiperglicemie severă şi obezi, cu nivel crescut de

triglyceride. Reprezintă un model animal adecvat pentru studiul nefropatiei diabetice (diabet

insulino-independent), asociat cu obezitate.

Şoarecii cu vârstele descrise în Tabelul 1, au fost importati de la The Jackson Laboratory, SUA.

Conform informaţiilor obţinute de la furnizor, şoarecii cu mutaţia spontană Lepob manifestă

obezitate, hiperfagie, sindrom hiperglicemic, intoleranţă la glucoză, valori plasmatice mari ale

insulinei, subfertilitate, vindecare defectuoasă a rănilor şi producere crescută de hormoni de către

hipofiză şi glandele suprarenale. Sunt hipometabolici şi hipotermici. Obezitatea este caracterizată de

creşterea numărului şi a dimensiunii adipocitelor. Hiperinsulinemia nu se dezvoltă decât după

creşterea greutăţii corporale. Şoarecii Lepob dezvoltă diabet la 6 săptămâni (masculii) şi la 8

săptămâni (femelele). Hiperglicemia este severă şi progresivă.

La nivelul sistemului urinar prezintă următoarele particularităţi:

Morfologie anormală a podocitelor (densitate redusă, număr redus de podocite)

Albuminurie (începând cu 8 săptămâni)

Rinichi mărit

Hipertrofia rinichiului

Masă crescută a rinichiului

Matrice mesangială glomerulară extinsă

Glomeruloscleroză

Mesangioliză (începând cu 8

săptămâni); scleroză mesangială difuză

Hipertrofie renală glomerulară

Fibroză renală interstiţială (începând cu 12 săptămâni)

4

Tabel 1. Numărul şi vârsta şoarecilor la momentul recepţiei lor în INCD Victor Babeş.

Din care: Nr. lot Data naşterii

Vârsta la 23 oct 2013 (±3 zile)

Zile/săptămâni

Nr. total şoareci F M

1 20 aug 2013 61 / 8,7 30 13 17

2 27 aug 2013 54 / 7,7 18 11 7

3 3 sep 2013 47 / 6,7 22 11 11

Protocolul de acomodare a şoarecilor în laboratorul gazdă:

- 23 – 24 oct: şoarecii au ramas 24 h în cuştile de transport

- 24-28 oct: şoarecii au stat în cuşti obişnuite, conform repartizării descrise în Tabelul 4.

Şoarecii au fost cazaţi în camere cu iluminat artificial controlat (12/12, întuneric/lumină), cu

temperatura (20-24C), umiditatea de 55 ± 10%, cuşti ventilate individual (Tehniplast, Italia) şi

aşternut (talaj autoclavat). Animalele au fost hrănite ad libidum cu nutreţ granulat concentrat

special (provenit de la INCDMI Cantacuzino) şi au fost adăpate cu apă filtrată şi sterilizată

schimbată periodic pentru a asigurare prospeţime. Toţi şoarecii au fost ţinuţi sub un program

riguros de curăţenie şi igienizare.

Constituirea loturilor de animale

Au fost constituite 3 loturi de animale, în funcţie de vârstă şi implicit în funcţie de gradul de

dezvoltare a diabetului (Tabel 2). În cadrul fiecărui lot de şoareci, au fost constituite 4 subloturi în

funcţie de tratament (Tabel 3): enalapril şi spironolactonă (En+Sp), enalapril, spironolactonă şi

vitamina E (En+Sp+VitE), vehicol (hidroxietil celuloză), apă distilată.

Animalele din fiecare lot şi sublot au fost repartizate în cuşti normale (Tabel 4).

De cel puţin 3 ori pe parcursul terapiei, căte 2 animale de acelaşi sex din fiecare sublot au fost ţinute

în cuşti metabolice (Tabel 3), pentru recoltarea urinei.

Tabel 2. Loturile de animale constituite pe baza vârstei la momentul începrii tratamentului.

Din care:

Nr. lot

Vârsta la momentul începerii

tratamentului Zile/săptămâni

Nr. total şoareci F M

1 66 / 9,4 30 13 17

2 60 / 8,5 18 11 7

3 54 / 7,7 22 11 11

5

Tabel 3. Loturi/subloturide şoareci, constituite pe baza vârstei şi a tratamentului.

F=femele, M=masculi, T=număr total de animale/sublot

Nr. animale Lot Sublot

F M T Tratament

Data începerii

tratamentului

Data plasării animalelor în cuşca metabolică pentru 24h

1 1.1 3 5 8 En+Sp 28.10.2013 1.2 4 5 9 En+Sp+VitE 28.10.2013 1.3 3 3 6 Vehicol 28.10.2013 1.4 3 3 6 Apă distilată 28.10.2013

28.10.2013 04.11.2013 18.11.2013


29.10.2013 05.11.2013 13.11.2013


30.10.2013 06.11.2013 14.11.2013

T=număr total de animale/sublot

Tabel 4. Repartizarea animalelor din loturi şi subloturi în cuşti normale.

Femele Masculi Lot Sublot

Cuşca Nr. animale Cuşca Nr. animale

1 1.1 1.1F 3 1.1M 5 1.2 1.2F 4 1.2M 5 1.3 1.3F 3 1.3M 3 1.4 1.4F 3 1.4M 3 2 2.1 2.1F 3 2.1M 2 2.2 2.2F 3 2.2M 2 2.3 2.3F 3 2.3M 2 2.4 2.4F 2 2.4M 1 3 3.1 3.1F 3 3.1M 3 3.2 3.2F 3 3.2M 3 3.3 3.3F 3 3.3M 3 3.4 3.4F 2 3.4M 2

6

2. Terapie

Scheme de terapie

Schemele de terapie administrate animalelor prin gavaj zilnic au fost:

enalapril şi spironolactonă (En+Sp)

enalapril, spironolactonă şi vitamina E

(En+Sp+VitE)

vehicol (hidroxietil celuloză)

apă distilată.

Dozele de agenţi terapeutici administraţi animalelor zilnic, prin gavaj (0,2 mL/animal) sunt descrise

în Tabelul 5.

Tabel 5. Dozele de agenţi terapeutici/animal/zi, administrate zilnic prin gavaj.

Medicament Enalapril (En) Spironolactonă (Sp) Vitamina E (VitE) Doza zilnică / şoarece 0,25 mg/zi 0,5 mg/zi 0,45 mg/zi

Concentraţia în soluţia de gavaj (0,2 mL / şoarece) 1,25 mg/mL 2,50 mg/mL 2,25 mg/mL

Prepararea medicamentelor

Enalaprilul (sare de maleat), spironolactona, vitamina E şi hidroxietil celuloza (vehicol) au fost

procurate de la Sigma-Aldrich.

Datorită faptului că spironolactona este insolubilă în apă, s-a ales varianta de suspensionare a

acesteia, împreună cu ceilalţi agenţi terapeutici, în hidroxietil celuloză (HEC), în vederea

administrării controlate, prin gavaj, a amestecurilor de substante (En+Sp, sau En+Sp+VitE).

Am utilizat o soluţie de 1% HEC în apă tridistilată, deionizată. Pe scurt, hidroxietil celuloză a fost

pulverizată lent în apă, sub agitare continuă la 1100-1300 rpm, la temperatură medie de 40oC (±3oC).

În aproximativ 40 min, soluţia de polimer se clarifică. Toată procedura s-a realizat în condiţii sterile.

Agenţii terapeutici - Au fost pregătite soluţii triplu concentrate de de enalaprill, spironolactona şi

vitamina E în HEC (comparativ cu concentraţiile finale descrise în Tabelul 5). În cazul

spironolactonei, s-a realizat în fapt o suspensie, care, pentru omogenizare a trebuit puternic

vortexata. De asemenea, preparatul de vitamină E în HEC s-a realizat prin emulsionare.

Realizarea amestecurilor de agenţi terapeutici:

En+Sp 1 volum 3,75 mg/mL En + 1 volum 7,5 mg/mL Sp + 1 volum 1% HEC

En+Sp+VitE 1 volum 3,75 mg/mL En + 1 volum 7,5 mg/mL Sp + 1 volum 6,75 mg/mL VitE

Soluţiile/suspensiile de agenţi terapeutici şi amestecurile lor au fost preparate zilnic, cu cel mult 18

ore înainte de administrarea terapiei la animale.

7

Administrarea medicamentelor

Administrarea medicamentelor s-a realizat zilnic, prin gavaj (0,2 mL) animal.

Durata terapiei pentru fiecare lot/sublot de animale este descrisă în Tabelul 6. În ziua sacrificării

animalelor, acestora nu li s-a mai administrat medicaţie.

Loturile 2 şi 3, cu vârstele la sacrificare de 76, respectiv 70 zile (Tabel 7), au fost tratate timp de 16

zile. Lotul de şoareci vârstnici (Lotul 1, cu vârsta l meomentul sacrificării de 87 zile), a fost tratat

mai mult timp (21 zile) deoarece, cel puţin teoretic, prezintă forme mai avansate de diabet.

Tabel 6. Durata terapiei pentru fiecare lot de animale.

Lot Sublot Tratament Data începerii tratamentului

Data finalizării tratamentului

Număr zile de tratament

1 1.1 En+Sp 1.2 En+Sp+VitE 1.3 Vehicol 1.4 Apă distilată

28.10.2013 17-18.11.2013 21-22


29.10.2013 13.11.2013 16


30.10.2013 14.11.2013 16

Tabel 7. Vârsta animalelor la sacrificare.

Lot Sublot Tratament Vârsta animalelor la

debutul terapiei (zile – săptămâni)

Vărsta animalelor la sacrificare

(zile – săptămâni)


66 / 9,4 87-88 / 12,4


60 / 8,5 76 / 10,8


54 / 7,7 70 / 10,0

8

3. Monitorizarea animalelor pe parcursul terapiei

Pe parcursul terapiei, animalele au fost monitorizate privind semnele clinice.

Starea clinică a şoarecilor a fost controlată zilnic, iar greutatea a fost evaluată de

la începutul şi la sfarşitul experimentului. Evaluarea stării clinice a animalului a

inclus examinarea tegumentului, comportamentului şi sănătatea animalului.

Examinarea comportamentului şi a sănătăţii animalului a presupus observarea

zilnică dacă animalul manâncă, bea apă, se deplasează fără disconfort.

De 3 ori pe parcursul terapiei (înainte de instituirea terapiei, după 7 zile şi

înaintea sacrificării), animalele au fost plasate în cuşti metabolice (căte 2

animale/sublot/sex) pentru recoltarea urinii în vederea analizei biochimice.

4. Sacrificarea animalelor

Sacrificarea animalelor s-a realizat la 1 zi după terminarea

tratamentului (Tabel 6), prin dislocuire cervicală.

5. Recoltarea şi stocarea probelor biologice relevante

Înainte de începerea terapiei, am realizat sîngerarea animalelor (puncţie retroorbitală) pentru

exprimarea serului în vederea realizării unor teste imunologice (profilul seric al citokinelor). Am

evitat sângerarea animalelor pe parcursul terapiei, întrucât ar fi putut induce perturbări biochimice şi

hematologice necontrolabile, putând provoca chiar moartea animalelor.

Imediat înainte de sacrificarea animalelor, s-a recoltat sânge pentru realizarea investigaţiei

hematologice (sânge integral recoltat pe anticoagulat) şi a celei biochimice (ser).

Au fost recoltati rinichii, căntăriţi şi apoi au fost secţionaţi pentru diverse investigaţii:

Rinichiul mai mare de la fiecare animal a fost transferat pentru a) investigaţii

ultrastructurale (a fost mărunţit si plasat în soluţie 25% glutaraldehidăaldehidă pentru

fixare); b) culturi de celule renale

Celălalt rinichi a fost secţionat în plan orizaontal si repartizat pentru: a) analiză proteică

prin Western blot (porţiunea de rinichi a fost îngheţată imediat, ca atare, la -80oC);

imunohistochimie (porţiunea de rinichi a fost imediat plasată în formol 10%); analiză

genomică (porţiunea de rinichi a fost plasată în RNAlater şi ţinută până a doua zi la

frigider).

Au fost recoltate şi alte organe decât rinichii, pentru diverse investigaţii:

Cord – o prţiune a fost plasată în formol 10% pentru analiză imunohistochimică, iar altă

porţiune a fost mărunţită şi plasată în glutaraldehidă pentru investigaţii ultrastructurale.

Pancreas - a fost izolat şi plasat în glutaraldehidă pentru analiză ultrastructurală

9

Plamân – a fost plasat în formol 10% pentru analiză imunohistochimică

Creier – o porţiune a fost plasată în formol 10% pentru analiză imunohistochimică, iar

altă porţiune a fost îngheţată rapid în azot lichid şi apoi păstrată la -80oC pentru

investigaţii proteomice

Splină – a fost plasată în mediu de cultură RPMI1640 suplimentat cu antibitic-

antimicotic, pentru izolarea şi stocarea splenocitelor în vederea realizării unor investigaţii

imunologice (capacitatea proliferativa, stres oxidativ, răspunsul de citokine al

splenocitelor la activarea experimentală cu LPS etc).

Pentru analiza profilului microelementelor prin ICP-MS, s-a recoltat şi înghţat la -20oC piele cu păr,

grăsime şi plămân.

6. Cultivarea celulelor renale

Celulele renale au fost izolate şi apoi multiplicate în cultură-, pentru realizarea unei rezerve de celule

renale de la animalele investigate, în vederea testării in vitro a medicamentelor administrate

animalelor. Se vor realiza teste funcţionale în condiţii experimentale specifice diabetului

(concentraţie crescută de glucoză, produşi finali de glicare avansată), care au ca scop investigarea

mecanismelor de acţiune a medicamentelor.

Prepararea soluţiei de digestie a rinichilor. Pentru digestia rinichiului în vederea izolării celulelor

renale, s-a utilizat o un cocktail de colagenaze: 100 μg/mL Liberase TM research grade (Roche

Applied Science) în tampon HEPES-MEM (3,3mM HEPES în mediu de cultură MEM suplimentat

cu 1% BSA, 24mM CaCl2, 0,7 mg aprotinină). Notă: inainte de adăugarea enzimelor în mediu,

trebuie ajustat pH-ul mediului la 7,4.

Digestia ţesutului renal. O porţiune de rinichi a fost spălată imediat după recoltare în tampon

Hank’s suplimentat cu antibiotic-antimicotic şi apoi a fost transferată în cocktailul de colagenaze.

Ţesutul a fost mărunţit şi incubat în coctailul de colagenaze la 37oC, timp de 25 min cu agitare la 5

min. După aproximativ 20 min de incubare, ţesutul a fost disociat prin pipetare repetată cu o pipeta

Pasteur de plastic. cu gura largă. După încheierea celor 25 min de incubare, s-au adăugat 2 mL

mediu DMEM cu HEPES, suplimentat cu 20% ser fetal bovin (SFB), pentru stoparea reacţiei

enzimatice. Suspensia celulară a fost trecută printr-o sită de 200 μm şi centrifugată la 4oC, 1000 rpm,

timp de 5 min. Sedimentul rezultat a fost reluat în 1 mL mediu DMEM cu 15mM HEPES şi 20%

SFB. S-a determinat concentraţia celulară (numărare în camera Burker-Turk) şi s+a determinat

viabilitatea celulară (testul excluziei albastrului de tripan). Suspensia celulară a fost centrifugată

(1000 rpm, 5 min), iar sedimentul a fost reluat în mediu DMEM cu bicarbonat, Glutamax, suplimenti

(insulină, transferină, seleniu), 36 ng/mL hidrocortizon (mediu de cultură complet) şi 4% SFB. S-a

10

mai realizat apoi încă o spălare a celulelor in acest mediu şi, în final, csuspensia celularî a fost

ajustată la concentraţia de 5 x 106 celule/mL.

Îmbrăcarea plăcii de cultură cu poli-L lizină. S-au utilizat plăci de cultură sterile cu 24 godeuri.

Plăcile au fost incubate cu 0,1 mg/mL poli-L lizină, timp de minim 1h, la 37oC. Apoi s-a îndepărtat

poli-L lizina, godeurile au fost spălate cu apă tridistilată, deionizată si apoi cu mediu de cultură

complet cu 4% SFB. În fiecare godeu s-au adăugat 0,9 mL mediu de cultură complet cu 4% SFB şi

apoi placa a fost incubată la 37oC, minim 30 min, pentru echilibrare. S-au adăugat apoi 0,1 mL din

suspensia de celule cu densitatea de 5 x 106 celule/mL (0,5 x 106 celule/mL final în sistem).

Cultivarea celulelor renale. Celulele (0,5 x 106 celule/mL) au fost cultivate 48h în mediu de cultură

complet cu 4% SFB, la 37oC în atmosferă de 5% CO2, pentru aderarea celulelor. Mediul a fost apoi

schimbat complet pentru îndepărtarea celulelor neaderente. Celulele aderente au fost cultivate încă

48h în mediu de cultură complet cu 4% SFB, după care au fost crescute în mediu de cultură cu 2%

SFB timp de 48h. După aceea, celulele au fost incubate în mediu de cultură cu 1% SFB timp de 96h,

cu schimbarea mediului de cultură la 48h. După 10 zile de cultivare, celulele renale au fost desprinse

cu tripsina-EDTA, spălate prin centrigugare la rece şi reluate în mediu de cultură complet cu 20%

SFB şi 1% DMSO, răcit pe ghiaţă. Celulele au fost rapid transferate la -80oC.

În figura 1 sunt prezentate imagini ale celulelor renale pe parcursul cultivării.

a) celule renale cultivate 2 zile

11

b) celule renale cultivate 4 zile

c) celule renale cultivate 6 zile

d) celule renale cultivate 8 zile

e) celule renale cultivate 10 zile

Figura 1. Imagini ale celulelor renale pe parcursul cultivării (microscopie optică, obiectiv 20x).

7. Investigaţia hematologică

Animalele au fost sângerate înainte de sacrificare, prin puncţie în plexul retrorbital. Sângele a fost

recoltat în microtuburi cu EDTA. Probele s-au analizat în decursul unei ore după recoltarea sângelui,

la analizorul HEMAVET 950.

12

REZULTATE

A. Rezultate experimentale

Se prezintă în continuare rezultate preliminare privind:

1) evoluţia greutăţii animalelor pe parcursul terapiei

2) parametri hematologici la finalul terapiei

Codificarea loturilor şi a subloturilor de animale este descrisă în tabelul 8.

Interpretarea rezultatelor se va realiza după ce vor fi determinaţi toţi parametrii relevanţi pentru

studiu.

Tabel 8. Loturi şi subloturi de şoareci luaţi în studiu, diferenţiaţi în funcţie de vârstă şi tratament.

Nr. animale

Lot

Vârsta la

debutul

tratamentului

(Zile/săptămâni)

Vârsta la finalul

tratamentului

(Zile/săptămâni) Sublot

F M T Tratament

1.1 3 5 8 En+Sp 1.2 4 5 9 En+Sp+VitE 1.3 3 3 6 Vehicol

1 66 / 9,4 87 / 12,4

1.4 3 3 6 Apă distilată 2.1 3 2 5 En+Sp 2.2 3 2 5 En+Sp+VitE 2.3 3 2 5 Vehicol

2 60 / 8,5 76 / 10,4

2.4 2 1 3 Apă distilată 3.1 3 3 6 En+Sp 3.2 3 3 6 En+Sp+VitE 3.3 3 3 6 Vehicol

3 54 / 7,7 10 / 10,0

3.4 2 2 4 Apă distilată Unde, T=număr total de animale/sublot; En=enalapril; Sp=spironolactonă; VitE=vitamină E

13

1. Evoluţia greutăţii animalelor pe parcursul terapiei

1.1. Date primare

Lotul 1

Lot Sublot Cod animal din sublot

GREUTATE INITIALA (g)

GREUTATE FINALA (g)

1 28,7 26,3

2 24,0 29,5

3 16,5 17,6

4 33,8 34,1

5 35,7 37,4

6 33,6 33,2

7 33,4 35,4

1.1

8 34,2 34,6

1 30,6 31,9

2 27,8 28,3

3 27,2 28,2

4 27,7 28,2

5 32,5 34,4

6 35,2 37,7

7 32,7 34,6

8 32,6 33,3

1.2

9 32,4 34,6

1 24,5 28,5

2 25,5 26,8

3 29,3 26,6

4 33,6 36,1

5 31,6 33,2

1.3

6 34,5 36,0

1 25,1 27,6

2 28,8 29,7

3 27,6 29,3

4 32,0 32,5

5 34,2 35,5

1

1.4

6 30,6 33,6

14

Lotul 2



GREUTATE FINALA (g)

1 26,4 23,6

2 26,0 24,8

3 29,1 29,6

4 36,0 31,6

2.1

5 33,5 30,3

1 27,7 26,6

2 27,0 30,3

3 27,6 27,3

4 30,0 26,9

2.2

5 29,7 29,1

1 25,6 26,7

2 26,6 23,9

3 26,7 29,8

4 32,8 31,3

2.3

5 33,8 28,9

1 25,9 25,3

2 26,9 27,1

2

2.4

3 33,5 31,5 Lotul 3



GREUTATE FINALA (g)

1 27,3 27,4

2 28,9 27,6

3 23,8 25,8

4 30,8 28,1

5 33,2 31,9

3.1

6 28,8 30,5

1 22,8 24,2

2 24,4 26,9

3 28,0 29,0

4 37,9 32,1

5 29,9 27,5

3.2

6 30,4 32,1

1 25,5 29,0

2 25,3 26,1

3 24,0 23,5

4 32,3 32,5

5 32,0 28,7

3.3

6 30,6 30,3

1 26,0 27,2

2 26,0 25,8

3 29,2 28,5

3

3.4

4 31,7 27,9

15

1.2. Prelucrare statistică preliminară

Lot Sublot Medie Eroare standard

1.1 1,04 0,03

1.2 1,04 0,01

1.3 1,04 0,03 1

1.4 1,06 0,01

2.1 0,93 0,03

2.2 0,99 0,04

2.3 1,07 0,03 2

2.4 1,05 0,04

3.1 0,99 0,03

3.2 1,00 0,04

3.3 1,01 0,03 3

3.4 0,97 0,03

2. Parametri hematologici la finalul terapiei 2.1. Date primare

K/μL % M/μL g/dL % fL pg g/dL % K/μL fL Sex Nr. WBC NE LY MO EO BA ne ly mo eo ba RBC Hb HCT MCV MCH MCHC RDW PLT MPV Lot 2 F 1 5,88 2,26 2,79 0,75 0,07 0,02 38,36 47,4 12,7 1,19 0,35 12,14 16,9 72,6 59,8 13,9 23,3 19,6 2020 4,4 F 2 5,62 1,26 3,93 0,33 0,08 0,02 22,4 69,98 5,95 1,36 0,31 10,89 16,4 65,7 60,3 15,1 25 18,5 1799 4,3 F 3 4,64 0,91 3,27 0,38 0,06 0,02 19,65 70,41 8,23 1,25 0,45 9,68 15 58,2 60,1 15,5 25,8 18 1688 4,2 M 4 6,2 1,17 4,67 0,32 0,04 0,01 18,84 75,28 5,13 0,65 0,11 9,28 14,1 55,8 60,1 15,2 25,3 18,3 1488 4,2 M 5 6,46 1,01 5,04 0,35 0,05 0,01 15,6 78,08 5,4 0,75 0,17 8,62 12,8 53,6 62,2 14,8 23,9 20 1474 4,3 F 6 7,32 0,75 6,08 0,43 0,04 0,03 10,19 83,04 5,82 0,56 0,38 9,12 14,4 54,1 59,3 15,8 26,6 17,5 1457 4,3 F 7 6,32 0,62 5,3 0,33 0,06 0,02 9,77 83,81 5,21 0,93 0,27 9,62 14,4 58,6 60,9 15 24,6 18,3 1403 4,3 F 8 5,92 0,9 4,62 0,25 0,1 0,06 15,12 78,05 4,15 1,74 0,95 9,69 15,3 57,4 59,2 15,8 26,7 18,2 1319 4,3 M 9 11,34 2,03 8,13 0,95 0,19 0,04 17,91 71,73 8,36 1,64 0,36 9,58 14,5 56,7 59,2 15,1 25,6 18,9 1575 4,3 M 10 9,46 1,56 7,46 0,34 0,09 0,01 16,5 78,85 3,61 0,94 0,1 9,76 14,9 59,2 60,5 15,2 25,2 18,8 1735 4,3 F 11 10,08 1,87 7,71 0,38 0,1 0,01 18,59 76,52 3,79 1,04 0,06 9,83 15,4 59,6 60,6 15,7 25,8 18,2 1497 4,4 F 12 7,84 1,1 6,19 0,41 0,11 0,02 14,04 78,98 5,28 1,4 0,3 9,29 14,5 56,8 61,1 15,6 25,5 19 1501 4,3 F 13 8,38 1,32 6,47 0,4 0,17 0,03 15,73 77,15 4,76 1,97 0,4 9,76 15,7 59,8 61,3 16,1 26,3 18,2 1534 4,5 M 14 8,14 1,81 5,58 0,49 0,2 0,06 22,24 68,6 6,03 2,4 0,73 10,4 15,6 63,5 61,1 15 24,6 18,9 1391 4,5 M 15 5,8 1,48 3,62 0,4 0,25 0,06 25,53 62,33 6,85 4,34 0,95 10,93 15,8 65,6 60 14,5 21,1 19,2 1566 4,4 F 16 12,36 1,44 10,2 0,58 0,09 0,04 11,69 82,5 4,72 0,75 0,34 9,38 14,7 57,8 61,6 15,7 25,4 18,8 1658 4,6 F 17 14,58 2,35 11,16 0,67 0,31 0,09 16,1 76,56 4,58 2,12 0,63 10,32 15,6 62,1 60,2 15,1 25,1 17,8 1618 4,6 M 18 12,44 2,67 8,44 0,72 0,44 0,17 21,45 67,84 5,8 3,54 1,37 10,43 15,5 62,1 59,5 14,9 25 17,4 1387 4,6 Lot 3 F 19 12,4 1,23 10,36 0,65 0,12 0,04 9,93 83,53 5,24 1 0,32 9,69 14,1 53,8 55,5 14,6 26,2 17,6 1273 4,4 F 20 9,18 0,97 7,62 0,47 0,09 0,03 10,56 83,04 5,08 1 0,31 9,42 14,6 55,6 59 15,5 26,3 17,2 1473 4,5 F 21 9,56 0,89 8,06 0,49 0,08 0,03 9,36 84,33 5,14 0,83 0,34 9,36 14,5 55 58,8 15,5 26,4 17,4 1292 4,4 M 22 9,32 1,25 7,45 0,57 0,04 0,01 13,4 79,92 6,11 0,46 0,12 10,31 15,1 58,9 57,1 14,6 25,6 17,7 1440 4,2 M 23 10,48 1,53 8,17 0,68 0,08 0,02 14,63 77,92 6,53 0,72 0,21 9,38 14,2 55,8 59,5 15,1 25,4 17,5 1347 4,3 M 24 9,18 0,9 7,62 0,54 0,11 0,01 9,76 83 5,9 1,21 0,14 9,71 15 58,4 60,1 15,4 25,7 17,6 1413 4,3 F 25 13,12 2,11 9,64 0,95 0,34 0,08 16,08 73,47 7,27 2,57 0,62 9,68 14,9 59,7 61,7 15,4 25 18,1 1174 4,6 F 26 9,2 0,94 7,53 0,53 0,16 0,04 10,27 81,81 5,73 1,74 0,45 9,45 14,2 55,8 59,1 15 25,4 17,6 1123 4,7 F 27 10,22 1,23 8,23 0,66 0,08 0,02 12,04 80,53 6,47 0,77 0,19 9,32 14,2 55,9 60 15,2 25,4 17,7 1290 4,4 M 28 6,92 1,26 5,14 0,47 0,04 0,01 18,18 74,25 6,81 0,6 0,16 9,62 14,5 57,7 60 15,1 25,1 18 1442 4,4 M 29 9,08 2,13 5,8 0,67 0,38 0,1 23,49 63,87 7,33 4,14 1,15 9,72 14,9 57,6 59,3 15,3 25,9 17,5 1441 4,3 M 30 7,82 0,86 6,36 0,5 0,07 0,03 11,02 81,31 6,35 0,92 0,38 9,55 14,5 56,3 59 15,2 25,8 17,2 1378 4,3 F 31 13,18 1,27 11,05 0,72 0,1 0,04 9,67 83,82 5,44 0,77 0,3 10,17 15,8 63,5 62,4 15,5 24,9 18,6 1472 4,7 F 32 9,78 1,38 7,61 0,69 0,08 0,02 14,06 77,82 7,06 0,86 0,2 9,42 14,4 58,6 62,2 15,3 24,6 17,7 1429 4,3

17

F 33 13,42 2,34 10,03 0,72 0,27 0,06 17,41 74,76 5,33 2,02 0,48 9,95 15,1 59,9 60,2 15,2 25,2 17,9 1317 4,5 M 34 4,8 0,69 3,71 0,28 0,1 0,03 14,38 77,3 5,74 2,03 0,56 10,46 15,5 59,8 57,2 14,8 25,9 19,1 1516 4,3 M 35 4,68 0,76 3,63 0,22 0,05 0,01 16,33 77,5 4,71 1,16 0,31 10,22 15,2 60,6 59,3 14,9 25,1 17,5 1390 4,3 M 36 3,44 0,67 2,51 0,22 0,03 0 19,44 73,07 6,39 1 0,09 9,9 15,1 57,2 57,8 15,3 26,4 16,9 1680 4,4 F 37 10,7 1,24 8,79 0,46 0,17 0,04 11,56 82,19 4,32 1,58 0,34 9,89 15 60,5 61,2 15,2 24,8 18,2 1443 4,4 F 38 8,66 1,01 6,86 0,6 0,15 0,04 11,68 79,2 6,88 1,76 0,48 9,04 14,3 55,9 61,8 15,8 25,6 17,5 1201 4,8 M 39 4,34 0,82 3,31 0,17 0,04 0 18,84 76,27 3,84 0,96 0,08 10,51 15,4 62,6 59,6 14,7 24,6 17,4 1302 4,3 M 40 5,62 1,66 3,63 0,18 0,12 0,03 29,5 64,55 3,26 2,18 0,51 10,11 14,9 60,2 59,5 14,7 24,8 17,1 1443 4,2 Lot 1 F 41 9,58 1,25 7,36 0,64 0,25 0,08 13 76,85 6,63 2,65 0,87 8,98 13,8 52,4 58,3 15,4 26,3 17,2 997 4,9 F 42 8,64 0,86 7,11 0,57 0,08 0,01 9,99 82,34 6,55 0,97 0,14 8,77 13,7 53,4 60,9 15,6 25,7 16,7 1137 4,4 F 43 9,22 1,92 6,62 0,51 0,13 0,03 20,81 71,85 5,51 1,45 0,37 8,66 14,1 58,6 67,7 16,3 24,1 18,6 1383 4,3 M 44 9,6 1,31 7,48 0,62 0,14 0,05 13,67 77,9 6,43 1,49 0,51 8,77 13,4 52,2 59,5 15,3 25,7 16,6 1090 4,4 M 45 5,02 0,61 4 0,33 0,06 0,02 12,11 79,78 6,57 1,19 0,34 9,43 14,3 54,9 58,2 15,2 26 16,9 1312 4,3 M 46 6,12 1,22 4,35 0,34 0,17 0,04 20 71,02 5,53 2,84 0,62 9,59 14,1 56,8 59,2 14,7 24,8 16,6 1167 4,3 M 47 11,64 1,57 9,3 0,61 0,11 0,04 13,52 79,88 5,27 0,97 0,35 9,23 14,8 54,5 59,1 16 27,2 17 1141 4,4 M 48 13,66 2,26 10,53 0,71 0,14 0,02 16,51 77,07 5,23 1,04 0,15 9,57 15,2 58,2 60,8 15,9 26,1 16,2 1284 4,4 F 49 4,74 0,58 3,74 0,33 0,06 0,03 12,3 78,87 6,9 1,3 0,64 8,88 14,1 52,2 58,8 15,9 27 16,4 1244 4,4 F 50 7,06 1,11 5,24 0,44 0,2 0,07 15,7 74,29 6,26 2,77 0,98 8,67 13,4 51 58,8 15,5 26,3 16,5 1216 4,4 F 51 6,84 0,83 5,47 0,41 0,11 0,03 12,11 79,99 5,97 1,55 0,38 9,14 14,2 54,5 59,6 15,5 26,1 17,8 1155 4,4 F 52 7,88 0,85 6,42 0,46 0,12 0,03 10,73 81,52 5,87 1,5 0,38 9,16 13,6 53,7 58,6 14,8 25,3 18,9 1195 4,5 M 53 5,54 0,7 4,42 0,33 0,07 0,02 12,68 79,79 5,95 1,2 0,39 9,05 14,1 53,8 59,5 15,6 26,2 16,2 1198 4,4 M 54 5,7 0,88 4,44 0,27 0,09 0,02 15,41 77,81 4,73 1,64 0,41 9,11 14,1 53 58,2 15,5 26,6 16,2 1122 4,5 M 55 8,44 1,14 6,75 0,43 0,11 0,02 13,45 79,97 5,13 1,25 0,2 9,85 14,3 59,1 60 14,5 24,2 16,7 1202 4,4 M 56 9,24 1,65 6,76 0,53 0,26 0,05 17,81 73,16 5,69 2,79 0,55 9,43 14,3 55,8 59,2 15,2 25,6 17 1139 4,5 M 57 6,66 1,18 4,97 0,39 0,1 0,02 17,79 74,62 5,82 1,48 0,31 9,81 14,8 58 59,1 15,1 25,5 17 1184 4,3 F 58 4,36 0,65 3,29 0,32 0,1 0,01 14,83 75,39 7,32 2,22 0,23 10,4 15,5 62,4 60 14,9 24,8 18,3 1238 4,6 F 59 3,84 0,47 3,14 0,16 0,05 0,01 12,32 81,86 4,17 1,32 0,32 9,94 15,8 59,2 59,6 15,9 26,7 17,1 1300 4,5 F 60 4,64 0,72 3,53 0,27 0,11 0,02 15,42 75,97 5,87 2,32 0,43 10,33 15,1 61,8 59,8 14,6 24,4 18 1332 4,4 M 61 4,9 0,63 3,8 0,25 0,15 0,06 12,9 77,55 5,1 3,16 1,3 10,35 15,7 61,6 59,5 15,2 25,5 17,1 1303 4,3 M 62 11,8 2,58 7,73 0,76 0,56 0,16 21,89 65,52 6,44 4,78 1,38 9,87 14,8 59,4 60,2 15 24,9 17,3 1283 4,5 M 63 4,98 0,88 3,59 0,34 0,13 0,04 17,67 72,09 6,75 2,67 0,82 10,3 15,5 61 59,2 15 25,4 17,5 1311 4,2 F 64 10,6 1,53 8,32 0,61 0,11 0,03 14,42 78,45 5,8 1,08 0,26 9,33 14,7 56 60 15,8 26,2 17 1225 4,4 F 65 6,6 0,89 5,25 0,36 0,08 0,02 13,5 79,51 5,52 1,15 0,3 10,48 15,9 60,6 57,8 15,2 26,2 17,3 1223 4,4 F 66 7 0,77 5,76 0,36 0,07 0,03 11,04 82,34 5,21 1,02 0,38 10,46 15,8 62,1 59,4 15,1 25,4 17,8 1223 4,3 M 67 3,14 0,6 2,19 0,22 0,1 0,03 19,08 69,71 7,06 3,24 0,91 10,47 15,7 62,2 59,4 15 25,2 17,1 1239 4,5 M 68 3,14 0,57 2,3 0,18 0,07 0,01 18,2 73,17 5,87 2,34 0,42 10,34 15,8 61,4 59,4 15,3 25,7 17,1 1205 4,3 M 69 1,66 0,22 1,28 0,12 0,03 0,01 13,11 77,12 7,25 1,97 0,55 10,28 15,4 60,8 59,1 15 25,3 17,5 1196 4,1

18

2.2. Prelucrare statistică preliminară

Prezentăm în continuare grafic valorile statistice (medie ± eroare standard a mediei) ale unor

parametri hematologici ai animalelor luate în studiu, la sfărşitul tratamentului.

Hematologie WBC

0

2

4

6

8

10

12

14

16

En + Sp En + Sp + vitE Vehicol Control

WB

C (

K/m

icro

L)

Lot 3

Lot 2

Lot 1

Hematologie LY

0

2

4

6

8

10

12


LY

(K

/mic

roL

)

Lot 3

Lot 2

Lot 1

Hematologie MO

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8


MO

(K

/mic

roL

)

Lot 3

Lot 2

Lot 1

Figura 2. Parametri hematologici statistici ai animalelor luate în studiu, la finalul tratamentului.

Date prezentate ca medie ± eroare standard a mediei.

19

B. Draft de articol

NEW INSIGHTS OF OXIDATIVE STRESS INFLUENCE ON DIABETIC

NEPHROPATHY PROGRESSION

– A NEVER ENDING AND COMPLEX STORY –

RUNNING TITLE: DIABETIC NEPHROPATHY AND OXIDATIVE STRESS

Authors:

Affiliations:

Corresponding author:

Manuscript word count:

Abstract word count:

20

Abstract:

Over the years, it has been an increased interest in developing new therapeutically strategies to

slow diabetic nephropathy (DN) progression for improving patients’ quality of life and lessen all

cause-morbidity and mortality associated to the disease. In addition, it has been emphasized the

key role played by oxidative stress (OS) influence on DN development and evolution towards

end-stage renal disease (ESRD), diabetes mellitus (DM) representing one of the major causes

correlated with kidney impairment and, without an adequate treatment management, the

necessity of renal replacement therapy (RRT) initiation. Our review will highlight the most

significant steps made in understanding the importance of OS impact and complex

pathophysiology mechanisms underlining DN progression, over the last decades.

Key words: diabetic nephropathy, oxidative stress, treatment, outcome

21

INTRODUCTION

It is world-wide accepted that diabetes mellitus (DM) represents the leading cause of chronic

kidney disease (CKD) progression and, without an optimal treatment, end-stage renal disease

(ESRD) development [1]. Recent data assessed by National Health and Nutrition Education

Survey (NHANES) and United States Renal Data System (USRDS) concluded a significant

prevalence increase of diabetic patients since 1992 (almost 30%) [1-3]. Once again, these

findings emphasize the importance of correct understanding the main pathophysiology

mechanisms responsible of diabetes complications onset.

One of the most notorious and therapeutically challenging complications is represented by

diabetic nephropathy (DN) that can occur in all forms of diabetes (in 30 – 40% cases of type 1

and 10 – 20% of type 2 [4]), including secondary forms (after recurrent pancreatitis or

pancreatectomy) [5].

DN should be characterized as a glomerulopathy presenting complex clinical, structural and

functional changes developed in time, such as persistent albuminuria (> 300 mg/24h) confirmed

on at least 2 medical controls 3 – 6 months apart, progressive proteinuria (> 500 mg/24h),

hypertension, occasionally hematuria, clinical features underlined by important mesangial

expansion, glomerular basement membrane (GBM) thickening, glomerular sclerosis, and

tubulointerstitial injury [4,5].

Considering all these modifications, in 1983, DN was classified in [4,6]:

a. Stage 1 – early functional modifications emphasized by hypertrophy and hyperfunction

(elevated glomerular filtration rate – GFR and increased kidney size);

b. Stage 2 – early morphological modifications, that can develop even after 20 years, is

characterized by structural injuries without clinical signs, but with increased GFR;

22

c. Stage 3 – early onset of diabetic nephropathy presenting significant microalbuminuria,

very well expressed especially in hypertensive individuals (still elevated values of GFR);

d. Stage 4 – diabetic nephropathy clinically expressed with persistent proteinuria (nephrotic

range), decrease of GFR, hypertension, sometimes hematuria;

e. Stage 5 – diabetic nephropathy associating ESRD and the necessity of renal replacement

therapy (RRT) initiation (dialysis or kidney / and pancreas transplant).

Nowadays, another classification was proposed to better comprehend the morphological changes

contributing to DN progression [5,7]:

1. Class I – only GBM thickening over 430 nm and 395 nm in male and female subjects,

respectively;

2. Class II – more than 25% of mesangium is affected and depending on the complexity of the

lesions it can be classified in a mild (Class IIa) or sever (Class IIb) stage;

3. Class III – presenting less all most 50% global glomerulosclerosis and Kimmelstiel-Wilson

sign (nodular intercapillary glomerulosclerosis);

4. Class IV – > 50% global glomerulosclerosis corresponding to DN associated with ESRD.

Additionally, it has been postulated that the severity of tubulointerstitial injuries represents an

important contributing factor in DN progression [4], lesions early developed [4,8] and associated

also with patients’ future outcome [4,9]. Therefore, depending on the severity of the disease,

interstitial and vascular modifications are scored as [5]:

a. score 0 – no interstitial fibrosis and tubular atrophy, no infiltration with lymphocytes and

macrophages, no arteriolar hyalinosis, and no intimal thickening;

23

b. score 1 – all most 25% interstitial fibrosis and tubular atrophy, lymphocytes and

macrophages infiltration limited to atrophic tubules, one arteriolar hyalinosis, and the presence of

intimal thickening less than medial thickness;

c. score 2 – 25 – 50% interstitial fibrosis and tubular atrophy, lymphocytes and macrophages

infiltration not limited to atrophic tubules, multiple arteriolar hyalinosis, and the presence of

intimal thickening greater than medial thickness;

d. score 3 – > 50% interstitial fibrosis and tubular atrophy corresponding to DN with ESRD.

Over the past years, several clinical and experimental trials noticed that genetic predisposition

[10-14] and oxidative stress (OS) state have a major influence on DN further evolution [10,15-

17]. Furthermore, there is important evidence in the medical literature that observed a lack of

response in preventing or delaying DN development, even after an adequate glycemic and blood

pressure control in CKD subjects [18]. It is considered that OS, underlined by hyperglycemia and

dyslipidemia, perpetuates a severe inflammation state, contributing to DN progression [18-23],

aspects shown by elevated levels of cytokines and reactive oxygen species (ROS) [18].

Therefore, an exhaustive understanding of OS influence on DN progression can lead to the

identification of a new therapy protocol and management for the benefit of the renal impaired

patients associating diabetes [10].

THE ROLE OF OXIDATIVE STRESS IN DN

OS is defined as an imbalance between an increased prooxidants production and impaired

antioxidants defense that, finally, leads to tissue injury [24,25]. OS exacerbation can be noticed

in both type 1 and 2 diabetes and it is influenced by glucose and lipid metabolism via

24

mitochondria pathways [18] generating ROS formation that consequently induces DNA damage

and cellular apoptosis [26,27].

In 2002, it was proposed a unanimous theory explaining the interrelation between elevated

values of hyperglycemia and dyslipidemia contributing to DN development (Figure 1) [28]:

Figure 1. The theory explaining DN development

*AGE = advanced glycation end product; DAG = diacylglycerol; PKC = protein kinase C; NF-κB = nuclear factor

kappa-light-chain-enhancer of activated B cells; p38 MAPK = p38 mitogen-activated protein kinases; JNK/SAPK =

Jun amino-terminal kinases/Stress-activated protein kinases; ROS = reactive oxygen species.

*Modified after: Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. Oxidative stress and stress-activated signaling

pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes. Endocr Rev. 2002; 23(5):599-622.

25

It has been demonstrated that hyperglycemia and dyslipidemia induce OS via several stress

pathways [4,28]:

1. advanced glycation end products (AGEs) pathway – represent irreversible group of

proteins, lipids and nucleic acids formed nonenzymatically from amino residues that bind with

their surface cell receptors (RAGE = receptors for advanced glycation end products). In CKD

patients, because of their impaired renal function, there is a decrease of these products removal

[24] and AGEs overexpression (twice as in patients associating ESRD than in diabetic subjects

with normal renal function [26,29]) will stimulate several actions: cellular hypertrophy,

mesangial expansion, inhibition of nitric oxide (NO) synthesis, albuminuria [30],

glomerulosclerosis [30], activation of NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of

activated B cells) and VEGF (vascular endothelial growth factor) [31]. Additionally, AGEs

enhance IFN-γ (interferon gamma) expression that is linked to progressive proteinuria and

decreased GFR [18,32-34].

2. protein kinase C (PKC) pathway – is involved in vascular contractility and permeability,

blood flow and cellular proliferation. In DN patients, there is an increase in DAG

(diacylglycerol) synthesis activating some pathological forms of PKC, such as PKC-β, that

contributes to DN development and progression. In addition, it stimulates p38 MAPK (p38

mitogen-activated protein kinases) and TGF-β (transforming growth factor beta) activation with

clear impact on DN evolution [35]. PKC-β activation contributes also to endothelin-1 and VEGF

overexpression [26,36].

3. polyol pathway – hyperglycemia induces sorbitol accumulation (mediated by aldose

reductase) that stimulates Na+ and K+ loss, cellular damage, p38 MAPK and JNK/SAPK (Jun

amino-terminal kinases/Stress-activated protein kinases) activation. Several studies noticed a

26

clear association between sorbitol overexpression and the development of: neuropathy,

nephropathy, retinopathy, and cataract formation in diabetic patients [37].

4. hexosamine pathway – is activated by ROS formation and increased levels of glutamine

fructose-6-phosphate amidotransferase (GFAT) in the liver, that induces insulin resistance

[38,39] and, also, hyperlipidemia and obesity [40]. In addition, it induces NF-κB activation [41]

that further contributes to DN development.

Recent reports emphasized the importance of ROS generation in diabetes and especially its

complications development [42,43] and also the interrelation between stress pathways activation

and ROS formation [42]. Furthermore, ROS stimulation contributes to an increase of the

glycemic levels [42], values further enhanced by PKC activation, nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase and mitochondrial electron gradient [42,44].

NADPH stimulates OS by reducing the free oxygen to superoxide anion that is rapidly

transformed into hydrogen peroxide [24]. These two last compounds are implicated in NO

synthesis decrease, various molecules oxidation (e.g.: lipids, proteoglycans), chloramine

production and also in DNA irreversible damage [24].

Once mitochondrial NADPH oxidase is stimulated, including phox47, phox67, and Nox isoforms

overexpression [18,45], there is an increase ROS generation leading to endothelial dysfunction,

inflammation and cellular apoptosis [18,46].

In addition, OS is further exacerbated by elevated levels of dyslipidemia that induce β oxidative

phosphorylation via mitochondrial metabolism [18,47,48].

Summarizing, it is important to adequately comprehend the pathophysiological mechanisms

involved in DN development and progression, and understand that the increase of OS represents

a complex phenomena including a constant interrelation between numerous contributing factors.

27

CURRENT OPINION OF OS THERAPY IN DN PATIENTS

Nowadays, OS therapy target is to reduce, as possible, the stress pathways activation by

decreasing prooxidants compounds (e.g.: malonyldialdehyde, F2-isoprostanes, advanced lipid

oxidation products, AGEs, advanced oxidation protein products) and enhance antioxidant

defense (e.g.: superoxide dismutase, catalase, vitamin E and C) [24,49].

There is significant evidence suggesting that the following drugs can induce OS lessening and

consequently an overall improvement [50,51]:

A. renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) inhibitors – numerous studies observed

that mesangial angiotensin-II (Ang-II) accumulation stimulates the synthesis of TGF-β and PAI-

1 (plasminogen activator inhibitor-1), and inhibits mesangial cell collagenase activity, all these

contributing to important matrix accumulation [52-55] and cellular hypertrophy. Additionally,

Ang-II increases NADPH activity and ROS formation [56] and induces renal fibrosis by

activating Rho/Rho kinase pathway [57]. Therefore, angiotensin converting enzyme (ACE)

inhibitors and angiotensin receptor blockers (ARB) can reduce OS and improve glomerular

hemodynamics in DN patients [58-60]. Their beneficial effects are further summarized (Table

28

B. 1):

Table 1. ACE and ARB protective effects in DN patients Drugs Effects

ACE

captopril decreases microalbuminuria and inhibits lipid

peroxidation [61]

lisinopril inhibits monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and decreases proteinuria [62]

imidapril decreases microalbuminuria [63] ramipril decreases microalbuminuria [64]

perindopril decreases renal type IV collagen synthesis [65]

cilazapril decreases proteinuria and inhibits VEGF and intracellular adhesion molecule (ICAM-1) [66]

benazapril inhibits P42/44MAPK pathway [67] enalapril decreases proteinuria

ARB

losartan

inhibits TGF-β and mesangial cell collagenase activity [68]; additionally, combined with

diuretics, calcium channel antagonists or β-blockers decreases proteinuria [69]

irbesartan decreases proteinuria [70,71] olmesartan decreases proteinuria [72]

candesartan decreases TGF-β expression and increases

glomerular Smad7 production [73] *Modified after: Furukawa M, Gohda T, Tanimoto M, Tomino Y. Pathogenesis and novel treatment from the mouse

model of type 2 diabetic nephropathy. Scientific World Journal. 2013; doi: 10.1155/2013/928197. [Epub ahead of

print].

*Modified after: Balakumar P, Arora MK, Ganti SS, Reddy J, Singh M. Recent advances in pharmacotherapy for

diabetic nephropathy: current perspectives and future directions. Pharmacol Res. 2009; 60(1):24-32.

C. AGE inhibitors – AGE accumulation stimulates type IV collagen, TGF-β and PKC

production and consequently matrix overexpression and glomerular hypertrophy [74]. In

addition, ROS generation is increased by NADPH oxidase activation [75]. There are several

drugs targeting the inhibition of AGE formation (Table 2):

29

Table 2. AGE accumulation inhibitors Drugs Effects

OPB-9195 inhibits TGF-β, VEGF and type IV collagen

expression [76]

ALT-946 decreases albuminuria and inhibits AGE

formation [77]

ALT-711 inhibits matrix accumulation and PKC

activation [78]

aminoguanidine inhibits matrix and mesangial expansion by

reducing connective tissue growth factor (CTGF) activity [79]

TM2002 experimental drug [80]

LR-90

decreases microalbuminuria, glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis, inhibits lipid peroxidation and

accumulation of TGF-β, CTGF, MAPK, NF-κB, fibronectin and type IV collagen [81]

pyridoxamine decreases microalbuminuria and inhibits TGF-β expression without changing systemic blood

pressure by enhancing antioxidant defense *Modified after: Furukawa M, Gohda T, Tanimoto M, Tomino Y. Pathogenesis and novel treatment from the mouse

model of type 2 diabetic nephropathy. Scientific World Journal. 2013; doi: 10.1155/2013/928197. [Epub ahead of

print].

*Modified after: Balakumar P, Arora MK, Ganti SS, Reddy J, Singh M. Recent advances in pharmacotherapy for

diabetic nephropathy: current perspectives and future directions. Pharmacol Res. 2009; 60(1):24-32.

D. TGF-β inhibitors – experimental studies observed the beneficial effects of anti- TGF-β IgG4

in lessening microalbuminuria [82] and also the combination between murine (anti- TGF-β

antibody) and lisinopril [83]. Recent studies suggested the renoprotective effect of the following

compounds: hepatocyte growth factor (HGF) [84], circular antisense TGF-β

oligodeoxynucleotides (ODNs) [85] and soluble human TGF-β type II receptor (sT_RII.Fc) [86].

In addition, it was suggested that aldosterone antagonists can reduce TGF-β overexpression.

30

E. PKC inhibitors – ruboxistaurin (LY333531) is considered as a potent PKC inhibitor and

contributes to albuminuria decrease and inhibits extra cellular matrix protein accumulation,

interstitial fibrosis, macrophages infiltration and tubular atrophy [87,88]. In combination with

perindopril its renoprotective effects are increased [89].

F. other forms of therapies – thiazolidinediones (e.g.: troglitazone, pioglitazone, rosiglitazone)

have beneficial effects on impaired glucose tolerance and urinary albumin-creatinine ratio

[90,91,92]. Eicosapentaenoic acid (fish oil) has the following effects: antithrombotic,

hypolipidemic, antiatherogenic, antiinflammatory and antimitogenic by inhibiting the actions of

IL-1, IL-2, IL-6 and tumor necrosis factor (TNF). Other renoprotective drugs: statins

independent of their cholesterol-lowering effect [93,94], vitamin D analogues, vitamin E and C

diet supplementation [95] or oleanolic acid administration [96]. Additionally, lifestyle

modification (e.g.: exercise training) can attenuate OS by lowering plasma lipids, blood glucose,

blood pressure and body mass index.

CONCLUSIONS

DN patients present several factors (e.g.: long-term hyperglycemia and dyslipidemia) that are

involved in producing an important imbalance between antioxidants and prooxidants, generating

a pathological cellular response that influences and stimulates multiple stress pathways

activation. Consequently, a profound oxidative and inflammation state is settled that markedly

contributes to DN progression towards ESRD. Therefore, it is mandatory to understand correctly

the incriminated pathophysiological mechanisms for creating future targeted-specific drugs that

will slow down DN natural evolution.

31

REFERENCES

1. National Kidney Foundation. KDOQI clinical practice guideline for diabetes and CKD: 2012 update. Am J Kidney Dis. 2012; 60(5):850-886.

2. de Boer IH, Rue TC, Hall YN, Heagerty PJ, Weiss NS, Himmelfarb J. Temporal trends in the prevalence of diabetic kidney disease in the United States. JAMA. 2011; 305(24):2532-2539.

3. US Renal Data System. USRDS 2011 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States. Am J Kidney Dis. 2012; 59(1) (Suppl 1):e1-e420.

4. Ritz E. Pathogenesis, clinical manifestations, and natural history of diabetic nephropathy. In: Feehally J, Floege J, Johnson RJ (editors). Comprehensive clinical nephrology. 3rd Edition. Philadelphia: Mosby Elsevier, 2007; p. 353-364.

5. Bakris GL. Overview of diabetic nephropathy. UpToDate. 2013; http://www.uptodate.com/contents/overview-of-diabetic-nephropathy.com.

6. Mogensen CE, Christensen CK, Vittinghus E. The stages in diabetic renal disease. With emphasis on the stage of incipient diabetic nephropathy. Diabetes. 1983; 32(Suppl 2):64-78.

7. Tervaert TW, Mooyaart AL, Amann K, Cohen AH, Cook HT, Drachenberg CB, Ferrario F, Fogo AB, Haas M, de Heer E, Joh K, Noël LH, Radhakrishnan J, Seshan SV, Bajema IM, Bruijn JA, Renal Pathology Society. Pathologic classification of diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2010; 21(4):556-563.

8. Katz A, Caramori ML, Sisson-Ross S, Groppoli T, Basgen JM, Mauer M. An increase in the cell component of the cortical interstitium antedates interstitial fibrosis in type 1 diabetic patients. Kidney Int. 2002; 61(6):2058-2066.

9. Gilbert RE, Cooper ME. The tubulointerstitium in progressive diabetic kidney disease: more than an aftermath of glomerular injury? Kidney Int. 1999; 56(5):1627-1637.

10. Vashistha H, Meggs L. Diabetic nephropathy: lessons from the mouse. Ochsner J. 2013; 13(1):140-146.

11. Huang W, Gallois Y, Bouby N, Bruneval P, Heudes D, Belair MF, Krege JH, Meneton P, Marre M, Smithies O, Alhenc-Gelas F. Genetically increased angiotensin I-converting enzyme level and renal complications in the diabetic mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(23):13330-13334.

12. Kakoki M, Takahashi N, Jennette JC, Smithies O. Diabetic nephropathy is markedly enhanced in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101(36):13302-13305.

13. Kakoki M, Kizer CM, Yi X, Takahashi N, Kim HS, Bagnell CR, Edgell CJ, Maeda N, Jennette JC, Smithies O. Senescence-associated phenotypes in Akita diabetic mice are enhanced by absence of bradykinin B2 receptors. J Clin Invest. 2006; 116(5):1302-1309.

14. Kakoki M, McGarrah RW, Kim HS, Smithies O. Bradykinin B1 and B2 receptors both have protective roles in renal ischemia/reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104(18):7576-7581.

15. Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 2005; 54(6):1615-1625.

16. Lee HB, Yu MR, Yang Y, Jiang Z, Ha H. Reactive oxygen species regulated signaling pathways in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003; 14(8) (Suppl 3):S241-S245.

17. Li JM, Shah AM. ROS generation by nonphagocytic NADPH oxidase: potential relevance in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003; 14(8) (Suppl 3):S221-S226.

32

18. Mima A. Inflammation and oxidative stress in diabetic nephropathy: new insights on its inhibitions as new therapeutic targets. J Diabetes Res. 2013; doi: 10.1155/2013/248563. [Epub ahead of print].

19. Banba N, Nakamura T, Matsumura M, Kuroda H, Hattori Y, Kasai K. Possible relationship of monocyte chemoattractant protein-1 with diabetic nephropathy. Kidney Int. 2000; 58(2):684-690.

20. Sassy-Prigent C, Heudes D, Mandet C, Bélair MF, Michel O, Perdereau B, Bariéty J, Bruneval P. Early glomerular macrophage recruitment in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 2000; 49(3):466-475.

21. Okada S, Shikata K, Matsuda M, Ogawa D, Usui H, Kido Y, Nagase R, Wada J, Shikata Y, Makino H. Intercellular adhesion molecule-1-deficient mice are resistant against renal injury after induction of diabetes. Diabetes. 2003; 52(10):2586-2593.

22. Chow F, Ozols E, Nikolic-Paterson DJ, Atkins RC, Tesch GH. Macrophages in mouse type 2 diabetic nephropathy: correlation with diabetic state and progressive renal injury. Kidney Int. 2004; 65(1):116-128.

23. Gæde P, Poulsen HE, Parving HH, Pedersen O. Double-blind, randomised study of the effect of combined treatment with vitamin C and E on albuminuria in Type 2 diabetic patients. Diabet Med. 2001; 18(9):756-760.

24. Locatelli F, Canaud B, Eckardt K-U, Stenvinkel P, Wanner C, Zoccali C. Oxidative stress in end-stage renal disease: an emerging threat to patient outcome. Nephrol Dial Transplant. 2003; 18(7):1272-1280.

25. Sies H. Oxidants and antioxidants. Exp Physiol. 1997; 82(2): 291-295.

26. Sun YM, Su Y, Li J, Wang LF. Recent advances in understanding the biochemical and molecular mechanism of diabetic nephropathy. Biochem Biophys Res Commun. 2013; 433(4):359-361.

27. Giacco F, Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications. Circ Res. 2010; 107(9):1058-1070.

28. Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes. Endocr Rev. 2002; 23(5):599-622.

29. Galler A, Muller G, Schinzel R, Kratzsch J, Kiess W, Munch G. Impact of metabolic control and serum lipids on the concentration of advanced glycation end products in the serum of children and adolescents with type 1 diabetes, as determined by fluorescence spectroscopy and nepsilon-(carboxymethyl) lysine ELISA. Diabetes Care. 2003; 26 (9):2609-2615.

30. Vlassara H, Striker LJ, Teichberg S, Fuh H, Li YM, Steffes M. Advanced glycation end products induce glomerular sclerosis and albuminuria in normal rats. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91(24):11704-11708.

31. Lu M, Kuroki M, Amano S, Tolentino M, Keough K, Kim I, Bucala R, Adamis AP. Advanced glycation end products increase retinal vascular endothelial growth factor expression. J Clin Invest. 1998; 101:1219-1224.

32. Galkina E, Ley K. Leukocyte recruitment and vascular injury in diabetic nephropathy, J Am Soc Nephro. 2006; 17(2):368-377.

33. Imani F, Horii Y, Suthanthiran M, Skolnik EY, Makita Z, Sharma V, Sehajpal P, Vlassara H. Advanced glycosylation endproduct-specific receptors on human and rat Tlymphocytes mediate synthesis of interferon �: role in tissue remodeling. J Exp Med. 1993; 178(6):2165-2172.

33

34. Wu CC, Chen JS, Lu KC, Chen CC, Lin SH, Chu P, Sytwu HK, Lin YF. Aberrant cytokines/chemokines production correlate with proteinuria in patients with overt diabetic nephropathy. Clinica Chim Acta. 2010; 411(9-10):700-704.

35. Glogowski EA, Tsiani E, Zhou X, Fantus IG, Whiteside C. High glucose alters the response of mesangial cell protein kinase C isoforms to endothelin-1. Kidney Int. 1999; 55(2):486-499.

36. Kanwar YS, Wada J, Sun L, Xie P, Wallner EI, Chen S, Chugh S, Danesh FR. Diabetic nephropathy: mechanisms of renal disease progression. Exp Biol Med (Maywood). 2008; 233(11):4-11.

37. Singh SB, Malamas MS, Hohman TC, Nilakantan R, Carper DA, Kitchen D. Molecular modeling of the aldose reductase-inhibitor complex based on the X-ray crystal structure and studies with single-site-directed mutants. J Med Chem. 2000; 43(6):1062-1070.

38. Hebert LF, Daniels MC, Zhou JX, Crook ED, Turner RL, Simmons ST, Neidigh JL, Zhu JS, Baron AD, McClain DA. Overexpression of glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase in transgenic mice leads to insulin resistance. J Clin Invest. 1996; 98(4):930-936.

39. Tang J, Neidigh JL, Cooksey RC, McClain DA. Transgenic mice with increased hexosamine flux specifically targeted to β-cells exhibit hyperinsulinemia and peripheral insulin resistance. Diabetes. 2000; 49(9):1492-1499.

40. Veerababu G, Tang J, Hoffman RT, Daniels MC, Hebert Jr LF, Crook ED, Cooksey RC, McClain DA. Overexpression of glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase in the liver of transgenic mice results in enhanced glycogen storage, hyperlipidemia, obesity, and impaired glucose tolerance. Diabetes. 2000; 49(12):2070-2078.

41. James LR, Tang D, Ingram A, Ly H, Thai K, Cai L, Scholey JW. Flux through the hexosamine pathway is a determinant of nuclear factor κB-dependent promoter activation. Diabetes. 2002; 51(4):1146-1156.

42. Ha H, Hwang IA, Park JH, Lee HB. Role of reactive oxygen species in the pathogenesis of diabetic nephropathy. Diabetes Res Clin Pract. 2008; 82(Suppl 1):S42-S45.

43. Rösen P, Nawroth PP, King G, Möller W, Tritschler HJ, Packer L. The role of oxidative stress in the onset and progression of diabetes and its complications: a summary of a congress series sponsored by UNESCO-MCBN, the American Diabetes Association and the German Diabetes Society. Diab Metab Res Rev. 2001; 17(3):189-212.

44. Lee HB, Yu MR, Yang Y, Jiang Z, Ha H. Reactive oxygen species-regulated signaling pathways in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003; 14(Suppl 8):S241-S245.

45. Bedard K, Krause KH. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 2007; 87(1):245-313.

46. Cave AC, Brewer AC, Narayanapanicker A, Ray R, Grieve DJ, Walker S, Shah AM. NADPH oxidases in cardiovascular health and disease. Antioxid Redox Signal. 2006; 8(5-6):691-728.

47. Giugliano D, Ceriello A, Paolisso G. Oxidative stress and diabetic vascular complications. Diabetes Care. 1996; 19(3):257-267.

48. Duckworth WC. Hyperglycemia and cardiovascular disease. Curr Atheroscler Rep. 2001; 3(5):383-391.

49. Pryor WA. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes and reactions. Annu Rev Physiol. 1986; 48:657-667.

34

50. Furukawa M, Gohda T, Tanimoto M, Tomino Y. Pathogenesis and novel treatment from the mouse model of type 2 diabetic nephropathy. Scientific World Journal. 2013; doi: 10.1155/2013/928197. [Epub ahead of print].

51. Balakumar P, Arora MK, Ganti SS, Reddy J, Singh M. Recent advances in pharmacotherapy for diabetic nephropathy: current perspectives and future directions. Pharmacol Res. 2009; 60(1):24-32.

52. Kagami S, Border WA, Miller DE, Noble NA. Angiotensin II stimulated extracellular matrix protein synthesis through induction of transforming growth factor-β expression in rat glomerular cells. J Clin Invest. 1994; 93(6):2431-2437.

53. Kagami S, Kuhara T, Okada K, Kuroda Y, Border WA, Noble NA. Dual effects of angiotensin II on the plasminogen/plasmin system in rat mesangial cells. Kidney Int. 1997; 51(3):664-671.

54. Wilson HM, Haites NE, Booth NA. Effect of angiotensin II on plasminogen activator inhibitor-1 production by cultured human mesangial cells. Nephron. 1997; 77(2):197-204.

55. Singh R, Alavi N, Singh AK, Leehey DJ. Role of angiotensin II in glucose-induced inhibition of mesangial matrix degradation. Diabetes. 1999; 48(10):2066-2073.

56. Giacchetti G, Sechi LA, Rilli S, Carey RM. The renin-angiotensin-aldosterone system, glucose metabolism and diabetes. Trends Endocrinol Metabol. 2005; 16(3):120-126.

57. Ortega MR, Ruperez M, Esteban V, Vita JR, Lopez ES, Carvajal G, Egido J. Angiotensin II: a key factor in the inflammatory and fibrotic response in kidney diseases. Nephrol Dial Transplant. 2006; 21(1):16-20.

58. Lewis EJ, Hunsicker LG, Bain RP, Rohde RD. The effect of angiotensin-converting-enzyme inhibition on diabetic nephropathy. The Collaborative Study Group. New Engl J Med. 1993; 329(20):1456-1462.

59. Andersen S, Tarnow L, Rossing P, Hansen BV, Parving HH. Renoprotective effects of angiotensin II receptor blockade in type 1 diabetic patients with diabetic nephropathy. Kidney Int. 2000; 57(2):601-606.

60. Hong SW, Isono M, Chen S, Iglesias-De La Cruz MC, Han DC, Ziyadeh FN. Increased glomerular and tubular expression of transforming growth factor-β1, its type II receptor, and activation of the smad signaling pathway in the db/db mouse. Am J Pathol. 2001; 158(5):1653-1663.

61. Ha H, Kim KH. Amelioration of diabetic microalbuminuria and lipid peroxidation by captopril. Yonsei Med J. 1992; 33(3):217-223.

62. Amann B, Tinzmann R, Angelkort B. ACE inhibitors improve diabetic nephropathy through suppression of renal MCP-1. Diabetes Care. 2003; 26(8):2421-2425.

63. Katayamaa S, Kikkawab R, Isogaic S, Sasakia N, Matsuura N, Tajima N, Urakami T, Uchigata Y, Ohashi Y. Effect of captopril or imidapril on the progression of diabetic nephropathy in Japanese with type 1 diabetes mellitus: a randomized controlled study (JAPAN-IDDM). Diabetes Res Clin Pract. 2002; 55(2):113-121.

64. Gerstein HC. Diabetes and the HOPE study: implications for macrovascular and microvascular disease. Int J Clin Pract Suppl. 2001; 117:8-12.

65. McLennan SV, Kelly DJ, Cox AJ, Cao Z, Lyons JG, Yue DK, Gilbert RE. Decreased matrix degradation in diabetic nephropathy: effects of ACE inhibition on the expression and activities of matrix metalloproteinases. Diabetologia. 2002; 45(2):268-275.

66. Lin H, Huang S, Mi X, Sha Z. Effects of cilazapril on the expression of vascular endothelial growth factor and intercellular adhesion molecule-1 in diabetic rat glomeruli. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2003; 34(4):694-697.

35

67. Yongman LV, Junwu D, Xiaochun N, Xiaocheng L. Renoprotective effect of benazepril on diabetic nephropathy mediated by P42/44MAPK. J Huazhong Uni Sci Technol. 2005; 25(1):32-35.

68. Singh R, Alavi N, Singh AK, Leehey DJ. Role of angiotensin II in glucose-induced inhibition of mesangial matrix degradation. Diabetes. 1999; 48(10):2066-2073.

69. Eijkelkamp WBA, Zhang Z, Remuzzi G, Parving HH, Cooper ME, Keane WF, Shahinfar S, Gleim GW, Weir MR, Brenner BM, de Zeeuw D. Albuminuria is a target for renoprotective therapy independent from blood pressure in patients with type 2 diabetic nephropathy: post hoc analysis from the reduction of endpoints in NIDDM with the Angiotensin II Antagonist Losartan (RENAAL) Trial. J Am Soc Nephrol. 2007; 18(5):1540-1546.

70. Lewis EJ, Hunsicker LG, Clarke WR, Berl T, PohlMA, Lewis JB, Ritz E, Atkins RC, Rohde R, Raz I; Collaborative Study Group. Renoprotective effect of the angiotensin-receptor antagonist irbesartan in patients with nephropathy due to type 2 diabetes. N Eng J Med. 2001; 345(12):851-860.

71. Hunsicker LG. Emerging trends for prevention and treatment of diabetic nephropathy: blockade of the RAAS and BP control. J Manag Care Pharm. 2004; 10(5) (Suppl A):S12-S17.

72. Pugsley MK. The angiotensin-II (AT-II) receptor blocker olmesartan reduces renal damage in animal models of hypertension and diabetes. Proc West Pharmacol Soc. 2005; 48:35-38.

73. Lioa J, Kobayashi M, Kanamuru Y, Nakamura S, Makita Y, Funabiki K, Horikoshi S, Tomino Y. Effects of candesartan, an angiotensin II type 1 receptor blocker, on diabetic nephropathy in KK/Ta mice. J Nephrol. 2003; 16(6):841-849.

74. Yang CW, Vlassarat H, Peten EP, He CJ, Striker GE, Striker LJ. Advanced glycation end products up-regulate gene expression found in diabetic glomerular disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91(20):9436-9440.

75. WautierMP, ChappeyO, Corda S, Stern DM, Schmidt AM, Wautier JL. Activation of NADPH oxidase by AGE links oxidant stress to altered gene expression via RAGE. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2001; 280(5):E685-E694.

76. Tsuchida K, Makita Z, Yamagishi S, Atsumi T,Miyoshi H, Obara S, Ishida M, Ishikawa S, Yasumura K, Koike T. Suppression of transforming growthfactor beta and vascular endothelial growth factor in diabetic nephropathy in rats by a novel advanced glycation end product inhibitor, OPB-9195. Diabetologia. 1999; 42(5):579-588.

77. Forbes JM, Soulis T, Thallas V, Panagiotopoulos S, Long DM, Vasan S, Wagle D, Jerums G, Cooper ME. Renoprotective effects of a novel inhibitor of advanced glycation. Diabetologia. 2001; 44(1):108-114.

78. Bonke VT, Lindschau C, Rizkalla B, Bach LA, Boner G, Meier M, Haller H, Cooper ME, Forbes JM. Attenuation of extracellular matrix accumulation in diabetic nephropathy by the advanced glycation end product cross-link breaker ALT-711 via a protein kinase C dependent pathway. Diabetes. 2004; 53(11):2921-2930.

79. Twigg SM, Cao Z, Mclennan SV, BurnsWC, Brammar G, Forbes JM, Cooper ME. Renal connective tissue growth factor induction in experimental diabetes is prevented by aminoguanidine. Endocrinology. 2002; 143(12):4907-4915.

80. Izuhara Y, Nangaku M, Takizawa S, Takahashi S, Shao J, Oishi H, Kobayashi H, van Ypersele de Strihou C, Miyata T. A novel class of advanced glycation inhibitors ameliorates renal and cardiovascular damage in experimental rat models. Nephrol Dial Transplant. 2008; 23(2):497-509.

81. Figarola J, Loera S, Weng Y, Shanmugam N, Natarajan R, Rahbar S. LR-90 prevents dyslipidaemia and diabetic nephropathy in the Zucker diabetic fatty rat. Diabetologia. 2008; 51(5):882-891.

36

82. Hill C, Flyvbjerg A, Rasch R, Bak M, Logan A. Transforming growth factor-β antibody attenuates fibrosis in the experimental diabetic rat kidney. J Endocrinol. 2001; 170(3):647-651.

83. Benigni A, Zojaa C, Campanaa M, Cornaa D, Sangallia F, Rottolia D, Gagliardini E, Conti S, Ledbetter S, Remuzzi G. Beneficial effect of TGF- β antagonism in treating diabetic nephropathy depends on when treatment is started. Nephron Exp Nephrol. 2006; 104(4):e158-e168.

84. Mizuno S, Nakamura T. Suppressions of chronic glomerular injuries and TGF-β1 production by HGF in attenuation of murine diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2004; 286(1):F134-F143.

85. Jeong HS, Park KK, Kim SP, Choi IJ, Lee IK, Kim HC. Effect of antisense TGF-β1 oligodeoxynucleotides in streptozotocin-induced diabetic rat kidney. J Kor Med Sci. 2004; 19(3):374-383.

86. Russo LM, Re ED, Brown D, Lin HY. Evidence for a role of transforming growth factor (TGF)-β1 in the induction of postglomerular albuminuria in diabetic nephropathy. Amelioration by soluble (TGF)-β1 type II receptor. Diabetes. 2007; 56(2):380-388.

87. Tuttle KR, Anderson PW. A novel potential therapy for diabetic nephropathy and vascular complications: protein kinase C beta inhibition. Am J Kidney Dis. 2003; 42(3):456-465.

88. Kelly DJ, Chanty A, Gow RM, Zhang Y, Gilbert RE. Protein kinase C beta inhibition attenuates osteopontin expression, macrophage recruitment, and tubulointerstitial injury in advanced experimental diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2005; 16(6):1654-1660.

89. Kelly DJ, Buck D, Cox AJ, Zhang Y, Gilbert RE. Effects on protein kinase C-beta inhibition on glomerular vascular endothelial growth factor expression and endothelial cells in advanced experimental diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2007; 293(2):F565-F574.

90. Schwartz S, Raskin P, Fonseca V, Graveline JF. Effect of troglitazone in insulin-treated patients with type II diabetes mellitus. Troglitazone and Exogenous Insulin Study Group. New Engl J Med. 1998; 338(13):861-866.

91. Imano E, Kanda T, Nakatani Y, Nishida T, Arai K, Motomura M, Kajimoto Y, Yamasaki Y, Hori M. Effect of troglitazone on microalbuminuria in patients with incipient diabetic nephropathy. Diabetes Care. 1998; 21(12):2135-2139.

92. Fujii M, Takemura R, Yamaguchi M, Hasegawa G, Shigeta H, Nakano K, Kondo M. Troglitazone (CS-045) ameliorates albuminuria in streptozotocin-induced diabetic rats. Metabolism. 1997; 46(9):981-983.

93. McFarlane SI, Muniyappa R, Francisco R, Sowers JR. Clinical review145: pleiotropic effects of statins: lipid reduction and beyond. J Clin Endocrinol Metab. 2002; 87(4):1451-1458.

94. Endres M, Laufs U. Effects of statins on endothelium and signaling mechanisms. Stroke. 2004; 35(11):2708-2711.

95. Baburao Jain A, Anand Jain V. Vitamin E, its beneficial role in diabetes mellitus (DM) and its complications. J Clin Diagn Res. 2012; 6(10):1624-1628.

96. Dubey VK, Patil CR, Kamble SM, Tidke PS, Patil KR, Maniya PJ, Jadhav RB, Patil SP. Oleanolic acid prevents progression of streptozotocin induced diabetic nephropathy and protects renal microstructures in Sprague Dawley rats. J Pharmacol Pharmacother. 2013; 4(1):47-52.

Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare in domeniul Patologiei şi Ştiinţelor Biomedicale “Victor Babeş”

Proiect PN-II-RU-PD-2012-3-0543

Blocarea receptorilor mineralocorticoizi o soluţie terapeutică pentru prevenirea apariţiei nefropatiei diabetice şi a influenţei stresului oxidativ

Raport ştiinţific

Etapa 2 / 05.12.2013

Elaborat de, Avizat de,

Ionel-Alexandru CHECHERIŢĂ Mihail Eugen HINESCU

2

OBIECTIVUL PROIECTULUI

OB 1. Investigarea consecinţelor morfologice ale schemelor teraputice aplicate (microscopie optica

şi electronică)

OB 2. Demonstrarea diferenţelor funcţionale la nivelul ţesutului renal în diverse condiţii

terapeutice, in vivo şi după prelevarea ţesutului.

OB 3. Investigarea modificării imunofenotipului după tratament versus control.

PACHETE DE LUCRU

PL 1. Monitorizarea fiziologică a animalelor pe parcursul terapiei

PL 2. Recoltarea şi procesarea ţesutului renal

PL 3. Evaluarea morfologică a ţesutului renal prin microscopie

PL 4. Monitorizarea funcţională a probelor de ţesut

PL 5. Imunofenotipare.

OBIECTIVUL ETAPEI 1

1. Evaluarea morfologică a ţesutului renal prin microscopie

2. Monitorizarea funcţională a probelor biologice.

ACTIVITĂŢI EXPERIMENTALE IN ETAPA 2

1.1. Investigarea ultrastructurii țesutului renal prin microscopie electronică 1. Investigarea consecinţelor morfologice

ale schemelor terapeutice aplicate 1.2. Investigarea modificărilor morfologice la nivelul tesutului renal și a altor țesuturi

2.1. Determinarea și analiza parametrilor hematologici 2. Investigarea consecințelor schemelor terapeutice aplicate asupra parametrilor hematologici și biochimici 2.2. Determinarea și analiza parametrilor biochimici

urinari

3.1. Determinarea și analiza markerilor de stres oxidativ în urină

3.2. Evaluarea activității oxidative și a răspunsului la stres oxidativ în țesutul renal

3. Investigarea consecințelor schemelor terapeutice asupra statusului oxidativ la nivelul rinichiului

3.3. Investigații genomice pentru evaluarea răspunsului la stres oxidativ în țesutul renal

4. Diseminarea rezultatelor 4.1. Redactarea unui articol de tip review în domeniul proiectului

3

REZUMAT

In aceasta etapa am realizat investigarea probelor biologice recoltate de la soarecii Cg-Lepob /WiscJ,

tratati cu enalapril si spironolactona, in prezenta sau in absenta de vitamina E. Au fost realizate

investigatii in rinichii si urina animalelor exeprimentale, pentru: 1) detectarea eventualelor

modificari histologice si ultrastructurale; 2) evaluarea statusului oxidativ si a capacitatii

antioxidante in urina; 3) identificarea genelor cu profil de expresie modificat, implicate in raspunsul

celulelor renale la stres oxidativ; 4) evidentierea unor modificari biochimice in urina 5) evidentierea

modificarilor hematologice.

Rezultatele experimentale au relevat urmatoarele: 1) Leziunile ultrastructurale decelate sunt de mica

amplitudine, si, pe esantioanele studiate, neuniform distribuite in cadrul aceluiasi lot. Este necesara

continuarea colectarii de imagini pentru a identifica tendinta fenomenelor de nefropatie diabetica, in

termeni ultratstructurali. 2) Modificarile histopatologice identificate sunt reprezentate de scleroza

mesangiala usoara-moderata si hipercelularitate mesangiala (prezenta de 3 celule mesangiale in

majoritatea spatiilor mesangiale hipercelulare). Nu se observa hialinizare arteriolara sau alte leziuni

vasculare si nici ingrosarea membranei bazale ale tubilor renali. 3) Lotul de soareci cu varsta cea

mai mare este responsiv la terapia cu spironolactona si enalapril, in absenta sau in prezenta de

vitamina E. Terapia determina scaderea statistic semnificativa a concentratiei de ADN oxidat in

urina (Trat 1 – netratat p=0,004256; Trat 2 – netratat p=0,0324). Nu am constatat diferente intre

loturile de soareci Cg-Lepob /WiscJ netratati, ceea ce sugereaza ca soarecii prezinta status oxidativ

similar la nivel renal, in intervalul de varsta 87-70 zile. 4) Subexpimarea unor gene importante

pentru sistemul antioxidant, documentate in aceasta etapa a proiectului, s-ar putea sa fie consecinta

gradului scazut de stres oxidativ in rinichiul soarecelui Cg-Lepob /WiscJ. Alternativ, este posibil sa

reprezinte un defect de combatere a stresului oxidativ, si sa influenteze de asemenea negativ

semnalizarea redox intracelulara. Prin evaluarea markerilor de stres oxidativ in rinichiul soarecilor

Cg-Lepob /WiscJ, comparativ cu animale normale, se va putea clarifica statusul oxidativ al rinichilor

animalelor transgenice studiate, ceea ce va clarifica cauza subexprimarii antioxidantilor endogeni.

5) A fost evidentiata subexprimarea genei Scd1 care determina scaderea sintezei de acizi grasi

nesaturati si cresterea susceptibilitatii la peroxidare lipidica. Perturbarea este adancita prin

subexprimarea apolipoproteinei E, care mediaza legarea, internalizarea si catabolizarea

lipoproteinelor. Prin subexprimarea genei Ucp3 scade capacitatea mitocondriilor de a controla

fluxul de acizi grasi.

Au fost submise pentru publicare 2 articole de tip review in domeniul proiectului, dintre care

unul la revista “Mediators of inflammation” (factor de impact 2,417), cel de-al doilea la Chinese

Medical Journal..

4

REZULTATE

1. Investigarea consecinţelor morfologice ale schemelor terapeutice aplicate

1.1. Investigarea ultrastructurii tesutului renal prin microscopie electronică

Microscopie electronica

Tehnica prelucrarii fragmentelor de tesut cardiac pentru analiza ultrastructurala Analiza structurii si ultrastructurii tesutului renal a fost efectuata pe materialul inclus in rasina epoxidica (Epon) conform procedurii standard in laboratorul de Patologie Ultrastructurala.

Includerea fragmentului bioptic renal in rasina epoxidica

Temperatura Timp

Fixarea tesutului in glutaraldehida 4% tamponata cu TCS 0,1M. Tesutul a fost taiat in cuburi de aproximativ 1 mm3 pentru a fi corect fixat.

4 o C min 4 ore

Spalare in tampon cacodilat de sodiu (TCS) 0,1 M 4 o C 2 x 1 h Post-fixare cu tetraoxid de osmiu 0,1 M 4 o C 1 h Spalare in TCS 0,1 M 4 o C 2x 10-15min Deshidratare alcool etilic 30o 4 o C 15-30 min Deshidratare alcool etilic 50 o 4 o C 15-30 min Deshidratare alcool etilic 70 o 4 o C 15-30 min Deshidratare alcool etilic 90 o 4 o C 15-30 min Deshidratare alcool etilic 96 o TC 2x15 min Deshidratare alcool etilic 100 o TC 3x15 min Propilen oxid TC 2x15 min Baia I: Propilen oxid/ rasina epoxidica (2/1) TC 2 h Baia II: Propilen oxid/ rasina epoxidica (1/2) TC peste noapte Baia III: Rasina epoxidica in recipiente neacoperite (pentru a se evapora restul de propylen oxid)

TC 2-3 h

Includere in rasina epoxidica in capsule de plastic etichetate TC - Polimerizarea rasinii epoxidice 60 o C 48 h

Examinarea fragmentelor de tesut a fost efectuata in prima etapa cu microscopul optic pe sectiuni

(semifine) de 1 micron grosime pentru evaluare hitologica. Colorarea sectiunilor semifine a fost

facuta cu albastru de toluidina.

Dupa apreciere generala microscopo-optica a sectiunilor semifine am orientat structurilor de interes

pentru realizarea sectiunilor ultrafine (60-80 nm) necesare evaluarii electrono-microscopice.

Contrastarea sectiunile fine incluse in epon a fost facuta cu acetat de uranyl 1% si solutie Reynolds.

Sectionarea a fost realizata cu un ultramicrotom RMC iar examinarea la un microscop electronic cu

transmisie FEI Morgagni 268 la 80kV. Imaginile relevante au fost achizitionate cu CCD

MegaView III (Olympus).

P*

5

LOT 1 Lot 1.1

Rare zone cu MBG ingrosate

Lot 1.2 Aspect ultrastructural in limite normale

Lot 1.3


Lot 1.4 Aspect ultrastructural in limite normale

LOT 2 Lot 2.1

rare zone cu MBG ingrosate

LOT 3

6

Lot 3.1


Lot 3.2


Lot 3.3

Zone cu MBG ingrosate

In aceasta etapa au fost examinate doar o parte din esantioanele tisulare recoltate, din fiecare

lot, cu exceptia loturilor 2.2, 2.3.

Tehnica de microscopie electronica presupune un volum mare de mnca si este consumatoare

de timp. Inainte de a dispune de o colectie semnificativa de imagini pentru fiecare din loturi, se

poate identifica doar o tendinta de constituire a leziunilor, iar efectele interventie farmacologice nu

pot fi inca evaluate corect, inainte de a dispune de intreaga colectie de imagini.

Pentru aceasta etapa s-au observat: o mare variabilitate inter-individuala in ceea ce priveste

dezvoltatrea spontana a leziunilor si diferente, acolo unde leziunile s-au instalat, in prezenta unui

tratament, distributia leziunilor decelabile ultrastructural este neuniforma si inegala. Exista spre

7

exemplu, sectiuni ultrastrcturale in care apar leziuni la nivelul unui singur glomerul, care se gaseste

la mica distanta de alti doi glomerului cu aspect ultrastructural normal.

Leziunile ultrastructurale decelate sunt de mica amplitudine, si, pe esantioanele studiate,

neuniform distribuite in cadrul aceluiasi lot. Este necesara continuarea colectarii de imagini pentru a

identifica tendinta fenomenelor de nefropatie diabetica, in termeni ultratstructurali. Aceste studii

vor fi efectuate in etapa urmatoare.

1.2. Investigarea modificărilor morfologice la nivelul ţesutului renal şi a altor ţesuturi

LOTUL 2

Sublot 2.1 – Terapie 1 (bloc de parafina 216224)

Fragmentele de tesut renal recoltate de la cei 5 soricei din sublotul 2.1 au la coloratia conventionala

hematoxilin-eozina (HE) aspect histologic de parenchim renal cu arhitectura prezervata, marginit de

tesut adipos perirenal, cu zone de tesut adipos brun. Capsula renala este subtire, fara modificari

histologice. Corticala renala este compusa din glomeruli predominant cu arhitectura conservata si

sunt formati dintr-o retea de capilare sustinuta de 1-2 celule mesangiale si tubi renali contorti

proximali si contorti fara modificari histologice evidente la coloratiile HE si PAS. Aproximativ 5%

dintre glomeruli prezinta usoara hipercelularitate mesangiala (un numar de 3, maxim 4 celule

mesangiale) si aproximativ 10—15% prezinta scleroza mesangiala, evidentiata de coloratia PAS.

Capsula Bowman este alcatuita dintr-un strat de celule epiteliale parietale plate sau cuboide, fara

ingrosari vizibile la coloratiile HE si PAS. Tubii renali corticali sunt tapetati de celule cubice cu

citoplasma eozinofila, granulara, in zonele corticale superficiale citoplasma fiind vacuolizata, si

nuclei cu cromatina uniform dispersata. Ei nu prezinta ingrosare a membranei bazale tubulare la

coloratia PAS. Vasele capilare prezinta focal hiperemie usoara. Zona medulara renala contine

bratele descendente si ascendente ale tubilor contorti si tubii renali colectori cu traiect rectiliniu cu

epiteliu aplatizat, structuri fara modificari histologice decelabile la coloratiile HE si PAS. Pelvisul

renal si ureterul sunt tapetate de epiteliu de tip urotelial si nu prezinta modificari histologice atat la

coloratia conventionala HE, cat si la coloratia speciala PAS.Arteriolele si arterele prezinta structura

histologica prezervata, fara hialinizare. Interstitiul renal este normal, fara modificari fibrotice.

Sublot 2.2 – Terapie 2 (bloc de parafina 216225)

Fragmentele de tesut renal, recoltate de la 5 soricei din sublotul 2.2, prezinta la coloratia

conventionala hematoxilin-eozina (HE) aspect histologic de parenchim renal cu arhitectura

conservata. Tesutul renal este marginit de o capsula renala subtire, fara modificari histologice, si

inconjurat de tesut adipos perirenal, cu zone de tesut adipos brun. La nivelul corticalei renale,

aproximativ 10% dintre glomeruli prezinta hipercelularitate mesangiala (un numar de 3, maxim 4

celule mesangiale) si aproximativ 10—15% prezinta scleroza mesangiala usoara, evidentiata de

coloratia PAS. Capsula Bowman prezinta un strat de celule epiteliale parietale plate sau cuboide,

8

fara scleroza sau ingrosari vizibile la coloratiile HE si PAS. Tubii renali contorti proximali si distali

de la nivelul cortexului renal nu prezinta modificari histologice evidente la coloratiile HE si PAS,

fiind tapetati de celule cubice cu citoplasma eozinofila, granulara, cu vacuolizari citoplasmatice

focal, in zonele corticale superficiale, dar fara ingrosari ale membranei bazale tubulare la coloratia

PAS. Vasele capilare prezinta focal hiperemie usoara. Zona medulara renala contine tubi renali fara

modificari histologice decelabile la coloratiile HE si PAS. Pelvisul renal si ureterul sunt tapetate de

epiteliu de tip urotelial si nu prezinta modificari histologice atat la coloratia conventionala HE, cat

si la coloratia speciala PAS.Arteriolele si arterele prezinta structura histologica prezervata, fara

hialinizare. Interstitiul renal este normal, fara modificari fibrotice.

Sublot 2.3 – Control vehicul (bloc de parafina 216226)





aproximativ 10% dintre glomeruli prezinta hipercelularitate mesangiala usoara (un numar de 3,

maxim 4 celule mesangiale) si aproximativ 20% dintre glomeruli prezinta scleroza mesangiala

usoara, evidentiata de coloratia PAS. Capsula Bowman prezinta structura histologica prezervata,

fara scleroza sau ingrosari vizibile la coloratiile HE si PAS. Tubii renali contorti proximali si distali

de la nivelul cortexului renal nu prezinta modificari histopatologice evidente la coloratiile HE si

PAS, fara ingrosari ale membranei bazale tubulare la coloratia PAS. Zona medulara renala contine

tubi renali fara modificari histologice decelabile la coloratiile HE si PAS. Pelvisul renal si ureterul,

de asemenea, nu prezinta modificari histologice atat la coloratia conventionala HE, cat si la

coloratia speciala PAS.Arteriolele si arterele prezinta structura histologica prezervata, fara

hialinizare. Interstitiul renal este normal, fara modificari fibrotice.

Sublot 2.4 – Control netratat (bloc de parafina 216227)





aproximativ 10% dintre glomeruli prezinta hipercelularitate mesangiala usoara (un numar de 3,

maxim 4 celule mesangiale) si aproximativ 30% prezinta scleroza mesangiala moderata, evidentiata

de coloratia PAS. Capsula Bowman prezinta structura histologica prezervata, fara scleroza sau

ingrosari vizibile la coloratiile HE si PAS. Tubii renali contorti proximali si distali de la nivelul

cortexului renal nu prezinta modificari histopatologice evidente la coloratiile HE si PAS, fara

ingrosari ale membranei bazale tubulare la coloratia PAS. Zona medulara renala contine tubi renali

9

fara modificari histologice decelabile la coloratiile HE si PAS. Pelvisul renal si ureterul, de

asemenea, nu prezinta modificari histologice atat la coloratia conventionala HE, cat si la coloratia

speciala PAS. Arteriolele si arterele prezinta structura histologica prezervata, fara hialinizare.

Interstitiul renal este normal, fara modificari fibrotice.

LOTUL 3

Sublotul 3.1 – Terapie 1 (bloc de parafina 216228)

Fragmentele de tesut renal, recoltate de la 6 soricei din sublotul 3.1, prezinta la coloratia HE aspect

histologic de parenchim renal cu arhitectura conservata. Capsula renala este subtire, fara modificari

histologice, si este inconjurata de tesut adipos perirenal, cu zone de tesut adipos brun. La nivelul

cortexului renal, aproximativ 10% dintre glomeruli prezinta hipercelularitate mesangiala usoara (un

numar de 3, maxim 4 celule mesangiale) si aproximativ 20% dintre glomeruli prezinta scleroza

mesangiala moderata, evidentiata de coloratia PAS. Capsula Bowman este conservata si nu prezinta

scleroza sau ingrosari vizibile la coloratiile HE si PAS. Tubii renali contorti proximali si distali de

la nivelul cortexului renal nu prezinta modificari histopatologice evidente la coloratiile HE si PAS,

fara ingrosari ale membranei bazale tubulare la coloratia PAS. Zona medulara renala contine tubi

renali fara modificari histologice decelabile la coloratiile HE si PAS. Pelvisul renal si ureterul, de

asemenea, nu prezinta modificari histologice atat la coloratia conventionala HE, cat si la coloratia

speciala PAS.

Structurile vasculare de tip arterial (arteriole si artere) prezinta structura histologica prezervata, fara

hialinizare a peretelui sau fibroza intimala. Interstitiul renal este normal, fara modificari fibrotice.

Sublotul 3.2 – Terapie 2 (bloc de parafina 216229)



histologice si este inconjurata de tesut adipos perirenal, cu zone de tesut adipos brun. La nivelul



mesangiala moderata, evidentiata de coloratia PAS. Capsula Bowman prezinta structura histologica

prezervata, fara scleroza sau ingrosari vizibile la coloratiile HE si PAS. Tubii renali contorti

proximali si contorti de la nivelul cortexului renal nu prezinta modificari histopatologice evidente la

coloratiile HE si PAS, fara ingrosari ale membranei bazale tubulare la coloratia PAS. Zona

medulara renala contine tubi renali fara modificari histologice decelabile la coloratiile HE si PAS.

Pelvisul renal si ureterul, de asemenea, nu prezinta modificari histologice atat la coloratia

conventionala HE, cat si la coloratia speciala PAS.



10

Sublotul 3.3 – Control vehicul(bloc de parafina 216230)















Sublotul 3.4 – Control netratat (bloc de parafina 216231)















11

Figura 1.2.1. Scleroza mesangiala si hipercelularitatea mesangiala usoara. Coloratie HE 20x

Figura 1.2.2. Scleroza mesangiala in comparatie cu un glomerul normal. Coloratie HE 20x

Figura 1.2.3. Scleroza mesangiala. Coloratie PAS 20x

12

Figura 1.2.4. Artera cu aspect histologic conservat 2. Investigarea consecintelor schemelor terapeutice aplicate asupra parametrilor hematologici

si biochimici 2.1. Determinarea si analiza parametrilor hematologici

La sacrificarea sorecilor a fost recoltat sange si s-a realizat testarea hematologica. Datele prezentate

in Figura 2.1 arata ca, in cazul lotului 1 de animale (cu varsta cea mai mare), terapia cu enalapril si

spironolactona induce cresterea numarului de limfocite si monocite periferice. Un efect similar se

inregistreaza in cazul lotului 3 de animale (cu varsta cea mai mica).

O manifestare diferita se remarca in cazul lotului 3 (cu varsta intermediara). Asistam la scaderea

numarului de limfocite periferice, fara ca monocitele sa fie statistic afectate ca numar (comparatie

cu sublotul de animale tratate cu vehicul). Lotul 2 este singurul lot in care am constatat modificari

hematologice induse de vehicol, respectiv scaderea drastica a numarului de monocite si limfocite

periferice.

Hematologie WBC

0

2

4

6

8

10

12

14

16


WB

C (

K/m

icro

L)

Lot 3

Lot 2

Lot 1

13

Hematologie LY

0

2

4

6

8

10

12


LY

(K

/mic

roL

)

Lot 3

Lot 2

Lot 1

Hematologie MO

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8


MO

(K

/mic

roL

)

Lot 3

Lot 2

Lot 1

Figura 2.1. Parametri hematologici statistici ai soarecilor Cg-Lepob /WiscJ tratati 16-21 zile cEn+Sp+VitE). Animale netratate sau tratate cu vehicul (hidroxietilceluloza) au constituit lotul control. Grupurile de soareci au diferit prin varsta la momentul sacrificarii (lot 1-87 zile, lot 2-76 zile, lot 3-70 zile). Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei.

14

2.2. Determinarea şi analiza parametrilor biochimici urinari

Proteine urinare (evaluare calitativa) Numarul de soareci cu proteine urinare la 100 mg/dL, din numarul total de animale pe sublot

netratat tratat LOT 1 2 din 7 0 din 6 LOT 2 4 din 6 2 din 5 LOT 3 6 din 8 5 din 6

Conform datelor obţinute la evaluarea calitativă, şi prezentate în graficele de mai sus, s-a înregistrat o creştere semnificativă a glicemiei la animalele din lotul 3, netratat.

3. Investigarea consecinţelor schemelor terapeutice asupra statusului oxidativ la nivel renal

15

3.1. Determinarea şi analiza markerilor de stres oxidativ în urină

In urina animalelor experimentale, recoltata in ultimele 24 h inainte de sacrificare, am investigat

stresul oxidativ, analizand ca marker ADN-ul mitocondrial si genomic oxidat, respectiv 8-hidroxi-

2'-deoxiguanozina (8-OhdG) urinara. Determinarea s-a realizat prin ELISA, cu kitul DNA Damage

ELISA Kit (Enzo Life Sciences), conform protocolului furnizat de producator.

Datele experimentale din Figura 3.1 arata ca numai lotul 1 de soareci (cu varsta cea mai mare) este

responsiv la terapia cu spironolactona si enalapril, in absenta sau in prezenta de vitamina E (Treat 1,

respective Treat 2). Terapia determina scaderea statistic semnificativa a concentratiei de ADN

oxidat in urina (Treat 1 – netratat p=0,004256; Treat 2 – netratat p=0,0324). Nu am constatat

diferente intre loturile de soareci Cg-Lepob /WiscJ netratati, ceea ce sugereaza ca soarecii prezinta

status oxidativ similar la nivel renal, in intervalul de varsta 87-70 zile.

Urine oxidized DNA

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Group 1 Group 2 Group 3

Experimental mice groups

8-O

Hd

G c

on

cen

trat

ion

(n

g/m

L)

Treat 1

Treat 2

Untreat

Figura 3.1. Concentratia de ADN oxidat (8-OHdG) in urina soarecilor Cg-Lepob /WiscJ tratati 16 zile cu spironolactona si enalapril (Treat 1), sau cu spironolactona, enalapril si vitamina E (Treat 1). Animale netratate sau tratate cu vehicul (hidroxietilceluloza) au constituit lotul control. Grupurile de soareci au diferit prin varsta la momentul sacrificarii (lot 1-87 zile, lot 2-76 zile, lot 3-70 zile). Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei.

3.2. Evaluarea activitătii oxidative si a răspunsului la stres oxidativ în tesutul renal

In urina animalelor experimentale, recoltata in ultimele 24 h inainte de sacrificare, am investigat

capacitatea antioxidanta totala. Am utilizat kitul Total Antioxidant Capacity Colorimetric Assay kit

(BioVision), care se bazeaza pe reactia de oxidoreducere a Cu2+.

Datele experimentale descrise in Figura 3.2 arata ca terapia cu enalapril si spironolactona,

suplimentata sau nesuplimentata cu vitamina E, nu afecteaza statistic semnificativ capacitatea

antioxidanta a urinei soarecilor din loturile 1 si 2 (cu varsta mare si intermediara). Remarcam totusi

faptul ca scaderea stresului oxidativ indusa de terapia cu enalapril si spironolactona in cazul

soarecilor din lotul 1 (Figura 3.1) este insotita de tendinta de crestere a capacitatii antioxidante in

urina (Figura 3.2).

In mod surprinzator, constatam ca terapia reduce capacitatea antioxidanta in urina in cazul

soarecilor tineri, din lotul 3 (p=0,003311, Figura 3.2).

16

Urine total antioxidant capacity

0

5

10

15

20

25

30



TA

C (

mM

)

Treat 1

Treat 2

Untreat

Urine total antioxidant capacity

0

5

10

15

20

25

30



TA

C (

mM

)

Treated

Untreated

Figura 3.2. Capacitatea antioxidanta totala in urina soarecilor Cg-Lepob /WiscJ tratati 16 zile cu spironolactona si enalapril (Treat 1), sau cu spironolactona, enalapril si vitamina E (Treat 1). Animale netratate sau tratate cu vehicul (hidroxietilceluloza) au constituit lotul control. Grupurile de soareci au diferit prin varsta la momentul sacrificarii (lot 1-87 zile, lot 2-76 zile, lot 3-70 zile). Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei.

Am realizat un stiu de corelare a markerilor de stres oxidativ si a capacitatii antioxidante totale in

urina animalelor de experiment.

In grupurile 1 si 2 (cu varsta mare si intermediara) tratati cu spironolactona, enalapril si vitamina E

exista o corelatie negativa intre cei 2 parametrii (lot 1: r=-0,98144, p=0,030297; lot 2: r= -0,90968,

p= 0,032242). Aceasta indica tipul de mecanism de actiune al terapiei, respectiv scaderea stresului

oxidativ pare sa se datoreze cresterii capacitatii antioxidante totale. In cazul lotului de soareci tineri

(lotul 3), corelatia negativa se manifesta in cazul terapiei cu spironolactona si enalapril, fara

suplimentare cu vitamina E (r= -0,87611, p= 0,004963).

La loturile 1 si 3 corelatia intre cele doua marimi analizate este pozitiva (lotul 1 - terapie cu

enalapril si spironolactona, lotul 3 – terapie cu enalapril, spironolactona si vitamina E). Aceste

rezultate indica tipul de raspuns la stres oxidativ, respectiv cresterea stresului oxidativ dicteaza

cresterea capacitatii antioxidante.

3.3. Investigații genomice pentru evaluarea răspunsului la stres oxidativ în tesutul renal

Pentru a identifica profilul genic care caracterizeaza raspunsul la stres oxidativ in rinichiul

soarecilor Cg-Lepob /WiscJ, comparativ cu soarecii normali, am realizat un studiu genomic pe 84

17

gene relavante. Am aplicat metoda „pathway-focused PCR array”, care furnizeaza informatii

cantitative privind gradul de exprimare al genelor din panel (Tabel 1, Mouse Oxidative Stress and

Antioxidant Defense PCR Array, Qiagen). Determinarile au fost realizate pe rinichi de la un soarece

Cg-Lepob /WiscJ din lotul netratat, care a fost comparat cu profilul de exprimare genica al

rinichiului de la un soarece normal C57Black, cu varsta similara.

Table 1. Panelul de gene din kitul Mouse Oxidative Stress and Antioxidant Defense PCR Array

(Qiagen)

Antioxidanti:

Glutation peroxidase (GPx): Gpx1, Gpx2, Gpx3, Gpx4, Gpx5, Gpx6, Gpx7, Gpx8, Gstk1.

Peroxiredoxine (TPx): Ehd2, Prdx1, Prdx2, Prdx3, Prdx4, Prdx5, Prdx6.

Alte peroxidaze: Aass, Apc, Cat, Ctsb, Duox1, Epx, Kif9, Lpo, Mpo, Prdx6-ps1, Ptgs1, Ptgs2,

Rag2, Serpinb1b, Slc41a3, Tmod1, Tpo.

Alti antioxidanti: Gsr, Nxn, Sod1, Sod3, Srxn1, Txnrd1, Txnrd2, Txnrd3, Zmynd17.

Gene implicate in metabolismul ROS:

Superoxid dismutase (SOD): Sod1, Sod2, Sod3.

Alte gene implicate in metabolismul anionului superoxid: Ccs, Cyba, Ncf2, Nos2, Nox1, Nox4,

Noxa1, Noxo1, Recql4, Scd1.

Alte gene implicate in metabolismul ROS: Fmo2, Il19, Il22.

Gene responsive la stress oxidativ: Aass, Als2, Apoe, Cat, Ctsb, Duox1, Epx, Ercc2, Ercc6, Gab1,

Gpx1, Gpx2, Gpx3, Gpx4, Gpx5, Gpx6, Gpx7, Idh1, Mpo, Mpp4, Nqo1, Nudt15, Park7, Ppp1r15b,

Prdx1, Prdx2, Prdx6, Prnp, Psmb5, Sod1, Tpo, Txnip, Txnrd2, Ucp3, Xpa.

Transportori de oxigen: Aqr, Atr, Cygb, Dnm2, Fancc, Hbq1a, Ift172, Mb, Ngb, Slc38a1, Vim,

Xirp1.

Tabel 2. Gene cu profil de expresie modificat fata de normal in rinichiul unui soarece Cg-Lepob

/WiscJ.

Gene Symbol Fold Regulation Gene Symbol Fold Regulation Gene Symbol Fold Regulation

Ptgs2 6,91 Lpo -18,51 Duox1 -2,31

Tpo 3,46 Scd1 -18,51 Ehd2 -2,31

Ccl5 -18,51 Ercc6 -2,31

Nox1 -9,26 Fmo2 -2,31

Ucp3 -9,26 Gclm -2,31

Aox1 -4,63 Gpx4 -2,31

Cat -4,63 Gpx6 -2,31

Cygb -4,63 Gss -2,31

Ercc2 -4,63 Gstk1 -2,31

Fancc -4,63 Gstp1 -2,31

18

Gclc -4,63 Hmox1 -2,31

Gpx2 -4,63 Idh1 -2,31

Il19 -4,63 Ncf1 -2,31

Serpinb1b -4,63 Nox4 -2,31

Nqo1 -2,31

Sod2 -2,31

Vim -2,31

Xpa -2,31

Apc -2,31

Apoe -2,31

Ccs -2,31

Rezultatele obtinute sunt descrise in Tabelul 2. Analiza genomica a evidentiat 2 gene

supraexprimate si 35 gene subexprimate in rinichiul sorecelui Cg-Lepob /WiscJ, comparativ cu un

rinichi de soarece normal, relativ la raspunsul la stresul oxidativ.

Dintre genele cu expresie modificata, am selectat pentru interpretare pe cele puternic sub- sau –

supraexprimate si am realizat corelatii cu gene cu expresie mai putin modificata.

Gene puternic supraexprimate (supraexprimare de 6,1 ori)

– Ptgs2 – forma inductibila a ciclooxigenazei (prostaglandin-endoperoxid sintaza): este

implicata in sinteza de prostaglandine cu rol de mediatori ai inflamatiei si mitogeneza.

Supraexprimarea acestei gene este indicator al unui proces inflamator, ceea ce se coreleaza

si cu subexprimarea genei Scd1 (vezi mai jos).

Gene puternic subexprimate in rinichiul soarecelui Cg-Lepob /WiscJ, comparativ cu soarecele

normal (subexprimare de 18,51 ori)

Scd1 – stearoil-CoA desaturaza 1

– Enzima catalizeaza sinteza acizilor grasi mono-nesaturati din acizi grasi saturati.Soarecii

asebia, care au o alela nula Scd1 sau soarecii la care a fost alterat locusul Scd1 prezinta un

fenotip “slavb”, cu consum crescut de energie si sensibilitate crescuta la insulina1,2.

Subexprimarea inregistrata in Scd1 in cazul soarecilor investigati in acest studiu poate fi

unul dintre factorii genici care determina fenotipul „slab”. Un nivel scazut de Scd1

protejeaza fata de perturbari metabolice, cum ar fi obezitatea si rezistenta la insulina.

1 Ntambi, J.M., et al. 2002. Loss of stearoyl-CoA desaturase-1 function protects mice against adiposity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:11482-11486. 2 Maeda, K., et al. 2005. Adipocyte/macrophage fatty acid binding proteins control integrated metabolic responses in obesity and diabetes. Cell Metab. 1:107-119.

19

– Din punctul de vedere al stresului oxidativ, subexprimarea Scd1 poate fi asociata cu un grad

crescut de oxidare lipidica. In acelasi timp, subexprimarea Scd1 determina susceptibilitate

mai mare la procese inflamatorii, prin modificarea profilului lipidic3.

Lpo – lactoperoxidaza

– Este o haloperoxidaza care functioneaza ca un agent natural antibacterian, prin cataliza

oxidarii unor substraturi organice si anorganice de catre apa oxigenata

– Scaderea expresiei Lpo este asociata posibil unui profil scazut de stres oxidativ in rinichiul

investigat. Avand in vedere a lactoperoxidaza este constituent al granulelor neutrofilului, si

se exprima de asemenea de catre monocite/macrofage, este posibil ca subexprimarea genei

sa reflecte un infiltrat scazut de fagocite in cazul animalului studiat, comparativ cu profilul

genic al soarecelui normal.

– Capacitatea scazuta de recrutare a leucocitelor in rinichi se reflecta si prin subexprimarea

Ccl5, care codifica pentru RANTES, chemokina care se adreseaza limfocitelor T .

Alte gene implicate in stresul oxidative care sunt subexprimate

– gene care codifica pentru surse de ROS: Nox1 si Nox 4 din familia NADPH-oxidazelor.

Subexprimarea Nox4 reduce stresul oxidativ local, dar poate afecta si functionalitatea

celulelor renale prin alterarea unor cai de semnalizare. Este de asemenea inhibata aldehid

oxidaza 1 (Aox1) care catalizeaza producerea de apa oxigenta si, in unele conditii, de anion

superoxide.

– gene care codifica pentru enzime antioxidante: Cat (catalaza) si Sod2 (superoxid

dismutaza, forma mitocondriala), Gpx2, Gpx4 si Gpx6 (glutation peroxidaze), Gclm

(glutamat-cistein ligaza care catalizeaza prima etapa in sinteza glutationului). In consecinta,

este scazuta capacitatea de protectie fata de stresul oxidativ prin afectarea unor enzime care

detoxifica apa oxigenata. Subexprimarea genelor care codifica pentru antioxidanti ar putea

reprezenta un defect de combatere a astresului oxidativ, dar s-ar putea datora si productiei

scazute de specii reactive de oxigen (ROS) in rinichiul soarecilor Cg-Lepob /WiscJ.

– gene care controleaza stresul oxidativ la lipide: Ucp3 – proteina mitocondriala de

decuplare a fosforilarii oxidative de sinteza de ATP. Subexprimarea Ucp3 creste

susceptibilitatea mitocondriei la stresul oxidativ mediat de lipde. Gradul de exprimare creste

atunci cand mitocondria se confrunta cu un exces de acizi grasi, proteina codificata de Ucp3

avand rolul de a exporta acizii grasi din mitocondrie.

3 Liu X, Strable MS, Ntambi JM. Stearoyl CoA Desaturase 1: Role in Cellular Inflammation and Stress. Adv Nutr, 2: 15-22, 2011.

20

– gene care controleaza fibrinoliza: Serpin1b (inhibitor de serin proteaze) care este

inhibitorul principal al activatorului de plasminogen tisular si al urokinazei, implicit

inhiband fibrinoliza. Valori scazute ale Serpinei1 conduc la degradarea fibrinei, scazand

astfel gradul de depunere al fibrinei in tesuturi in conditii inflamatorii. Rezultatele indica

faptul ca angiotensina II nu semnalizeaza sinteza Serpin1b, ceea ce scade riscul de

ateroscleroza.

Multitudinea de gene care sunt responsive la stres oxidativ, si a caror expresie este scazuta in

rinichiul soarecelui Cg-Lepob /WiscJ (Tabelul 1, gene marcate cu albastru), corelat cu surse

importante de ROS care sunt supraexprimate, sugereaza un stres oxidative scazut in rinichiul

acestor soareci transgenici.

4. Diseminarea rezultatelor

4.1. Redactarea unui articol de tip review în domeniul proiectului

A fost elaborat articolul de tip review cu titlul "OXIDATIVE STRESS – A MATTER OF LIFE

AND DEATH IN DIABETIC NEPHROPATHY", autori Gina Manda, Alexandru-Ionel Checherita,

Maria Victoria Comanescu, Mihail Eugen Hinescu. Articolul a fost submis la revista “Mediators of

Inflammation” (factor de impact 2,417), in cadrul numarului special "Live or Die: Choice

Mechanisms in Stressed Cells” (nr. de identificare 604208). Al doilea manuscris, cu titlul "NEW

INSIGHTS OF DIABETIC NEPHROPATHY - A NEVER ENDING AND COMPLEX STORY" a

fost trimis la Chinese Medical Journal. (Numarul de identificare este "cmj_369_14").

Concluzii de etapa ale studiului ultrastructural

Inainte de a dispune de o colectie semnificativa de imagini pentru fiecare din loturi, se poate

identifica doar o tendinta de constituire a leziunilor, iar efectele interventie farmacologice nu pot fi

inca evaluate corect, inainte de a dispune de intreaga colectie de imagini.

Pentru aceasta etapa s-au observat: o mare variabilitate inter-individuala in ceea ce priveste

dezvoltarea spontana a leziunilor si diferente, acolo unde leziunile s-au instalat, in prezenta unui

tratament, distributia leziunilor decelabile ultrastructural este neuniforma si inegala. Exista spre

exemplu, sectiuni ultrastructurale in care apar leziuni la nivelul unui singur glomerul, care se

gaseste la mica distanta de alti doi glomerului cu aspect ultrastructural normal.

Leziunile ultrastructurale decelate sunt de mica amplitudine, si, pe esantioanele studiate,

neuniform distribuite in cadrul aceluiasi lot. Este necesara continuarea colectarii de imagini pentru a

identifica tendinta fenomenelor de nefropatie diabetica, in termeni ultratstructurali.

Concluzii ale examenului histopatologic

Aspectul histopatologic in loturile si subloturile studiate este de nefropatie diabetica moderata si

este similar intre acestea, neputandu-se decela diferente notabile morfologice la coloratia uzuala

21

hematoxilin-eozina si coloratia speciala PAS. Modificarile histopatologice identificate sunt

reprezentate de scleroza mesangiala usoara-moderata si hipercelularitate mesangiala (prezenta de 3

celule mesangiale in majoritatea spatiilor mesangiale hipercelulare). Nu se observa hialinizare

arteriolara sau alte leziuni vasculare si nici ingrosarea membranei bazale ale tubilor renali.

Concluzii privind activitatea oxidativa şi răspunsul la stres oxidativ, în ţesutul renal

La loturile 1 si 3 corelatia intre cele doua marimi analizate este pozitiva (lotul 1 - terapie cu

enalapril si spironolactona, lotul 3 – terapie cu enalapril, spironolactona si vitamina E). Aceste

rezultate indica tipul de raspuns la stres oxidativ, respectiv cresterea stresului oxidativ dicteaza

cresterea capacitatii antioxidante.

Concluziile studiului genomic

Investigatia genomica la nivelul genelor relevante pentru stresul oxidativ a relevat unele

particularitati ale rinichiului soarecilor, comparativ cu soareci C57Black normali.

Productia de ROS la nivelul rinichiului soarecelui pare sa fie redusa in comparatie cu

soarecele normal, intrucat surse majore de ROS in rinichi, cum ar fi Nox 4, sunt subexprimate. In

acelasi timp, remarcam ca sisteme antioxidante majore sunt de asemenea subexprimate. Remarcam

faptul ca activitatea antioxidanta a glutationului pare sa fie inhibata, prin subexprimarea unei

enzime cheie in sinteza tripeptidului, si prin inhibarea a 3 glutationperoxidaze. Subexpimarea unor

gene importante pentru sistemul antioxidant s-ar putea sa fie consecinta gradului scazut de stres

oxidativ in rinichiul soarecelui Cg-Lepob /WiscJ. Alternativ, este posibil sa reprezinte un defect de

combatere a stresului oxidativ, si sa influenteze de asemenea negativ semnalizarea redox

intracelulara. Prin evaluarea markerilor de stres oxidativ in rinichiul soarecilor Cg-Lepob /WiscJ,

comparativ cu animale normale, se va putea clarifica statusul oxidativ al rinichilor animalelor

transgenice studiate, ceea ce va clarifica cauza subexprimarii antioxidantilor endogeni.

Au fost evidentiate perturbari la nivelul metabolismului lipidic. Am evidentiat

subexprimarea genei Scd1 care determina scaderea sintezei de acizi grasi nesaturati si cresterea

susceptibilitatii la peroxidare lipidica. Perturbarea este adancita prin subexprimarea apolipoproteinei

E, care mediaza legarea, internalizarea si catabolizarea lipoproteinelor. Prin subexprimarea genei

Ucp3 scade capacitatea mitocondriilor de a controla fluxul de acizi grasi.

Supraexprimarea genei care codifica pentru cicloxigenaza, de asemenea implicata in

metabolismul lipidic, indica existenta unui proces inflamator activ in rinichiul soarecilor Cg-Lepob

/WiscJ. Profilul genic sugereaza insa ca acesta nu pare sa fie asociat cu recrutare crescuta de

leucocite pro-inflamatoare (fagocite si limfocite T). In plus, subexprimarea genei Serpin 1

sugereaza faptul ca procesul inflamator nu este insotit de depunere crescuta de fibrina.

institutul national de cercetare-dezvoltare in domeniul ... · lotul de şoareci vârstnici (lotul...

Documents