INTRODUCERE

Fertilizarea “in vitro” este o tehnologie bine stabilită cu o multitudine de aplicaţii în

practică. Tehnologia se bazează pe producţia de embrioni utilizaţi pentru cercetare,

pentru tratarea infertilităţii la oameni şi animale, pentru creşterea productivităţii la

animalele de fermă şi pentru protejarea speciilor de animale pe cale de dispariţie.

Pentru majoritatea speciilor, protocoalele de fertilizare “in vitro” (IVF) sunt disponibile şi

oferă cantităţi mari sau suficiente de ovule fertilizate, ducând la o producţie de embrioni

viabili care se pot dezvolta într-un produs de concepţie normal după transferul la

femelele receptoare.

Originile fertilizării “in vitro” se regăsesc încă din anul 1878, însă primele studii

care atesta succesul fertilizării “in vitro” la om s-au publicat în anul 1969 (Yanagimachi

şi Chang, 1963, 1964). Aceste studii au fost primele studii care s-au referit la IVF

mamiferelor utilizând spermatozoizi capacitaţi “in vitro”. Un studiu mai recent (Chang,

1976) a arătat ca ovulele de iepuroaica fertilizate “in vitro” se pot dezvolta în produşi

normali. Aceste lucrări de pionerat au fost cruciale pentru acceptarea, 20 de ani mai

târziu, a IVF la om ca şi un tratament clinic al infertilităţii. Anii 1960 şi 1970 au fost anii

de aur ai fertilizării “in vitro” când, după descoperirea capacitării spermei, s-au raportat

succese remarcabile la câteva specii importante ca iepure, şoarece, hamster, şobolan,

om.

În ciuda eforturilor intense de cercetare încă de la jumătatea secolului al 19 lea, în

1971, cunoştinţele de fiziologie, biochimie şi morfologie a fertilizării la mamifere erau

insuficiente. Progresul cercetării a fost greu realizat deoarece fertilizarea are loc în

organismul mamiferelor, ceea ce înseamnă că evenimentele implicate în fertilizarea

ovocitelor şi dezvoltarea embrionară nu au putut fi investigate în microclimatul lor

natural. Aşadar, informaţia privind relaţia dintre ovulă sau embrionul în dezvoltare şi

microclimatul matern a fost greu de obţinut. O tehnică folositoare este recoltarea

ovocitelor fertilizate sau a embrionilor timpurii din tractul genital femel şi studiul

dezvoltării lor ulterioare “in vitro”. Aceasta abordare a fost utilizată, dar oferă informaţii

puţine despre evenimentele din „in vivo”. Mai mult, momentul ovulaţiei şi a fertilizării „in

vivo” nu s-a putut stabili cu acurateţe, ceea ce restricţionează investigaţia rapidă a

evenimentelor care apar, ca de ex. penetrarea spermatozoizilor prin învelişul ovocitei şi

a modificărilor pe care le suferă gameţii pe parcursul stadiilor iniţiale ale fertilizării.

Astfel, informaţii utile pot fi obţinute din studiul ovocitelor care sunt fertilizate „“in vitro””

şi care apoi se dezvoltă “in vitro”. Nu numai că procesul fertilizării poate fi observat de

aproape, dar de asemenea se pot examina şi factorii care contribuie la o fertilizare

normală.

În prezent se încearcă punerea la punct a unui protocol de fertilizare “in vitro” a

ovocitelor bovine care să ducă la obţinerea de embrioni viabili ce vor putea fi transferaţi

la femelele receptoare. Succesul acestui protocol depinde de: tehnica de recoltare a

ovocitelor şi aprecierea morfologică a acestora, metodele de cultivare pentru

maturizarea ovocitei, capacitatea spermatozoizilor şi fertilizarea ovocitelor prin punerea

în contact a ovocitelor mature cu spermatozoizii capacitaţi.

Până nu de mult, pentru recoltarea ovocitelor bovine se utilizau metode

chirurgicale, ceea ce provocă suferinţă animalului. În ultimii ani s-a încercat

implementarea unor tehnici de recoltare nechirurgicale (de ex.: introducerea unui

endoscop prin fosa paralombară dreaptă, prin laparascopie sau prin aspirarea

transvaginală ecoghidată a foliculilor ovarieni (Gordon, 1991). Se mai pot obţine ovocite

din ovarele animalelor sacrificate în abatoare prin metoda aspirării foliculilor, prin

disecţia foliculior sau prin mărunţirea ovarelor (Duran, 2000).

Cultivarea “in vitro” pentru maturare afectează atât numărul ovocitelor care ajung

în metafaza II şi care devin apte pentru fertilizarea “in vitro”, cât şi dezvoltarea

embrionară ulterioară (Bavister, 1982). Mediile de maturare “in vitro” care se folosesc

sunt medii simple (de obicei sunt sisteme tamponate carbonate care conţin ser fiziologic

cu piruvat, lactat si glucoza) şi medii complexe ce conţin suplimentar la componentele

de baza şi aminoacizi şi vitamine. Cele mai multe laboratoare de IVF utilizează mediul

TCM 199 ca şi mediu de maturare a ovocitelor bovine „“in vitro”” (Bavister, 1992). Hawk

şi Wall în 1993 fac o comparaţie a mediilor pentru maturarea “in vitro” (IVM),

concluzionând că mediul F-10 este superior mediilor TCM 199 şi B2. Mai recent, Gliedt

şi col., 1996, în urma cercetărilor, demonstrează că mediul RPMJ-1940 este inferior

mediului TCM 1999. În 1997, Wang şi col., demonstrează că nu exista nici o diferenţă

între rata dezvoltării embrionare a ovocitelor maturate în mediul TCM 199 şi cele

maturate în mediul RPMJ-1940 şi în mediul B2. Ovocitele maturate “in vitro” au o slabă

competenţă de dezvoltare, au nivele scăzute ale glicolizei, care este necesară pentru

finalizarea maturării. O reducere a nivelului glicolizei poate reflecta o activitate scăzută

a căilor pentozo-fosfat care joacă un rol important în maturarea meiotică a ovocitelor

bovine, de aceea este obligatorie utilizarea unui mediu de maturare care conţine

glucoză (Krisher şi Bavister, 1998).

Succesul IVF la bovine necesită pregătirea corespunzătoare a spermei si a

ovocitei, ca şi condiţii de cultivare care să favorizeze activitatea metabolică a gameţilor

(Xu şi King, 1990). Primul studiu asupra succesului maturării şi fertilizării “in vitro” la

bovine a fost realizat de Iritani şi Niwa (1977) în Japonia, dar naşterea de viţei nu a fost

raportată până în 1986 de către Hanada şi col.

Fertilizarea ovocitelor bovine include o serie de evenimente succesive în care

sperma:

trebuie sa fie mobilă pentru a ajunge la ovocita şi pentru a penetra învelişul

acesteia;

să aibă abilitatea de a începe capacitarea şi de a manifesta reacţie acrozomială;

să aibă capacitatea de a se ataşa de zona pelucida (ZP) şi de membrana vitelină

a ovocitei prin dobândirea proteinelor de legătură în timpul maturării şi expunerea

acestor locusuri de ataşare ovocitei într-un timp corespunzător;

să aibă abilitatea de a fuziona cu oolema şi de a se incorpora în ovocită;

“In vitro”, pentru inducerea capacităţii şi reacţiei acrozomiale se utilizează mai

multe medii. Unul dintre acestea este mediul de fertilizare cu concentraţie mare ionică

(Mediul BO) cu osmolaritate de 360-390 mOsM pentru capacitarea spermei proaspete

de taur (Bousquet si Brackett, 1982). Însă Sirard şi col., 1986 au demonstrat că

utilizarea acestui mediu este limitată la câţiva tauri şi ei nu consideră că are o aplicare

generală. Mai recent (Ibrahim, 1993) s-a început utilizarea mediului TALP pentru

capacitarea “in vitro” spermatozoizilor de taur. În acest sens, Jaakma şi col., 1997 au

observat un procent semnificativ mai mare a ovocitelor bovine care s-au dezvoltat în

stadiul de blastocist după inseminarea cu spermatozoizi capacitaţi cu acest mediu

suplimentat cu heparină. Alte studii susţin ideea că capacitarea spermei de taur cu

heparina reflectă mecanismul capacitării din vivo (Parrish şi col., 1989). Doza de

heparină şi perioada de incubaţie pentru capacitare sunt factori importanţi care

afectează fertilizarea “in vitro” la bovine şi dezvoltarea embrionară ulterioară

(Vlaenderen şi col., 1991). Heparina induce schimbări în proprietăţile de legare a

proteinelor spermatice şi determină reducerea concentraţie de ioni de calciu în timpul

capacitării (Leclerc şi col., 1992). Unii autori (Shamsuddin şi col., 1992) sugerează că

rata fertilizării poate fi rapid îmbunătăţită prin adăugarea heparinei la mediul de

fertilizare, doza variind între 0,5 – 50 microlitri/ml. Sugawarea şi col., 1984, utilizând

sperma de taur congelată/decongelată preincubata într-un mediu ce conţinea lichid

folicular bovin (bFF), au raportat o rată de penetrare de 56%. Se pare că bFF-ul conţine

componente (ca de ex. glucozo-amino-glicanzii) capabile să capaciteze sperma de taur.

Pentru acest motiv, lichidul folicular bovin a fost utilizat ca şi mediu de capacitare a

spermatozoizilor de taur în 1992 de către Iqbal şi Hunter. În 1989, Fukuda şi col. au

demonstrat importanţa fluxului de ioni de calciu extracelular în procesul capacitării

spermei. Ei au arătat că tratamentul spermei cu calciu ionofor are ca rezultat

hiperactivarea şi funcţionarea reacţiei acrozomiale la sperma de taur, oferindu-i

capacitatea să penetreze ovocita. Jiang şi col., 1992 comparând tratamentele cu calciu

ionofor cu cel cu heparina, susţin simplitatea utilizării ionoforului şi obţinerea unei

producţii mai mari de embrioni. Madison şi col., 1991 utilizează pentru pregătirea

spermei mediul TALP cu heparina şi cafeina, ei adaugând în mediul de fertilizare o

concentraţie de 1x1,5x106 spermatozoizi/ml. Fukui şi col., 1990 stabilesc condiţiile

standard pentru co-cultivarea spermatozoizilor cu ovocitele care sunt 16 – 22 de ore la

39OC în atmosfera cu 5% CO2.

În aceste condiţii de co-cultivare a spermatozoizilor cu ovocita are loc fertilizarea

care constă în (Wassarman, 1999 şi Wrigh , 1999):

1. Penetrarea spermatozoizilor a complexului cumulus:

ovocita ovulată este închisă în celulele cumulus. Celulele cumulus sunt celule

somatice care înconjoară ovocita şi au rădăcini în matricea extracelulară care

conţine acid hialuronic; numai spermatozoizii capacitaţi şi cu acrozom intact pot

penetra cumulusul pentru a ajunge la ovocita;

hialuronidaza, parte componentă a spermatozoidului participă la progresia

acestui prin cumulus.

2. Interacţiunea spermatozoidului cu zona pelucida:

zona pelucida este un înveliş glicoproteic care înconjoară ovocita şi care conţine

trei glicoproteine (ZP1, ZP2, ZP3). Ea este locul de iniţiere a legării

spermatozoidului la ovocita şi se constituie ca o barieră pentru polispermie.

3. Penetrarea zonei pelucida:

este necesară o mobilitate mai mare a spermatozoidului (mobilitate

hiperactivată);

are loc digestia enzimatică a zonei pelucida de către acrozin.

4. Fuziunea spermatozoidului cu oolema:

după fuzionarea cu oolema, întregul spermatozoid este încorporat total în

oolema şi suferă decondesarea cromatinei;

5. Reluarea meiozei de către ovocita:

în timpul decondensării cromatinei spermatozoidului, meioza care era oprită în

stadiul de metafaza II este reiniţializată spre stadiul de telofaza II;

ovocita în metafaza II este caracterizată prin prezenţa primului globul polar în

spaţiul perivitelin. La finalul meiozei, al doilea globul polar este eliberat în spaţiul

perivitelin şi ovocita devine haploidă şi este caracterizată prin prezenţa a doi

globuli polari.

6. Formarea pronucleilor:

cromatina spermatozoidului, ulterior decondensării/recondensării ei în ovocită şi

cromatina ovocitei în telofază II se vor transforma în pronuclei patern şi matern.