exemplul 3

UNIVERSITATEA DE ȘTIINTE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ

VETERINARĂ “ION IONESCU DE LA BRAD” DIN IAȘI

FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ

SPECIALIZAREA MEDICINĂ VETERINARĂ

EPIDEMILOGIA ȘI DIAGNOSTICUL

RINOTRAHEITEI INFECȚIOASE BOVINE –

VULVOVAGINITA PUSTULOASĂ (IBR – IPV)

Coordonator științific,

Prof. dr. Gheorghe Savuța

Absolvent,

Dumitrița-Roxana Frunză

IAȘI - 2012

Frunză Dumitrița - Roxana

CUPRINS

pag.

Introducere…………………………………………………………................................ 9

Lista tabelelor, figurilor și a abrevierilor

PARTEA I – CONSIDERAȚII GENERALE

CAPITOLUL 1. DATE BIBLIOGRAFICE PRIVIND RINOTRAHEITA

INFECȚIOASĂ BOVINĂ-VULVOVAGINITA PUSTULASĂ (IBR-IPV) ................ 12

1.1 Definiție. Istoric. Răspândire și importanță .................................................... 12

1.1.1 Definiție ............................................................................................ 12

1.1.2 Istoric ................................................................................................ 12

1.1.3 Răspândire și importanță .................................................................. 13

1.2 Etiologie ......................................................................................................... 14

1.3 Caractere epidemiologice ............................................................................... 18

1.3.1 Receptivitate .................................................................................... 18

1.3.2 Surse de infecție ............................................................................... 18

1.3.3 Doza infectantă ................................................................................. 18

1.3.4 Mod de transmitere 19

1.3.5 Factori de receptivitate ..................................................................... 19

1.4 Patogeneză ...................................................................................................... 19

1.4.1 Replicarea intracelulară a BoHV-1 ................................................. 19

1.4.2 Multiplicarea la poarta de intrare ..................................................... 22

1.4.3 Diseminarea în organism .................................................................. 22

1.4.3.1 Diseminarea locală ........................................................... 22

1.4.3.2 Diseminarea sistemică prin viremie ................................. 23

1.4.3.3 Neuroinvazia .................................................................... 23

1.5 Răspunsul imun .............................................................................................. 24

1.6 Rolul BoHV-1 în complexul infecțiilor respiratorii ale bovinelor ................. 25

1.7 Latența și reactivarea ...................................................................................... 25

1.8 Semne clinice .................................................................................................. 27

1.9 Modificări anatomopatologice ........................................................................ 29

1.10 Diagnostic ....................................................................................................... 30

1.10.1 Examenul serologic .......................................................................... 30

1.10.2 Examenul virusologic ....................................................................... 31

1.10.3 Diagnostic diferențial ....................................................................... 32

1.11 Profilaxie ........................................................................................................ 33

1.12 Combatere ....................................................................................................... 34


CAPITOLUL 2. DESCRIEREA CADRULUI ORGANIZATORIC ÎN CARE S-AU

EFECTUAT INVESTIGAȚIILE ……………………………………………................ 35

PARTEA a II-a – CONTRIBUȚII PROPRII

CAPITOLUL 3. MATERIALE ȘI METODE …………………………………............ 39

3.1 Scopul lucrării ................................................................................................ 39

3.2 Metodologia de lucru utilizată în investigațiile serologice ............................. 40

3.2.1 Descrierea Kitului pentru detecția anticorpilor specifici virusului

rinotraheitei infecțioase bovine ( BoHV-1) în ser, plasmă sau lapte

bovin prin testul ELISA ...................................................................... 40

3.2.2 Prepararea reactivilor şi soluţiilor de lucru pentru detecţia

anticorpilor serici faţă de virusul IBR ................................................ 43

3.2.3 Protocol de testare ............................................................................... 43

3.2.4 Examinarea și calcularea rezultatelor ……………………………..... 47

3.2.5 Interpretarea rezultatelor ………………………………………......... 48

CAPITOLUL 4. REZULTATE ȘI DISCUȚII............................................................... 49

4.1 Fermele de bovine de la care s-au recoltat probele pentru detectarea

anticorpilor specifici anti - virusul rinotraheitei bovine (BoHV-1) ................ 51

4.2 Rezultatele obținute la examenul serologic în anul 2007 ............................... 55





CAPITOLUL 5. CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI.................................................... 72

5.1 Concluzii ......................................................................................................... 72

5.2 Recomandări pentru reducerea riscului de introducere a infecției cu BoHV-

1 în efectivele de bovine.................................................................................. 73

BIBLIOGRAFIE............................................................................................................... 74


Lista tabelelor

pag.

Tabelul 1.1: Tipurile de herpesvirusuri izolate de la bovine infectate natural ………....... 14

Tabelul 1.2: Caracteristicile glicoproteinelor virusului BoHV-1 ……………………....... 17

Tabelul 4.1: Numărul total de probe recoltate și testate prin metode serologice (ELISA)

în perioada 2007-2011 din județele Iași, Vaslui și Galați .............................. 50

Tabelul 4.2: Numărul total de bovine pe categorii de vârstă din ferma Pruteț …………... 51

Tabelul 4.3: Componența pe categorii de vârstă și sex a bovinelor din ferma Broșteni în

perioada Ianuarie – Aprilie 2012 …………………………………………… 54

Tabelul 4.4: Situația stării de sănătate în ferma Broștenii în intervalul Ianuarie - Aprilie

2012 ................................................................................................................ 54

Tabelul 4.5: Rezultatele examenului serologic E.L.I.S.A. pentru detecția anticorpilor

specifici IBR-IPV, obținute în anul 2007 ....................................................... 55




specifici IBR-IPV, obținute în anul 2009 ………………………………....... 60




specifici IBR-IPV, obținute în județul Iași (anul 2011) ................................. 65


specifici IBR-IPV, obținute în județul Vaslui (anul 2011) …………............. 66


specifici IBR-IPV, obținute în județul Galați (anul 2011)………………….. 68


Lista figurilor

pag.

Figura 1.1: Structura arborelui filogenetic al Familiei Herpesviridae ............................... 15

Figura 1.2: Morfologia BoHV-1 - reprezentarea schematică a virionului ......................... 15

Figura 1.3: Structura genomică a BoHV-1 ………………………………………........... 16

Figura 1.4: Reprezentare schematică a ciclului de multiplicare virală a BoHV-1 …........ 21

Figura 1.5: Secreţie nazală seroasă până la mucopurulentă ............................................... 28

Figura 1.6: Eritem la nivelul botului – “boala botului roșu” ............................................. 28

Figura 1.7: Celulă infectată cu virusul IBR. Virusul se multiplică în nucleul celulei ....... 29

Figura 1.8: Cultură celulară MDBK infectată - prezența plajelor de liză ......................... 32

Figura 1.9: Cattlemaster 4 - Vaccin polivalent contra rinotraheitei, diareei virotice,

parainfluenţei tip 3 şi virusului sinciţial respirator la bovine .......................... 33

Figura 2.1: Aspecte din laboratorul de serologie al Facultății de Medicină Veterinară,

Iași................................................................................................................... 36

Figura 2.2: Aspecte din cadrul Laboratorului Sanitar Veterinar (LSV), Iași - laboratorul

de virusologie ….............................................................................................. 37

Figura 3.1: Prezentarea generală a kitului pentru detecția anticorpilor specifici virusului

rinotraheitei infecțioase bovine ( BoHV-1) ..................................................... 41

Figura 3.2: Prezentarea reagenților utilizați la detectarea anticorpilor specifici virusului

rinotraheitei infecțioase bovine ( BoHV-1) (detalii) ....................................... 41

Figura 3.3: Incubarea în incubatorul cu agitator și termostat pentru microplăci,

Heidolph.......................................................................................................... 44

Figura 3.4: Spălarea cu spălătorul automat de microplăci ................................................. 44

Figura 3.5: Depunerea soluției substrat în placă ................................................................ 45

Figura 3.6: Citirea microplăcilor la cititorul TECAN ........................................................ 46

Figura 4.1: Numărul total de probe recoltate și testate prin metode serologice (ELISA)

în perioada 2007-2011 ..................................................................................... 50

Figura 4.2: Aspecte din ferma Târzii ................................................................................. 52

Figura 4.3: Aspecte din fermele Bădeana și Pogonești ..................................................... 53

Figura 4.4: Componența pe categorii de vârstă și sex a bovinelor din ferma Broșteni în

perioada Ianuarie – Aprilie 2012 ..................................................................... 54


Figura 4.5: Rezultatele examenului serologic E.L.I.S.A. obținute în anul 2007 ............... 56

Figura 4.6: Distribuția pe hartă a rezultatelor obținute în urma testărilor serologice în

anul 2007 ......................................................................................................... 57

Figura 4.7: Reprezentarea generală a rezultatelor din 2007 în urma examenului ELISA

pentru depistarea anticorpilor specifici IBR-IPV ............................................ 57



anul 2008 ........................................................................................................ 59


pentru depistarea anticorpilor IBR-IPV .......................................................... 59

Figura 4.11: Rezultatele examenului serologic E.L.I.S.A. obținute în anul 2009 …........... 60


anul 2009 ......................................................................................................... 61





anul 2010 ......................................................................................................... 63



Figura 4.17: Rezultatele examenului serologic E.L.I.S.A. obținute din județul Iași (anul

2011) ................................................................................................................ 66

Figura 4.18: Rezultatele examenului serologic E.L.I.S.A. obținute în județul Vaslui (anul

2011) ................................................................................................................ 67

Figura 4.19: Rezultatele examenului serologic E.L.I.S.A. obținute în județul Galați (anul

2011) ................................................................................................................ 69


anul 2011 ......................................................................................................... 70




Lista abrevierilor

Apo E – gena lipoproteinei E;

BoHV-1 – herpesvirus bovin tip 1;

CPE – efect citopatic;

Ctcs - răspândirea directă celulă la celulă;

DICC50 – doză infectantă 50% pentru culturi celulare

ELISA – Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (tehnică cu enzime legate de

imunsorbenți)

GP - gospodăriile populației

IBR – Rinotraheita infecțioasă bovină;

IFN – interferon

IPB – Balanopostita pustuloasă infecțioasă;

IPV - Vulvovaginita pustuloasă infecţioasă;

Kpb – kilogram perechi de bază;

LRT – transcriere legată latentă;

LSVSA – Laboratorul Sanitar Veterinar şi pentru Siguranţa Alimentelor

MDV – Virusul bolii lui Marek;

PBMC – celule mononucleare din sângele periferic proaspăt;

PCR – polymerase chain reaction

STAT 1 - proteină cheie reglatoare a căii antivirale induse de interferonii (IFN) α și

β;

TK – timidinkinaza;

UL - secvenţa lungă;

US - secvenţa scurtă;

Vhs - proteina de închidere a virionului gazdă;

VZV – Varicella-Zoster virus;

α-TIF - factorul de transinducere de gene alfa;


9

INTRODUCERE

Rinotraheita infecțioasă bovină – vulvovaginita pustuloasă (IBR – IPV) este o boală

virală ce aparține familie Herpesviridae, genul Varicellovirus întâlnită și la noi în țară. Apariția

bolii ce ține de mai multe aspecte, care de regulă sunt specifice fermelor dar și exploatațiilor

nesistematizate, duce la înregistrarea de pierderi economice majore provocate de creșteri ale

morbidității, mortalității dar și scăderii ale producției de lapte.

Rinotraheita infecțioasă bovină este o maladie infecțioasă, înalt contagioasă cauzată de

Herpesvirus bovin tip 1 (BoHV-1). În afară de simptomele respiratorii, acest virus cauzează

conjunctivită, vulvovaginită, avorturi, encefalită și infecții sistemice generalizate. Deși datele

clinice pot sugera IBR, semnele respiratorii patologice nu sunt limitate la IBR. Astfel, este

necesară confirmarea de laborator (teste ELISA pentru detecția anticorpilor BoHV-1 în ser sau

lapte, examene histopatologice, RT-PCR, izolarea virusului pe culturi celulare, etc).

Unul dintre ultimele rapoarte europene demonstrează o mare preocupare în acest sens.

Cifrele publicate relevă foarte clar răspândirea largă a acestei infecţii de-a lungul şi de-a latul

întregului continent european: Anglia, Irlanda, Lituania, Estonia, Germania, Franţa, Grecia,

Italia, Cehia, Spania, România fiind doar câteva din ţările unde s-a diagnosticat şi recunoscut

evoluţia IBR.

În toate aceste ţări este certificată evoluţia IBR şi în efectivele de vaci de lapte, punându-

se astfel în practică diverse strategii de control, chiar eradicarea infecţiei. Aceasta, deoarece

impactul acestei infecţii asupra eficienţei activităţii fermei, precum şi asupra sănătăţii animalelor

este evident, ceea ce a dus în mod logic la iniţierea unor programe care să ducă la limitarea

pierderilor şi la optimizarea gradului de sănătate a efectivelor.

Marea problemă cu care ne confruntăm în controlul acestei infecţii este aceea că virusul

IBR este un herpesvirus (BoHV-1), care determină infecţii ce evoluează de regulă (atunci când

nu sunt letale), în infecţii latente. Situaţiile de stres (fătări dificile, balanţa energetică negativă,

condiţiile improprii de microclimat), pot conduce la reactivarea infecţiilor latente, animalele

purtătoare infectând celelalte animale din turmă, menţinând astfel ciclul infecţios din fermă.

Contactul direct între animale este cel mai frecvent întâlnit mecanism de transmitere a infecţiei


10

(mucozităţile nazale provenind de la animalele infectate conţin un mare număr de vibrioni).

Transmiterea indirectă prin vizitatori şi vehicule, deşi posibilă, este mai puţin periculoasă.

Aceste afecţiuni cunosc în prezent o creştere a incidenţei în sistemul intensiv, fiind alături

de gastroenteropatii, principalele boli întâlnite la bovine şi în special la tineretul taurin. În acelaşi

timp reprezintă cauzele cele mai însemnate ale pierderilor economice înregistrate în creşterea

taurinelor.

Pierderile economice sunt realizate prin mortalitate, sacrificări precoce, scăderea sporului

de creştere, cheltuieli cu tratamente, profilaxie şi combatere. La aceste pierderi se adaugă şi

faptul că vindecarea clinică a animalelor nu echivalează şi cu recuperarea economică, animalele

trecute prin boală rămânând subdezvoltate şi predispuse la recidive, constituind, în acelaşi timp,

surse de infecţie permanente în adăposturi.

Monitorizarea şi controlul bolilor respiratorii de origine virală, limitarea sau prevenirea

răspândirii lor şi eforturile de eradicare trebuie să fie priorități sanitar-veterinare naționale.

Ţinând cont de gradul seroprevalenţei faţă de BoHV-1, programele de eradicare sunt

bazate fie pe detecţia şi eliminarea animalelor seropozitive, fie pe vaccinarea repetată a

efectivelor infectate. Datorită imposibilităţi vaccinului de a preveni infecţia cu BoHV-1 și

instalarea stării de latenţă, programele de control faţă de BoHV-1 vor dura o perioadă lungă de

timp până se va ajunge la o completă eradicare a acestui virus bovin foarte bine adaptat la

bovine.


11

PARTEA I – CONSIDERAȚII GENERALE

[Type a quote from the document or

Text Box Tools tab to change the

formatting of the pull quote text box.]


12

CAPITOLUL 1.

DATE BIBLIOGRAFICE PRIVIND RINOTRAHEITA INFECȚIOASĂ

BOVINĂ – VULVOVAGINITA PUSTULOASĂ (IBR - IPV)

1.1 Definiție. Istoric. Răspândire geografică și importanță

1.1.1 Definiție

Rinotraheita infecțioasă bovină-vulvovaginita pustuloasă (IBR-IPV) este o boală

infectocontagioasă, specifică bovinelor, cu caracter epidemic și evoluție acută, caracterizată

clinic prin febră și tulburări dominant respiratorii, (inflamația căilor respiratorii anterioare și a

mucoasei traheale), sau genitale (avorturi, infertilitate) și conjunctivite, produsă de un virus

(Bovine herpesvirus 1) încadrat în familia Herpesviridae, genul Varicellovirus. (Pop M. și colab.,

2011)

1.1.2 Istoric

În timpul secolului al XIX-lea, Buchner şi Trommsdorf descriu în Germania exantemul

coital vezicular („Blaschenausschlag”), o boală a bovinelor probabil cauzată de către

herpesvirusul bovin tip 1 (BoHV-1). Etiologia virală a fost descrisă în 1928 de către Reisinger şi

Reimann, care au arătat că această boală venerică este transmisă de către un agent filtrabil.

Până la începutul anilor 1950 manifestarea infecţiei cu BoHV-1 era cunoscută sub numele

de “vulvovaginita pustuloasă infecţioasă” (IPV) la vaci şi de „balanopostita pustuloasă

infecţioasă” (IPB) la tauri, fiind atribuită doar afecţiunilor de la nivelul aparatului genital. În

acest timp, o formă respiratorie a apărut în efectivele de bovine din America de Nord. Această

boală produsă de infecţia BoHV-1 a fost numită “rinotraheita infecţioasă bovină” (IBR).

(Schroeder R.J. și colab., 1954) Rinotraheita infecţioasă bovină s-a răspândit rapid în Europa,

aceasta datorându-se importurilor de vaci de lapte din America de Nord cu scopul de a

îmbunătăţi producţia de lapte din Europa.

În România, boala a fost diagnosticată de Coman (1964) și studiată clinic și

epidemiologic de Aniță D. C-tin. (Perianu T. și colab., 2012)

Toate tulpinile de BoHV-1 izolate până în prezent aparţin unei singure specii virale, şi

sunt clasificate în trei subtipuri: BoHV-1.1, BoHV-1.2a şi BoHV-1.2b. Deşi cele mai multe


13

tulpini de BoHV-1.1 au fost izolate din aparatul respirator şi avortoni, şi tulpinile de BoHV-1.2

au fost izolate din leziunile aparatului genital, singurul criteriu distinctiv dintre cele două tulpini

fiind analiza acidului dezoxiribonucleic viral utilizând endonucleazele de restricţie.

Subtipurile virale BoHV-1.1 şi BoHV-1.2a au fost asociate cu formele severe de boală,

incluzând infectarea fetusului şi avortul. Subtipul viral BoHV-1.2b nu a fost asociat cu apariţia

avorturilor. (Edwards S. și colab., 1990)

BoHV-1 prezintă o importanţă deosebită datorită pierderilor provocate de către boală și

de restricţiile de circulaţie ale animalelor. Astfel, programele de control au fost rapid dezvoltate

după apariţia IBR în efectivele din nordul Americii.

Ţinând cont de gradul seroprevalenţei faţă de BoHV-1, programele de eradicare sunt

bazate fie pe detecţia şi eliminarea animalelor seropozitive, fie pe vaccinarea repetată a

efectivelor infectate. (Ackermann M. și colab., 2006) Datorită imposibilităţi vaccinului de a

preveni infecţia cu BoHV-1 și instalarea stării de latenţă, programele de control faţă de BoHV-1

vor dura o perioadă lungă de timp până se va ajunge la o completă eradicare a acestui virus foarte

bine adaptat la bovine.

1.1.3 Răspândire şi importanţă

Virusul este prezent pe toate cele 5 continente având diferite specii de animale drept

gazdă. Infecţia este prezentă peste tot, sub formă enzootică, putând lua un caracter contagios la

nivelul unui efectiv. În Europa, în ţările unde IBR evoluează, prevalența este diferită de la țară la

țară. Astfel există țări cu prevalenţă redusă, medie şi ridicată a infecţiilor cu BoHV-1.

Ţările cu prevalenţă scăzută prezintă un nivel de efective seropozitive cuprinse între 0-

5%. Aceste ţări au stabilit planuri de luptă bazându-se pe analize serologice sistematice,

eliminarea seropozitivelor şi interdicţia vaccinărilor.

Ţările cu prevalenţă medie au nivel de seropozitivitate a efectivelor cuprins între 5-30% a

efectivelor. Este vorba de Germania care a pus în aplicare un program sanitar veterinar, în

Portugalia, Spania şi Franţa, aceste valori ale seropozitivităţii nu sunt omogen răspândite, ele

variind de la o regiune la alta în cadrul unei ţări.

Ţările cu prevalenţă ridicată au un nivel de seropozitivitate crescut și de aceea strategia de

luptă se bazează pe vaccinare. Din această categorie face parte Belgia, Ţările de jos, Croaţia

(peste 85% animale au fost găsite seropozitive).


14

1.2. Etiologie

BoHV-1 (Bovine herpesvirus-1) face parte din marea familie Herpesviridae, subfamilia

Alphaherpesvirinae, genul Varicellovirus, (fig. 1.1) care conţine virusuri caracterizate printr-o

receptivitate destul de largă în privinţa speciilor, un ciclu scurt de replicare şi abilitatea de a

induce frecvent infecţii latente la nivelul neuronilor, dar nu exclusiv.

BoHV-1 este unul din cele opt herpesvirusuri izolate de până în prezent de la bovinele

infectate natural. (tabelul 1.1).

Tabelul 1.1

Tipurile de herpesvirusuri izolate de la bovine infectate natural

Bovinele – gazde

Herpesvirusul bovin tip 1

(BoHV-1) α

Rinotraheita infecţioasă

bovină


(BoHV-2) α

Mamilita infecţioasă bovină,

pseudo-variola bovină


(BoHV-4) γ

Vulvovaginita, infecţii

subclinice


(BoHV-5) α Encefalita bovină

Herpesvirusul limfotrop

bovin (BHLV) γ

Bovinele – gazde intermediare

Alcelaphineherpesvirus 1

(AIHV-1) γ Febra catarală malignă

Herpesvirusul ovin tip 2

(OHV-2) γ Coriza gangrenoasă

Herpesvirusul suin tip 1

(SuHV-1) α Boala lui Aujeszky

Toţi membrii familiei Herpesviridae împart aceeaşi morfologie virală bazată pe o

structură icozaedrală a capsidei, în jurul cărei se găseşte o zonă numită tegument, cu structură

globuloasă apoi anvelopa care este compusă din fosfolipide şi glicoproteine. (fig. 1.2).


15

Fig. 1.1 Structura arborelui filogenetic al Familiei Herpesviridae

(după McGeoch și colab., 2000)

În cadrul genului Varicellovirus, BoHV-1 este înrudit dar distinct de celelalte virusuri ce

infectează rumegătoarele. Genomul virusului BoHV-1 este alcătuit dintr-o moleculă de ADN

dublucatenară structurată pe tipul genomului din clasa D. Mărimea totală este de 135,3 kpb și cu

un conţinut de 72% în guanină-citozină ce codează circa 70 de gene.

Fig. 1.2 Morfologia BoHV-1 - reprezentarea schematică a virionului (Thiry E. 2000)


16

Clasa genomică D cuprinde două secvenţe unice, una lungă UL de 140 kpb și una scurtă

US de 10 kpb, flancate de două zone repetitive (IR şi TR, 11 kpb). În timpul replicării ADN-ului

ambele regiuni, UL și US, pot să realizeze mişcări de flip-flop independente una faţă de cealaltă,

generând constant 4 forme izomerice ale genomului viral. Totuşi, un proces de selecţie

favorizează secvenţa UL în orientarea iniţială la nivelul de clivaj al ADN concatemeric, prin

urmare secvenţa UL este predominant fixă într-o singură orientare în cadrul virionului BoHV-1

(fig. 1.3).

Fig. 1.3 Structura genomică a BoHV-1

(după Muylken B. și colab., 2007)

A. Cele două secvenţe unice: UL (secvenţa lungă), US (secvenţa scurtă);

B. Reprezentare schematică a primelor doi promotori implicaţi în transcripţie;

C. Localizarea regiunii virusului BoHV-1 care este transcrisă activ în perioada de latenţă.

Proteinele virale codate de BoHV-1 cunoscute până în prezent sunt în număr de 10

glicoproteine (gB, gC, gD, gE, gI, gH, gL, gG, gK și gM), numeroase enzime (ribonucleotid-

reductaza, ADN-polimeraza și dATP-aza) și proteine regulatoare. O parte dintre glicoproteine şi

anume 6, se găsesc la nivelul UL: gK (UL53), gC (UL44), gB (UL 27), gH (UL22), gH (UL10),

gL (UL1), iar restul de 4 se găsesc la nivelul US: gG (UL4), gD (UL6), gI (US7) şi gE (US8).

Glicoproteinele au numeroase funcţii, fiind responsabile de ataşarea și penetrarea

virusului în celulă, de maturarea şi ieşirea virusului din celula infectată şi progresia virusului de

la o celulă la alta. Glicoproteinele joacă un rol important în răspunsul imunitar (umoral și celular)

al gazdei. Din acest punct de vedere se disting 2 tipuri de glicoproteine: majore și minore.

(tabelul 1.2)

Glicoproteinele majore (gB, gC și gD) prezintă proprietăţi imunogenice făcându-le

componente esenţiale ale vaccinurilor. În condiţii selective, funcţia gD BoHV-1 în răspândirea

directă de la o celulă la celulă şi intrare, poate fi compensată de către mutaţiile în alte proteine

virale. (Liang X. și colab., 1995)


17

Glicoproteinele minore sunt considerate ca neesenţiale deoarece nu sunt implicate în

multiplicarea virală. Deleţia unei gene ce codează pentru o glicoproteină minoră nu va afecta în

nici un fel ciclul de multiplicare virală. Această caracteristică este utilizată la fabricarea

vaccinurilor marcate care permit identificarea animalelor vaccinate de animalele infectate cu un

virus sălbatic.

Glicoproteina gD este considerată esenţială în BoHV-1, dar nu este codificată de

Varicella-Zoster Virus (VZV), şi nu este esenţială în virusul bolii lui Marek (MDV). Dimpotrivă,

gE este cunoscută ca o proteină neesenţială în BoHV-1, în timp ce în VZV este esenţială

(Mallory S. și colab., 1998).

Tabelul 1.2.

Caracteristicile glicoproteinelor virusului BoHV-1

(după Thiry E., 2000)

Nume Genă Denumire

anterioară Esențială Importanță Rol

gB UL27 gI esențială majoră

Participă la pătrunderea în celula gazdă şi

la diseminarea virionului de la o celulă la

celulă

gC UL44 gIII nu majoră

Rol în mecanismul de ataşare la celula

gazdă, dar fără influenţă asupra virulenţei

virusului

gD US6 gIV esențială majoră

Participă la ataşare şi pătrunderea în

celulă, dar şi la propagarea din celulă în

celulă

gE US8 nu minoră

Formează un complex cu glicoproteina gI

care ar putea fi implicată în transportul

interneuronal şi la propagarea virusului

gG US4 gX nu minoră

Participă la propagarea virusului ,

menţinând joncţiunea intercelulară ,

independent de gE

gH UL22 gII esențială minoră

Participă la penetrarea celulei gazdă şi la

propagare, la transportul intracelular şi

ancorarea gL la membrana celulară

gI US nu Asociată cu gE participă la propagarea

virusului

gK UL53 esențială Intervine în transportul intracelular către

suprafaţa celulei

gL UL1 esențială Asociată la gH formează complexul

gH/gL

gM UL10 nu

Influenţează fluiditatea membranară şi

favorizează intrarea şi ieşirea virusului

din celula gazdă.


18

1.3 Caractere epidemiologice

Studiile epidemiologice au arătat că la infecția cu BoHV-1 sunt receptive mai ales

tineretul și animalele adulte din efectivele mari. Sursele de infecție sunt reprezentate de

animalele infectate cu sau fără semne clinice, care elimină virusul prin secrețiile respiratorii,

genitale și oculare. Jetajul reprezintă sursa majoră de infecție, virusul fiind prezent în mucusul

nazal la 24 de ore după infecție. Sunt receptive numai bovinele, mai ales tineretul și animalele

adulte din unitățile cu efective mari.

1.3.1 Receptivitate

Sunt receptive toate bovinele, inclusiv cele vaccinate sau aflate sub imunitatea colostrală

pot fi infectate cu virusul BoHV-1, ce poate rămâne sub formă de stare latentă sau poate fi

excretat. Şi alte specii sunt de asemenea susceptibile la infecţie.

Caprinele sunt sensibile la infecţia cu BoHV-1. Virusul se multiplică și este excretat între

a 5-13-a zi de la infecţie, animalul producând anticorpi specifici. Ovinele sunt de asemenea

sensibile la infecţia cu BoHV-1. Virusul se multiplică fiind excretat între a 8-15-a zi animalul

producând anticorpi specifici. Se poate instala și starea de latenţă, virusul putând fi reexcretat. Se

pare că nu există contaminare între oi deoarece doza infectantă trebuie să fie destul de mare. În

acest fel oile pot juca doar rol de rezervor de virus pentru bovine.

Rumegătoarele sălbatice: numeroase specii sălbatice sunt sensibile la infecţia cu BoHV-1

în funcţie de continentul luat în considerare. În Europa de exemplu: cervidele (cerb, căprioară,

capră de munte).

Virusul poate să persiste mai multe zile în mediul exterior și poate fi prezent pe diferite

suporturi precum: îmbrăcămintea îngrijitorilor, în spaţiile de furajare, adăpători, furaje,

materialul de contenţie. Virusul persistă mai mulţi ani în azot lichid de exemplu în spermă şi

embrioni congelaţi. (Van Schaik G. și colab., 2001)

1.3.2 Surse de infecție

În forma respiratorie virusul este prezent din abundenţă în jetajul nazal, secreţiile respiratorii

şi oculare, până la 1010

DICC50/g mucus, la animalele sensibile în timpul fazei de primoinfecţie.

În forma genitală, virusul este prezent din abundenţă în secreţiile genitale, până la 1011

DICC50/g

mucus în cazul primoinfecţiei. Virusul este prezent de asemenea în sperma taurilor infectaţi, la

nivelul lichidului seminal în doză de 104 DICC50/g şi absorbit la suprafaţa celulelor reproductive

şi embrionilor.

1.3.3 Doza infectantă

Doza minimală infectantă este foarte scăzută fiind estimată la 3,2 DICC50. Astfel o

excreţie slabă de virus reprezintă un potenţial periculos pentru contaminarea altor animale. Doza

necesară pentru producerea unei infecţii prin însămânţare artificială este mult mai mare , fiind de


19

aproximativ 200 DICC50.

1.3.4 Mod de transmitere

Transmiterea directă este cea mai frecventă, producându-se prin contactul direct între

două bovine. Astfel într-un adăpost contaminarea bovinelor se face din aproape în aproape pe

cale nazală sau conjunctivală. Transmiterea bolii între două efective se realizează de obicei prin

introducerea unui animal infectat. Contaminarea pe cale genitală prin intermediul unui taur

infectat poate avea loc atunci când se realizează monta naturală. Transmiterea directă la fetus

poate avea loc în timpul viremiei tranzitorii care apare la vacă în cazul primoinfecţiei conducând

în general la moartea fetusului.

Transmiterea indirectă se poate realiza la distanţă prin aerosoli cu particule infectate

(mucus nazal) în timpul tusei sau a strănutului. Transmiterea se poate face de asemenea prin

contact cu diverse suporturi contaminate cu mucus care conţine doze crescute de virus:

îmbrăcămintea îngrijitorilor, adăpători, iesle, material de contenţie. Transmiterea indirectă mai

poate avea loc fie prin însămânţări artificiale şi transfer de embrioni.

1.3.5 Factori de receptivitate

Vârsta nu este un factor de sensibilitate la infecţie; totuşi nou-născuţii fără anticorpi

maternali sunt mai sever afectaţi. Rasa nu este un factor care influenţează receptivitatea la

bovine. Stresul unui animal influenţează răspunsul său faţă de infecţie: un viţel supus unui stres

şi apoi infectat cu BoHV-1 prezintă semne clinice, o febră mai puţin intensă şi o excreţiei virală

mai tardivă. (Thiry E., 2000)

1.4 Patogeneză

Poarta naturală de pătrundere a virusului BoHV-1 este membrana mucoaselor de la

nivelul segmentelor superioare aparatului respirator şi la nivelul aparatului genital. Infecţia mai

poate fi transmisă și prin inocularea la nivelul epiteliului conjunctival. Calea principală de

transmitere este însă contactul direct dintre animale, totuşi s-a demonstrat şi transmiterea pe cale

aerului prin intermediul aerosolilor, însă doar pe distanţe mici (Mars M.H. și colab., 2000).

Transmiterea genitală a virusului necesită contactul direct din timpul montei naturale. De

asemenea virusul se transmite și prin intermediul spermei de la taurii infectaţi datorită capacităţi

criogenice a virusului.

1.4.1 Replicarea intracelulară a BoHV-1

Infecţia cu BoHV-1 a celulelor ţintă este iniţiată de un proces care conţine trei etapei.

Prima interacţiune implică o afinitate scăzută de ataşare a virusului între gB şi/sau gC la

structurile suprafeţei celulare. Aceasta este urmată de stabilirea unei legături între gB a virusului

BoHV-1 şi receptorii celulari specifici. O structură aflată în prelungirea receptorilor a fost


20

identificată ca potenţială ţintă a interacţiunii gD. Cu toate acestea acest proces include cel puţin 4

clase de molecule, dar însă doar nectina-1 (un membru al familie imunoglobulinelor), a fost

demonstrat că serveşte ca receptor pentru pătrunderea lui BoHV-1. După această interacţiune

dintre gD şi receptori celulari, penetrarea virusului are loc prin fuziunea anvelopei virale cu

membrana plasmatică. Acest proces important necesită cel puţin implicarea a 4 glicoproteine

BoHV-1, gD, gB, şi heterodimerul format de gH şi gL (Meyer G. și colab., 1998).

Odată ce ei au intrat în citosolul celulei, particula virală trebuie transportată utilizând un

complex motor dineină asociat microtubulilor către porii nucleului pentru a se permite eliberarea

ADN-ului viral. Acest transport citoplasmic centripet în asociaţie cu microtubulii, a fost

demonstrat în celulele infectate HSV-1 şi este aproape în totalitate conservat la

alfaherpesvirusuri.(fig. 1.5)

În timp ce particulele virale sunt transportate către nucleu, proteinele din tegumentul

virusului sunt împrăştiate în citosolul celulei unde pot avea un rol important în primele momente

ale infecţiei virale, deoarece ele sunt primele care interacţionează cu mediul intracelular. Dintre

cele mai importante proteine ale tegumentului viral sunt: VP8, VP16. (fig. 1.4)

VP8 este proteina învelişului cea mai mare a BoHV-1. Ea este localizată în nucleu

imediat după infecţie datorită unui semnal al localizării nucleare. Cu toate acestea, rolul exact al

VP8 în infecţia virală este încă neclară. Proteina învelişului codificată de UL41 este cunoscută

sub numele de proteina de închidere a virionului gazdă (vhs) a BoHV-1. (Hinkley S. și colab.,

2000)

Altă proteină de înveliş importantă este VP16 (virion protein 16) cunoscută sub numele

de α-TIF BoHV-1 (factorul de transinducere de gene alfa). Este responsabilă de iniţierea

expresiei genei BoHV-1 prin transactivarea genelor (gene alfa) imediat. Expresia genelor BoHV-

1 este reglată temporar în timpul infecţiei.

Cascada expresiei genice includ trei expresii cinetice de gene, care dau naştere succesiv

ARN-ului (IE), precoce (E) şi tardiv (L). (Wirth U.V. și colab, 1989) Ele codifică proteinele

implicate în principal în reglarea ciclului viral, în replicarea ADN-ului viral şi în morfogeneza de

noi virioni.

ADN viral este eliberat în nucleul celulei unde debutează transcripţia sa, de către ARN

polimeraza celulară sub controlul factorilor virali. Expresia genelor virale se face în cascadă ca şi

la celelalte herpesvirusuri.


21

Fig. 1.4 Reprezentare schematică a ciclului de multiplicare virală a BoHV-1

(după Thiry E., 2000)

Legendă:

np - porul nucleului; im - faţa internă a membranei nucleare; om - faţa externă a membranei

nucleare; npc- por nucleara complet; dl - proteină antifusion; sp - spikes, te - tegument.

Prima fază, care nu necesită nici o sinteză proteică “de nuovo” se efectuează imediat după

eliberarea genomului viral. Se produc proteine precoce-imediate (IE-immediate earley) numite

de asemenea proteine alfa. Proteinele IE au rol strict esenţial de proteine regulatoare. În cadrul

acestei grupări au fost puse în evidenţă 7 proteine cu greutate moleculară cuprinsă între 35 şi 180

kDa.

A doua fază are loc după sinteza proteinelor IE şi generarea de proteine precoce (E-

early) numite şi proteine beta. În cadrul grupului de proteine E se găsesc proteine regulatoare, dar

mai ales proteine implicate în replicarea genomului, timidinkinaza (TK) şi ADN polimeraza. TK

nu este o proteină esenţială pentru multiplicarea virală dar deleţia genei care codează TK reduce

virulenţa virusului BoHV-1 în vivo. Gena care codează ADN polimeraza este localizată în

regiunea UL a genomului viral.

A treia faza nu se efectuează decât în prezenţa ADN viral. Pe parcursul acestei faze sunt

produse proteinele tardive (L-late) care sunt denumite și proteinele gamma. Proteinele L sunt

proteine structurale precum proteinele structurale ale tegumentului (VP-8, VP-16) sau

glicoproteina (gB). Componentele structurale produse de gena L sunt necesare pentru sinteza

unei noi particule virale.


22

Asamblarea virionului este un proces complicat. Iniţial proteinele tegumentului formează

un schelet pentru a crea o particulă intermediară în interiorul nucleului. În timpul maturării

proteina internă a scheletului este clivată şi deplasată din interiorul capsidei în timp ce genomul

ADN este plisat. Concatemerii cu greutate moleculară mare sunt clivaţi în unităţi de lanţuri

genomice printr-un mecanism complex, care este în strânsă legătură cu inserţia ADN-ului în

capsida abia formată.

Virionul anvelopat iese din celula infectată prin exocitoză (utilizând vezicule ale

aparatului Golgi ale celulei).

1.4.2 Multiplicarea la poarta de intrare

Odată pătruns la nivelul epiteliului celular, BoHV-1 pune în funcţiune ciclul litic de

replicare virală. Acesta corespunde expresiei genelor virale şi duce atât la producerea de noi

particule virale cât şi la moartea celulei. Efectul citopatic al virusului BoHV-1 (CPE) se

caracterizează prin balonizarea celulei infectate şi apariţia de incluzii intracelulare. Moartea

celulară rezultă în urma a celor două procese și anume: necroza şi apoptoza, procese rezultate în

urma ciclului de multiplicare virală. În cazul celulelor infectate cu BoHV-1, sinteza proteinelor

celulare este oprită parțial de către proteinele din tegumentul viral.

După producerea efectului citopatic, BoHV-1 duce şi la scăderea capacităţii reparatorii a

epiteliului respirator prin inhibarea migrării celulelor epiteliale în zonele lezate. În cadrul unui

model in vitro, infecţia BoHV-1 a avut efecte marcante asupra interacţiunii celulelor epiteliale

bronşice cu matricea extracelulară, scăzând astfel migrarea celulei. (Spurzem J.R. și colab.,

1995)

1.4.3 Diseminarea în organism

Infecţia BoHV-1 la poarta naturală de intrare rezultă în producţia masivă de virus. Noi

viruşi descendenţi se desprind în mucusul nazal la titruri de excreţie ridicate şi sunt responsabili

pentru difuzarea rapidă a infecţiei în cadrul unei turme de vite.

Raportul reproducție de bază (R0) este o valoare de prag care descrie dinamica infecţiilor

într-o populaţie. Acest parametru este definit ca numărul mediu de cazuri secundare generate de

către un caz primar într-o întreagă populaţie susceptibilă de densitate diferită. În condiţii

experimentale, R0 a fost estimat să fie de cel puţin 7 într-o turmă de vite de lapte. Noii

descendenţi, de asemenea, se răspândesc în animalul infectat folosind diseminarea locală,

răspândirea sistemică prin viremie şi eventual neuroinvazia. (Engels M., Ackermann M., 1996)

1.4.3.1 Diseminarea locală

Răspândirea noii generaţii de BoHV-1 în mucoasa infectată se poate realiza prin două

moduri diferite. În primul rând, virusurile eliberate în mediul extracelular sunt particule complet


23

încapsulate capabile să interacţioneze cu receptorii celulelor sensibile. În caz contrar, particulele

virale se pot răspândi direct de la o celulă infectată la celulele învecinate neinfectate (răspândirea

directă celulă la celulă, ctcs). Glicoproteinele gB, gD şi gH/gL sunt necesare pentru ctcs, întrucât

gG şi heterodimerul format de gI/gE promovează ctcs-urile directe în prototipul herpesvirusurilor

HSV-1. (Trapp S. și colab., 2003)

1.4.3.2 Răspândirea sistemică prin viremie

BoHV-1 se poate răspândi în gazdă prin viremie, dobândind acces la o gamă mai largă de

ţesuturi şi organe şi cauzând alte manifestări clinice, ca de exemplu avort la vacile gestante şi

infecţii sistemice la viţeii seronegativi foarte tineri. În urma unei inoculări intranazale a unei

tulpini BoHV-1 foarte virulentă, virusul a fost izolat după câteva zile din serurile de viţei

infectaţi.

După citoliza celulelor infectate virioni trec în mediul interstiţial şi de aici în sânge. Se

declanşează o stare de viremie care explică localizarea secundară a infecţiei la nivelul organelor

ţintă, precum tubul digestiv, ovare, glanda mamară, fetus, şi o infecţie generalizată la viţeii noi

născuţi. Virioni pot să fie transportaţi în sânge cu ajutorul limfocitelor, absorbiţi la suprafaţa

acestora, şi cu ajutorul monocitelor în care pot efectua o replicare limitată după care să se

detaşeze.

1.4.3.3 Neuroinvazia

Pe parcursul replicării primare a virusului care are loc pe suprafeţele mucoaselor, BoHV-

1 se consideră a infecta neuronii prin intermediul terminaţiilor nervoase din mucoase şi urcă spre

sistemul nervos central (SNC). Mucoasa oronazofaringeală este inervată de şase nervi majori ai

creierului, din care nervul olfactiv şi nervul trigemen suplinează mucoasa nazală. Părţile rostrale

ale cavităţii nazale sunt inervate doar de către nervul trigemen, întrucât epiteliul olfactiv în

părţile caudale ale cavităţii nazale conţine atât terminaţii nervoase olfactive cât şi trigeminale.

(Gerdts V. și colab., 2000) Aceste două rute (olfactivă şi trigemenă) reprezintă căile majore a

neuroinvaziei virale către SNC folosite de două alphaherpesvirusuri neurotrope referitoare la

BoHV-1: BoHV-5 şi PrV. Din contră, BoHV-1 utilizează de preferinţă numai calea trigemenului.

Mai mult decât atât, neuroinvazia BoHV-1, de obicei, nu merge mai departe de primul

neuron situat în ganglionul trigemenului unde infecţia latentă este stabilită. Cu toate acestea

BoHV-1 a fost sporadic izolat de la bovinele cu tulburări ale sistemului nervos central. Unele

dintre aceste tulpini izolate s-au dovedit a fi responsabile de meningoencefalita acută care apare

la bovinele adulte. (Roels S., și colab., 2000)

Aceste cazuri sporadice reflectă probabil susceptibilităţile individuale ale gazdei la

infecţia SNC, mai puţin decât modificările tulpinei BoHV-1 care au dat naştere la o neuroinvazie

crescută şi/sau neuroviruleţă. O serie de factori ai gazdei pot fi responsabili de sensibilitatea


24

crescută la infecţia SNC a BoHV-1, așa cum este sugerat de către datele recent obţinute privind

cazurile sporadice de encefalită cauzate de HSV la oameni. De exemplu, nou-născuţii care deţin

deficienţe homozigote în STAT 1, o proteină cheie reglatoare a căii antivirale induse de

interferonii (IFN) α și β, s-au dovedit a fi foarte sensibili la infecţia letală a SNC a

herpesvirusului. În caz contrar, gena apolipoproteinei E (Apo E) a fost, de asemenea, legată de

infecţiile SNC umane. Trei alele comune ale Apo E există în populaţia umană (Apo E2, E3 și

E4); dintre ele, Apo E4 este mai puţin frecventă. Infecţia de şoricei transgenici care exprimă alela

umană ApoE4, a arătat o creştere severă a concentraţiei de HSV-1 în creier, comparativ cu

şoriceii de tip sălbatic, şoriceii knock-mout în genele Apo E şi şoriceii transgenici exprimă alela

Apo E3. Cu toate acestea, nu au fost diferenţe semnificative la nivelurile virale găsite în organele

periferice. Apo E4 pare a facilita intrarea şi/sau răspândirea HSV-1 în creier, mult mai eficientă

decât E3. Se poate postula într-un mod rezonabil faptul că astfel de tipuri de alele sensibile poate

explica neuroinvazia şi/sau neurovirulenţa BoHV-1 la bovinele individuale.

1.5 Răspunsul imun

În urma infecţiei primare, reacţiile inflamatorii nespecifice şi reacţiile celulare sunt

primele răspunsuri la infecţia BoHV-1. Unele din mecanismele non-specifice sunt constitutive,

precum activarea complementului în timp ce altele, precum IFN, sunt induse de replicarea

virusului. Producţia de citokine timpurii conduce la recrutarea şi activarea de celule diferite, cum

ar fi macrofagele, neutrofilele polimorfonucleare şi limfocitele mari granulare (în calitate de

celule Natural Killer la bovine). Aceşti efectori consolidează primul val antiviral de citokine

secretoare în epiteliul infectat şi ucid celulele infectate de virus. Activarea nespecifică a celulelor

imune sunt, de asemenea, esenţiale în iniţierea şi reglementarea răspunsului specific imun a

BoHV-1.

Imunitatea specifică celulară este detectată în a cincea zi post infecţie (pi) şi atinge un

nivel maxim la 7-10 zile pi. În general, coincide cu vindecarea manifestărilor clinice. Limfocitele

T helper specifice mediază liza celulelor infectate a BoHV-1 prin activarea macrofagelor şi

celulelor NK, prin secreţia IFN-γ şi IL2, şi prin angajarea şi promovarea proliferării limfocitelor

T citotoxice specifice.

Imunitatea umorală specifică devine detectabilă din ziua 10 pi. Chiar dacă anticorpii par a

fi mai puţin importanţi în recuperarea infecţiei primare, ei participă probabil la clearance-ul

infecţiei BoHV-1 prin neutralizarea particulelor celulei virale libere, prevenind astfel răspândirea

extracelulară a infecţiei şi medierea citotoxicităţii celulare dependentă de anticorpi. În schimb,

răspunsul anticorpilor este de importanţă critică în prevenirea infecţiilor secundare şi pentru

limitarea consecinţelor de reactivare. Mai mult, imunitatea pasivă oferită de anticorpii colostrali


25

BoHV-1 de la vacile imune BoHV-1 este pe deplin eficientă să protejeze nou-născutul împotriva

bolii sistemice şi letale. (Mechor G.D. și colab., 1987)

1.6 Rolul BoHV-1 în complexul infecțiilor respiratorii ale bovinelor

Complexul infecțiilor respiratorii ale bovinelor este o boală polifactorială cauzată de

multiple practici dăunătoare de management şi interacţiuni dintre agenţii patogeni virali şi

bacterieni. Observaţiile experimentale ale probelor şi domeniului, au sprijinit implicarea infecţiei

BoHV-1 în promovarea suprainfecţiilor bacteriene conducând la bronhopneumonie severă.

Modificările induse de BoHV-1 pot acţiona la trei niveluri de răspunsuri fiziologice la

agenţii patogeni:

Leziunile epiteliului cauzate de infecţia BoHV-1 reduce clearance-ul mucoasei datorită

secreţiei de mucus şi a activităţii ciliare.

Infecţiile BoHV-1 pot diminua activităţile macrofagelor alveolare şi neutrofilelor

polimorfonucleare. Acestea pot provoca, de asemenea, o scădere selectivă a populaţiilor

de limfocite CD4+, modificând astfel traficul de limfocite. (Warren L.M. și colab., 1996)

Un alt posibil mecanism care ar putea explica BoHV-1/sinergism bacterian este

reprezentat de expunerea leucocitelor la citokinele inflamatorii eliberate ca răspuns la

infecţia BoHV-1. (Leite F. și colab., 2004)

1.7 Latenţa şi reactivarea

După infecţia primară cu BoHV-1, bovinele devin purtători latenţi. BoHV-1 stabileşte pe

tot parcursul vieţii latenţa în neuronii senzoriali ai sistemului nervos central periferic după

replicarea în epiteliul mucoasei. Prin analogie la omologii herpesvirusului HSV şi PrV, BoH-1 se

consideră că penetrează extremitatea nervilor senzitivi distribuiţi la nivelul epiteliul infectat. Este

apoi transportat de-a lungul microtubulilor axonilor pentru a ajunge la corpul neuronului în

ganglionul nervos. Deşi locul principal de latenţă este în neuronii ganglionari, există dovada că

latenţa şi reactivarea au loc în cadrul centrelor germinale a amigdalelor faringiene. (Winkler

M.T. și colab., 2000)

Cascada de transcriere bine organizată a genelor alfa, beta şi gamma a virusului duce la

activarea caspazelor şi p53 rezultate în moartea programată a celulelor şi eliberarea eficientă a

virionului în celulele permisive. Gena BICP0 IE joacă un rol esenţial în această fază litică. Din

contră, în neuronii infectaţi latent, numai regiunea BoHV-1 care conţine transcrierea legată

latentă (LRT) este exprimată, conducând la inhibarea ciclului litic al virusului şi inducerea unui

strat antiapoptotic al celulelor infectate. Această observaţie sugerează că secvenţele de ADN în

promotorul LR sunt reglementate în mod pozitiv de factorii tip ai celulelor neuronale. Acest


26

lucru este evidenţiat de către o localizare diferită a locului de start pentru ARN-ul LR în infecţia

litică şi infecţia latentă, în ganglionul trigeminal. O fracţiune din transcrierea LR a BoHV-1 este

polimerizată şi îmbinată alterativ în celulele infectate latent, sugerând că aceste transcrieri sunt

traduse în mai multe produse LR (LRP).

Diferite funcţii au fost atribuite LRT: inhibarea apoptozei, inhibarea intrării în faza S şi

inhibarea expresiei BICP0. Expresia LRP este necesară pentru inhibarea apoptozei, dar expresia

de proteine nu pare să fie necesară pentru inhibarea creşterii celulelor sau expresiei BICP0. Mai

multe studii in vivo au fost efectuate pentru a investiga rolul LRT şi LRP în cursul infecţiilor

productive şi latente. Infecţia viţeilor cu mutante non sens LRT, a arătat o imagine clinică mai

puţin severă, în comparaţie cu infecţia cu BoHV-1 de tip sălbatic sau salvat LRT. Mutantele LRT

au fost revărsate la rate similare din cavitatea nazală în timpul infecţiei primare. În neuronii

infectaţi latent, nivelurile reduse ale ADN-ului viral au fost depistate, dar nivelurile mai ridicate

ale apoptozei au avut loc în ganglionul trigeminal, la sfârşitul infecţiei acute. Mutantele LRT ale

BoHV-1 nu au fost reexcretate în urma tratamentului de reactivare cu dexametazonă, ceea ce a

indus reactivarea şi reexcreţia în toate infecţiile de tip sălbatic a viţeilor sau LRT virusului salvat.

Aceste rezultate indică faptul că gena LR este necesară pentru ciclul latenţă-reactivare al

BoHV-1. Este evident demonstrat că, gena LR protejează neuronii de la moartea celulelor în

timpul instituirii latenţei. Inhibarea morţii celulelor ar fi, de asemenea, necesară pentru a menţine

latenţa prin menţinerea în viaţă a neuronilor infectaţi latent. Nici un mecanism explică în prezent

rolul genei LR în reactivarea şi/sau reexcreţia BoHV-1.

Prin analogie cu observaţiile obţinute în latenta şi reactivarea HSV, sistemul imunitar se

crede că ar juca un rol în reglementarea ciclului latenţă-reactivare al BoHV-1. În modelul

șoarecelui, latenţa HSV și limfocitele citotoxice T producătoare de IFN-γ s-au dovedit a fi

capabile de a preveni reactivarea latenţei în neuronii senzoriali. Un alt studiu a concluzionat că

IFN-α şi -γ acţionează ca factori de control ale leziunilor herpetice recurente.

Reactivarea latenţei poate apărea după o expunere la stimulente naturale sau tratamentul

cu corticoizi culminând cu transmiterea virusului recurent la animalele neinfectate, în general

fără semne clinice. Odată reactivat în neuronii din ganglionul trigeminal, BoHV-1 iniţiază un nou

ciclu de replicare. Reactivarea indusă cu Dexametazonă, efectuată pe iepurii infectaţi latent, a

arătat că doar o mică parte din neuronii infectaţi latent au trecut cu succes de reactivare şi acel

AND viral specific al infecţiei productive BoHV-1 a fost detectat mai devreme de 18 ore post

tratament. Viruşii descendenţi, se crede că, ajung la locul primar de intrare prin intermediul căii

axonale. La nivelul acestui epiteliu mucozal, amplificarea virusului va da sau nu naştere la

reexcreţia BoHV-1.


27

Reexcreţia virusului este influențată de doi factori: statusul preimun şi fenotipul viruşilor

descendenţi. Răspunsul imun primar dobândit în urma expunerii naturale la BoHV-1 sau la o

schemă de vaccinare este în măsură să controleze cu succes reexcreţia oricărui transportor latent.

Răspunsul imun secundar potenţat de stimuli de reactivare succesivi este de asemenea eficient la

inhibarea reexcreţiei virusului. Prin urmare, stimulii de reactivare care apar în primele două luni

de la infecţia primară nu pot să activeze reexcreţia virusului.

Fenotipul viruşilor descendenţi influenţează asupra capacităţii unui virus de fi reexcretat

sau nu. Experimentele recente au demonstrat că mutanta gC-gE- nulă a BoHV-1 stabilește

latenţa, dar nu este reexcretată în urma unui tratament de reactivare. (Whetstone C.A. și colab.,

1992)

1.8 Semnele clinice

Severitatea bolii este influenţată de mai mulţi factori cum ar fi virulenţa tulpinii BoHV-1,

factori de rezistenţă a gazdei, în special vârsta şi potenţialul de infecţii bacteriene curente.

Infecţiile subclinice BoHV-1 sunt obişnuite. Mai multe tulpini BoHV-1 afişează o capacitate

slabă de a induce semne clinice şi au fost clasificate ca tulpini slab virulente într-un experiment

comparativ al virulenţei.

În caz contrar, aceste tablouri clinice discrete pot fi, de asemenea, explicate de către

infecţia primară a viţeilor imuni pasivi în ţările în care BoHV-1 este endemic. Imunitatea

colostrală este cunoscută să protejeze în mod eficient animalele infectate de la semnele clinice.

(Lemaire M. și colab., 2000)

După inocularea intranazală a viţeilor seronegativi, febra mare se măsoară pentru 4-5 zile

(maxim 41ºC) şi poate fi însoţită de apatie şi anorexie.

Vacile de lapte prezintă o scădere semnificativă a laptelui în această perioadă. După 2-3

zile de incubaţie, semnele respiratorii şi oculare sunt observate. Acestea corespund cu răspunsul

inflamator şi daunele epiteliului cauzate de BoHV-1 la locul de replicare primară. Ele constau în

aspectul roşu al mucoasei nazale, secreţie nazală seroasă până la mucopurulentă, (fig. 1.5, fig.

1.6) şi în cazurile severe, respiraţie grea la inspiraţie (obstrucţie traheală cauzată de resturile

necrotice în lumenul traheal) şi tuse.

Examinarea endoscopică a relevat un aspect roşu al epiteliului mucoaselor faringeale şi

traheale, prezenţa mai multor focare necrotice, cu celule moarte ale epiteliului mucoaselor

înglobate în exsudat fibrinos.

Semnele oculare, cum ar fi conjunctivita şi secreţia oculară mucopurulentă nu sunt

neobişnuite.


28

Avortul este o consecinţă a infecţiei respiratorii BoHV-1 a vacilor seronegative. În mod

natural avorturile BoHV-1 sunt de obicei observate la 4-8 luni de gestaţie, deşi inocularea

parentală a virusului experimental la juninci înainte de 3 luni induce moartea embrionară.

Utilizând răspândirea sistemică prin viremie, BoHV-1 trebuie să traverseze bariera materno-

fetală pentru a produce infecţii letale la fetuşi. Traseul BoHV-1 de la placentă la făt nu este

cunoscut, dar, din moment ce leziunile virale sunt observate în mod constant în ficatul fetal,

răspândirea hematogenă apare cel mai probabil prin intermediul venei ombilicale.

Perioada de incubare dintre inocularea BoHV-1 şi avort este de 15 - 65 zile. Deşi

leziunile sunt observate atât în placentă cât şi la nivelul mai multor organe fetale, s-a sugerat că

degenerescenţa placentară ar fi secundară morţii fetale indusă de BoHV-1. Aşa cum s-a arătat

anterior, numai tulpinile BoHV-1.1 şi BoHV-1.2a au fost până acum asociate cu potenţial

abortigen. (Miller J.M. și colab, 1991)

Viţeii neonatali pot prezenta infecţie multisistemică în urma infecţiei congenitale înainte

de naştere sau infecţiei timpurii postnatale a BoHV-1. Viţeii privaţi de colostru sunt mai expuşi

riscului. Salivaţia excesivă şi diareea sunt consecutive replicării BoHV-1 în epiteliul organelor

digestive care nu sunt ţinte comune pentru BoHV-1. Mai multe leziuni sunt observate în tractusul

digestiv, precum glosită, esofagită, şi ruminită necrozantă acută. Rezultatul este fatal în decurs de

4- 5 zile; viţeii mor într-o stare muribundă.

Forma genitală a BoHV-1 se transmite de obicei la împerechere. Denumirile date bolilor

care afectează vaca (vulvovaginita pustuloasă infecţioasă, IPV) şi taurul (balanopostita

pustuloasă infecţioasă, IPB) descriu clar tablourile clinice observate în urma infecţiei primare.

Deşi infecţia este limitată la organele genitale, infecţiile severe care produc orhită la taur şi

endometrite la vacă au fost raportate ocazional.

Fig.1.5 Secreţie nazală seroasă până la

mucopurulentă

(http://www.bva.co.uk/public/documents/0

7congress_IBR_graham_pp.pdf)

Fig. 1.6 Eritem la nivelul botului – “boala

botului roșu”.

(http://quizlet.com/2914298/)


29

1.9 Modificări anatomopatologice

În localizarea respiratorie se constată prezenţa de peteşii, necroze, exsudat fibrinopurulent

şi ulcere la nivelul mucoaselor tractusului respirator anterior, rinotraheită purulentă la început,

apoi pseudomembranoasă, laringită pseudomembranoasă, congestia zonei epidermice a botului,

uneori bronhopneumonie fibrinoasă cu zone de emfizem sau chiar bronhopneumonie

gangrenoasă datorită implicării florei secundare.

În forma genitală (I.P.V.) macroscopic la masculi se constată balanopostită pustuloasă

iniţial, ce devine erozivă, iar în final necrotică. La femele este prezentă vulvovaginita pustuloasă.

În celelalte forme ale bolii apar focare eroziv-ulcerative ale mucoasei esofagului,

faringelui, laringelui, cheagului şi intestinului, exsudate seromucoase sau mucopurulente la

nivelul sinusurilor, limforeticulită hemoragică retrofaringiană, iar organele parenchimatoase

(ficat, cord, rinichi) sunt degenerate sau prezintă focare de necroză. .

Fetuşii sunt parţial autolizaţi, prezintă edem subcutanat şi pulmonar, colecţii roşiatice în

marile cavităţi, uneori hemoragii subepicardice şi subendocardice, pleurale şi pulmonare.

La examenul histologic se evidenţiază procese congestiv-hemoragice, necrotice,

ulcerative şi infiltrative, meningoencefalită limfomonocitară şi prezenţa de incluzii intranucleare

acidofile de tip Cowdry A în celulele epiteliilor mucoaselor respiratorii şi digestive. (fig. 1.7)

Fig. 1.7 Celulă infectată cu virusul IBR.

Virusul se multiplică în nucleul celulei

( după Muylken B. și colab., 2007)


30

1.10 Diagnosticul

Pentru a stabili un diagnostic de certitudine se va recurge obligatoriu la examene de

laborator (examen histopatologic şi virusologic), iar în acest scop se recurge la izolarea virusului

din cazurile de rinotraheită infecţioasă (I.B.R.), vulvovaginită pustuloasă (I.P.V.) şi de

balanopostită infecţioasă.

De la animalele vii se recoltează în vederea izolării virusului secreţii nazale şi oculare. De

la animalele moarte se recoltează: limfonodurile bronhice, ţesut traheal, porţiuni de piele cu

leziuni de dermatită, fragmente de derm din spaţiul interdigital, porţiuni de encefal cu leziuni de

encefalomielită, porţiuni de intestin cu enterită, mucoasa conjunctivală cu leziuni, avortoni,

splina şi alte ţesuturi limfoide. Diagnosticul infecțiilor cu BoHV-1 se realizează prin examene

serologice, virusologice și alergice.

1.10.1 Examenul serologic constă în evidențierea anticorpilor specifici putându-se

realiza pe probe de ser și lapte individual sau de colectură. Tehnica imunoenzimatică ELISA este

foarte larg utilizată datorită ușurinței de utilizare, rapidității, costului și adaptării analizării unui

număr mare de eșantioane. Pot fi utilizate 2 metode:

ELISA indirectă

ELISA prin competiție sau blocking ELISA.

a) ELISA indirectă – eșantionul de testat este pus în prezenta determinanților antigenici

specifici ai BoHV-1 absorbiți pe un suport solid. Anticorpii eventual fixați sunt revelați cu

ajutorul anticorpilor anti imunoglobulinici bovini conjugați cu o enzimă. După adăugarea unui

substrat cromogen specific enzimei, interpretarea se efectuează prin spectrofotometrie: densitatea

optică este proporțională cu cantitatea de anticorpi prezentă în eșantion.

b) Blocking ELISA – eșantionul de testat este pus în prezenta determinanților antigenici

specifici ai BoHV-1 absorbiți pe suport solid. Se adaugă apoi imunoser anti BoHV-1 sau

anticorpi monoclonali anti gB asociați cu o enzimă care se fixează pe situsurile antigenice rămase

libere, în competiție cu anticorpii eventuali prezenți în eșantion. Densitatea optică obținută după

adiția stratului cromogen este cu atât mai slabă cu cât cantitatea de anticorpi prezenți în eșantion

este mai mare.

Testele ELISA efectuate pe ser sanguin sunt utilizate în funcție de sensibilitatea și

specificitatea lor față de tipul probei recoltate (sânge sau lapte, individual sau amestec). Factorii

de variație sunt numeroși: modul de preparare și fixare a antigenului, diluția eșantionului de

testat, durata perioadei de incubare pentru diferite etape.

Testele blocking ELISA prezintă o mai mare sensibilitate în particular pentru detectarea

eșantioanelor pozitive din amestecuri. În plus ele permit detectarea animalelor infectate recent

adică a purtătorilor de imunoglobuline M. Datorită marii sensibilități tehnica permite detecția


31

anticorpilor maternali la vițeii sănătoși pe o perioadă mult mai lungă decât alte teste: de la 9 la 11

luni în loc de 7. Laptele reprezintă o probă ușor de recoltat inclusiv în amestec, fiind suficientă

prelevarea unui singur eșantion de lapte de colectură pentru a controla statusul serologic al unei

turme. Laptele de colectură nu permite detectarea crescătoriilor foarte slab infectate, deoarece

diluția face să diminueze sensibilitatea testului. Complementar vaccinurilor deletate au fost

elaborate teste ELISA pentru detectarea anticorpilor specifici ai unei glicoproteine de suprafață a

BoHV-1, în principal gE. Metoda constă în utilizarea tehnicii blocking ELISA în care conjugatul

este un anticorp monoclonali anti-gE sau de anticorpi monoclonali anti-gE ce recunosc diferiți

epitopi ai gE. Acest test este mult mai sensibil când se utilizează pentru anti gE decât pentru anti

gB. În cazul unei infecții recente ELISA-gE poate detecta seroconversia mai tardiv decât ELISA

gB, astfel nu putem utiliza aceste teste pentru analiza amestecurilor de ser sau a laptelui de

colectură.

Sensibilitatea se ameliorează utilizând anticorpi monoclonali specifici pentru un singur

epitop a gE care este foarte bine conservat la toate sușele diferite de BoHV-1. La anumite

animale vaccinate de numeroase ori cu un vaccin deletat se înregistrează un procent destul de

crescut de fals pozitivi. Legătura dintre anticorpi anti-gE poate fi împiedicată de prezența unui

număr mare de anticorpi dirijați împotriva altor glicoproteine. (Muylken B. și colab., 2007)

1.10.2 În cazul examenului virusologic pe animalul în viață, recoltarea probelor trebuie

să se realizeze precoce, în faza de hipertermie utilizând badijonări nazale profunde sau lavaje

bronho-alveolare. De la cadavre prelevările de probe trebuiesc făcute în primele 3 ore de la

moartea animalului. În această situație se recoltează fragmente de organe lezate (pulmon și

trahee), organe și țesuturi limfoide (splina). În toate cazurile probele recoltate se trimit la

laborator în recipiente, la rece, în maxim 24 ore.

Izolarea virusului pe culturi celulare: efectul citopatic – punerea în evidență a virusului

BoHV-1 pe culturi celulare se bazează pe proprietatea virusului de a infecta celulele sensibile

cultivate în vitro și evidențierea efectului citopatic caracteristic prin microscopie electronică la

câteva zile de la infecție. Particulele virale izolate sunt apoi identificate prin teste imunologice.

Faza de preparare constă în separarea particulelor virale de celelalte elemente care constituie

proba recoltată prin dilacerare sau punerea în suspensie, centrifugare și filtrare. Ele sunt apoi

inoculate pe culturi celulare. Sistemele celulare cel mai frecvent utilizate datorită sensibilității lor

sunt celulele primare testiculare de vițel sau renale de vițel. (fig. 1.8) Inoculările se realizează în

stratul de celule confluente cultivate în plăci de microtitrare sau flacoane de cultură. Dacă virusul

BoHV-1 este prezent în proba recoltată se va observa o rotunjire a celulelor care se vor regrupa

în ciorchine lăsând în jurul lor spații în stratul celular. În lipsa efectului citopatic la 4-5 zile de la

inocularea pe cultura celulară, se realizează un al doilea sau un al treilea pasaj pe celule pentru a


32

verifica absența BoHV-1 din proba recoltată. În acest fel se poate facilita multiplicarea

particulelor virale eventual prezente în mici cantități.

Această izolare a virusului pe culturi celulare nu se poate realiza decât dacă particulele

virale prezente și-au păstrat puterea infecțioasă. De aceea este esențial de a urmări calitatea

probelor recoltate și transportul lor cât mai rapid la laborator. (Muylken B. și colab.,2007)

Fig. 1.8 Cultură celulară MDBK infectată - prezența plajelor de liză

( după Muylken B. și colab., 2007)

Seroneutralizarea constă în punerea în contact de diluții descrescătoare de suspensie

virală cu cantități constante de imunoser monospecific neutralizant anti-BoHV-1 pe de o parte și

o cantitate constantă dintr-un ser negativ față de BoHV-1 de altă parte. Se calculează titrurile

obținute pentru cele două serii, iar prin diferența lor se calculează indicele de neutralizare care

dacă este superior lui 2, permite concluzionarea că virusul BoHV-1 se găsește în celulele

inoculate.

Tehnica PCR este utilizată pentru detecția BoHV-1 în sperma taurilor în centrele de

însămânțări artificiale. De asemenea se poate utiliza pentru izolarea ADN-ului viral din probe de

sânge la nivelul limfocitelor și pentru detectarea unei infecții subclinice. PCR-ul permite

confirmarea rezultatelor serologice dubioase, identificarea animalelor purtătoare latente

seronegative, decelarea unei infecții recente înainte de apariția anticorpilor și diferențierea unei

infecții de o vaccinare cu o sușa deletată pentru gE.

1.10.3 Diagnosticul diferenţial se impune faţă de diareea virală/boala mucoaselor care

afectează tineretul şi are o evoluţie mult mai gravă, de febra catarală malignă care apare sporadic

- este necontagioasă cu mortalitate crescută, de pesta bovină care evoluează enzootico-epizootic

cu evoluţie gravă şi mortalitate mare, de rinite alergice ce evoluează mai ales în perioada

păşunatului, de theilerioză, de difteria viţeilor, de pneumonia virală a viţeilor, sau de

pasteureloză. Vulvovaginita pustuloasă (I.P.V.) trebuie diferenţiată de diareea virală/boala

mucoaselor, bruceloză, listerioză, leptospiroză sau febra Q.


33

1.9 Profilaxie

a) Profilaxia nespecifică

Prevenirea bolii în unităţile de creştere se realizează prin măsuri generale şi măsuri

specifice. Măsurile generale vizează: achiziţionarea de animale se va face numai din efective

indemne, animalele nou achiziţionate vor fi ţinute în carantină profilactică, respectarea

tehnologiilor de creştere şi exploatare, evitarea factorilor de stres, supravegherea serologică,

folosirea la montă sau la însămânţări artificiale a taurilor serologic negativi, efectuarea

dezinfecţiilor curente, evitarea supraaglomerării adăposturilor.

b) Profilaxia specifică

Obiectivele în combaterea infecţiei BoHV-1 au evaluat de-a lungul ultimelor decenii de la

o reducere obţinută cu uşurinţă de către un impact clinic către o prevenire mai dificilă de

transmitere a virusului.

Vaccinurile BoHV-1 sunt clasificate în patru categorii: viu modificat, inert (inactivat şi

subunitar), ADN-ul şi vaccinuri bazate pe vectori. Vaccinarea împotriva BoHV-1 a fost revizuită

recent într-un mod exhaustiv. Vaccinurile anti IBR-IPV se găsesc sub trei forme de bază:

vaccinuri vii modificate genetic, care nu se administrează la vacile gestante, vaccinuri inactivate

şi vaccinuri intranazale (vii şi atenuate). Vaccinurile pot fi monovalente aşa cum este vaccinul

“traheine” ce conţine virus viu modificat contra rinotraheitei infecţioase bovine, obţinut prin

cultivarea pe o linie celulară stabilă bovină a tulpinii mutante RLB-106, modificată prin

temperatură specifică, sau mixte cum este vaccinul “Cattlemaster 4” (fig. 1.9) care este un

vaccin polivalent contra rinotraheitei, diareei virale, parainfluenţei 3 şi virusului sinciţial

respirator la bovine sau vaccinul cu virusurile vii modificate contra rinotraheitei infecţioase,

adenovirozei şi parainfluenţei bovine denumit “imuresp-RAP” care se administrează pe cale

intranazală.

Fig. 1.9 Cattlemaster 4 - Vaccin polivalent contra rinotraheitei, diareei virotice,

parainfluenţei tip 3 şi virusului sinciţial respirator la bovine.

(www.pfizer.com)


34

Până în prezent nici un vaccin nu asigură o protecţie completă, de aceea se impune

instituirea unui protocol de vaccinări repetate, completate prin măsuri stricte sanitar - veterinare

şi de igienă care să diminueze riscul contaminării. În perspectivă se speră ca vaccinurile

subunitare, recombinate, sau cele constituite din ADN plasmidic să confere o imunitate

superioară.

c) Strategia DIVA (diferenţierea animalelor infectate de cele vaccinate)

Mai multe ţări europene au iniţiat programe de control care vizează eradicarea BoHV-1 şi

care sunt bazate pe utilizarea vaccinurilor marker deletate în gena gE. Aceste vaccinuri marker,

inactivate sau viu atenuate, utilizate împreună cu o detectare serologică a anticorpilor specifici

gE, permite diferenţierea animalelor infectate de cele vaccinate. Această capacitate de

diferenţiere este critică pentru restricţia de comercializare. (Lehmann D. și colab., 2002)

1.12 Combatere

La apariţia bolii în focar animalele bolnave se izolează şi se tratează. Pentru tratament în

scopul prevenirii complicaţiilor se vor folosi antibiotice şi se va institui un tratament simptomatic

şi unul igieno-dietetic. De asemenea se poate folosi şi serul antiviral - antipasteurelic ca şi serul

mixt “servipast” în doză de 0,5-0,6 ml/kg viu.

În cazul formei genitale de vulvovaginită pustuloasă infecţioasă se va întrerupe monta pe

toată durata evoluţiei bolii în efectiv şi se va practica însămânţarea artificială cu material seminal

provenit de la tauri indemni de IBR – IPV. Animalele sănătoase din focar se vor serumiza

folosind serul mixt în doză de 0,3-0,4 ml/kg viu pe cale subcutanată sau se vor vaccina de

necesitate pe cale intramusculară. Pentru stingerea focarului se recomandă eliminarea animalelor

depistate pozitiv la testele de laborator.


35

CAPITOLUL 2.

DESCRIEREA CADRULUI ORGANIZATORIC ÎN CARE S-AU

EFECTUAT INVESTIGAȚIILE

Rinotraheita infecțioasă bovină-vulvovaginita pustuloasă (IBR-IPV) este o boală infecto-

contagioasă virotică specific bovinelor, cu evoluție acută, caracterizată clinic prin hipertermie și

tulburări dominant respiratorii (rinită, traheită) sau genital (avorturi, infertilitate, balanopostite),

însoțite de conjunctivite.

Sub denumirea de rinotraheită infecțioasă a bovinelor este cunoscut un complex de

manifestări, aparent dispersate, determinate de același virus aparținând grupului Herpesviridae

(herpesvirus I).

Având în vedere prevalența crescută a infecțiilor cu virusul rinotraheitei infecțioase

bovină la taurine în Europa și faptul că și pentru România investigațiile privind infecțiile cu IBR-

IPV sunt insuficiente, în această lucrare am încercat să depistez bovinele infectate din județele

Iași, Vaslui și Galați utilizând tehnici serologice.

Investigațiile au constat în testarea probelor de sânge recoltate, în vederea evidențierii

anticorpilor specifici anti-virusul rinotraheitei infecțioase bovină utilizând metoda

imunoenzimatică E.L.I.S.A..

Prelucrarea, condiționarea și testarea probelor s-a realizat în cadrul laboratorului de

virusologie al Direcției Sanitar Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor Iași, și în cadrul

laboratorului de serologie, disciplina Boli Infecțioase, din cadrul Facultății de Medicină

Veterinară Iași.

Descrierea laboratorului de serologie din cadrul Facultății de Medicină Veterinară, Iași

Laboratorul de serologie din cadrul Facultății de Medicină Veterinară Iași se găsește în

cadrul pavilionului 6. Aparatura din dotarea laboratorului se ridică la standardele de calitate

specifice unui laborator de serologie, fiind achiziționată prin proiecte de cercetare în perioada


36

2008 - 2010. Astfel condițiile de securitate ale probelor biologice si ale cercetătorului sunt

asigurate de Hote cu flux laminar de tip II.

Manipularea probelor se face prin intermediul pipetelor semiautomate și automate

Eppendorf, centrifugarea probelor de sânge s-a realizat prin intermediul centrifugii cu răcire de

mare viteza iar incubarea plăcilor ELISA s-a făcut în incubatorul cu vibrații și termostat

Heidolph.

Linia de serologie, respectiv cititorul de plăcii și spălătorul automat, face parte din

prestigiosul brand TECAN, asigurându-se astfel reproductibilitatea și repetabilitatea rezultatelor

serologice.

În cadrul laboratorului de virusologie, am efectuat investigațiile serologice sub

îndrumarea D-lui Dr. Asist. univ. Aniță Dragoș Constantin.

Fig. 2.1 Aspecte din laboratorul de serologie al Facultății de Medicină Veterinară, Iași


37

Descrierea Laboratorului Sanitar Veterinar (LSVSA), Iași

Funcționând în incinta Direcției Sanitar Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor Iași,

LSV este structurat din mai multe laboratoare de diagnostic, majoritatea deținând acreditare

RENAR.

În cadrul laboratorului de virusologie, am desfășurat investigații sub îndrumarea D-nei

Dr. Medic Veterinar Merticariu (Anderco) Ștefania, a cărei expertiză în domeniul virusologic

este cunoscută la nivel național.

Fig. 2.2 Aspecte din cadrul Laboratorului Sanitar Veterinar (LSVSA), Iași - laboratorul de

virusologie

exemplul 3

Documents