1

TEZA DE DOCTORAT

Evaluarea locala si globala a agregarii si deplasarii plachetelor sanguine

Doctorand Conducator

Mati Erand Prof. Univ. Dr.Constantin Mircioiu

CUPRINS

I. INTRODUCERE

II. STADIUL CUNOASTERII

Capitolul II.1 Hemoreologia

II.1.1 Fundamentele reologiei

II.1.2 Reologia suspensiilor

II.1.3 Curgerea in jurul sferelor

II.1.3.1 Curgerea in jurul unei singure sfere

II.1.3.2 Curgerea sirurilor de sfere

II.1.3.3. Curgerea unei colectivitati de sfere aflate in suspensie

II.1.4 Microreologia sangelui

II.1.4.1. Efectu Fåhraeus

II.1.4.2 Deformabilitatea eritrocitelor

II.1.5. Hemoreologia globala

Capitolul II.2 Metode de evaluare a aggregarii plachetare

II.2.1 Metode gobale de evaluare

II.2.2 Metode de evaluare locala

Capitolul II.3 Agregometria optica

II.3.1 Bazele agregometriei optice

II.3.1.1 Teoria masurarii agregarii plachetare

II.3.1.2 Procedura de lucru cu aparatul Hellena PACKS-4

II.3.1.3 Operatii PACKS-4 pentru agregarea plachetara

II.3.1.4 Specificatiile aparatului

III. PARTEA EXPERIMENTALA

Capitolul III.1 Evaluarea globala a agregarii plachetare

III.1.1 Dezvoltarea metodei de evaluare a agregarii plachetare folosind agregometrul

Packs-4

III.1.1.1. Calificarea canalelor de masurare al aparatului PACKS-4

III.1.1.2 Obeservatii despre metoda de lucru

III.1.1.3 Limitari hardware si software

III.1.1.4 Concluzii

III.1.2 Cercetari in vederea optimizarii metodei de testare a agregarii

III.1.2.1 Stocarea și stabilitatea probelor

III.1.2.2 Metoda de testare a agregarii

III.1.2.3 Aspecte generale nerezolvate in evaluarea si utilizarea clinica a

agregarii plachetare

III.1.2.4 Prelucrarea si analiza probelor din sange recoltat 3 ore inaintea

determinarii

III.1.2.5. Testarea agregarii plachetare a PRP obtinuta din sange recoltat pentru

VSH cu 6 ore inaintea analizei

III.1.2.6 Studiul efectului congelarii asupra activitatii plachetelor

III.1.2.7 Studiul efectului tipului si marimii magnetilor pentru agitarea probelor

de PPP si PRP.

2

III.1.2.8 Reducerea volumului de probe de sange pentru a putea face

determinarile in duplicat sau triplicat.

III.1.2.9 Parametrizarea curbelor de agregare furnizate de aparat.

III.1.2.10 Concluzii

Capitolul III.2 Studiul dependentei agregarii plachetare de concentratia de adrenalina folosita ca

inductor

III.2.1 Materiale si metode

III.2.2 Problemele de rezolvat in studiul agregarii induse de adrenalina

III.2.3 Compararea inhibitiei maxime

III.2.4 Discutii

III.2.5 Concluzii

Capitolul III.3 Studiul privind intercatiunea farmacodinamica intre adrenalina si clopidogrel

III.3.1 Calcule empirice de orbital molecular privind structura electronic a adrenalinei si

clopidogrelului

III.3.1.1 Metoda de calcul

III.3.1.2 Rezultate si discutii

III.3.1.3 Concluzii

III.3.2 Studiul interactiunii farmacodinamice intre adrenalina si clopidogrel in agregarea

plachetelor sanguine

III.3.2.1 Materiale si metode

III.3.2.2 Efectul clopidogrelului singur asupra plachetelor sanguine

III.3.2.3 Efectul cresterii concentratiei de clopidogrel cand concentratia

adrenalinei este tinuta constanta

III.3.2.4 Efectul concetratiei de clopidogrel asupra agregarii induse de

adrenalina

III.3.2.5 Concluzii

Capitolul III.4. Model experimental de evaluare curgerii suspensiilor de cellule sanguine

III.4.1 Model experimental privind deplasarea si agregarea populatiilor de celule

sanguine

III.4.1.1 Calculul vitezelor relative folosind matricea vectorilor de viteza relative

III.4.1.2 Concluzii

III.4.2 Sedimenntarea in suspensie extrem de diluate in zona aparent limpede de aspupra

limitei de separare in cazul sedimentarii hematiilor

III.4.2.1 Metoda de lucru

III.4.2.2 Rezultate obtinute

III.4.2.3 Discutii

III.4.2.4 Concluzii

IV . CONCLUZII

IV.1 Concluzii partiale

IV.2 Concluzii generale

V REFERINTE

VI ANEXE

Anexa 1 Curbe de agregare plachetara

Anexa 2 LUCRARI PUBLICATE

INTRODUCERE

Teza de fata se inscribe intr-un program mai larg de cercetare initiat in cadrul Universitatii de Medicina si

Farmacie “Carol Davila” din Bucuresti, in principal Facultatea de Farmacie, Spitalul Colentina, Sectia de

Neurologir si Spitalul Militar Central , Sectia de Medician Interna , urmarind dezvoltarea unor metode de

screening, aplicabi;a la patul bolnavului, pentru evaluarea efectului tratamentelor antiagregante pe baza de

clopidogrel si asociatii ale ecestuia cu aspirina.

Evaluarea isi propune, mai departe detectarea pacientilor cu rezistenta la clopidogrel si ajustarea

tratamentului , pornind de la cercetari de biofarmacie, de farmacocinetica si stabilire a unor scheme de tratament

individualizate, pentru depasirea rezistentei.

Ca metoda de monitorizare a efectului antiagregant s-au avut in vedere urmarirea agregarii plachetare si

urmarirea sedimentarii eritrocitelor.

3

Prouiectul de cercetare mentionat a fost inclus ca tema proiritara in strategia de cercetare a Academie de Stiinte

Medicale pentru perioada 2015 – 2020. Cercetarile au fost din pacate intrerupte temporar ca urmare a

reducerii fondurilor de cercetare allocate Academiei.

Teza , in cadrul acesui program si-a propus urmarirea agregarii plachetare si eritrocitare, prin mijloace de

evaluare globale , la nivel plasma cu eritrocite , si prin evaluari la nivel cellule sau populatii de cellule, prin

evaluari dinamice prin microscopie.

In ceea ce priveste agregarea plachetara , teza si-a propus determinarea parametrilor crritici ai agregarii

plchetare, in vederea unei simplificari a metodei optice Born, unei reduceri a timpului de determinare si conservarii

probelor pentru a putea face determinarile dup ace s-a strans un numar mai mare de probe.

S-a gasit ca rezultatele testelor optice de agregare depind putin de temperatura sau de viteza de agitare.

Parametru critic este timpul scurs de la recoltarea probei de sange. Rezultate reproductibile se obtin numai in prima

ora dupa recoltarea sangelui. Dupa mai mult trei ore de la recoltare nu se mai obtine nici o variatie a luminii

transmise prin proba de plasma bogata in plachete ( PRP).

Un alt obiectiv al cercetarilor privind optimizarea metodei optice de testare a agregabilitatii plachetelor l-a

constituit studiul dependenta agregarii de concentratia de adrenalina ca inductor , dependent care nu a fost studiata

sistematic pana in present. Experimentul nostru a aratat ca agregarea plachetelor creste o data cu concentratia de

adrenalina. Cresterea este liniara in intervalul 1 - 16 μM.

Efectul apare si este liniar la nivelul a patru parametri ai curbelor de sedimentare: prima panta, a doua

panta, inhibitia maxima si aria de sub curba de sedimentare.

S-a studiat apoi dependenta agr egarii de concentratia de adreanalina ca inductor in prezenta

clopidogrelului. S-a gasit ca efectele adrenalinei si clopidogrelului sunt practic independente. Nu a aparut, in

domeniul de concentratii studiat o interactiune farmacodinamica intre adrenalina si clopidogrel in agregarea

plachetelor sangvine.

Lipsa efectului antiagregant in cazul PRP s-a regasit si la nivelul agregarii intrinsece si la ce al agregarii

induse, ea ce nu era un rezultat neaparat asteptat deoarece se stia din literatura de existenta unui efect antiagregant in

cazul agregarii induse de adrenalina asupra plachetelor spalate.

Evaluari locale , la nivel cellule sau populatii de cellule prin microscopie dinamica. Agregarea si

sedimentarea eritrocitelor au fost urmarite prin filmare la microscop in suspensii concentrate ( sange normal) ,

diluate de 20 de ori si infinit diluate. Curgerea ( deplasareaa) celulelor s-a efectuat cu un soft din biblioteca

matematica MatLab pentru “analiza deplasarii particulelor “ (Particle Image Velocity – PIV).

Sangele diluat de 20 de ori are o concentratie de de 250 – 300 .000 de eritrocite ce pot fi urmarite la

microscop in ceea ce priveste agregarea, dezagregarea si sedimentarea. Acest experiment a fost considerat ca un

model privind evolutia populatiei de plachete in plasma libera de eritrocite.

La acest nivel de concentratie, eritrocitele s-au agregat foarte putin. Deplasarea a fost sedimentare in plan

vertical si diagonal, spre deosebire de suspensiile concentrate, unde s-au observant tuburi de curenti ascendenti de

plasma si singleti.

Aplicarea analizei matematice si statistice de tip Particle Image Velocity‟ a pus in evidenta o dispersie

foarte mica a vitezelor, si o preponderenta a curentilor descendenti.

In cazul suspensiilor infinit diluate s-a constatat ca sedimentarea a privit numai complexele mari.

Agregatele foarte mici si singletii stau pe loc sau se misca cu viteze foarte mici. Analiza PIV pus in evidenta, la

nivelul frontierei in miscare, curenti ascendenti, in principal de plasma si singleti, curenti descendenti de aggregate

si curenti turbionari.

Corelarea intre analiza globala si cea locala. Analiza globala si analiza locala a agregarii si sedimentarii

celulelor sanguine au pus in evidenta ca , cel putin sub aspect calitativ fenomene complemetare, foarte diferite.

Local avem fenomene reversibile de agregare si dezagregare,

La nivel global se percepe numai agregarea , si aceasta agregare apare ca un fenomen ireversibil.

Local avem curenti descendenti ai agregatelor mari cuplati cu miscasri ascendente ale plasmei si

agregatelor mici, plus o circulatie microlocala turbionara. La nivel global este perceptibila doar o sedimentare.

In final trebuie mentionat ca cercetarile efectuate si rezultatele obtinute ne dau sperante privind atingerea

obiectivului final al proiectului de cercetare in cadrul Academiei. Sperand, pe de alta parte ca se va reveni la o

atitudine mai toleranta fata de cercetare si proiectul va fi reluat.

PARTEA DE CONTRIBUTII PERSONALE

Capitolul III.1.1 Dezvoltarea metodei de evaluare a agregarii plachetare folosind agregometrul Packs-4

Testarea în laborator a funcției plachetare este esențială pentru diagnosticul de mai multe tulburari

plachetare. Mai mult, este utilizat pentru a monitoriza eficacitatea terapiei antiplachetare. Agregarea plachetara

4

masurata prin transmisia de lumina este cel mai util test in vitro a funcției plachetare disponibile în prezent, și este

încă standardul de aur pentru a detecta tulburari de prachete și de a iniția o caracterizare mai precisă. [Juan P 2013]

Aparatul de agregare PACKS-4 (sau Platelet Aggregation Chromogenic Kinetic System 4) masoara

agregarea plachetelor umane prin metoda de transmisie a luminii, metoda dezvoltata de Born [Born 1962] si O‟Brien

[O‟Brien 1961], dar inca nu este standadizata [Breddin HK 2005] cu toate ca foarte multe studii si intructiuni sunt

publicate [The British Society for Haematology 1988], [Christie DJ 2008], [Hayward CP 2010]. Metaanalize

effectuate de către organizații de profil au identificat variații în practicile de masurare a agregarii prin transmisia

luminii și necesitatea unor ghiduri pentru standardizarea metodei [Moffat KA 2005], [Jennings I, 2008], [Duncan

EM 2009]. Aparatul este prevazut cu patru canale care functioneaza in mod contemporan. Aparatul de agregare

PACKS-4 este are si functia de fotometer, prin masurarea ratei de productie a pNA (p-nitroaniline) din reactile

cromogenice. Absorbanta curbelor pentru fiecare canal este afisata in timpul obtineri datelor.

III.1.1.1. Calificarea canalelor de masurare al aparatului PACKS-4

Aparatul PACKS 4 este prevazut cu patru canale de masurare care se pot folosi in aceleasi timp pentru

masurarea agregabilitati. Calificarea canalelor consta in compararea datelor obtinute la fiecare canal Procedura

calificarii este astfel:

Sangele total prelevat in mai putin de 3 ore, a fost centrifugat la 200 G timp de 10 minute. Plasma bogata in

plachete obtinuta a fost separata cu o pipeta Pasteur si pipetata intr-o eprubeta de plastic prevazuta cu dop, si a fost

etichetata cu PRP (plasma bogata in plachete). Sedimentul ramas a fost recentrifugat la 3000 G timp de 20 de

minute. Plasma obtinuta a fost separata cu o pipeta Pasteur intr-o eprubeta de plastic, prevazuta cu dop, si a fost

etichetata cu PPP (plasma saraca in plachete). Plasma bogata in plachete si plasma saraca in plachete s-au incubat la

37o C. Dupa ce temperatura in canale a ajuns 37

o C, s-a pipetat 450 µL de plasma saraca in plachete, intr-o cuva si s-

a folosit pentru calibrarea aparatului la 100% agregare cea ce inseamna toate plachetele sunt agregate. Dupa aceea s-

a pipetat in patru cuve 450 µL plasma bogata in plachete si s-a adaugat cate un magnet in fiecarea cuva. Cuvele s-au

pus in fiecare canal al aparatului si in momentul cand s-a adaugat 50 µL de reactiv pro agregant (adrenalina) s-a

pornit citirea. In fiecare canal s-a adaugat aceasi cantitate de reactiv la aceasi concentratie. Dupa efectuarea

calificarii s-a observant ca rezultatele obtinute pentru fiecare canal sunt suprapuse pentru trei dintre canale . Curba

din canalul 2 are aceiasi panta cu celelate curbe dar o amplitudine maxima cu circa 10 % (figura III.1.1.1).

Figura III.1.1.1 – Curbele de agregare plachetara pentru calificarea canalelor de masurare a aparatului PACKS-4, folosind ca inductor pro

agregant adrenalina. Curba 1, 3 si 4 se suprapun intre ele, iar cuba 2 are a amplitudine maxima cu circa 10 %

III.1.1.2 Obeservatii despre metoda de lucru

La refolosirea cuvelor se observau urme permanente pe peretele interior cea ce ducea la modificarea valorii

citite. Din acest motiv cuvele au fost de unica folosinta, in toate experimentele,

Dupa efectuarea mai multor probe experimentale folosind 3 viteze de agitare diferite, 800 rpm, 1000 rpm si

1200 rpm, s-a observant ca valorile optimale se obtineau la o viteza de agitare de 1000 rpm.

Calibrarea aparatului trebuie efectuata in fiecare zi de lucru. Calibrarea se face folosind o cuva cu 500 µL

apa purificata

Marimea si forma mangetiilor influenteaza valorile de agregare. Mangentii trebuie sa fie acoperiti cu un

strat inert de dimensiuni 3 mm x 5 mm de forma cilindrica

III.1.1.3 Limitari hardware si software

Stocarea datelor se face intr-un floppy disc standard, ceea ce duce la dificultatii in transferarea datelor intr-

un alt calculator din cauza lipsei unui cititor de floppy disc.

Fisierele sunt salvate intr-un format specific citibile doar prin softul instalat in aparatul PACKS-4, de aceea

nu pot fi citite si analizate de alte softuri.

Nu exista posibilitatea interventiilor manuale in vederea corectarii calculelor si estimarea parametrilor.

Nu este specificat cum se calculeaza efectiv pantele, valoarea maxima a inhibitei si aria de sub curba.

Softul aparatului PACKS-4 nu are prevazut efectuarea unei simulari

5

Nu se pot reprezenta si compara mai multe seturi de curbe, curbe obtinute din mai multe experimente.

Agregomentrul PACK-4 se poate conecta doar cu modelul ed imprimanta care este prevazut, acest factor

limiteaza imprimarea curbeor de agregare doar in alb-negru.

Concluzii. Aparatul de agregare PACKS-4 de la Helena Laboratories este un aparat foarte utilizat un multe

laboaratoare. Respectand observatiile de lucru mentionate mai sus si luand in calcul marja de eroare de circa 10%

pentru canalul 2, aparatul de agregare PACKS-4 de la Helena Laboratories, furnizeaza valori experimentale bune.

Limitariile software si hardware ale aparatului nu au impiedicat analiza datelor experimente obtinute, deoarece cele

mai multe estimari s-au facut cu metode mai complexe de analiza, ce depaseau nivelul statisticii softu-lui.

Capitolul III.1.2 Cercetari in vederea optimizarii metodei de testare a agregarii

Metoda optica de evaluare a agregarii, numita si metoda Born, este “standardul de aur” in testareea

agregabilitatii fiind metoda de referinta pentru toate celelalte metode dezvoltate in timp. Ea prezinta insa cateva

dezavantaje majore si anume:

- trebuie efectuata la foarte scurt timp de la recoltarea probelor de sange, de obicei o ora, dupa acest interval

plachetele pierzandu-si proprietatile,

- dureaza destul de mult, decurgand in mai multi pasi,

- este destul de costisitoare,

- necesita personal specializat si aparatura adecvata.

Din aceste motive, ea nu este inca o metoda uzuala in clinica, si s-au incercat multe alte metode si aparate.

In cele ce urneaza prezentam cercetarile personale in directia simplificarii metodei si a posibilitatilor de stocare a

probelor si testarea lor concomitenta.

III.1.2.1 Stocarea și stabilitatea probelor

Sanelege total, plasma bogata in plachete si plasma saraca in plachete au fost mentinute la diferite

temeperaturi: la temperatura -20° C, la rece la temperatura 5° C, la temperatura camerei (15-25°C). Pentru

mentinerea pH-ului neschimbat eprubetele cu plasma au fost pastrate inchise. Experimentele au fost efectuate in

termen de o ora, trei ore, sase ore si 24 de ore dupa colectarea probelor de sange. Stabilitatea probelor a fost

considerata corespunzatoare atunci cand inca se mai putea determina agregarea plachetelor.

III.1.2.2 Metoda de testare a agregarii Testul de agregare plachetară a fost realizat folosind metoda Born turbidimetrică de transmisie a luminii

folosind Agregomentrul Helena PACKS-4. Absorbtanta inițială este cauzată de lumina difuzată de plachete care

plutesc în plasma. Aceasta absorbanta este aproape proporțională cu numărul de plachete care plutesc in proba de

plasma. Plasma săracă in plachete (Platelet Poor Plasma - PPP), ce a fost racoltata din aceleasi sange de unde s-a

obtinut si proba cu plasma bogata in plachete, a simulat agreagarea de 100%, ce ce inseamna ca nu mai sunt plachete

care plutesc in plasma. Absorbanta cauzata de alti factori decât plachete a fost determinată prin măsurarea

absorbanței plasmei săracă în plachete.

Capacitatea de agregare indusa a plachetelor a fost definita de cantitatea de agregare indusă atunci când o

cantitate cunoscută de reactiv a fost adaugata la plasmă bogată în plachete. Absorbanta plasmei bogată în

plachete nereacționata amestecata cu reactivul de inducere a agregarii a reprezentat 0% agregare comparativ cu

absorbanța plasmei săracă în plachete care a reprezintat o agregare de 100% (fără plachete in suspensie).Nnumărul

de plachete in suspensie a scăzut in timp, reducând lumina absorbită de proba in lucru. A fost măsurata agregarea

plachetară prin metoda de absorbanță utilizând până la patru canale simultan. Curba de absorbanță pentru fiecare

canal a fost afișata în timpul obtinerii datelor. Datele de la absorbanță au fost afișate și stocate in memoria aparatului

si au fost tipărite pentru înregistrări permanente.

Testele au fost efectuate cu agregometrul Helena PACKS-4 la viteza de agitare a plasmei bogata in

plachete 1000 rpm.

S-au utilizat următorii pași:

1. Probele de sânge au fost colectate pe citrat de sudiu 3.2% in eprubete vacutainer cu citrat de sodiu.

2. Agenții de agregare au fost reconstituiti din reactivi sub forma de pulbere furnizati de firma Helena

Laboratories.

3. Reactivul cu adrenalina utilizat a fost obținut prin diluarea soluției mamă de 3mM cu soluție salină (0,9%

NaCI). Concentrațiile finale ale probei atunci când se utilizează reactivul reconstituit diluat au fost intervalul 1 - 16

μM.

4. Agregometrul folosit a fost pregatit pentru utilizare conform recomandărilor din Manualul Operatorului.

5. Un volum de 450 μL plasmă săracă în plachete s-a pipetat într-o cuvă.care a fost martor utilizat pentru a

seta agregarea 100%.

6. Un volum de 450 μL plasmă bogată în plachete a fost pipetat într-o cuvă cu un magnet de agitare. Cuva a

fost incubata la 37 oC inaintea determinarii, timp de unu până la trei minute.

6

7. Cuva cu plasmă săracă în plachete a fost inserata în canalul corespunzător, care a fost precizat in datele

de intrare pentru soft si a reprezentat agregarea 100%.

8. Cuva cu plasmă bogată în plachete a fost inserata în canale dupa masurearea facuta asupra cuveri cu

plasma saraca in plachete.

9. S-a adăugat un volum de 50 μL diluant a reactivului de agregare la cuva PRP și a fost înregistrat evolutia

procentul de agregare in timp. In momentul adaugari reactivului de agregare aparatul a inregistrat 0% agreagare.

III.1.2.3 Aspecte generale nerezolvate in evaluarea si utilizarea clinica a agregarii plachetare

- diferitele metode de determinare a agregarii (optica, impedanta, coagulare, etc) nu se coreleaza intre ele,

- metoda optica este considerata standardul de aur, dar este de durata, costisitoare si nu se poate face decat

in cel mult trei ore de la recoltarea sangelui

Intentia cercetarilor intreprinse pe tot parcursul cerecetarilor in cadrul tezei a fost de a perfectiona metodele

de evaluare a agregarii. Obiectivele complete ale cercetarii au fost cum urmeaza.

1. Cresterea timpului de la recoltare in care se poate determina agregabilitatea. In acest sens s-au pastrat

probele in mai multe conditii (la temperatura camerei, la – 20º C , probe de sange integral, probe de plasma,

probe de PRP si probe de PPP) si s-au facut determinari in mai multe intervale de timp de la recoltare.

2. Reducerea numarului de etape si reactivi in prelucrarea probelor.

3. Reducerea volumului de probe de sange pentru a putea face determinarile in duplicat sau triplicat.

4. Nu in ultimul rand, s-a dorit folosirea sangelui recoltat pentru VSH si testaarea corelarii intre curbele de

agregare si cele de sedimentare.

III.1.2.4 Prelucrarea si analiza probelor din sange recoltat 3 ore inaintea determinarii

Prepararea probelor de plasma bogata in plachete si plasma saraca in plachete a fost efectuata din sange

recoltat cu 3 ore inainte de efectuarea testelor. Efectuarea testelor a fost realizata la fel ca in procedura mentionata

mai sus. Pastrarea probelor de sange integral a fost facuta la temperatura camerei (15 - 25o

C), in eprubete de plastic

cu citrat de sodiu 3.2% ca antiagregant. Probele au fost pastrate inchise cu dop pentru pastrarea pH-ului neschimbat.

Din aceste teste s-a observat ca in cazul prelucrarii probelor la 3 ore dupa recoltare, agregareaa scazut

foarte mult. Plachetele din probele cu plasma bogata in plachete erau practic precipitate si se puteau fi considera

“moarte”. Valorile de abosrbanta a probei cu plasma saraca in plachete si probelor bogata in plachete s-au apropriat

foarte mult intre ele. Graficul final a aratat o agregare finala de maxim 40%. (figura 3.1.2.1).

Figura 3.1.2.1 - Curbele agregari plachetare folosind plasma obtinuta din sange recoltat 3 ore inaintea determinarii

III.1.2.5. Testarea agregarii plachetare a PRP obtinuta din sange recoltat pentru VSH cu 6 ore

inaintea analizei

In aceasta testare s-a dorit folosirea sangelui recoltat pentru VSH si testarea corelarii intre curbele de

agregare si cele de sedimentare.

Sangele din mai multe eprubete de VSH, recoltat pe citrat de sodiu a fost centrifugat conform procedurilor

pentru prepararea probelor de plasma bogata in plachete si plasma saraca in plachete. Rezulatele obtinute au fost ca

plachetele in prezenta reactivului nu au agregat intre ele, rezultand grafic o valuare de agregare aproape de 0%.

(Figura 3.1.2.2)

7

Figura 3.1.2.2 – Curbele agregari plachetare folosind plasma obtinuta din sange recoltat pentru VSH (concentratiile de adrenalina 10,

20, 40, 80 μM )

III.1.2.6 Studiul efectului congelarii asupra activitatii plachetelor

In aceasta testare s-a folosit plasma congelata la -20º C timp de 24 de ore. Din plasma congelata s-au

separat portiuni mici solide care se decongeleau la temperatura camerei. 450 μL din plasma obinuta in stare lichida

s-a pipetat ca atare intro cuva si a fost incubata la temperatura 37 oC, iar restul de plasma in stare lichida s-a

centrifugat la 200 G timp de 10 minute pentru a lua in considerare diminuarea numarului de plachete prezente in

plasma. Conform procedurii agregometrului PAKS 4, numarul optim de plachete in plasma bogata in plachete

pentru testare trebuie sa fie cuprinsa intre 3 x 105 si 4 x 10

5 / mm

3. Pntru obtinerea probei de plasma saraca in

plachete, plasma decongelata ramasa a fost centrifugata la 3000 G timp de 20 de minute. Dupa efectuarea testarii s-a

observat ca plachetele in prezenta reactivului de inducere a agregarii nu au agregat, rezultand un grafic cu valori de

agregare aproximativ 0%. (Figura 3.1.2.3)

Figura 3.1.2.3 – Curbele agregarii plachetare despre Studiul efectului congelarii asupra activitatii plachetelor

III.1.2.7 Studiul efectului tipului si marimii magnetilor pentru agitarea probelor de PPP si PRP.

In fiecare canal de masurare a absorbantei agregomerul PACKS 4 are un motor in pasi care creaza si un

camp magnetic. Acest camp magnetic face ca magnetul pus in fiecare cuva, care este introdusa in fiecare canal al

aparatului, sa se invarta atrenand in acest fel agitarea plasmei in cuva. Agitarea plasmei in cuva in timpul testarii este

un factor foarte important in acest proces. In cazul in care magnetii nu sunt prezenti in cuva, procesul de agregare

este zero sau minimal. Un rol important joaca nu numai prezenta agitatorului dar si viteza de agitare. Din diferite

probe s-a ajuns la concluzia ca dintre vitezele 800 rpm, 1000 rpm si 1200 rpm, viteza de 1000 rpm a fost cea mai

potrivita. Aparatul de agregare PAKS 4 avea inclusi 4 magneti din neodim neacoperite. Din testele efectuate s-a

observat o interactiune intre plachete si magnet. Plachetele aderau pe suprafata magentului, crescandu-i marimea si

in final ducand blocarea lui. Aceasta s-a reflectand in grafic ca flutuatii marii sau chiar si limitarea agregarii (valori

mici de agregare de sub 60 %). Din acest motiv s-au substituit magneti din neodim neacoperiti cu magneti din

neodim acoperiti cu PTFE (Politetrafluoretilenă). Acesti magneti cu provenienta SUA, sunt rezistenti la temperaturi

ridicate de pana la 250 oC si temperaturi joase de pana la –196

oC. Invelisul ales este inert si rezistent la diferiti acizi,

baze, solventi organici, apa, alcool etc. Dimensiunile alese au fost 3 x 5 mm. (Figura 3.1.2.4) Dupa schimbarea

mangetiilor s-a observat ca plachetele agregate nu mai adereau pe magnet. Acest factor a dus la obtinerea datelor

mai precise si productibile.

8

Figura 3.1.2.4 – Magneti acoperiti alesi

Figura 3.1.2.5 – Curbele agregarii plachetare pentru studiul efectului tipului si marimii magnetilor pentru agitarea probelor de PPP si PRP.

Curbele 1, 3 fara agitare, curba 2 cu magnet neacoperit, curba 4 cu magnet acoperit

III.1.2.8 Reducerea volumului de probe de sange pentru a putea face determinarile in duplicat sau

triplicat.

Aceasta testare s-a facut conform procedurii pentru prepararea probelor de plasma bogata in plachete si

proba saraca in plachete. Sangele integral s-a centrifagat la 200 G timp de 10 minute si supernatantul s-a separat

intr-o eprubeta din plastic prevazuta cu capac pentru pastrarea pH-ului neschimbat. Aceasta eprubeta s-a etichetat cu

“plasma bogata in plachete” si s-a lasat la incubat la 37º C. Sedimentul din sange ramas s-a agitat usor manual si s-a

recentrifugat la 3000 G timp de 20 de minute. Dupa centrifugare, s-a separat supernatantul si se pune intro eprubeta

din plastic cu dop. Aceasta eprubeta s-a etichetat cu “plasma saraca in plachete” si s-a lasat la incubat la temperatura

37º C. Pentru setararea absorbantei 100% adica agregare completa s-a pus intr-o cuva 225 μL plasma saraca in

plachete si pentru testare s-au pus in patru cuve 225 μL plasma bogata in plachete. Dupa efectuarea mai multor

incercari s-a observat ca nu exista o repetabilitate pentru rezultatele obtinute desi s-au respectat mereu aceleasi

conditii de lucru si aceeasi cantitate de reactiv adaugat pentru fiecare canal. Din acest test s-a tras concluzia ca

prelucrarea probelor de plasma la jumatatea cantitati nu a dus la rezultate acceptabile.

S-a repetat experimentul de 5 orifolosind patru concetratii diferite de adrenalina ca inductor al agregarii 1, 2 3 si

respectiv 4 uM/L. Rezultatele sunt prezentate in figura 3.1.2.6. Curbele obtinute in functie de concentratia de

adrenalina sunt foarte diferite intre ele si nu se poate decide care este efectul adrenalinei in functie de concetratie: o

crestere, o scadere sau o agregare inedpendenta de concentratia adrenalinei. In figura sunt reprezentat de fapt ariile

de sub curbele de agregare in functie de concentratie a adrenalinei,

0 1 2 3 4 5

0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

A U C - P ro b e c u 2 2 5 m ic ro L p la s m a

C o n c e n tra t ie A d re n a lin a (µ M /L )

AU

C

Figura 3.1.2.6 – Graficul valorilor obtinute la reducerea volumului probelor de plasma

9

III.1.2.9 Parametrizarea curbelor de agregare furnizate de aparat.

Curba de lumina transmisa in functie de timp, a urmat de regulă, structura: un decalaj de timp, o primă fază

de agregare, mai mult sau mai puțin liniară, definită ca "panta 1 (slope 1)", un al doilea val de agregare, ca urmare a

eliberării de ADP din trombocite și "accesoriu" de agregare, definită prin "panta 2" și o fază de "saturație". Acesta

este un posibil comportament standard. După cum se poate observa, de exemplu, în figura 1 aceste componente nu

sunt clar separate sau chiar nu sunt prezente în unele curbe. Softul de agregometru identifica aceste faze în curbe și

calculează parametrii asociați, dar rezultatele trebuie să fie validate de fiecare dată prin inspecții vizuale și

considerații referitoare la fenomenele din spatele curbelor obținute.

Figura 3.1.2.7 – Curbele obtinute din agregometrul PACKS 4

Principalul "end-point", deci parametru masurat luat în considerare în acest studiu a fost "aria de sub curba

de agregare" (ASC-AG). Acest parametru este cel mai utilizat in farmacocinetica si a fost de multe ori extins si la

compararea curbelor de efect farmacodinamic

Concluzii

1. In cea ce priveste intervalul de timp in care trebuiesc facute determinarile, in mod ideal aceasta trebuie sa

fie o ora. Dupa o ora agregabilitatea incepe sa scada. In caz ca determinariile sunt comparative se poate totusi ca

testul de agregare propiu-zis sa fie efectuat in intervalul o ora – trei ore cand scaderea agregabilitatii se poate

presupune ca este aceeasi la toate probele.

2. Nu apare sa existe o diferenta intre evolutia probelor la temperatura camerei si probele tinute la frigider.

3. Exfolierea stratului protector al magentiilor duce la agregarea plachetelor pe acestia.

Dimensiunea magnetiilor influenteaza nivelul de zgomot in curbele de agregare.

4. Agregarea si sedimentarea eritrocitara se pare ca induce si o agregare plachetara. Centrifugarea este in

fapt tot o sedimentare, dar intr-un timp mult mai scurt.

5. Reducerea volumului de probe la jumatate (225 uL) duce la o variabilitate foarte mare a rezultatelor si nu

se mai poate vorbi de o repetabilitate.

Capitolul III.2 STUDIUL DEPENDENTEI AGREGARII PLACHETARE DE CONCENTRATIA

DE ADRENALINA FOLOSITA CA INDUCTOR

Plachetele agrega in locul leziunii vasculare, formând trombi care contribuie la oprirea hemoragiei dar, de

asemenea, pot cauza ocluzia arterelor aterosclerotice care provoacă acidente cardiace și cerebrovasculare. Agregarea

plachetara este un mecanism fundamental pentru salvarea vietii prin pierderea de sange si tulburarile de functionare

duc la bolile cardiovasculare,. Aceste modificari apar cel mai pregnant după un accident vascular cerebral sau

accidente ischemice tranzitorii [1,2]. [Ruggeri 2006, Ruggeri 2002]

Agreagarea plachetara, ca si proces prin care plachetele adera una de altala la marginea leziunilor

vasculare, este etapa premergatoare coagulare si tromboza. (3, 7) [Jackson 2007, Conti 1987, Fuster 1992, Handin

1996, Liu 2003]

Cateva review-uri importante vorbesc despre rolul plachetelor in hemopstaza si tromboza (8, 11) [Brass

2003, Davi 2007, Varga-Szabo 2008, Offermanns 2006].

Acumularea excesiva de plachete la locul plagii aterosclerotice este unul din evenimentele principale care

duc la formarea de trombus arterial, care duce la infract miocardic acut, moarte subita, accident vascular cerebral

ischemic etc (12) [Maxwell 2007].

Acest proces patologic este responsabil pentru o morbiditate si o mortalitate mai mare decat orice alt proces

de boala. Ca urmare plachetele reprezinta un target major pentru interventia terapeutica. Anumiti factori contribuie

la potentarea activitatii plachetare la plagile deschise, incluzand un continut ridicat de collagen fibrilar la locul

leziunii (13-15) [Badimon 2001, Shekhonin 1987, Van Zanten 1994], prezenta factorului tisular (16) [Wilcox 1989],

ca si efectele activarii plachetare urmare a unui stres de forfecare inalt cauzat de ingustarea arteriala (17-20) [Kroll

1996, Ikeda 1997, Ruggeri 1997, Andrews 1997].

10

Mai multe studii epidemiologice au demonstrat faptul ca ateroscleroza coronara si infarctul mocardic acut

au loc mai frecvent la persoanele predispose la stres recurent acut (21-23) [Russek 1958, Pearson 1963, Wolf 1969].

Aceste personae au avut nivel ridicat de catecolamine (24) [Nestel 1967]. Un numar de investigatii in vitro au aratat

ca, catecolaminele cresc adezivitatea plachetelor si cauzeaza in final agregarea (25-27) [O'BRIEN 1963,

Mitchell1964, Macmillan 1966]. Anumite investigatii au postulat ca factorul declansator in IMA poate fi formarea

trombusului plachetar intravascular, care ulterior circula, si obstrueaza un segment coronar care a fost deja ingustat

de la ateroscleroza (28-29) [Mustard 1969, Jorgensen1968].

Progresul in intelegerea agregarii plachetare a fost incet pana la aparitia testului de agregare plachetara in

1962 de Born (30) [Born 1962] si in mod independent de O‟Brien (31) [O‟Brien 1962], in care agregarea plachetara

este determinate printr-o metoda turbidometrica, care masoara schimbarile densitatii optice a suspensiei plachetelor.

Agregometrul optic a fost folosit de atunci in toata lumea in cercetari fundamentale, clinice si epidemiologice (32)

[Born 2006]. S-a aratat ca adrenalina stimuleaza o cale independenta de ciclooxigeneaza din care rezulta potentarea

agregarii plachetare. Alte rapoarte au sustinut ca adrenalina a stimulat si calea ciclooxigenazei într-o măsură

suficientă pentru a genera tromboxan unde plachetele au fost sub influența inhibitorie a acidului acetilsalicilic [33]

[Cameron 1982].

Adrenalină potențează acțiunea tuturor tipurilor de agenți de agregare asupra agregării.

S-a argumentat [Lanza 1988] că adrenalina singură nu induce modificări de morfologie, metabolism sau

functia plachetelor intacte si plachetelor spalate functionale umane și deci ea nu poate fi considerata, ca un agent de

agregare per se , ea insa interactioneand cu receptorii alfa 2-adrenergici asupra plachetelor umane și potențand

raspunsurile biochimice și agregante induse de alți agoniști plachetari .

Scopul acestui studiu a fost acela de a determina dependența dintre concentrația de adrenalină și amploarea

procesului de agregare plachetara . In acelasi timp s-a dorit sa se arate ca de fapt ca adrenalina in sine are un effect

antiagregant.

III.2.1 Materiale si metode Reactivi:

Reactivul cu adrenalina: Adrenalina bitartrat a fost achiziționat de la Helena Laboratories și a fost de

calitate analitică.

Pregatirea pentru utilizare: a fost preparată o soluție stoc reconstituind un flacon de adrenalina pulbere cu

1,0 ml de apă distilată. S-a agitat ușor până la dizolvarea completa a adrenalinei bitartrat. După reconstituire s-a

obținut o soluție stoc de adrenalina bitartrat 3 mM.

Depozitare și stabilitate: Reactivul cu adrenalina bitartrat in forma sa uscata a fost depozitat la frigider la 2

până la 8 ° C și a fost stabil până la data de expirare mentionat pe flacon. Reactivul reconstituit a fost stabil timp de

1 săptămână, mentinut la frigider la temperatura 2 - 8 °C.

Semne de deteriorare: Cand culoarea alba al reactivului de adrenalina bitartrat nu a fost omogen alba,

reactivul nu a mai fost folosit.

Colectarea și manipularea probelor de sange

Rezultatele cele mai bune au fost obtinute cand plasma a fost obtinuta din sange integral in eprubete cu

citrat de sodiu 3.2% ca anticoagulant.

Sângele pentru acest studiu a fost obtinut de la pacienți din secția de Medicina Interna a Spitalului Clinic

Colentina, care au dat consimțământul înainte de a participa la acest studiu. Sângele a fost colectat în eprubete cu

citrat de sodiu 3.2% ca anticoagulant. Sangele colectat a fost pastrat la temperatura camerei.

Prepararea probelor de plasma bogata in plachete

1. Plasmă bogată în plachete a fost preparata prin centrifugarea probei de sange racoltat intro eprubeta

folosind ca anticoagulant citratul de sodiu 3.2% la 200 G timp de 10 minute. Plasmă bogată în plachete a fost

îndepărtat cu o pipetă Pasteur și plasata într-o eprubeta de plastic cu eticheta "Plasmă bogată în plachete". Eprubeta

cu plasma bogata in plachete a fost inchisa cu dop mentinuta la temperatura camerei timp de 30 de minute.

2. Plasmă săracă în plachete a fost preparata prin centrifugarea sedimentului ramas, dupa separarea plasmei

bogata in plachete, la 3000 G timp de 15 minute. Plasmă săracă în plachete a fost preluata, plasată într-o eprubeta de

plastic, etichetata „Plasmă săracă în plachete” și inchisa cu dop. La fel ca eprubeta cu plasma bogata in plachete si

eprubeta cu plasma saraca in plachete a fost mentinuta la temperatura camerei timp de 30 de minute.

Stocare și stabilitate

Eprubeta cu plasma bogata in plachete si cea cu plasma saraca in plachete si sangele racoltat au fost

mentinute la temperatura camerei (15-25 oC). Pentru mentinerea pH-ului ne schimbat eprubetele cu plasma au fost

pastrate inchise. Experimentele au fost efectuate in termen de cel mult trei ore dupa colectarea probelor de sange.

Metoda de testare a agregarii

11

Testul de agregare plachetară a fost realizat folosind metoda Born turbidimetrică de transmisie a luminii

[30] [Born] folosind Agregomentrul Helena PACKS-4. Lumina difuzata pe plachete care plutesc in plasma cauzeza

absorbanta initiala. Absorbanta este aproape proportionala cu numarul de plachete care plutesc in proba de plasma.

Plasma săracă in plachete (Platelet Poor Plasma - PPP), a simulat agreagarea de 100%, ce ce inseamna ca nu smai

sunt plachete care plutesc in plasma, a fost racoltat din aceleasi sange de unde s-a obtionut si proba cu plasma bogata

in plachete. Capacitatea de agregare a plachetelor a fost determinată de cantitatea de agregare indusă atunci când o

cantitate cunoscută de reactiv proagregant este adaugat la plasmă bogată în plachete. Absorbanta plasmei bogată în

plachete (Platelet Rich Plasma – PRP) nereacționata amestecata cu reactivul de agregare reprezinta 0% agregare

comparativ cu absorbanța plasmei săracă în plachete. (fără plachete plutitoare). Numărul de plachete in suspensie a

scăzut, ca urmare a agregarii, cea ce a dus la cresterea intensitatii lumini transmise. Utilizând până la patru canale

simultan, a fost măsurata agregarea plachetară prin metoda de absorbanță. Curba de absorbanță pentru fiecare canal

a fost afișata într-un interval de timp 10 minute. Datele de la absorbanță au fost afișate și stocate la concluziile

măsurătorilor, și au fost tipărite pentru înregistrări permanente.

Pasi de lucru urmati in testarea agregarii plachetare

- Reactivul cu adrenalina utilizat a fost obținut prin diluarea soluției mamă de 3 mM cu soluție salină (0,9%

NaCI). Concentrațiile finale ale probei atunci când se utilizează reactiv reconstituit diluat: 1 - 8 μM.

- Agregometrul a fost calibrat zilnic inainte de desfasurarea experimentelor

- Un volum de 450 μL plasmă săracă în plachete se pipetează într-o cuvă. Acest lucru a fost martor utilizat

pentru a seta agregarea 100%.

- Un volum de 450 μLplasmă bogată în plachete a fost pipetată într-o cuvă cu un magnet de agitare. Cuva a

fost incubata la 37 oC, timp de unu până la trei minute.

- Cuva cu plasmă săracă în plachete a fost s-a folosit pentru setarea aparatului de agregare PACKS-4 la

100% agregare

- Cuvele cu plasmă bogată în plachete a fost inserata în canalul corespunzător.

- S-a adăugat un volum de 50 μL de diluție a reactivului de agregare la cuvele cu PRP și a fost înregistrat

procentul de agregare. In momentul adaugari reactivului de agregare aparatul a inregistrat 0% agreagare.

II.2.2 Problemele de rezolvat in studiul agregarii induse de adrenalina

Obiectivele stuiului agregarii au fost:

- estimare pragului minim de concentratie a adrenalinei care induce agregarea plachetara

- stabilirea dependentelor intre parametrii curbelor de agregare si concentratia de adrenalina

- modelarea dependentelor folosind functii cat mai simple dar predictive

Parametrizarea curbelor de agregare furnizate de aparat.

Evolutia de lumina de transmisie in functie de timp, a urmat de regulă, urmatoarea structura: un time delay,

o primă fază de agregare, mai mult sau mai puțin liniară, definită ca "panta 1 (slope 1)", un al doilea val de agregare,

ca urmare a eliberării de ADP din trombocite și "accesoriu" de agregare, definită prin "panta 2" și o fază de

"saturație". Acesta este un posibil comportament standard. După cum se poate observa, de exemplu, în figura 3.2.3.1

aceste componente nu sunt clar separate sau chiar nu sunt prezente în unele curbe. Softul de agregometru identifica

aceste faze în curbe și calculează parametrii asociați, dar rezultatele trebuie să fie validate de fiecare dată prin

inspecții vizuale și considerații referitoare la fenomenele din spatele curbelor obținute.

Figura 3.2.3.1 – Curbele obtinute din agregometrul PACKS 4

Un alt “end point” deci parametru masurat luat în considerare în acest studiu a fost "aria de sub curba de agregare"

(ASC-AG). Acest parametru este utilizat foarte mult în farmacocinetica și aplicarea acestuia a fost extinsa recent, în

studiile clinice, pentru compararea curbelor de efecte farmacodinamice [46] [Mircioiu 2013].

Au fost calculate, in afara de panta 1 si panta 2 agregarea maxima (“maximum platelet aggregation –

MPA”).

Dependenta primei pante a curbei de agregare plachetare de concentratia de adrenalina

12

Datele individuale sunt prezentate in figura 3.2.3.2 a. Reprezentarea s-a facut atat in valori absolute ale

pantei cat si in valori relative, ca procent din panta maxima masurata, in scopul compararii ulterioare a dependentei

efectelor de concentratie adrenalinei asupra celor patru paramenti.

Dupa cum se poate observa din figura 3.2.3.2 b, datele prezinta o dispersie destul de mare dar se poate

aprecia ca apare o crestere a pantei in functie de concetratia de adrenalina, in toate cele opt experimente. Dreptele de

regresie liniara sunt diferite in cea ce priveste distributia in spatiu (unele sunt mai sus si unele sunt mai jos), dar ele

sunt aproximativ paralele.

Normalizarea curbelor. Avand in vedere acest paralelism s-a considerat justificata trecerea la datele

normalizate si calularea unei drepte de regresie care sa modeleze toate puncetele in acelasi timp.

Ceficientul de corelatie a fost de 0.89 indicand un grad mare incredere in cea ce priveste tendinta de

crestere. Mai mult se poate aprecia ca aceasta crestere este clar liniara figura 3.1.2.8 c

0 2 4 6 8 1 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

P a n t a 1

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

% p

er

m

in

ut

5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 2 . 1 2 . 2 0 1 4

1 5 . 1 2 . 2 0 1 4

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 1

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 2

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 3

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 4

Figura 3.2.3.2 a – Date indivituale

0 2 4 6 8 1 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

P a n t a 1

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

% p

er

m

in

ut

5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 2 . 1 2 . 2 0 1 4

1 5 . 1 2 . 2 0 1 4

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 1

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 2

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 3

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 4

Figura 3.2.3.2 b – Drepte de regresie individuale

0 2 4 6 8 1 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

s l o p e 1 n o r m a l i z a r e 1

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

Re

la

tiv

e %

C

ha

ng

e

Y = 1 0 , 3 3 * X + 2 8 , 5

R2

= 0 , 8 9

Figura 3.2.3.2 c – Valori normalizate ale pantei 1

Calculand mediile rezultatelor pentru fiecare concentratie de adrenalina si reprezentand dependenta acestor

medii de concenntratia adrenalinei, dupa cum se poate observa în figura 3.2.3.3, pentru valorile medii

corespunzătoare la 8 pacienți, dependență apare din nou a fi liniarea. În mod alternativ, rezultatele ar putea fi

interpretate ca un comportament diferit pentru 1 - 3 µmol / l adrenalină si 4 -8 µmol / l, dar nu sunt suficiente puncte

pentru a stabili modelele clare de evoluție.

Figura 3.2.3.3 - Pantă 1 ca o funcție a concentrației de adrenalină în PRP

Dependenta pantei a doua a curbei de agergare plachetare de concentratia de adrenalina

Datele obtinute in opt sesiuni de lucru sunt reprezentate in figura 3.2.3.4 a. La fel ca si in cazul pantei 1 s-

au calculat si valorile relative (procentul din panta maxima in fiecare experiment in parte). Valorile sunt mai mari si

y = 4.31x + 2.29R² = 0.88

0

5

10

15

20

25

30

35

0 2 4 6 8

Slo

pe

1 (

%*u

mo

l/l)

Adrenaline conc (µmol/l )

13

mult mai dispersate decat in cazul pantei 1 intr-un interval de la 1% - 80% in comparativ cu datele privind panta 1.

Evaluand fiecare experiment in parte tendinta este de crestere a pantei o data cu cresterea concentratiei de

adrenalina. Dreptele de regsie obtinute sunt mai putin acceptabile ca paralele decat in cazul pantei 1.

Dreapta de regresie asociata intregului set de date normalizate are un ceficient de corelatie de 0.78 deci mai

mic decat in cazul pantei 1 dar inca se poate afirma cu mare probabilitate ca efectul adrenalinei este de crestere si a

pantei 2.

0 2 4 6 8 1 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

P a n t a 2

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

% p

er

m

in

ut

5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 2 . 1 2 . 2 0 1 4

1 5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 8 . 1 2 . 2 0 1 4

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 1

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 2

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 3

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 4

Figura 3.2.3.4 a - Date indivituale

2 4 6 8 1 0

- 2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

P a n t a 2

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

% p

er

m

in

ut

5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 2 . 1 2 . 2 0 1 4

1 5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 8 . 1 2 . 2 0 1 4

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 1

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 2

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 3

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 4

Figura 3.2.3.4 b - Drepte de regresie individuale

0 2 4 6 8 1 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

P a n t a 2 V a l o r i n o r a m a l i z a t e

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

Re

lativ

e %

Ch

an

ge

Y = 1 4 , 0 8 * X + 4 , 5 7 1

R2

= 0 , 7 8 4

Figura 3.2.3.4 c – Valori normalizate ale pantei 2

Agregarea de adrenalina sau ADP ale plachetelor umane are loc în două faze, și s-a sugerat că a doua fază

este determinată de ADP eliberat din trombocitele [47] [MacMillan 1966]. În aceste condiții, era de așteptat ca

pantele din faza a doua ar fi mai mari decât cele din prima fază, adică panta 2 > panta 1. Acesta nu a fost cazul în

experimentele noastre, pantele medii fiind practic egale dar datele individuale mult mai dispersate. Este de remarcat

faptul că, în cazul valorilor medii ale pantei 2 dependența de concentrația de adrenalină a fost liniară mai clară, cu

un coeficient de corelație mai bună decât în cazul panta 1 (R2 = 0.92 fata de R

2 = 0.88)

Figura 3.2.3.5 - Pantă 2 ca o funcție a concentrației de adrenalină în PRP

Aria de sub curba de agregare (ASC-AG) Cel mai important parametru a fost considerat ca fiind aria de

sub curbă.

După cum se poate vedea în figura 3.2.3.6, ASC-AG depinde liniar de concentrația de adrenalină. Este de

notat faptul că efectuarea automata a calculului software-ul de agregometrul considera ca intervalul de timp de

y = 3.55x + 2.16R² = 0.92

0

5

10

15

20

25

30

35

0 2 4 6 8 10

Slo

pe

2 (

um

ol/

l)

Adrenaline conc ( μmol/l)

14

integrare de la zero până la sfârșitul măsurării transmiterii luminii T, în cazurile în care agregarea ajunge la saturație

într-un scurt timp t0, zona de la t0 la T nu are nici o semnificație care referitorul la procesul de agregare și scade

sensibilitatea parametrului ASC-AG.

Figura 3.2.3.6- ASC-AG ca o funcție a concentrației de adrenalină în PRP

Dependența liniară de concentrația de adrenalina nu a fost raportată ca o caracteristică, până în prezent.

Examinand unele date din literatura [Muhammad 2005] am observat ca valorile MPA se inscriu pe o dreapta fapt

care nu a fost sesizat e catre autori.

Dependenta agregarii maxime plachetare (MPA) din concentratia de adrenalina

In cazul MPA datele, dupa cum se vede in figura... sunt mult mai grupate decat pantele calculate de catre

agregometru. De altfel, calculul nu mai implica aroximari, deaorece MPA este obtinut direct de pe curbe. Fiind un

parametru mult mai usor si mai obiectiv de calculat, MPA este parametrul luat in considerare in studiile clinice de

comparare a efectelor medicamentelor antiagregante.

Cu o singura exceptie, dreptele de regresie individuale sunt aproximativ paralele (figura 3.2.3.7 b)

Dreapta de regresie asociata intregului set de date normalizate are un coeficient de corelatie foarte bun.

Valoarea outlier, prin normalizare intra in rand cu celelalte grupuri de date.

Agregarea plachetara maximă medie pentru fiecare concentratie de adrenalina, a fost reprezentata in functie

de concentratie.

Pe de alta parte, o "saturație" sau chiar un efect revers poate apărea odată cu creșterea mai departe a

concentrației de adrenalină. Dacă luăm în considerare faptul că adrenalina influențează agregarea la nivelul forțelor

electrice de repulsie. [37] [Voicu 1966] Dependența bifazica [49] [Hampton 1969] a răspunsului plachetar de

mobilitate electroforetică, la ADP sau noradrenalina, a fost observata cu mult timp inainte (Hamptom 1969) si ar fi

deci de astepta si in cazul de adrenalina.

0 2 4 6 8 1 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

M P A

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

Pr

oc

en

t

5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 2 . 1 2 . 2 0 1 4

1 5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 8 . 1 2 . 2 0 1 4

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 1

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 2

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 3

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 4

Figura 3.2.3.7 a Date indivituale

0 2 4 6 8 1 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

M P A

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

Pr

oc

en

t

5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 2 . 1 2 . 2 0 1 4

1 5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 8 . 1 2 . 2 0 1 4

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 1

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 2

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 3

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 4

Figura 3.2.3.7 b - Drepte de regresie individuale

y = 3.891x - 0.509R² = 0.946

y = 3.546x + 2.156R² = 0.919

0

10

20

30

40

0 2 4 6 8 10

Adrenaline concentration in PRP (μmol/L)

AU_AGC slope 2

Linear (AU_AGC) Linear (slope 2)

15

0 2 4 6 8 1 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

M P A v a l o r i n o r m a l i z a t e

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

Re

lativ

e %

Ch

an

ge

Y = 1 3 , 5 3 * X + 2 , 2 1 8

R2

= 0 , 9 2 3

Figura 3.2.3.7 c – Valori normalizate ale MPA

Calculul valorilor medii, dat fiind dispersia mai mica, este mult mai justificat decat in cazul pantelor.

Dependenta valorilor medii ale MPA de concentratia de adrenalina este reprezentata in figura 3.2.3.8.

Dependenta linear este in acest caz mult mai evident, coeficientul de corelare liniara fiind R2 =0.94.

Figura 3.2.3.8 - Dependenta valorilor medii ale MPA de concentratia de adrenalina

Dependenta ariei de sub curba al agergarii plachetare de concentratia de adrenalina

Aria de sub curba este parametrul uzual in farmacocinetica, prezentand avantajul ca se coreleaza de regula

cu marimea efectului farmacodinamic. Aceasta corelare este atat de buna pentru anumite intervale de concentratie

date, incat se considera ca daca medicamentele respective realizeaza aceleasi arie ele sunt echivalente terapeutic.

Unul din scopurile aceste lucrari a fost acela de a arata ca aria de sub curba de agregare este un parametru superior

celorlalti discutati si in particular si MPA, parametrul utilizat in clinica.

Rezultatele privind ASC sunt reprezentate in figura 3.2.3.9 a. Datele sunt omogen distribuite , aparand un

singur punct outlier la concentratia 4 µM. Dupa cum se vede in figura 3.2.3.9 b pentru fiecare subiect in parte aria

creste o daata cu cresterea concentratiei de adrenalina , dependenta aparand a fi liniara . Dreptele de regresie sunt

aproximativ paralele 7 din ele, dar apare si o dreapta outlier, unde cresterea este cu mult mai mica la adaugarea de

adrenalina.

0 2 4 6 8 1 0

0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

A r i a d e s u b c u r b a d e a g r e g a r e

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

% *

s

ec

un

de

5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 2 . 1 2 . 2 0 1 4

1 5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 8 . 1 2 . 2 0 1 4

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 1

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 2

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 3

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 4

0 2 4 6 8 1 0

0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

A r i a d e s u b c u r b a d e a g r e g a r e

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

% *

s

ec

un

de

5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 2 . 1 2 . 2 0 1 4

1 5 . 1 2 . 2 0 1 4

1 8 . 1 2 . 2 0 1 4

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 1

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 2

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 3

2 3 . 1 2 . 2 0 1 4 - 4

Figura 3.2.3.9 a - Rezultatele privind ASC puncte Figura 3.2.3.9 b - Rezultatele privind ASC curbe

Dreapta de regresie aproximand toate valorile normalizate are un coefficient de corelatie foarte bun, la fel

ca si dreapta de regresie aproximand dependent valorilor medii pentru cei 8 subiecti in functie de conc de adrenalina

(figura 3.2.3.9 c si d)

y = 12.46x - 4.44R² = 0.940

50

100

0 2 4 6 8

MPA

16

0 2 4 6 8 1 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

A r i a d e s u b c u r b a d e a g r e g a r e

v a l o r i n o r m a l i z a t e

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

Re

la

tiv

e %

C

ha

ng

e

Y = 1 3 , 2 3 * X + 1 , 5 1 3

R2

= 0 , 9 1 2 4

Figura 3.2.3.9 c, d Dreapta de regresie aproximand toate valorile normalizate

Datele care le avem sunt insuficiente pentru a decide privind comparatia intre MPA si ASC-AG, in ceea ce

priveste valoarea lor ca parametri globali de caracterizare a agregarii. Dat fiind ca, exista o corelare in tre

concentratia antiagreganatelor in plasma si efectul antiagregant, aceste aspect foarte important este de cercetat in

continuare, decizia fiind posibila numai plecand de la un numar mult mai mare de date.

Testarea statistica multipla a efectului,folosind mai multi parametri ai curbelor de agregare.

Parametrii discutati pana acum nu sunt in intregime independenti. In ceea ce priveste AUC-AG este evident

ca aceasta vine sa integreze toti ceilalti parametri. Testarea fiecarui parametru in parte este un fel de testare multipla

a agregarii. Compararea intre rzultatle obtinute se poate face dupa normalizarea modificarilor fiecarui parametru in

parte.

O reprezentare a valorilor corespunzand la trei parametri (ASC-AG, panta 1 si MPA) in functie de

concentratia de adrenalina este data in figura 3.2.3.10

0 2 4 6 8 1 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

G r a f i c u l c u t o a t e v a l o r i l e n o r m a l i z a t e

( A U C , M P A , S l o p e 1 )

C o n c e n t r a t i e A d r e n a l i n a ( µ M / L )

Re

la

tiv

e %

C

ha

ng

e

R2

= 0 . 9 4

Y = 1 2 , 4 3 * X + 9 , 7 9 4

Figura 3.2.3.10 – Valori normalizate AUC, MPA si Panta 1

Se observa ca datele sunt destul de dispersate dar, aparent normal distribuite ( ipoteza nu poate fi verificata

deoarece numarul de date este totusi prea mic) si in mod foarte probabil apare o crestere liniara in functie de

concentratia de adrenalina. Coeficientul de corelatie liniara este mai bun decat in fiecare caz in parte. Panta 2 s-a

core;at ceva mai putin cu ceilalti parametri.

In schimb, pentru datele medii ale celor opt subiecti corelarea intre ASC-AG si panta 2 a fost excelenta.

Se pune o intrebarea naturala care metoda este mai buna, corelarea datelor medii sau corelarea datelor

individuale. Daca se poate presupune ca subiectii formeaza un lot omogen , de exemplu tineri si sanatosi, se poate

face o medie intre acestia . Daca sunt pacienti cu boli diferite, sunt de preferat analize care pun in evidenta toate

datele individuale, in primul rand pentru depistarea si analiza datelor outlier.

y = 4,467.58x - 968.98R² = 0.92

0

10000

20000

30000

40000

0 2 4 6 8 10

Aria de sub curba de agregareAria de sub curba de agregareAria de sub curba de agregare

17

Figura 3.2.3.11 Variația ASC-AG și panta 2 ca o funcție a concentrației de adrenalină în PRP, după normalizare

III.2.4 Discutii

Primul obiectiv al acetei cercetari a fost de aevalua efectul direct al adrenalinei singura, nu în asociere cu

alte aggregante. Unii autori consideră că adrenalina nu induce modificări de morfologie, metabolism sau functie

plachetara și că nu poate fi considerat, ca un agent de agregare [35] [Lanza 1988].

A fost raportat de exemplu potențarea adrenalinei prin ADP [36] [Alarayyed 1995]. În acest sens, rezultatul

nostru a fost clar, adrenalina a avut o activitate proagreganta. Acesta a fost un rezultat de așteptat, deoarece

adrenalina s-a dovedit a avea, de asemenea, și efect asupra sedimentarii eritrocitelor, cel mai probabil ca urmare a

unui efect asupra agregării lor [37] [Voicu 1999].

Alta problemă a privit concentrația necesara pentru obținerea de agregare. Într-un studiu pe un interval

mare de concentrații de adrenalină (0.25-16 µM), s-a constatat că există un prag de concentrație de adrenalină (0,03

- 1 pM) unde efectul antiggregant apare numai după asocierea cu colagen sau serotonina [38] [Alarayyed 1995]. La

concentrații mai mari de adrenalină singura este suficienta pentru a promova agregarea. Este de subliniat faptul că

pragul este modificat în diferite situații patologice. De exemplu, s-a găsit un prag scăzut de agregare la adrenalină în

doze mici, efect care a fost interpretat ca semn al hiperagregabilitatii de plachete la pacienții cu tromboză [39]

[Chelsea 2014], mai ales în cazul sindromului de plachete “lipiciase” (SPS), o tulburare de trombocite autosomale

dominanta asociata cu evenimentele tromboembolice arteriale si venoase [40-45] [Mammen 1998, Bick 1998,

Mammen 1988, Frenkel 2003, Kubisz 2013, Mammen 2003].

Concentrațiile utilizate în acest studiu au fost 1 - 8 µmol / l, ceea ce înseamnă că concentrații mai mari

decât pragul. Așa că era de așteptat o corelare a rezultatelor noastre cu rezultate anterioare, pentru adrenalina sau

combinații de adrenalina cu alte antiagregante raportat la concentrații mai mari de 1 µmol / l.

Am reprezentat agregarea maximă a plachetelor (AMP) estimată din curbele obținute la diferite concentrații

și obținute, în domeniul similar concentrațiilor noastre, o excelenta de regresie liniară. O "saturație" sau chiar un

revers de efect poate apărea odată cu creșterea concentrației mai departe de adrenalină. Trebuie sa luăm în

considerare faptul că adrenalina influențează agregarea la nivelul forțelor electrice de repulsie. [37] [Voicu 1999]

Dependența bifazica [49] [Hampton 1969] a răspunsului a mobilitati electroforetice a plachetelor, in functia de

concentratia de ADP sau noradrenalina trebuie să conducă în final la o modificare semnificativă a dependenței de

agregare asupra concentrației de adrenalină.

III.2.5 Concluzii 1. Adrenalina, în concentrații în 1 - 8 µM, induce agregarea plachetelor umane din plasmă bogată în

plachete.

2. A doua panta ale curbelor de agregare și ariile de sub curbe depind liniar de concentrația de adrenalină.

3. Modele de regresie liniară pentru pantă și aria de sub curba erau practic identice sugerând o mai degrabă

mecanism unic decât de acțiune bifazică al adrenalinei în decursul timpului de agregare.

Capitolul III.3.1 Calcule empirice de orbital molecular privind structura electronic a adrenalinei si

clopidogrelului

Este de remarcat diferenta foarte mare intre interpretarile si mecanismele propuse privind efectele asupra

agregarii plachetare. Teza de fata s-a axat in primul rand pe abordarea biofizica, ce presupune numai efecte

reversibile, determinate de perturbari ale structurilor electrice si campurile de forte la nivelul membrane, ca urmare a

interactiunii intre moleculele de substanta activa determinate in primul rand de proprietatile lor globale.

Abordarea biochimica si biologica considera in locul campurilor de forte la interfetele membranare,

structuri chimice complementare numite receptori substantei active, si reactii chimice intre acestea cu transfer de

electroni.

In esenta nu se pune problema alegerii intre cele doua clase de mecanisme. Unele caracteristici ale

efectuluise se pot explica pornind de la interpretarile biochimice, iar altele de la interpretarile biofizice.

y = 3.89x - 0.51R² = 0.95

y = 3.55x + 2.16R² = 0.92

0

20

40

0 2 4 6 8 10

Adrenaline concentration in PRP (μmol/L)

AU_AGC slope 2

Linear (AU_AGC) Linear (slope 2)

18

Relatiile strucura actiune mai recente iau in calcul atat unele proprietati moleculare globale (coeficienti de

partitie, volum molecular, moment de dipol etc) dar si densitati electronice locale si potentiale de modificare a

acestora, ceea ce duce mai degraba la mecanismele biochimice. Am incercat o modelare si calcule de chimie

cuantica folosind un soft specializat, pentru a incerca a explica interactiunile clopidogrelului si adrenalinei cu un

ipotetic receptor din membrane plachetara, pornind de la multiple proprietati calculate. Aceste proprietati nu sunt

independente, dar mozaicul lor poate sugera mult mai mult decat fiecare luate in parte in ceea ce priveste relatiile

posibile intre structura si actiunea biologica asupra agregarii plachetare.

Metoda de calcul

Geometriile moleculare au fost modelate şi optimizate prin metoda RHF (Restricted Hartree-Fock) în

aproximaţia semiempirică PM3 cu ajutorul programului Hyperchem [Hypercube INC]. Aceste geometrii au fost

utilizate în calcule empirice de orbitali moleculari, obţinând date privind structura electronică a substanţelor studiate

(nivele electronice moleculare, populaţie elctronică, moment de dipol, sarcini electrice nete pe atomi, partiţii

energetice după tipul de legături chimice sau interacţii, ordine de legătură sau valenţă liberă etc).

Rezultate si discutii

Rezultatele sugereaza absenta interactiunii farmacodinamice intre clopidogrel si adrenalina. Acest rezultat

era de asteptat in masura in care cele doua substante active se considera ca au receptori alfa 1, 2 beta 1, 2 –

adrenalina) si P2Y12 – clopidogrelul. Nu stiim , dar am facut o comparatie intre

propietatiile fizico-chimice cuantice (potentialul electrostatic molecular, energia HOMO - LUMO, momentele de

dipol, logP, logD) si fizico-chimice globale pentru cele doua molecule.

S-a observant ca diferentele intre propietatiile celor doua molecule sunt destul de mari nu numai in cea ce

priveste formula chimica dar si propietatiile moleculare globale. Acest lucru nu este banal deoarece de exemplu

pentru anestezice locale s-a aratat in urma de aproape 50 de ani (S.Moldoveanu, 1981]; [C.Mircioiu, 1982] ca

molecule cu structura chimica foarte diferita pot avea potentiale electrostatice moleculare si alte propietati globale

foarte apropiate, precum si faptul ca molecule foarte apropiate in cea ce priveste formula chimica clasica pot avea

proprietati foarte diferite.

In cazul celor două molecule studiate, bazat pe proprietatea moleculară denumită potențial electrostatic, a

fost obținută harta tridimensională a densității electronice, diferitele valori ale potențialului electrostatic fiind

marcate prin culori (Figura 1). Potențialul electrostatic molecular poate fi utilizat pentru aprecierea

cuantomoleculară a lipofilicităţii, deoarece caracterizează polaritatea unei anumite regiuni de pe suprafaţa Van der

Waals a moleculei. Regiunile cu valori mari ale potenţialului (zonele pozitive, colorate în verde) vor atrage

puternic moleculele de apă, iar regiunile cu valori scăzute (zonele negative, colorate în violet) nu le vor atrage,

putând fi considerate hidrofobe.

a b

Figura 1. Suprafața potențialului electrostatic molecular a clopidogrelului (a) şi a adrenalinei (b).

Interacţiile între substanţele chimice şi receptorii biologici, interacţii care dau naştere unor răspunsuri

biologice corespunzătoare, au loc în general prin transfer de electroni în ambele sensuri (unde O-MO – orbital

molecular ocupat si U-MO – orbital molecular neocupat):

19

ligand (O-MO) => receptor şi ligand (U-MO) <= receptor (Figura 2).

Figura 2. Interacţia ligand – receptor prin transfer de electroni [Amzoiu Emilia 2010].

De aceea orbitalii de frontieră sunt parametrii foarte importanţi în descrierea interacţiei ligand

(medicament) – receptor biologic şi pentru moleculele studiate (Figura 3) prezintă următoarele valori energetice.

EHOMO, ADR = - 8.6748 eV

ELUMO,ADR = 0.4042 eV

EHOMO,CLO = - 9.0177 eV

ELUMO,CLO = - 0.2824 eV

Figura 3. Orbitali moleculari de frontieră.

Culoarea verde indică o polaritate pozitivă, iar culoarea violet – o polaritate negativă

(HOMO – Higher occupied molecular orbital; LUMO – lower unoccupied molecular orbital)

Studiul ariilor moleculare pentru cele două tipuri de orbitali moleculari arată contribuţia orbitalilor

atomici la formarea acestora. Valoarea descriptorului EHOMO permite o apreciere a proprietăţilor donoare ale unei

molecule, respectiv a tendinţelor ei de oxidare. In schimb, valoarea descriptorului ELUMO permite aprecierea

proprietăţilor acceptoare ale unei molecule, respectiv a tendinţelor ei de reducere.

Moleculele pentru care EHOMO are valoare maximă sunt cele mai susceptibile la atac electrofil, iar cele

pentru care ELUMO are valoare maximă sunt mai susceptibile la atac nucleofil.

Diferența de energie dintre nivelele HOMO și LUMO (ΔE = ELUMO - EHOMO) este, de asemenea, un

descriptor molecular important din punct de vedere chimic, care explică stabilitatea moleculei, o valoare scăzută a

acesteia indicând că molecula este extrem de reactivă. Din valorile prezentate în tabel, cea mai stabilă moleculă este

adrenalina dar diferentele intre cele doua molecule par sa fie departe de o semnificatie statistica si/sau biologica.

Substanţa ΔE, eV λ η

Adrenalină 9.079 4.1353 4.5584

Clopidogrel 8.7353 4.6500 4.3676

20

Suma și diferența energiilor orbitalilor moleculari de frontieră sunt corelate cu reactivitatea chimică a

moleculelor prin descriptorii cuantici de reactivitate globală, electronegativitatea absolută (λ) și rigiditatea

absolută (η) [IB Obot 2013] [J. Janak 1978]:

Tendinţa de cedare - acceptare de electroni este descrisă de electronegativitatea λ. Rigiditatea (hardness)

este o mărime care descrie opoziţia unui sistem atomic sau molecular la variaţia densităţii electronice din sistem.

Electronegativitatea mai mare este prezentată de clopidogrel, acest lucru explicând efectul antiagregant al acestei

substante, dar in acest caz deferenta pare sa fie semnificativa statistic si chimic.

Un alt parametru molecular rezultat din calcule chimice cuantice este momentul de dipol electric (μ),

care reflectă separarea parțială a sarcinii electrice în moleculă. Acest descriptor molecular reprezintă, de asemenea,

un predictor al reactivității chimice a moleculelor. Acest parametru este o măsură a polarizării sistemului molecular.

In tabelul următor sunt prezentate valorile momentului de dipol pentru moleculele studiate.

Substanţa M, g/mol Momentul de dipol, D

Adrenalina 183.208 2.049

Clopidogrel 321.829 2.063

După cum se observă, valoarea cea mai mare a momentului de dipol aparţine clopidogrelului, dar

diferenta este foarte mica

Transportul medicamentelor prin membranele celulare depinde de solubilitatea acestora în membranele

biologice şi de coeficientul lor de partiţie, care exprimă solubilitatea diferenţiată a substanţelor în solvenţi apoşi şi

organici. In tabelul următor sunt redate valorile acestui parametru calculate teoretic.

Substanţa log P

Clopidogrel 3.81

Adrenalina -0.61

In acest caz deoarce suntem pe o scara logaritmica diferenta este foarte mare si cele doua molecule sunt

esential diferite: adrenalina este hidrofila iar clopidogrelul este lipofil. Acest parametru este singurul care ar putea

explica actiunea efectul opus al celor doua substante asupra agregarii plachetare: adrenalina este proagregant iar

clopidogrelul este antiagregant.

Concluzii

Dat fiind insa faptul ca adrenalina este pro agregant si clopidogrelul este un prodrog antiagregant

interactiunea intre ele ar fi fost posibila in cazul in care pe langa mecanismul de interactiune cu receptori ar exista

si un alt mechanism, biofizic prin efecte la nivelul straturilor duble electrice ale membranelor. Astfel s-a pus in

evidenta (Stiliyana Borisova 2016] efectul antiagregant eritrocitar al clopidogrelulu in absenta unei activari prin

metabolizare hepatica . Nu in ultimul rand trebuie tinut cont de faptul ca efectele, cel putin la nivelul straturilor

duble electrice, depind de concentratie .

Capitolul III.3.2 Studiul interactiunii farmacodinamice intre adrenalina si clopidogrel in agregarea

plachetelor sangvine

Agregarea intrinseca a plachetelor este foarte redusa si nu este masurabila direct. Ea este mult crescuta

inainte si imediat dupa accidentele vasculare, implicand un risc crescut de recadere sau de accident vascular

tranzitoriu. Ca urmare instituirea tratamentul antiagregant este obligatoriu in toate cazurile iar tratamentul cu un

medicament sau cu asocieri de medicamente antiagregante este unul de durata.

In clinica efectul aspura agregarii intrinsece a placheteleor este practice imposibil de masurat, deoarece este

mic si variabil. Efectecul antiagregantelor se masoara indirect prin efectul asupra agregarii induse de adrenalina sau

alti proagreganti (collagen ristocetina, ADP etc). Efectul antiagregant masurat este efectul de reducere a agregarii

induse de adrenalina.

Intr-o abordare fizico-chimica fundamentala a fenomenlor de agregare plachetara pe baza teoriei

Dereaghin-Landau Verwey Overbeek extinse stabilitatea sangelui si lipsa agregarii plachetelor este consecinta

incarcarii electrice negative a acestora si a respingerii intrestraturile duble electrice formate la nivelul membranelor.

21

Efectelor ionilor si macromoleculelor asupra structurii stratului dublu electric si asupra potentialului

electroforetic al celulelor depind de concentratiile lor plasmatice si in general la concentratii mari efectele observate

la concentratii mici dispar sau chiar se inverseaza. [V. A. Voicu, 1999]. Echilibrul intre efectele agregante si/sau

proagregante este foarte fragil si depinde calitativ si cantitativ de concentratie. In acest context, tinand cont si de

variabilitatea mare a farmacocineticii antiagregantelor uzuale am considerat util a face o cercetare asupra

interactiunii intre proagregantul standard – adrenalina si un antiagregant major – clopidogrelul, intr-un domeniu de

concentratie mai larg a acestora. Dincolo de interesul stiintific, problema poate avea si implicatii clinice imediate,

dat fiind rezistenta la tratamentele antiagregante a o parte importanta a pacientilor. (Zhang H., 2014).

III.3.2.1 Materiale si metode

Reactivi Ca reactivi s-au folosit reactivul cu adrenalina achizitionat de la Helena laboratories si cu o calitate

analitica iar reactivul de clopidogrel a fost donat de 3S-Pharmacological Consultation & Research GmbH,, de

asemenea de o calitate analitica.

Pregatirea reactivilor S-a preparat o solutie standard de adrenalina si apa distilata pornind de la o doza de

pulbere aflat intr-un flacon furnizat de Helena Laboratories.

Pentru Clopidogrel s-au preparat 3 solutii de concentratii diferite, solutii de clopidogrel bisulfat de

concentrati 1 μg/mL, 2 μg/mL si 3 μg/mL.

S-a preparat o solutie mama de clopidogrel cu concentratiile de 1 μg/mL, 2 μg/mL 3ug/mL.

Dupa preparare solutiile obtinute au fost verificate sa nu contina particule suspendate in solutie.

Depozitare si stabilitate

Adrenaina bitartrat sub forma de pulbere a fost pastrata la frigider la temperature 2-8° C conform European

Pharmacopoeia 7.0. Ca semn de deteriorare s-a observant o schimbare a uniformitatii de culoare alba a pulberii de

adrenalina. Reactivul de adrenalina nu a fost folosit cand culoarea alba a pulberii nu a fost uniforma.

Colectarea probelor si manipularea lor

Colectarea probleor: Sangele a fost recoltat de la pacienti din sectia de medicina interna a spitalului clinic

Colentina care au fost informati inainte de a participa la acest studiu. Sangele a fost recoltat in eprubete cu vid.

Proba: Sangele integral, recoltat in eprubete avand ca anticoagulant citrat de sodiu 3.2%, a fost centrifugat,

iar plasma obtinuta a fost separate si pastrata la temperature camerei.

Observatii de lucru

- Solutia reactivilor trebuia sa fie limpede si lipsita de particule suspendate.

- Probele de plasta au trebuit incubate la temperatura 37 oC pentru cel putin 5 minute pentru a se obtine

valorile citite de absorbanta stabila.

- Solutiile reactivi trebuiau adaugate in cuva direct in PRP si nu pipetate pe peretii interior al cuvei.

- Fiecare cuva cu plasma trebuia verificata sa nu aiba bule de aer pentru a nu influenta citirea

abosrbantei.

- Inaintea adaugarii reactivului in cuva cu PRP, trebuia verificat ca magnetul din fiecare cuva, se

invartea si nu era blocat, pentru a asigura o agitatie continua pe tot parcursul experimentului.

- In cazul in care magnetul lispesea sau nu se invartea din cause tehnice sau ramanea blocat in cuva,

citirea abosrbantei urma sa arate valori mici de agregare pentru ca Solutia de reactiv nu era dispersata

omogen in PRP,

Metoda de testare

S-au testat separat adrenalina bitartrat, clopidogrelul bisulfat si combinatii ale acestora , in diferite

concentratii.

Stocare si stabilitate

Sangele integral si probele de plasma au fost pastrate la temeperatura camerei (15 – 25 oC). Probele de

plasma au fost mentinute tot timpul acoperite pentru a mentine pH-ul neschimbat. Toate testele au fost efectuate in

maxim trei ore dupa recoltarea sangelelui.

Metoda de testare

S-au testat separat adrenalina, clopidogrelul si combinatii ale acestora, in diferite concentratii. S-a pipetat

intr-o cuva 500 uL plasma saraca in plachete (PPP), obtinuta la centrifugarea sangelului la 3000 G, si s-a lasat la

incubat la 37 oC cel putin 5 minute. S-a pipetat 450 uL de plasma bogata in plachete (PRP) in patru cuve si s-a lasat

la incubat la 37 oC cel putin 5 minute. Dupa aceea, cuva care continea PPP s-a introdus in fiecare canal al aparatului

pentru determinarea primei citiri de absorbanta care a corespuns cu agregarea totala al plachetelor din plasma, 100%

agregare. Apoi s-au introdus cele 4 cuve cu PRP in canalele aparatului, s-a adaugat cate un magnet agitator in fiecare

cuva si s-a verificat daca magnetul se invarte. S-a pipetat in fiecare cuva reactivul antiagregant in concentratie

diferita la fiecare cuva cu exceptia cuvei in primul canal unde s-a pipetat solutie de NaCl 0.9%, care corespundea cu

proba cu 0 ug/mL Clopidogrel bisulfat. Dupa aceea s-a introdus reactivul inductor de agregare, adrenalina cu o

22

concentratie identica pentru fiecare canal si s-a inceput citirea absorbantei timp de 10 minute. Solutiile de reactiv au

fost pipetate direct in PRP fara sa atinga pereti interior al cuvetelor. Experimentul s-a repetat dar cu o concentratie

diferita de adrenalina pentru a se compara efectul antiagregant al clopidogrelului in concentratii diferite de

adrenalina.

Figura 1 – Prezentare schematica a agregarii plachetare.

Rezultate si discutii

Reproductibilitatea

Dat fiind numarul mic de voluntari donator de sange pentru experiment, in vederea validarii rezultatelor, s-

a testat in prealabil reproductibilitatea metodei.

Reproductibilitatea curbelor in prezenta adrenalinei a fost studiata si publicata (rev Farmacia AP, IS,EM).

Datele normalizate privind ASC si MPA sunt date in fig.1

Figura 2 Reproductibilitatea curbelor de agregare

Se observa ca s-au obtinut coeficienti de corelare mai mici de 0,01, ceea ce indica absenta unei tendinte de

modificare a parametrilor curbelor la repetarea testelor.

In a doua faza, s-a testat repetabilitatea curbelor in prezenta atat a adrenalinei cat si a clopidogrelului.

S-au repetat de trei ori curba de agregare in prezenta de adrenalina 4 ug/ml, concentratia de clopidogrel

fiind de fiecare data: 0 in canalul 1, 1 ug/ml in canalul 2, 2 ug/mL in canalul 3 si 3 ug/mL in canalul 4.

0 1 2 3 4

2 5 0 0 0

3 0 0 0 0

3 5 0 0 0

4 0 0 0 0

4 5 0 0 0

5 0 0 0 0

5 5 0 0 0

A S C - C o n c e n t r a t ia C lo p id o g r e lu lu i in P R P

la 4 µ M A d r e n a l in a in P R P

( R e p r o d u c t ib i l i t a t e )

C o n c e n t r a t i e C lo p id o g r e l ( µ M /L )

Aria

de

su

bc

urb

a E xp erim en tu l 1

E xp erim en tu l 2

E xp erim en tu l 3

M ed ia

0 1 2 3 4

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0

1 1 0

M P A - C o n c e n t r a t ia C lo p id o g r e lu lu i in P R P

la 4 µ M A d r e n a l in a in P R P

( R e p r o d u c t ib i l i t a t e )

C o n c e n tra t ie C lo p id o g re l (µ M /L )

MP

A

E xp e rim e n tu l 1

E xp e rim e n tu l 2

E xp e rim e n tu l 3

M e d ia

Figura 3 reproductibilitatea agregari in prezenta adrenalinei la diferite concentratii de clopidogrel Dupa cum s-a

observat curbele difera intre ele dar, calculul statistic a aratat ca, in fiecare punct coeficientul de variatie a fost intre

10 si 15 %, ceea ce, pentru un parametru biologic, se cheama o stabilitate remarcabila. In cazul inhibitiei maxime –

MPA, coeficientii de variatie au fost chiar mai mici.

y = -0.08x + 74.06R² = 0.00

y = -0.02x + 60.43R² = 0.00

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20

no

rmal

ized

(%

) p

aram

eter

number of repeated determination

repetability of curves in presence of ADR ( s1- AUC. S2 - MPA)

Series1

Series2

Linear (Series1)Linear (Series2)

23

In schimb variabilitatea in cazul pantelor 1 si 2 a fost mai mare, ceea ce era de asteptat deoarece aceste

pante nu sunt intotdeauna bine definite.

III.3.2.2 Efectul clopidogrelului singur

Cum era de asteptat clopidogrelul nu are niciun efect asupra agregarii plachetare. A fost pus in evident un efect de

Weber. dar PE PLACHETE SPALATE.

III.3.2.3 Efectul cresterii concentratiei de clopidogrel cand concentratia adrenalinei este tinuta

constanta

Curbele de agregare pentru concentratii de clopidogrel 0; 1 ug/ml; 2 ug/ml si 3 ug/ml in timp ce adrenalina

a fost tinuta constanta la valoarea de 4 uM sunt prezentate in figura 2

S-a urmarit comparativ structura curbelor de agregare: aria de sub curba, agregarea maxima si cele doua

pante.

Prima serie de experimente a privit probe de sange recoltate de la un voluntar sanatos (SANGE AP). Datele

au fost normalizate la cea mai mare valoare pentru a se putea compara efectele asupra parametrilor curbelor.

0 1 2 3 4

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

A S C v a lo r i n o r m a l iz a te

AS

C

E x p e r im e n tu l 1

E x p e r im e n tu l 2

E x p e r im e n tu l 3

C o n c e n t r a t i e C lo p id o g r e l ( µ M /L )

0 1 2 3 4

8 0

9 0

1 0 0

1 1 0

1 2 0

1 3 0

M P A V a lo r i n o rm a liz a te

C o n c e n tra t ie C lo p id o g re l (µ M /L )

MP

A

E xp e rim e n tu l 1

E xp e rim e n tu l 2

E xp e rim e n tu l 3

M e d ia

Figura 5 Curbele de agregare pentru concentratii de clopidogrel 0; 1 μg /ml; 2 μg /ml si 3 μg /ml in timp ce

adrenalina a fost tinuta constanta la valoarea de 4 μM

Variabilitatea a fost destul de mare dar dincolo de aceasta, apare ca efectul nu a depins de concentratia

clopidogrelului, deci clopidogrelul nu a interactionat cu adrenalina ca efect asupra agregarii plachetelor.

Daca reunim intr-un singur grafic efectele asupra parametrilor se obtine graficul combinat din figura de mai

jos .

24

0 1 2 3 4

0

5 0

1 0 0

1 5 0

V a lo r i n o rm a liz a te

A S C , M P A , P a n ta 1 s i P a n ta 2

Va

lori

no

rm

ali

za

te

C o n c e n tra t ie C lo p id o g re l (µ M /L )

y = 0,96x + 99,86R² = 0,730,0

50,0

100,0

0 1 2 3 4

Figura 6 a) Valori normalizate ASC, MPA, Panta 1 si Panta 2, b) Valorile medii

Valorile medii, dupa cum se observa in figura b se inscriu pe o drepata de panta sub 1%, deci clopidogrelul

nu interactioneaza cu adrenalina si nu modifica efectul agregant al acesteia.

Repetarea de doua ori a experimentului in aceleasi conditii ca mai sus, pe sange de la un voluntar cu un

infarct miocardic in antecedednte a dus la aceiasi concluzie.

III.3.2.4 Efectul concetratiei de clopidogrel asupra agregarii induse de adrenalina

In vederea testarii efectului adaosului de clopidogrel asupra dependentei intre efectul antiagregant al

adrenalinei, s-au adaugat concentratii fixe de clo ( 1,2, 3 ug/mL ) si s-a testat efectul concentratiilor crescatoare 4, 8,

12 uM de adrenalina. Rezultatele sunt prezentate in figura

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15

MP

A

Adrenaline concentration in PRP (uM)

MPA vs. Adrenaline conc in PRP at different Clopidogrel

concentrations

0 ug/mL

CLO1ug/mL CLO

0

10000

20000

30000

0 2 4 6 8 10 12 14

To

tal area

Adrenaline concentration in PRP (uM)

Total area vs. Adrenaline conc in PRP at different Clopidogrel concentrations

0 ug/mL CLO

1ug/mL CLO

2ug/mL CLO

3ug/mL CLO

Figura 7 Efectul concentratiilor crescatoare 4, 8, 12 μM de adrenalina la concentratii fixe de clopidogrel (1, 2, 3

μg/mL)

S-a observat ca , la conc de 4 si 8 μM parametrii au fost aceiasi, indiferent de concentratia clopidogrel . La

concentratia de 12 μM datele au inceput sa fie variabile, fara insa a se observa o dependent clara de conc de

clopidogrel

Dat fiind insa faptul ca adrenalina este pro agregant si clopidogrelul este un prodrog antiagregant interactiunea intre

ele ar fi fost posibila in cazul in care pe langa mecanismul de interactiune cu receptori ar exista si un alt mechanism,

biofizic prin efecte la nivelul straturilor duble electrice ale membranelor. Astfel s-a pus in evidenta [STILIYANA

BORISOVA] efectul antiagregant eritrocitar al clopidogrelulu in absenta unei activari prin metabolizare hepatica .

Nu in ultimul rand trebuie tinut cont de faptul ca efectele, cel putin la nivelul straturilor duble electrice, depind de

concentratie .

In unele cercetari anterioare s-a obtinut rezultat cu caracter general ca substancele

Concluzii

Adrenalina in domeniul 2-4 uM a fost dependent de concentratie crescand foarte mult la marirea

concentratie de la 4-8 uM.

Efectul adrenalinei nu a fost influentat de adaugarea clopidogrelului la niciuna din concentratiile testate 1,

2 si 3 ug/mL)

Agregarea intrinseca nu a fost practic masurabila. Adaugarea de clopidogrelul singur nu a schimbat cu

nimic curba de agregare care a ramas practic aproape de 0.

Capitolul III.4.1 Model experimental privind deplasarea si agregarea populatiilor de celule sanguine

Dat fiind ca numarul de eritrocite in sange este de ordinul 5-6 milioane pe milimetru cub, iar numarul de

plachete este de ordinul sutelor de mii pe milimetru cub, s-a urmarit deplasarea in timp a celulelor (sedimentarea

hematiilor ) dintr-o proba de sange diluata de 20 de ori cea ce corespunde aproximativ unei suspensii de celule

plachetare, de ordinul fractiei de volum a plachetelor in sange.

25

Suspensia a continut in majoritate celule singure. Agregatele au fost putine, de mici dimensiuni si o parte

din ele in forma descrisa clasic de ,,fisicuri”.

S-a observat ca celulele s-au deplasat practic toate in plan vertical sau putin oblic ( vezi film). Deplasarea a

aparut sa fie uniforma cu viteze aproximativ egale. Nu s-a observat o agregare a hematiilor, nici pericinetica si nici

ortocinetica.

Viteza lor in campul vizual a microscopului a aparut sa foarte mare

Luand ca unitate de masura dimensiunea medie a unei hematii de 5 μm dupa cum se vede in fig III.4.2.1,

dimensiunea pe verticala a imaginii a fost aproximativ de 8 diametre de eritrocite deci aproximativ 40 μm.Parcursul

unui ertrocit pe toata verticala imagini a fost efectuata in aproximativ 30 de sec, deci viteza de sedimentare este

aproximativ 4/3 μm/s.

Un calcul simplu arata ca aceasta viteza corespunde la 5 mm/h cea ce este in limitele normalului in observatiile

evaluarile de VSH.

𝑉 =4

3 μm

s= 4 ∗

3600

3

μm

h= 4800

μm

h= 5

mm

h

Viteza observata este aproximativ cea normala (1 mm/h), pentru un subiect sanatos tinand cont si de o

accelerare ca urmare a scaderii hematocritului.

Dupa cum se vede in figura III.4.2.2. nu au fost agregate mari in proba. Cele mai multe agregate au fost de fapt

singleti sau agregate din cel mult patru eritrocite.

III.4.1.1 Calculul vitezelor relative folosind matricea vectorilor de viteza relativa

Evolutia in timp a matricii vectorilor de viteza confirma evaluarea vizuala privind o viteza relativ omogena.

O examinare mai atenta sugereaza viteze ceva mai mari in zona superioara si viteze ceva mai mici in zona

inferioara, sugerand o viteza franata de compactarea prin sedimentare (vezi figura III.4.2.3)

26

Pe de alta parte apar si vectori avand si componente pe directia OX corespunzand unor deplasari diagonale.

O analiza suplimentara a softului a pus in evidenta liniile de curent asociate campului de viteza care dupa cum se

vede in figura III.4.2.4 de mai jos sunt o parte verticale dar si o parte din ele diagonale.

In concluzie nu este de esclus existenta unor deplasari turbionari ca urmare a formarii unor contracurenti de

plasma in timpul sedimentari.

Analiza statistica a distributiei vitezelor pune in evidenta o distributie spatiala a vitezelor cu o simetrie

elipsoidala, dupa cum se vede in figura III.4.2.5. Reprezentarea calculului magnitudinii vitezelor absolute sugereaza

o distributie normala cu o dispersie foarte mica a vitezelor asa cum de fapt sugera si analiza globala vizuala.

Concluzii Calculele de tip PIV au aplicatie foarte larga punand in evidenta similaritati intre fenomene

foarte diferite cum ar fi deplasarea bancurilor de pesti si a stolurilor de pasari, agregarea suspensilor, evolutia in

timp a imaginilor radiografice ale tumorilor, coagularea solilor liofobi etc. Avand in vedere aceste fapte, analiza

deplasarii unei populatii de eritrocite de dimensiunea numerica a populatiei de plachete poate fi un model privind

deplasarea acestora din urma in timpul testelor in vitro de agregare.

27

Diferenta intre cele doua fenomene este data in primul rand de faptul ca testele de agregare plachetara

Born, se fac prin agitarea continua a plasmei. In absenta acestei agitari plachetele, la fel ca hematiile din

experimentul de fata ar agrega foarte putin. Cea ce este in fapt bine cunoscut in experimentele de agregare

palchetara.

Capitolul III.4.2 Sedimenntarea in suspensie extrem de diluate in zona aparent limpede de aspupra limitei de

separare in cazul sedimentarii hematiilor

Agregarea si sedimentarea hematiilor se desfasoara in conditiile unor restrictii majore impuse de numarul

mare al celulelor si a fractiei de goluri intre ele mica, uneori chiar sub 0.5.

Suspensiile de plachete sunt de circa 20 de ori mai diluate decat cele de hematii si , ca urmare, aceste

restrictii sunt mult reduse. Ca modelul pentru agregarea placheteleor s-a folosit o suspensie foarte diluata de hematii

Pentru a intelege mai mult cum se desfasoara fenomenle, in particular deplasarile plachetelor individuale si

a agregatelor de plachete, s-a studiat local, microscopic, video-recording , deplasarea hematiilor singure si a unor

agregate de hematii, intr-o suspensie aparent lipsita de hematii si anume plasma „liber de hematii” de deasupra

limitei de separare in miscare, la sedimentarea sangelui. Aceste hematii si agregate nu se vad cu ochiul liber dar au

fost puse in evidenta prin microscopie.

Metoda Sangele recoltat pe citrat a fost lasat sa sedimenteze timp de o ora. S-a obtinut „plasma fara

hematii” din portiunea superioara, in cazul unor subiecti cu viteza de sedimentare mai mare de 20 mm/h. S-a

preparat o proba pentru examinare la microscop cu masa microscopului in plan vertical. S-a depistat limita de

sepasrare in miscare (moving boundary) si s-au urmarit procesele in zona de deasupra limitei de separare.

Rezultate

Analiza ce urmeaza descrie filmul obtinut in timp. Pentru exemplificare, s-au ales si cateva imagini

reprezentative, prezentate mai departe, in textul ce urmeaza.

(Analiza video) Agregatele sunt rare si de dimensiuni aproximativ constante. Singletii sunt mult mai multi.

Agregatele de aceasi marime sedimenteaza aproximativ cu aceasi viteza. Singletii nu par sa sedimenteze.

Coagularea orto-cinetica pare a fi foarte redusa. De fapt singleti intalniti in cale nu sunt captate ci sunt respinsi.

Miscarea singletilor este dezordonata, se desfasoara in toate directiile, in toate directile aratand mai curand

a miscare browniana.

28

Vectori de viteza sunt foarte mari la complexe

Softul considera agregatele ca o singura particula dand vectori de viteza mari, dar in aceleasi timp identifica

si fragmente ale agregatelor. Ca urmare liniile de curent in zona agregatelor sunt multiple determinand practic tuburi

de curent. Uneori tuburile de curent urmeaza o miscare turbionara.

Singleti se intalnesc, dar nu par a se agrega intre ei.

Agregatele mari antreneaza in miscarea lor si plasma inconjuratoare (curgere vascoasa). La frontiarea

tuburilor de curent generate de agregatele mari apar contracurenti de plasma care antreneaza si singleti inducandu-le

o miscare ascendenta. In preajma lor apar si tuburi de curent (miscari paralele) ale singletiilor purtati de plsama.

Distributia vectorilor de viteza

Distributia vectorilor de viteza are o simetrie sferica cu o sfera centrala mai densa si un nor de raza cam de

doua ori mai mare. Nucleul dens are o raza cam de 5 pixel fiind centrat in punctul x-2.5, y=2.5 cea ce sugereaza o

cadere oarecum diagonala. Norul este distribuit atat in zonele pozitiva cat si in zonele negative, sugerand o miscare

dezordonata, o miscare ce nu urmareste o anumita directie. Fig III.4.4

Distributia magnitudinii vitezelor este bimodala

O distributie gausiana de viteze mici (intre 0 si 10 px/frame) cu frecvente mari (intre 5-30), corespunzand

singletiilor este reprezentata in figura III.4.5

Distributii de viteze mari pana la 10-20 pixel/frame cu frecvente mici curespunzand agregatelor. Se pare ca

distributia vitezelor si a marimii agregatelor este omogena.

Un agregat are diamentrul de aproximativ 3-7 ori mai mare fata de un singlet.

29

Dat fiind ca viteza este proportionala cu patratul razei hidrodinamice, raportul 20px/5px = 4

Legea de sedimentare Stokes

Cat priveste sedimentarea in absenta coagularii, daca se considera ca ea decurge la echilibru se poate egala

forta gravitatiei care actioneaza asupra complexului k cu forta de frecare care se opune inaintarii acestuia considerat

ca o sfera dupa legea lui Stokes:

gR

VR k

kk 0

3

3

46

si de aici viteza de sedimentare:

2

9

~2kk

Rg

V

Discutii O teorie anterioara (V.Voicu,1995) propunea o sedimentare si o agregare tip avalansa. Agregatele mai mari

captand in drumul lor singleti si aggregate mici. Filmarea a aratat ca agregatele in sedimentarea lor nu capteaza

agregate mai mici sau singleti ci ii respinge electric impingadu-i in fata sau lateral in straturi limita hidro-dinamic

impunandule o miscare ascendenta intr-un curent de plasma. Extrapoland fenomenele la suspensii mai concentrate,

sedimentarea sirurilor de singleti inseamna o accelerare din faptul ca fiecare hematie intra in straturi limita

hidrodinamica (in trena celui antrerior) (C.Mircioiu 1995), dar pastranduse dinstanta dintre hematii individuale prin

respingerea electrica.

Deci este posibil ca asa-zisa coagulare ortocinetica sa devina de fapt mai redusa decat coaguarea

pericinetica. In acest fel se explica lipsa agregarii plachetelor in chiar conditii de agitare (1000-1200 rpm) daca nu se

adauga si un proagredant (adrenalina, rsitocetina, collagen, ADP etc)

Concluzii Examinarea si evaluarea proceselor la nivelul limetei de separare pune in evidenta deosebiri fundamentale

atat in ceea ce priveste deplasarea si interactiunea intre hematii, complexele de hematii si plasma. Procesele de baza

observate la dilutia ,,infinita” observata de asupra limitei de separare se modifica fundamental in momentul cresteri

foarte mari a concentratiilor ,,suspensiei” si aparitiei restrictiilor de spatiu si interactiunii hidrodinamice.

Agregarea plachetara este asemanatoare cu ceea ce s-a observat la dilutia infinita. Acesta este motivul

pentru care agregarea intrinseca a plachetelor nu poate fi masurata cantitativ in absenta proagregantiilor si agitarii.

Evaluarea video microscopica a permis punerea in evidenta a fenomenelor de baza in solutii in care cu

metode globale nu putea masura nimic.

Chiar daca solutia examinata infinit diluata, numarul de hematii si aggregate este inca imens pentru a putea

fi urmarite fara metode matematice avansate. Metoda PIV permite integrarea si analiza statistica a unor colectivitati

mari si caracterizarea unei agregari intrinsece care nu poate fi observata prin metode globala.

CONCLUZII GENERALE

I. ANALIZA GLOBALA A CURGERII (DEPLASARII) SI AGREGARII PLACHETARE .

Analiza globala a constat in cercetari privind evaluarea agregarii plachetare, folosind metode optice.

I.1. Stabilirea parametrilor critici ai metodelor de testare optica.

S-a gasit ca rezultatele testelor optice de agregare depind putin de temperatura sau de viteza de agitare.

Parametru critic este timpul scurs de la recoltarea probei de sange.

Rezultate reproductibile se obtin numai in prima ora dupa recoltarea sangelui. Dupa mai mult trei ore de la

recoltare nu se mai obtine nici o variatie a luminii transmise prin proba de plasma bogata in plachete ( PRP).

I.2 Dependenta agregarii de concentratia de adrenalina ca inductor .

Desi adrenalina este principalul inductor al agregarii in vederea testarii efectelor antiagregante ale

medicamentelor dependenta cantitativa a agregarii de concentratia de adrenalina, nu a fost studiata sistematic pana

in present. Experimentul nostru a aratat ca agregarea plachetelor creste o data cu concentratia de adrenalina.

Cresterea este liniara in intervalul 1 - 16 μM.

Efectul apare si este liniar la nivelul a patru parametri ai curbelor de sedimentare: prima panta, a doua

panta, inhibitia maxima si aria de sub curba de sedimentare.

O reprezentare normalizata fata de valorile maxime ale parametrilor, duce practice la grafice suprapuse,

semnificand o buna corelare a aefectelor asupra parametrilor care de fapt sunt numai partial independenti.

I.3 Dependenta agregarii intrinsece (in absenta unui inductor ) de concentratia de clopidogrel .

In absenta adrenalinei adaugate prealabil pentru inducerea agregarii, efectul antiagregant al clopidogrelului

adaugat in probele de PRP este practic nul, Lipsa efectului este insa o conluzie relativa, deoarece agregarea

intrinseca a fost la randul ei foarte redusa in comparative cu ceea ce se intampla in zilele imediat urmatoare unui

accident vascular sau a unui accident ischemic tranzitoriu.

I.4 Dependenta agregarii de concentratia de adreanalina ca inductor in prezenta clopidogrelului.

30

Efectele adrenalinei si clopidogrelului sunt practic independente. Nu a aparut, in domeniul de concentratii

studiat o interactiune farmacodinamica intre adrenalina si clopidogrel in agregarea plachetelor sangvine.

Deci lipsa efectului antiagregant in cazul PRP descrisa la nivelul agregarii intrinsece, se regaseste si la

nivlul agregarii induse de adrenalina, ceea ce nu era un rezultat neaparat asteptat deoarece se stia din literature de

existent unui effect antiagregant in cazul agregarii induse de adrenalina asupra plchetelor spalate.

II. MODELUL EXPERIMENTAL DE ANALIZA LOCALA A AGREGARII SI SEDIMENTARII

POPULATIEI DE CELLULE SANGUINE.

II.1 Suspensii concentrate

In suspensiile concentrate deplasarea eritrocitelor este de tip frontiera in miscare ( “moving boundary “) si

o analiza aprofundata a acesteia impune metode de tip “curbe de sedimentare” in locul analizei uzuale de

determinare a vitezei de sedimentare a hematiilor. Sedimentarea plachetelor apare in timp mai indelungat si este

vizibila doar in absenta agitarii probelor.

II.2 Suspensiile diluate de eritrocite ca model de studiu al agregarii si deplasarii plachetelor

Suspensii moderat diluate. Sangele diluat de 20 de ori are o concentratie de de 250 – 300 .000 de eritrocite

ce pot fi urmarite la microscop in ceea ce priveste agregarea, dezagregarea si sedimentarea. Acest experiment poate

fi considerat ca un model privind evolutia populatiei de plachete in plasma libera de eritrocite. La acest nivel de

concentratie, eritrocitele s-au agregat foarte putin. Sedimentarea nu a dus la o agregare ortocinetica. Deplasarea a

fost sedimentare in plan vertical si diagonal, spre deosebire de suspensiile concentrate, unde s-au observant tuburi

de curenti ascendenti de plasma si singleti.

Aplicarea analizei matematice si statistice de tip Particle Image Velocity‟ a pus in evidenta o dispersie

foarte mica a vitezelor, si o preponderenta a curentilor descendenti.

II.3. Suspensii infinit diluate . Sedimentarea a privit numai complexele mari. Agregatele foarte mici si

singletii stau pe loc sau se misca cu viteze foarte mici.

Aplicarea analizei matematice si statistice de tip Particle Image Velocity a pus in evidenta, la nivelul

frontierei in miscare, curenti ascendenti, in principal de plasma si singleti, curenti descendenti de aggregate si

curenti turbionari.

III. CORELAREA INTRE ANALIZA GLOBALA SI CEA LOCALA.

Analiza globala si analiza locala a agregarii si sedimentarii celulelor sanguine au pus in evidenta ca , cel

putin sub aspect calitativ fenomene complementare, foarte diferite.

III.1 Agregarea si dezagregarea . Revesibilitate si ireversibilitate.

Local avem fenomene reversibile de agregare si dezagregare,

La nivel global se percepe numai agregarea , si aceasta agregare apare ca un fenomen ireversibil.

III.2 Sedimentarea si flotarea

Local avem curenti descendenti ai agregatelor mari cuplati cu miscasri ascendente ale plasmei si

agregatelor mici, plus o circulatie microlocala turbionara.

La nivel global este perceptibila doar o sedimentare.

IV. DEPENDENTA PROPRIETATILOR GLOBALE DE CURGERE DE PARAMETRII DE

INTERACTIUNE LOCALI AI CELULELOR SANGUINE

Analiza vizuala dinamica la microscop a reusit sa evidentieze deplasarea colectivitatilor .

Pe baza acestor observatii s-a estimat theoretic, pornind de la lucrari generale experimentale si teoretice

[Mircioiu 1995], efectul interactiunii intre cellule asupra vitezei de sedimentare globale.

Intrucat s-au observant, pe de o parte, ca in suspensii concentrate eritrocitele se aliniaza si sedimenteaza in

siruri, s-a calculat, ponind de la lucrari de mecanica fluidelor privind deplasarea colectivitatilor de sfere, cresterea

vitezei de sedimentare a sirurilor de eritrocite. S-a obtinut rezultatul ca , in cazul unui sir de 100 sfere , viteza creste

de circa 5 ori

In aceklasi context s-a propus, pentru explicarea cresterii VSH cu scaderea hematocritului, o aplicare a

teoriei filtrarii, ecuatia Kozeny-Carman, in calculul influentei scaderii Ht aasupra VSH. S-a gasit ca , la o scadere a

HT de la 40 la 20, sedimentarea este accelerata, viteza crescand de aproape 5 ori.

Aplicabilitea acestor calcule, se justifica si prin observatia ca, in deplasarea omogena in jos, perceputa la

nivel global sunt inclusi si curenti ascendenti de plasma astfel incat putem considera o deplasare a plasmei intr-un

pat filtrant de eritrocite.