IMUNOLOGIE IIReactiile de precipitareReactiile de precipitare se folosesc pentru a masura concentratii de Ac sau Ag. Precipitarea implica interactiunea antigenelor solubile cu anticorpii in proportie corecta, rezultatul fiind obtinerea unui precipitat vizibil. Antigenele solubile utilizate in reactiile de precipitare sunt solutii de molecule de natura proteica sau carbohidrati.Anticorpii care agrega Ag solubile se numesc precipitine, pot sa fie monoclonali sau policlonali. Cea mai simpla reactie de precipitareconsta in adaugarea unei solutii de antigen intr-un volum mic de antiser, la interfata dintre cei doireactivi se formeaza un inel.Fenomenul are la baza faptul ca anticorpii au mai mult de o valenta si ca atare se pot lega in reteala antigenele prezente. Reactiile de precipitare se pot desfasura in mediu lichid (turbidimetrie, nefelometrie) sau solid (imunodifuzie radiala, imunoelectroforeza).ehnici calitative! "ubla difuzie #uchterlon$ %lectroforeza proteica in gel Contraimunoelectroforeza &munoelectroforeza &munofi'areaeste cantitative! &munodifuzia radiala %lectroimunodifuzia (aurellReactii de precipitare in solutie)i'area Ac si Ag in forma solubila in eprubeta poate evolua in doua directii! Raman in forma solubila Formeaza precipitatPrin adaugarea de cantitati crescande de Ag la o cantitate fi'a de Ac se construieste curba de precipitare *eidelberger care poate fi impartita in trei zone!+. ,ona de e'ces Ac- dupa centrifugare comple'e Ag-Ac raman Ac in solutie- aici se formeaza comple'e solubile Ac-Ag, raportul Ag.Ac este scazut./. ,ona de echivalenta 0 formare eficienta comple'e Ac-Ag, nu raman in solutie Ag sau Ac,se formeaza comple'e insolubile Ag-Ac care se vad sub forma de precipitat1. ,ona de e'ces Ag 0 Ag liber in solutie dupa centrifugare comple'e Ag-Ac- in aceasta zona se formeaza din nou incomple'e solubile de Ac-Ag si mimeaza zona de concentratiescazuta de Ag. Pentru verificarea titrului de Ag se fac dilutii ce aduc in proportie optima concentratia de Ac si Ag si permite formarea de comple'e insolubile (precipitat).&n cadrul reactiilor de precipitare comple'ele Ag-Ac sunt rezultatul interactiunii unui Ac cu un Ag molecular, Ag difuzeaza intr-o proba cuconcentratie cunoscuta de Ac si se formeaza precipitate in zona de echivalenta.Testul inelului 0 metoda simpla de evidentiere a reactiei Ag-Ac intr-un tub,prin punerea in contact a unei solutii de Ag cu imunoserul corespunzator. (a interfata apare in cateva minute un inel sau un disc albicios ce corespunde precipitatului Ag-Ac.Reactia Heidelberger si Kendall 0 posibilitate de cuantificare a reactiei Ag-Ac prin interactiunea in mai multe tuburi de reactie a unei cantitati constante de Ac cu concentratii crescute de Ag intr-un volum dat. Apare precipitat, posibil inca din primele tuburi, creste cantitatea de precipitat in tuburile urmatoare pt ca apoi sa se reduca in conditiile e'cesului de Ag (zone Ag-Ac).Turbidimetria- 2n Ag este plasat intr-o cuva si interactioneaza cu Ac corespunzator aflat in e'ces. 3e formeaza comple'e solubile ce tulbura proba de cercetat. 3e masoara fotometric formarea de comple'eNefelometria 0 are acelasi principiu ca si turbidimetria, ca metoda de cuantificare a rezultatului se foloseste insa o lumina laser ce va fi reflectata de comple'ele Ag-Ac si preluata. focusata de niste lentile speciale intr-un fotometru . Concentratia de Ag din proba studiata este determinate cu a4utorul unor curbe standard. 5ecesita aparatura mai complicate, este insa de folos in determinarea in medii biologice a moleculelor de imunoglobuline (&g6, &gA, &g), &g%), fractiunide complement C+7, C1, C8, etc. Precipitarea in faa solida1. Imunodifuia radiala Mancini 0 o cantitate constanta de Ac este incorporata omogen in gel de agar inainte de solidificarea gelului si in godeuri facute in gel se plaseaza dilutii de Ag. Pe masura ce Ag difuzeaza in gel, reactioneaza cu Ac si cand se atinge punctul de echivalenta apare un inel de precipitare (vezi figura alaturata)."iametrul inelului este proportional cu logaritmul concentratiei de Ag din moment ce concentratia de Ac este constanta. Astfel daca se lucreaza cu un Ag standard se poate genera o curba standard pe seama careia se poate masura e'act cantitatea de Ag dintr-o proba necunoscuta0 deci acesta esteun test cantitativ. "aca apare mai mult de un inel inseamna ca au aparut mai multe reactii Ag-Ac. Acest lucru se intampla cand se lucreaza cu o mi'tura de Ac si de Ag. 3e foloseste de obicei in laboratorul clinic pt a determina nivelul de imunoglobuline in serul pacientilor. %ste de folos in determinarea &g6, &gA, &g), fractiuni de complement C1, alfa-+-antitripsina, etc.2. Imunodifuia radiala dubla Ouc!terlon" 0 in cadrul acestei metode Ag este plasat intr-un godeu,Ac monospecific in alt godeu, difuzeaza unul catre celalalt in gel de agar si apar arce de precipitare vizibile la locul de intalnire. Aceasta metoda calitativa permite analizarea sistemului Ag-Ac gratie reactiei de identitate.Pot fi observate mai multe aspecte ale precipitarii!a# Reactia de identitate $ daca doua Ag sunt identice sau au epitopi asemanatori, liniile lro de precipitare cu Ac vor avea continuitate.b# Reactia de nonidentitate $ / Ag diferite ce se combina cu / Ac, arcele de precipitare se intersecteazac# Reactia de identitate partiala $ daca cele doua Ag au un epitop comun si un epitopspecific doar uneia dintre antigene, se va forma un arc de cerc continuu si va aparea atasat un brat secundar epitopului diferit.3efoloseste pentru evidentierea proteinei C reactive, proteinelor 9ence-:ones, beta-/-microglobulina, alfa-fetoproteina, produsi de degradare a fibrinogenului, rezultatele sunt e'primate semicantitativ! ;, ;;, ;;;.d# Imunoelectroforea 0 o mi'tura comple'a de Ag este plasata in godeuri in gel de agar si prin electroforeza Ag sunt separate pe seama incarcaturii lor electrice. "upa electroforezasunt efectuate santuri in gel si se adauga Ac (imunoelectroforeza sau imunofi'are). Pe masura ce Ac difuzeaza in gel, apar arce de precipitare la zona de echivalenta.Acest test este folosit pentru analiza cantitativa a mi'turilorcomple'e de Ag, pentru analiza componentelor din serul pacientului. Comparand serul pacientului cu serul normal, se poate identifica deficienta uneia sau mai multor componente serice in proba de cercetat. 3e folosesc imunoseruri de origine animala specifice pentru proteine din serul uman. Aceeasi tehnica permiteanalizarea proteinelor urinare sau a lichidului cefalorahidian.%ste o metoda calitativa, se poate constata aparitia sau nu a precipitarii in raport cu un martor. e# Electroforea contracurent %elctroimunodifuia& 0Ag este plasat in godeuri de agar, sunt supuse electroforezei atat Ag cat si Ac si apare linie de precipitare ca in figura de mai 4os. Acest test poate fi utilizat numai daca Ac si Ag au incarcatura electrica opusa. %ste un test calitativ desi se poate aprecia si cantitatea prin aprecierea grosimii benzii de precipitare. Avanta4ul sau ma4or este rapiditatea testului.f# Imunoelectroforea in rac!eta 0 electroforeza in gel ce contine anticorpi 0 Ag migreazaelectroforetic catre anod prin gelul continator de Ac si apare precipitare sub forma de racheta ce poate fi vizualizata prin colorare. Aceasta metoda permite cuantificarea unui Ag prin comparatia cu o proba standard.g# Radioimmunoassa" %RI'&(En"me Lin)ed Immunosorbent 'ssa" %ELI*'& $ R&A sunt metode bazate pe masurarea radioactivitatii generate de comple'ele Ag-Ac. Pentru ca R&A necesita molecule radiomarcate, dificil de efectuat, a fost inlocuita cu metodele deinvestigare in faza solida (%(&3A).)arcarea se face fie la nivelul Ag fie la Ac. estele %(&3A sunt cele bazate pe masurarea unei reactii enzimatice asociate cu formarea comple'elor Ag-Ac. # reactie pozitiva duce la aparitia unui produs colorat ce poate fi masurat spectrofotometric. 3e folosesc doua alternative de reactie! directa si indirecta. &n metoda directa, proba de cercetat este adaugata peste placa in care sunt fi'ati Ac monoclonali in faza solida, se spala dupa incubare si este inlaturat materialul nelegat. &n metoda directa un Ac secundar marcat reactioneazacu Ag-ul legat de primul Ac. &n metoda indirecta se adauga un Ac anti-Ag de cercetat si un al treilea Ac marcat enzimatic interactioneaza cu Ac secundar (3and