DIAGNOSTICUL N SALMONELOZE Material patologic: cadavre ntregi de animale mici sau psri, n cazul formelor septicemice, un os lung nedeschis, organe cu leziuni (ficat, vezic biliar, splin, ganglioni limfatici, n cazul psrilor: ficat, cord, ovar, testicul), lichid articular, avortoni, nvelitori sau lichide fetale, probe de snge recoltate la 8-10 zile dup avort. n cazul diagnosticului n tifo-puloroz sau paratifoze, pot fi utilizate ca probe patologice i probe de aternut contaminat cu fecale din hal sau cuibare. n cazul toxiinfeciilor alimentare, produsele folosite pentru nsmnri sunt reprezentate de carne i produse din carne, ou, ap, etc. Diagnosticul de laborator n cazul infeciilor cu germeni din familia Enterobacteriaceae include examene bacterioscopice i bacteriologice, urmrinduse iniial izolarea apoi identificarea bacteriilor izolate. Tipizarea se efectueaz prin mijloace serologice, cu ajutorul bacteriofagilor (lizotipia), prin testarea sensibilitii fa de un set de bacteriocine cunoscute (bacteriocinotipia), prin teste biochimice (biotipia) (antibiotipia). EXAMEN MICROBIOLOGIC Examen bacterioscopic Amprentele efectuate din materialele patologice se coloreaz, dup fixare, prin metoda Gram. Salmonelele se prezint sub form bacilar sau cocobacilar, colorat n rou (G-), avnd dimensiuni de 2-5/0,7-1,5 microni. Nu este capsulat i nu formeaz spor. Marea majoritate a salmonelelor sunt mobile datorit prezenei unui numr variabil de cili, dispui peritrich. S. pullorum i S. gallinarum sunt imobile. Examen bacteriologic Salmonelele cresc bine pe medii de cultur uzuale. n bulion produc turbiditate uniform, moderat pn la intens, n general mai slab dect n cazul E. coli. Pe agar, formeaz colonii mijlocii, de 1,5-3 mm diametru, de tip S, nepigmentate. Unele tulpini formeaz colonii pitice iar altele de tip R. Identificarea cu certitudine nu se poate face prin nsmnrile pe medii uzuale, de aceea se i pe baza sensibilitii fa de anumite antibiotice

recurge la utilizarea unor medii de mbogire (Kauffmann-Mller, bulion selenit), de pe care se fac transplantri dup 10-12-18 ore pe medii selective (Wilson-Blair, Leifson, Istrati-Meitert). Pe aceste medii se realizeaz o prim departajare a bacteriilor lactozo pozitive de cele lactozo negative. Mediul Istrati-Meitert. Conine lactoz, bil uscat de bou, citrat i hiposulfit de sodiu ca i citrat de fier. Are culoare verde nchis i este solid. Coloniile din genul Shigella, Salmonella apar verzi-albstrui, relativ transparente iar cele de E.coli sunt galbene, opace. Mobilitatea pentru Proteus este inhibat iar coloniile au centrul de culoare neagr. Coloniile lactozo-negative vor fi transferate pe medii de difereniere (Drigalski, Endo, Gassner, medii multitest: TSI, MILF, etc.). Examenul caracterelor biochimice const n evidenierea echipamentului enzimatic al bacteriilor, diferit de la o specie la alta. Astfel, unele medii pot evidenia fermentarea zaharurilor, altele utilizarea ca substrat a diferite substane, producia de indol sau hidrogen sulfurat, etc. Mediile politrope pun n eviden activitatea enzimatic bacterian indirect, prin identificarea metaboliilor rezultai. Mediul Simmons citrat. Mediul conine citrat de amoniu sau sodiu cristaliza. Mediul este solid, are culoare verde nchis, se toarn nclinat i se nsmneaz prin haurare cu ansa. Bacteriile care utilizeaz citratul drept surs de carbon vor duce la virarea culorii mediului n verde. Salmonelele sunt citrat pozitive. Mediul TSI (triple sugar iron). Mediul conineglucoz, lactoz, sucroz i sulfat feros. Mediul se solidific n poziie nclinat, astfel nct s aib o poriune inferioar, vertical i una superioar, nclinat. Poriunea vertical se nsmneaz prin nepare iar cea nclinat prin haurare. Mediul nensmnat are culoarea rou nchis. Fermentarea glucozei: se consider pozitiv dac n poriunea dreapt culoarea mediului vireaz n galben; dac fermentarea s-a realizat cu producie de gaz, se observ n masa mediului bule de gaz sau chiar detaarea mediului de la fundul tubului. Reacia este negativ n absena acestor modificri. Salmonelele sunt glucoz pozitive.

Fermentarea lactozei: este pozitiv dac culoarea suprafaei nclinate a mediului vireaz n galben i negativ, dac aceasta rmne roie. Salmonelele sunt lactozo-negative. Producia de hidrogen sulfurat: este pozitiv dac mediul se nnegrete la limita de separare ntre cele dou poriuni. Producia de hidrogen sulfurat mai poate fi estimat cu ajutorul benzilor de hrtie mbibate cu acetat de plumb. Benzile se fixeaz imediat dup nsmnare, cu ajutorul dopului de vat, astfel nct s fie la un centimetru distan de poriunea vertical. n prezena hidrogenului sulfurat, acesta trece n sulfur de plumb, de culoare neagr. Salmonelele sunt hidrogen sulfurat pozitive. Mediul MILF (mobilitate, indol, lizindecarboxilaz, fenilalanindezaminaz). Mediul conine glucoz, L-lizin, DL-triptofan, DL-fenilalanin, bromcrezolpurpur ca indicator de pH. Este un mediu solid, se toarn sub form de coloan i are culoare mov-cenuie. Se nsmneaz prin nepare. Mobilitatea: Se apreciaz prin apariia turbiditii n toat masa mediului. Bacteriile imobile cresc doar pe traiectul nepturii. Salmonelele, cu excepia S. pullorum-gallinarum sunt mobile. Producia de indol: Reacia indolului se apreciaz cu ajutorul benzii pentru indol, impregnat cu para-dimetil-amino-benzaldehid, de culoare galben. n prezena indolului, banda se nroete. Salmonelele sunt indol negative. Producerea de fenilalanindezaminaz: la suprafaa mediului se adaug cteva picturi de soluie de clorur feric 10%. Dac testul este pozitiv, culoarea galben a reactivului vireaz n verde. Salmonelele sunt fenialanin-dezaminaz negative. Testul lizindecarboxilazei: n prezena lizindecarboxilazei, lizina din compoziia mediului trece n cadaverin, care duce la colorarea mediului n violet, prin pierderea gruprii carboxilice (alcalinizare). Dac reacia este negativ (absena lizindecarboxilazei), culoarea mediului vireaz n galben, acidul carbonic rezultat din metabolizarea glucozei din mediu produce o acidifiere care nu este tamponat de cadaverin. Salmonelele sunt pozitive. Mediul MIU (mobilitate, indol, ureaz). Permite aprecierea mobilitii, producia de indol i pe aceea de ureaz.

Schema de izolare i identificare a germenilor Enterobacteriaceaelor (dup Blbie i Pozsgi, 1985, modificat) Urin Snge Mduv osoas Punctate aseptice Colecii nchise Tampoane plgi Hc Agar simplu 2% Agar snge Izolare B.Gram Geloz snge Materii fecale Bil Probe necroptice Alimente suspecte Lichide de vom Medii de mbogire Kauffmann-Muller Selenit Medii selective Leifson Wilson-Blair Istrati-Meitert

Prelevat

Urocultur cant.

COLONII SUSPECTE

SUSPENSIE DENS SISTEME MULTITEST I D E N T I F I C A R B I O C H I M I C Medii multitest TSI MILF MIU Simmons SISTEME MICROTEST Enterotube API Minitek Enterotek Discuri impregnate ncadrare gen/specie Colonii suspecte direct Lam Tub Bacteriofagic Bacteriocinic Biochimic (biotip) ncadrare de tip Medii simple

SEROLOGIC

TIPIZARE

Conine uree, glucoz i rou fenol ca indicator de pH. Mediul este galben maroniu transparent, se toarn sub form de coloan i se nsmneaz prin nepare. Mobilitatea: ca i pe mediul MILF. Producia de indol: se poate aprecia cu band de indol sau picurnd la suprafaa mediului cteva picturi de reactiv Ehrlich-Kovacs. Acest reactiv are culoare maronie, care n prezena indolului vireaz n rou-viiniu. Producia de ureaz: n caz de reacie pozitiv, datorit descompunerii ureei cu eliberare de amoniac, culoarea mediului vireaz n rou. Dac bacteria nu produce ureaz, culoarea mediului vireaz n galben. Salmonelele nu hidrolizeaz ureea. EXAMENE SEROLOGICE Testele serologie se folosesc n diagnosticul salmonelozei fie pentru identificarea salmonelelor izolate din materialele patologice (tipizarea serologic) fie n scopul depistrii i cuantificrii anticorpilor antisalmonelici la animalele bolnave sau trecute prin boal (RSAR, RAL). Tipizarea serologic. Structura antigenic a salmonelelor. Antigenele somatice O constituie baza clasificrii salmonelelor conform schemei Kauffmann-Mller. Aceste antigene sunt termostabile, alcoolorezistente, reprezentate de complexul lipopoliglucidic din membrana extern a peretelui celular. Aglutinarea acestor antigene are aspect granular. Ele pot fi majore, de serogrup i minore, comune mai multor grupe serologice. Antigenele de suprafa Visunt termolabile, dar insensibile la alcool i formol, este prezent doar la trei serotipuri S.typhi, S. paratyphi i S. dublin. Fiind situat la exteriorul antigenului somatic, l mascheaz i mpiedic aglutinarea cu seruri anti O. Antigenele flagelare H sunt termolabile, de natur proteic, alcoolosensibile. Aglutinarea H are aspect floconos i nu este inhibat de formol. Marea majoritate a salmonelelor pot produce alternativ dou categorii de antigene H (variaie de faz).

Materiale necesare: cultura bacterian de identificat, seruri antisalmonelice polivalent, de grup (B, C, D, E), anti Vi, de faz (anti H), lame de sticl, ser fiziologic, ans bacteriologic. Tehnica de lucru: pe lama bine degresat se face o suspensie bogat (dar fr grunju) din cultura bacterian pe agar. Se adaug o pictur de ser antisalmonelic polivalent, se amestec cele dou picturi i se urmrete apariia reaciei de aglutinare n decurs de 1-3 minute. Dac bacteria respectiv este o salmonel, vor apare treptat grunji de culoare albicioas, cu limpezirea consecutiv a amestecului. Pentru a evita erorile provocate de eventuala aglutinare spontan a culturii n ser fiziologic, se efectueaz n paralel o suspensie n ser fiziologic fr a aduga ser aglutinant. Dac reacia este negativ i totui datele epidemiologice, clinice anatomo-patologice indic o salmoneloz, se efectueaz i aglutinarea cu serul anti Vi. Prin aceeai tehnic se determin apartenena la serogrup, folosind serurile anti B, C, D, etc. iar apoi specia, cu utilizarea serurilor anti H. Tehnica de aglutinare rapid pe lam pentru identificarea anticorpilor antisalmonelici. Se efectueaz ndeosebi n supravegherea i diagnosticul salmonelozelor aviare, la gini n vrst de 16-24 sptmni cu repetare la 36-44 i 56-64 sptmni. Poate fi realizat n dou variante de lucru: cu snge integral sau cu ser sanguin. Aglutinarea rapid pe lam folosind snge integral. Este tehnica cu cea mai larg aplicabilitate n practica veterinar de teren. Materiale necesare: Testul se efectueaz ntr-o ncpere nchis, fr cureni de aer sau praf, n care temperatura trebuie s fie de 18-20C. Se folosesc: lame de sticl bine degresate, anse bacteriologice cu diametrul ochiului ansei de 3 mm, o susr de foc (bec de gaz, lamp de spirt) pentru flambarea ansei, un pahar cu ap pentru splarea ansei nainte de flambare, pipete Pasteur sau o sering cu ac fin pentru dozarea antigenului, vat i alcool pentru dezinfecie, foarfec, spatul pentru cauterizarea crestei dup recoltarea sngelui, antigen pullorum (suspensie de corpi bacterieni, inactivat prin formol), cuti pentru izolarea psrilor seropozitive.

Tehnica de lucru: Pe o lam de sticl se pun trei picturi de antigen la distan aproximativ 2 cm una de alta. Se dezinfecteaz creasta psrii, apoi se secioneaz vrful unui caruncul, se las s se scurg primele 2-3 picturi de snge i cu ansa, se recolteaz o pictur, care va fi omogenizat cu una din picturile de antigen de pe lam. Creasta se cauterizeaz cu spatula nclzit pentru a evita hemoragia i canibalismul. Operaiunea se repet pentru fiecare pasre. Ansa se spal i se flambeaz dup fiecare utilizare. Se urmrete apariia reaciei de aglutinare. Reacia se consider pozitiv atunci cnd apar grunji de culoare albicioas (a nu se confunda cu evntuali grunji de culoare roie rezultai prin hemaglutinare)i amestecul se limpezete ntr-o oarecare msur, dup trei minute sau mai repede. Grunjii cresc prin confluare la nclinri repetate ale lamei. Dac primii grunji ncep s apar la finele celor trei minute, reacia se repet, dublnd cantitatea de snge. Seroaglutinarea rapid pe lam. Tehnica de lucru este similar celei anterioare, cu deosebirea c se folosete ser n loc de snge integral. Interpretarea rezultatelor este mai facil, grunjii, chiar de dimensiuni mai mici fiind uor de oservat. Inconvenientul const n obinerea mai dificil a reaciei i manopere separate pentru recoltarea sngelui, obinerea serului i efectuarea reaciei. Toate probele pozitive la aglutinarea rapid vor fi testate prin aglutinarea lent n tuburi, care permite i stabilirea titrului de anticorpi. Reacia de aglutinare lent n tuburi (RAL). Aceast metod se aplic att pentru depistarea anticorpilor antisalmonelici la mamifere (n caz de avorturi) ct i la psri (tifo-puloroz sau paratifoze). Materiale necesare: tuburi de sticl pentru RAL, stative, pipete gradate sau automate pentru repartizarea reagenilor, ser fiziologic fenolat 5%o, pentru diluarea antigenului (n diagnosticul salmonelozelor aviare, diluia antigenului pullorum se face 1/20-1/50 dup titrul nscris pe flacon), termostat. Tehnica de lucru n salmonelozele aviare. Diluarea serului suspect se face direct n antigen, conform schemei de mai jos:

Tubul 1 2 3 4 5

Antigen (ml) 1,8 1 1 1 1

Serul de cercetat (ml) 0,2 din dil. din dil. din dil. din dil.

Diluia realizat 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160

1 1 1 1

ml ml ml ml

1/10 1/20 1/40 1/80

(Exemplu de calcul al diluiei pentru tubul 2: la 1 ml antigen se adaug un ml de amestec antigen 0,9 ml + ser 0,1 ml, presupunnd c n primul tub, serul s-a omogenizat; se obin astfel 0,1 ml ser la 2 ml amestec, deci diluia 0,1/2 total amestec, adic 1/20). Pentru fiecare serie de determinri se execut un martor pozitiv (folosind un ser sigur pozitiv) i un martor negativ (cu un ser sigur negativ). Seria de tuburi se incubeaz la termostat timp de 18-24 ore dup care se face citirea. Interpretarea se bazeaz pe mrimea i caracteristicile depozitului i limpezimea supernatantului. Aglutinarea total (depozit mare, supernatant perfect limpede) se noteaz ++++ (aglutinare 100%), depozit mai mic, supernatant foarte puin tulbure cu +++ (aglutinare 75%), etc. Rezultatul pozitiv se noteaz pentru prezena anticorpilor antisalmonela se noteaz cu cel puin ++++ sau +++. n salmonelozele abortigene titrul aglutinant care indic boala la cabaline este de 1/100 (dup unii autori, cel puin 1/600), 1/100 la ovine i de 1/50 la taurine. n salmonelozele aviare, se consider pozitive pentru prezena anticorpilor antisalmonela probele care dau aglutinare ++++ sau +++ la diluia 1/40, restul se elimin. Probele care dau rezultate pozitive pentru diluile de 1/160-1/320 indic infecii cu latente cu S. pullorum, infecii cronice cu S. gallinarum sau salmonele mobile de grup D. Titre de 1/40-1/80 se ntlnesc n infecii latente cu alte serotipuri de salmonele mobile sau aglutinri ncruciate. Lotul este considerat indemn doar dac examene bacteriologice din secreiile urogenitale i examenele serologice dau rezultate negative. Pentru depistarea psrilor purttoare de salmonele se pot utiliza i vitelusul din ou provenite de la aceste psri.