Determinarea vitaminei C din sucurile de fructe prin cromatografia lichidă de înaltă performanță ( HPLC )

Vitamina C, acidul ascorbic, este un acid organic cu proprietăţi antioxidante, implicat într-o serie de procese care se desfăşoară în celulele vii. În organismul uman vitamina C deţine un rol complex şi important; protejează compuşii biologic activi de degradări oxidative, întăreşte sistemul imunitar, stimulează procesele de biosinteză a colagenului, hormonilor steroidici şi a unor neurotransmiţători. Doza de 10 mg/zi previne avitaminoza C, însă raţia zilnică recomandată pentru un adult este de 60 mg. Lipsa vitaminei C din organism conduce la scorbut, denumită şi boala marinarilor, caracterizată prin gingivite (gingii cavernoase şi inflamate), paradontoze, pierderea dinţilor, vase de sânge fragile, neelastice, inflamarea articulaţiilor şi anemie.Sub denumirea de vitamina C este, de fapt, cunoscut izomerul levo al acidului ascorbic.

Vitamina C este o substanţă usor oxidabilă, degradarea sa fiind accelerată de căldură,lumină şi de prezenţa cationilor metalelor grele. Pierderile de acid ascorbic ce au loc în decursul procedeelor tehnologice ce sunt parte a procesării sucurilor de fructe, pot depăşi 50%. Din acest motiv,adeseori,fabricanţii adaugă vitamina C pentru a îmbunătăţi valoarea nutritivă şi de a prelungi timpul de viaţă al produselor.Metodele de determinare a conţinutului de acid ascorbic sunt diverse, toate bazându-se pe caracterul reducător al analitului. Cele mai cunoscute sunt metodele titrimetrice bazate pe titrare cu o soluţie oxidantă (diclorofenol indofenol, iodat de potasiu sau bromat de potasiu)cromatografice (HPLC), fluorimetrice sau amperometrice, bazate pe biosenzori.In special,metodele cromatografice sunt foarte eficiente in determinarea acidului ascorbic prin analiza cantitativa a materialelor complexe,cum ar fi sucurile de fructe, legume si bauturile.

Prin această metodă se pot separa,identifica si cuantifica majoritatea acizilor organici din sucurile naturale de fructe folosind HPLC ,care va identifica compuşii, nu doar cu timpii lor de retenţie,ci şi cu spectrele lor individuale.

Materiale și metode

Sucul de citrice se centrifughează la 3000 de rotaţii timp de 10 minute ,iar supernantantul se diluează în raport 1:50 pentru determinarea acidului citric şi în raport 1:5 pentru alţi acizi.Diluţiile sunt filtrate printr-o membrană înainte de injectare.Se analizează 2 eşantioane în duplicat.

Se prepară o soluţie standard mixtă ce conţine 1000mg/l acid citric,2000mg/l acid malic ,300mg/l acid oxalic si acid ascorbic ,700mg/l acid tartric şi 400mg/l acid lactic.Soluţia standard si diluţiile corespunzatoare sunt preparate cu apă distilată şi sunt păstrate în locuri întunecoase ,la temperatură joasă (+4oC).

Analiza HPLC

Acizii organici din probe sunt separaţi prin cromatografie cu fază inversă ,şi determinaţi cu ajutorul absorbanţei,apoi cuantificaţi cu graficele de calibrare externe.Pentru detectarea simultană a 6 probe,detectorul este setat la lungimea de undă =254nm pentru acidul ascorbic şi =214nm pentru alţi acizi organici.

Timpii de reten ie,gradul de concentra ie si limita de detec ie pentruț ț ț acizi organici standard

Acizi organici (nm) Timp de retenție(min)

Grad de cocentrație(mg/l)

Limita de detecție(mg/l)

Acid oxalic 214 4,122 0,2-300 0,1Acid tartric 214 4,834 1-700 0,5Acid malic 214 6,186 20-2000 10Acid lactic 214 6,890 40-400 20Acid ascorbic 254 7,353 1-300 0,5Acid citric 214 12,538 16-1000 8,0

Determinările se fac la 10oC folosind o fază mobilă formată din soluţie de fosfat (se dizolvă 6,8g dihidrogenofosfat de potasiu în 900ml apă; pH-ul se ajustează cu acid fosforic până la pH=2,8 apoi se completează cu apă până la

1000 ml),ce se filtrează printr-o membrană de poliamidă şi este introdusă la vid.Rata de curgere a fazei mobile este de 0,7ml/min pentru toate separările cromatografice.Coloana de separare este echilibrată cu faza mobilă înainte ca linia de bază să se stabilizeze.La acest nivel se fac pipetări cu volume de 5 µl pentru fiecare probă preparată sau soluţie standard.

Valorile abaterilor standard relative variază de la 0,154 la 3,18% indicând că această metodă este precisă ,cu un grad mare de repetabilitate ,în special pentru acidul citric,ascorbic,lactic şi oxalic .Recuperarea acizilor organici din sucurile de citrice variază între 95,8 si 102,1% confirmând precizia de separare si condiţiile de analiză.

Această metodă contribuie la dezvoltarea procedurii HPLC,fiind rapidă şi precisă,pentru determinarea cantitativă a acizilor organici din sucurile de fructe,în condiţiile de fază inversă.Acizii oxalic,tartric,malic,lactic,citric şi ascorbic sunt determinaţi simultan şi eluate din coloană în timp de 20 de minute. Având în vedere uşurinţa şi concizia de pregătire a probei,această metodă poate fi considerată eficientă,precisă şi rapidă pentru determinarea acizilor organici.Se mai pot folosi şi alte metode de determinare a vitaminei C, însă au anumite dezavantaje,consumă mult timp şi au reproductibilitate mai mică.