UNIVERSITATEA DE ŞTIIN łE AGRICOLE ŞI MEDICIN Ă VETERINAR Ă

CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORAL Ă

FACULTATEA DE MEDICIN Ǎ VETERINAR Ǎ

DANIELA ELENA C ĂLINA

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

CERCETĂRI IMUNOLOGICE ÎN TRICOFI łIA VI łEILOR ŞI APRECIERI PRIVIND IMUNOGENITATEA UNOR

VACCINURI ANTITRICOFITICE

Conducător ştiin Ńific

Prof. univ. dr. Gh. Răpuntean

CLUJ-NAPOCA

2009

REZUMAT

InvestigaŃiile realizate în cadrul tezei intitulată “Cercetări imunologice în tricofiŃia viŃeilor şi aprecieri privind imunogenitatea unor vaccinuri antitricofitice”, s-au desfăşurat în perioada 2005-2009 şi au avut ca principale obiective următoarele:

izolarea de tulpini în urma prelucrării unui număr semnificativ de probe, prelevate de la animale cu leziuni de tricofiŃie (cruste, scuame, fire de păr).

identificarea tulpinilor izolate pe baza caracterlor morfologice, culturale. modalitatea în care examenul microscopic se corelează cu cel cultural, aspect important pentru situaŃiile

în care pentru precizarea diagnosticului se dispune doar de examenul microscopic. stabilirea celor mai adecvate medii de cultură şi condiŃii de cultivare, care să permită dezvoltarea

acestor dermatofiŃi într-un interval cât mai scurt de timp, luând în considerare mediile de cultură descrise de literatură.

stabilirea capacităŃii imunizante a vaccinului “TRICHOBEN” prin verificarea toleranŃei locale şi generale; urmărirea evoluŃiei clinice a leziunilor după administrarea vaccinului.

verificarea capacităŃii de a induce sinteza de anticorpi în urma inoculării la animale de experienŃă (iepuri) a tulpini vaccinale supuse tratamentului cu ultrasunete (sonicare).

urmărirea în dinamică a anticorpilor anti-Trichophyton, determinaŃi prin reacŃia de imunodifuzie (tehnica Ouhterlony), atât la viŃei cu tricofiŃie dar şi la martori clinic sănătoşi.

stabilirea unei corelaŃi între reacŃiile de la imunodifuzie şi valoarea proteinelor totale (γ-globulinelor). monitorizarea valorilor parametrilor hematologici la animalele bolnave dar şi la cele fără leziuni. observarea aspectelor anatomo-clinice, histopatologice la animalele de laborator (modificări tisulare şi

elemente fungice la nivelul pielii cu leziuni). Teza redactată cuprinde 197 pagini şi este structurată în conformitate cu prevederile legale actuale în

două părŃi principale: prima parte intitulată „Studiu bibliografic”, cu 5 capitole cuprinde 51 de pagini şi reprezintă 25.89% din teză şi partea a doua denumită „Cercetări proprii ” are 10 capitole, extinsă pe 146 de pagini, reprezentând 74.11%.

În conŃinutul tezei există 82 de imagini foto şi 23 tabele, menite să sintetizeze rezultatele obŃinute şi să contribuie la o mai bună înŃelegere a aspectelor de ordin practic. Bibliografia selectată cuprinde 181 de titluri din literatura de specialitate autohtonă şi străină.

Prima parte, intitulată „Studiu bibliografic” , prezintă date legate de istoricul, taxonomia, eco-biologia şi patogeneza dermatofiŃilor; caracterele generale legate de morfologia, şi cultivarea speciilor de Trichophyton. Referitor la ecologia dermatofiŃilor din genul Trichophyton sunt prezentate specii care interesează atât oamenii cât şi rumegătorele de la care se face izolarea, precum şi distribuŃia lor. Biologia dermatofiŃilor se caracterizează printr-o viaŃă parazitară, ei dezvoltându-se în firele de păr sau alte structuri keratinizate la om şi animale; fie saprobiotă în sol sau pe medii de cultură. DermatofiŃii au tendinŃa de a se limita la nivelul straturilor cornoase ale pielii, precum şi la nivelul unghiilor şi părului. AcŃiunea patogenă determinată de Trichophyton este uneori însoŃită de alte ciuperci: Candida albicans, Aspergillus fumigatus care complică leziunile.

Genul Trichophyton cuprinde peste 20 de specii de dermatofiŃi antropofili, zoofili şi geofili, cu un areal extins de răspândire. Aspectul morfo-cultural este variabil, recunoscând particularităŃi de aspect şi de culoare în funcŃie de specia de dermatofit izolată.

În capitolul 2 al primei părŃi sunt prezentate câteva aspectele legate de importanŃa acestor dermatofiŃi atât în patologia umană cât şi în cea animală.

Modalitatea de apărare a organismelor afectate, inclusiv mecanismele imune au fost abordate, cu prezentarea detaliată a răspunsului imun mediat celular şi umoral. Caracterizarea sistemului imun la bovine prin descrierea organele limfoide primare/secundare şi a celulele implicate în răspunsul imun la bovine.

În finalul primei părŃi sunt prezentate câteva aspecte legate de profilaxie, combatere , cu descrierea unor formule terapeutice şi a vaccinurilor antitricofitice. Cercetările imunologice din ultimii ani au adus contribuŃii importante la cunoaşterea imunogenităŃii tulpinilor de Trichophyton, fiind produse vaccinuri care s-au dovedit a fi eficiente atât în prevenirea, cât şi în combaterea tricofiŃiei la bovine.

Partea a doua „Cercetări proprii ”, cuprinde 10 capitole, discuŃia generală a rezultatelor, concluziile finale şi bibliografia, cu prezentarea şi discuŃia rezultatelor investigaŃiilor efectuate.

În capitolul 6, intitulat „Aspecte privind caracterele morfologice ale dermatofi Ńilor din genul Trichophyton” au fost prezentate şi discutate rezultatele obŃinute la examenul microscopic al probelor recoltate (cruste, scuame, fire de păr) de la tineret şi bovine adulte; au fost descrise tehnicile de colorare speciale , a fost stabilită afinitatea tinctorială a acestor dermatofiŃi, şi au fost caracterizate structurile morfologice. Diagnosticul micologic în toate cazurile necesită efectuarea unor examene de laborator care permit examinarea directă a probelor recoltate, izolarea fungilor pe diferite medii de cultură dar şi identificarea morfologică, biologică.

Pentru diagnosticul microscopic (preparate native şi colorate) s-au luat în considerare un număr de 318 probe, 88 de la bovine adulte şi 230 probe de la viŃei de 3-6 luni. De la toate animalele cu leziuni din loturile

prezentate anterior s-au prelevat probe de cruste, scuame şi fire de păr. Raclarea s-a făcut de la marginea leziunii, pornind de la limita aparent sănătoasă a pielii insistându-se până la apariŃia unei serozităŃi roz-roşietică.

Numărul de probe investighate microscopic pentru evidenŃierea dermatofiŃilor din genul Trichophyton pentru cazurile din cele patru ferme din arealul Cluj-Napoca sunt prezentate în tabelul nr. 1.

Numărul total şi provenienŃa probelor recoltate Tabel nr.1

ProvenienŃa probelor examinate Numărul total de probe

Ferma Jucu Ferma Berind Ferma Cojocna SDE Cojocna

318 135 72 52 59

Probe recoltate de la tineret

97 55 34 44

Probe recoltate de la adulte

38 17 18 15

La examenul microscopic al dermatofiŃilor s-au urmărit îndeosebi evidenŃierea elemente morfologice:

macroconidii, microconidii, clamidosporii, micelii şi organele nodulare, prin utilizarea soluŃiilor clarificatoare, lactofenolul şi soluŃia Lügol dar şi prin colorarea frotiurilor utilizând diferite tehnici: metoda Giemsa, Gram, albastru de toluidină. Rezultatele cele mai bune în cadrul examenului microscopic au fost obŃinute în cazul utilizări soluŃiei Lügol şi a coloraŃiei cu albastru de toluidină (metoda prelungită pâna la 10 minute), permiŃând evidenŃierea optimă a elementelor structurale.

La examenul microscopic al preparatelor native şi colorate s-a observat prezenŃa unor hife ramificate; rare macroconidii septate transversal şi a numeroşi spori dispuşi în grămezi în jurul firului de păr (Fig. 2, 3).

În cele 4 biotopuri din fermele luate în studiu din numărul total de 318 probe examinate microscopic, probele pozitive au reprezentat un număr de 217, ceea ce reprezintă un procent de 68,23%, în timp ce numărul probelor negative a atins valoarea de 101, adică 31,76%.

Din totalul probelor recoltate, cele pozitive sunt în număr de 217 astfel: probele din zona perioculară 102 (64,16%); zona peribucală 17 (70,84%); laturile gâtului 34 (69,39%) şi zona toracală 64 (74,42%). Probele negative la examenul microscopic au provenit din: zona perioculară 57(35,84%); zona peribucală 7 (29,16%); laturile gâtului 15 (30,61%); zona toracală 22 (25,58%) (Fig. 1).

86

49

24

159

17

102

34

6457

715

22

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Zona perioculara Zona peribucala Laturile gatului Zona toracala

Num

ar p

robe

exa

min

ate

Total Pozitive Negative

Fig. 1, Numărul total de probe, probele pozitive şi negative pentru cele patru zone corporale

evaluate în arealulurile geografice

Prin cunoaşterea particularităŃilor structurale microscopice, ne putem da seama de substratul morfologic al funcŃiilor esenŃiale ale fungilor; acestea asigură o mai bună înŃelegere a proceselor patogenetice, specifice

dermatofiŃilor.

Fig. 2, Artrospori - examen direct cu soluŃie Lügol

(Ob.40x) Fig. 3, Hife şi microconidii, izolate din leziuni

coloraŃia Giemsa

În capitolul 7, intitulat „ConsideraŃii privind izolarea şi caracterele culturale ale dermatofiŃilor din genul Trichophyton”, sunt descrise cele mai adecvate medii de cultură care permit dezvoltarea facilă a acestor dermatofiŃi, precum şi diferenŃierea lor de alte microorganisme. Întrucât examenul microscopic nu permite de fiecare dată identificarea acestor dermatofiŃi direct din materialul patologic, un pas deosebit de important care s-a impus a fi urmat în vederea confirmării diagnosticului, a fost realizarea examenului cultural. Cultivarea este de mare ajutor pentru microscopia directă şi este esenŃială cel puŃin în toate infecŃiile localizate la nivelul Ńesuturilor keratinizate, precum şi în orice alte infecŃii ce urmează a fi supuse unui tratament pe cale generală. Sunt menŃionate comparativ caracterele culturale ale dermatofi Ńilor pe medii selective: Sabouraud dextroză îmbogăŃit cu tiamină-gentamicină şi DTM, evidenŃiind cu precădere acele aspecte care fac posibilă diferenŃierea facilă a speciilor din genul Trichophyton.

După însămânŃare probele s-au incubat în paralel la temperatura de 30°C şi 37°C, în condiŃii aerobe. Pe mediile de cultură amintite anterior, speciile de Trichophyton s-au dezvoltat bine, întrucât culturile, pe mediile solide (constituirea coloniilor) au fost evidenŃiate chiar după câteva zile. Prin păstrarea plăcilor timp de mai multe zile, aspectele culturale câştigă unele particularităŃi în baza cărora speciile de Trichophyton pot fi identificate, dar şi diferenŃiate de alte microorganisme.

La examenul cultural pe mediile solide după 10 zile s-a observat dezvoltarea coloniilor, iniŃial de dimensiuni mici, crescând în dimensiuni în zilele următoare. La examinarea cu ochiul liber coloniile au avut un diametru de cca 10-12 mm, margini neregulate, cu o excrescenŃă în zona centrală, culoare albă- cenusie, glabre. S-a observat totuşi o creştere mai rapidă prin cultivarea probelor recoltate pe DTM şi pe Sabouraud cu dextroză cu adaous de tiamină şi incubarea plăcilor la termostat la 30°C (Fig. 4, 5).

Fig. 4, Colonii de Trichophyton verrucosum,

mediul Sabouraud dextroză - avers Fig. 5, Colonii de Trichophyton verrucosum,

mediul Sabouraud dextroză - revers

În timpul experimentului am semnalat la doi din membri echipei, leziuni de tricofiŃie, cu placarde tipice localizate iniŃial la nivelul antebraŃului apoi s-au extins şi la nivelul gâtului. S-au recoltat cruste care au fost însămânŃate pe mediul gelozat cu cloramfenicol (Fig. 6, 7).

Fig. 6, TricofiŃie la om

Leziune tipică Fig. 7, Colonii de T. verrucosum, tulpină izolată

de la om-mediul gelozat cu cloramfenicol Trebuie menŃionat faptul că există o strânsă corelaŃie între rezultatele examenului microscopic şi a celui cultural, existând totuşi situaŃii în care izolarea miceŃilor pe mediile de cultură nu a fost însoŃită şi de evidenŃierea lor microscopică sau invers. Utilizând testul „t” pentru a compara rezultatele examenului microscopic şi a celui cultural, după cum reiese din figura 8, valoarea t>0,05. În consecinŃă corelaŃia dintre cele două variante, nu poate fi considerată semnificativă din punct de vedere statistic.

112121

5142

3429

20 18

0

20

40

60

80

100

120

140

Pro

cent

ul d

e pr

obe

pozi

tive

Ferma 1 Ferma 2 Ferma 3 Ferma 4

Probe pozitive microscopic Probe pozitive cultural

Fig. 8, SituaŃia comparativă dintre probele pozitive microscopic şi cultural pentru cele patru ferme

În capitolul 8, intitulat „Stabilirea capacităŃii imunizante a vaccinurilor antitricofitice prin administrare la tineret bovin şi bovine adulte, în condiŃii de fermă” s-a urmărit verificarea toleranŃei locale şi generale; evoluŃia leziunilor clinice după administrarea vaccinului Trichoben MenŃionăm că în cercetările de laborator (examen bacterioscopic şi bacteriologic) am luat în studiu şi un vaccin de producŃie românească numit Tricovac, produs de Institutul Pasteur.Vaccinul pentru testare este preparat dintr-o tulpină de Trichophyton verrucosum, conŃinând minimum 2,5 x 106 elemente structurale, dispersate într-un mediu liofilizat. Cercetările realizate cu privire la testarea clinică a vaccinului Trichoben prin administrarea în condiŃii de fermă au relevat următoarele aspecte:

viŃeii vaccinaŃi în scop terapeutic cu doza de 5 ml (corespunzătoare vârstei de 3 săptămâni-3 luni) au prezentat o tendinŃă de vindecare a leziunilor încă după prima administrare a vaccinului. La animalele care nu au manifestat clinic tricofiŃie, după aproximativ 10 zile de la vaccinare, au apărut la locul de inoculare o placardă tricofitică cu diametru de 3-4 cm, care în termen de 5-6 zile a început să regreseze. La 28 de zile de la administrarea vaccinului s-a observat regresia leziunilor de hipercheratoză cu subŃierea crustelor şi regenerarea firelor de păr. Vindecarea leziunilor începe de la trenul posterior, cel mai greu se vindecă leziunile cu localizare perioculară (Fig. 9, 10, 11, 12).

viŃeii vaccinaŃi în scop preventiv cu doza de 5 ml (corespunzătoare vârstei de 3 -6 luni) nu au prezentat reacŃii post vaccinale la locul de inoculare al vaccinului.

vindecarea leziunilor a depins foarte mult de o serie de factorii: îmbunătăŃirea condiŃiilor de întreŃinere şi alimentaŃie, izolarea animalelor afectate, respectarea protocolului şi a dozelor de vaccinare corespunzătoare vârstei dar şi a stadiului boli.

Fig. 9, Localizare perioculară - leziuni multiple,

rotunde, stadiul de crustizare (înainte de vaccinare)

Fig. 10, Faza de regresie a leziunilor, la 14 zile de la prima administrare a vaccinului

Fig. 11, Faza de vindecare a leziunilor, în urma administrării a două doze de vaccin antitricofitic

Fig.12, ViŃei în fază de vindecare după leziuni de tricofiŃie generalizată

Metodele imunoprofilactice efectuate cu succes prin utilizarea vaccinurilor rămâne un pilon esenŃial de

control al acesteia. Cu toate acestea, sunt animale care nu sunt protejate de vaccinare. Se presupune că principalii factori responsabili pentru această situaŃie cuprind: proasta manipulare a tulpini vaccinale şi erori în aplicare, dar şi absenŃa protocoalelor de vaccinare continuă şi sistematică în ferme. În baza rezultatelor obŃinute la testarea clinică, apreciem că vaccinarea antitricofitică poate fi utilizată în Ńara noastră pentru prevenirea şi tratamentul tricofiŃiei la bovine, chiar în formele generalizate de boală.

În capitolul 9 „Cercetări privind produc Ńia de anticorpi anti-Trichophyton prin hiperimunizarea iepurilor” se prezintă capacitatea antigenului vaccinal obŃinut prin tratarea cu ultrasunete a vaccinului comercial Trichoben, de a induce un răspuns imun, consecutiv administrării succesive şi în cantităŃi crescânde la iepuri. Înainte de a fi sonicat vaccinul a fost supus examenului bacterioscopic şi bacteriologic pe mediul Sabouraud-dextroză şi DTM, dar şi după fiecare moment al sonicări. Suspensia obŃinută în urma sonicării a fost apoi repartizată câte 4 ml în tuburi sterile şi apoi s-a centrifugat la 2500 turaŃii/minut, timp de 15 minute. Supernatantul obŃinut şi-a păstrat aspectul lactescent iniŃial şi a fost testat pentru determinarea proteinelor totale. Cantitatea de proteină totală a supernatantului a fost de 0,4g/dl. Tulpina vaccinală sonicată s-a folosit la inocularea iepurilor şi s-a utilizat ca antigen în reacŃia de imunodifuzie. Probele de ser au fost prelucrate prin utilizarea dublei difuzi în gel de agar (tehnica Ouchterlony). În godeul central s-a pus antigenul (vaccin Trichoben) şi apoi urmând o anumită direcŃie s-au plasat serurile de cercetat obŃinute după fiecare recoltare de sânge. Plăcile s-au introdus în microcamere umede, pentru a împiedica uscarea agarului. Interpretarea plăcilor s-a făcut în stare crudă la 24, 48 şi 72 de ore. Tulpina vaccinală pot fi inactivată sub acŃiunea ultrasunetelor, dar dezintegrarea ei se face într-un timp prelungit şi la puterea maximă a aparatului.

După prima inoculare nu s-au putut evidenŃia anticorpi la reacŃia de imunodifuzie în gel de agar. Sinteza imunoglobulinelor a fost demonstrată după primele 2 inoculări, numai la doi iepuri din lot, constatându-se apariŃia linilor de precipitare slab conturate la citirea la 24 h. La 72h linile de precipitare observate au fost mult mai evidente faŃă de cele de la 24h.

În imaginea ce urmează sunt prezentate liniile (arcurile) de precipitare, cu plasarea centrală a antigenului, şi a serurilor de testat în godeurile periferice (Fig. 13, 14).

Fig. 13, Dubla difuzie în gel de agar,

linii de precipitare Ag - antigen, S - ser pozitiv

Fig. 14, Dubla difuzie în gel de agar, linii de precipitare

Ag - antigen, S - ser pozitiv

ApariŃia linilor de precipitare în serul iepurilor semnifică activarea unor clone limfocitare specifice, având ca rezultat formarea mai multor clase de imunoglobuline, în cazul nostru imunoglobuline de tipIgG.

Produşii obŃinuŃi (serul hiperimun şi antigenele) pot fi utilizaŃi în activitatea practică curentă de diagnostic retrospectiv (identificarea anticorpilor specifici în serul animalelor bolnave) sau în caracterizarea structurilor antigenice identificabile la acest gen de microorganisme.

În capitolul 10, intitulat „Investigarea statusului imun umoral la viŃeii cu tricofi Ńie” s-a urmărit verificarea inducerii răspunsului imun prin detectarea anticorpilor anti-Trichophyton utilizând tehnici serologice (Ouchterlony); evoluŃia în dinamică a parametrilor imunologici la animalele vaccinate; stabilirea unei corelaŃii între reacŃiile de la imunodifuzie şi valoarea proteinelor totale (γ-globulinelor), dozarea lizozimului.

Cu toate că în ferme evolua tricofiŃia, iar unii din viŃeii luaŃi în studiu prezentau leziuni tricofitice, la probele de ser recoltate înainte de administrarea vaccinului nu s-au putut evidenŃia anticorpi la reacŃia de imunodifuzie în gel de agar. Aceasta presupune fie lipsa anticorpilor, fie că se găsesc în cantităŃi foarte reduse, nedecelabile prin reacŃia de imunodifuzie. La recoltarea 2 şi 3 s-au evidenŃiat liniile de precipitarea, reacŃie s-a accentuat la citirea făcută la 72 de ore când s-a observat prezenŃa liniilor duble de precipitare şi a fenomenului de comunitate antigenic (Fig. 15, 16).

Fig. 15, Aspectul liniilor de precipitare la recoltarea II,

Ag- antigen, S - ser pozitiv, SI - ser negativ, M - martor cu reacŃie pozitivă

Fig. 16, Aspectul liniilor de precipitare, recoltarea III, Ag- antigen, S - ser pozitiv,

M - martor cu reacŃie pozitivă

Rezultatele obŃinute la dubla imunodifuzie din cele 6 ferme luate în studiu sunt redate în fig. 17 şi 18:

S

S S

S

S

S

S S

S

S S S

Ag Ag

Ag Ag SI

S S

S

S M

5

7

5

0

0

2

45

128

67

52

15

57

50

135

72

52

15

59

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Gadalin

Jucu

Berind

Cojocna

Carmolimp

SDE Cojocna

Den

um

ire

ferm

a

numar probe examinate serologic

probe pozitive probe negative total probe

Fig. 17, Raportul dintre probele pozitive şi cele negative la controlul

efectuat înainte de vaccinare în cele 6 ferme

31

42

23

18

10

26

19

93

49

34

5

23

50

135

72

52

15

59

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Gadalin

Jucu

Berind

Cojocna

Carmolimp

SDE Cojocna

Den

um

ire

ferm

a

numar probe examinate serologic

probe pozitive probe negative total probe

Fig. 18, Raportul dintre probele pozitive şi cele negative la controlul efectuat după vaccinare în cele 6 ferme

Din analiza datelor obŃinute rezultă că în urma vaccinării vi Ńeilor cu Trichoben, se iniŃiază un răspuns

imun prin producerea de anticorpi specifici, care se pot evidenŃia prin reacŃia de imunodifuziune în gel de agar. Trebuie subliniat faptul că răspunsul imun al viŃeilor diferă ca intensitate de la o fermă la alta. Spre

exemplu a dat rezultate foarte bune în ferma din Cojocna şi Gădălin, unde viŃeii aveau o stare de întreŃinere bună şi a dar rezultate mai slabe în ferma Jucu, unde starea de întreŃinere a viŃeilor a fost necorespunzătoare. Chiar dacă nu toŃi viŃeii vaccinaŃi au răspuns printr-o reacŃie pozitivă, vaccinarea merită a fi luată în considerare ca o metodă de urmat, mai ales în fermele în care tratamentele clasice nu dau rezultate. Mai mult dacă vaccinările se practică preventiv, numărul indivizilor care fac boala este foarte scăzut, iar leziunile sunt slab exprimate şi au tendinŃa de vindecare.

Indiscutabil mecanismul răspunsului imun în tricofiŃia la bovine, mai prezintă încă necunoscute, iar structura antigenică a tulpinilor de Trichophyton trebuie descifrată, pentru a cunoaşte care dintre substanŃele componente are ce mai bună imunogenitate.

Anticorpii sunt proteine serice şi anume gamaglobuline. Grupul globulinelor de care aparŃin anticorpii a fost numit imunoglobuline. Prin cercetări fizico-chimice s-a ajuns la concluzia că anticorpii sunt tipuri de

globuline modificate în cursul răspunsului imun. În urma determinărilor efectuate au rezultat următoarele valori medii (raportat la proteina totală) la loturile de viŃeii bolnavi, comparativ cu cei sănătoşi (Tabel nr.2):

Valorile medii ale proteinelor totale la loturile de bovine cu tricofiŃie

(parametrii statistici; 103/mm3) Tabel nr.2

Lot experimental Lot martor Parametri calculati

Proteine g/dl

Albumine g/dl

γ Globuline g/dl

Proteine g/dl

Albumine g/dl

γ Globuline g/dl

Minim 4,38 1,88 0,8 4,64 2,23 0,75 Maxim 6,88 2,96 1,93 6,09 2,73 1,21 Media 5,92 2,48 1,22 5,56 2,52 1,01 Dev. St 0,72 0,37 0,33 0,58 0,2 0,16

Lizozimul conŃinut în probele biologice (ser sanguin) determină, în contact cu tulpina bacteriană

Micrococcus luteus, liza celulară cu clarificarea mediului de reacŃie. În urma măsurătorilor realizate şi a corelării valorilor cu concentraŃia lizozimului s-a observat că valorile medii ale acestui efector umoral sunt mai mici la lotul martor, comparativ cu lotul experimental la care s-a administrat vaccinul, la toate recoltările, cu mici diferenŃe dar care nu sunt semnificative statistic.

În capitolul 11, intitulat „Evaluarea statusului imun celular la viŃeii cu tricofi Ńie” pentru a se evidenŃia modalităŃile de reacŃie a organismului în urma vaccinări antitricofitice şi a se face o corelaŃie între aspectele clinice şi activitatea organelor hematopoetice, s-au prelevat probe de sânge fără anticoagulant în ziua 0, 14 şi 28 după vaccinare, efectuăndu-se următoarele determinări:

numărarea leucocitelor totale prin metoda cu lichide de diluŃie Tőrk utilizănd camera de numărat Bőrker- Tőrk dar s-a utilizat şi aparatul Abacus Junior Vet iar valorile au fost exprimate în 103/mm3;

numărarea eozinofilelor s-a făcut ca şi in cazul leucocitelor totale, utilizându-se aparatul Abacus Junior Vet, iar exprimarea s-a făcut în 103/mm3;

formula leucocitară ( exprimare procentuală), preparate colorate Panoptic şi May-Grünwald-Giemsa. Rezultatele obŃinute au fost prelucrate statistic în sistemul de operare Windows XP cu care s-au calculat:

media aritmetică şi deviaŃia standard; semnificaŃia statistică a diferenŃelor (testul „t”) dintre variante respectiv loturi.

Pe baza rezultatelor obŃinute la numărarea polimorfonuclearelor şi a limfocitelor respectiv monocitelor s-a întocmit tabelul nr. 3 ce conŃine media aritmetică a valorilor pe fiecare recoltare şi deviaŃia standard a acestora.

Valorile procentuale ale subpopulaŃiilor leucocitare la loturile de bovine

Tabel nr. 3 Lot experimental Martor Recoltări

N E B L M N E B L M

Media 38,8 5,06 0 54,2 1,9 37,6 9,2 0 51,2 2 Rec 1 Dev.st. 9,39 3,31 0 9,40 1,51 7,77 6,61 0 12,3 1,22 Media 33,8 4,6 0 59,4 2,1 37,4 6,8 0 53,8 2 Rec 2

Dev.st. 10,1 4,53 0 9,75 1,19 7,5 8,26 0 11,5 1,22 Media 40,6 3,8 0 53,2 2,33 40,6 2,2 0 55,6 1,6 Rec 3

Dev.st. 7,59 4,06 0 8,42 1,29 10,8 1,3 0 11,3 0,89

Rezultatele privind media aritmetică, deviaŃia standard ale leucocitelor totale în infecŃia cu

Trichophyton, după vaccinare la ambele loturi de animale sunt prezentate în figurile nr.19, 20.

38.8

33.8

40.6

5.06 4.6 3.8

54.2

59.4

53.2

1.9 2.1 2.33

0

10

20

30

40

50

60

Val

ori

le s

ubp

op

ula

tiilo

r le

uco

cita

re

Neutrofile Eozinofile Limfocite Monocite

Rec. I

Rec. II

Rec. III

Fig. 19, Dinamica subpopulaŃiilor leucocitare la lotul experimental de viŃei

37.637.4

40.6

9.26.8

2.2

51.259.4

53.2

2 2 1.6

0

10

20

30

40

50

60

Val

orile

sub

popu

latii

lor

leuc

ocita

re

Neut rof i le Eoz inof i le Limf oc it e Monoc it e

Rec. I

Rec. II

Rec. III

Fig. 20, Dinamica subpopulaŃiilor leucocitare la lotul martor de viŃei

Numărul total de leucocite a crescut în timpul infecŃiei, ceea ce confirmă existenŃa unui răspuns de

apărare din partea organismul care încearcă să stopeze agravarea leziunilor cutanate. Leucocitoza prezentă la loturile de viŃei a fost asociată cu limfocitoză, fapt ce poate reflecta o infecŃie sau un stress suferit de viŃeii din experiment.

Limfocitele intră în relaŃie cu antigenul (vaccinul “TRICHOBEN”), păstrează memoria contactului imunologic, iar la un nou contact cu acesta, se produc rapid clone de celule identice, sensibile faŃă de antigen, având loc o sinteză sporită de anticorpi. În capitolul 12, intitulat „ObservaŃii clinice şi histopatologice în infecŃia naturală cu dermatofiŃi la cobai” ne-am propus să identificăm modificările tisulare prezente la nivelul pielii lezionate şi aspectul elementelor fungice din frotiurile realizate.

Pielea are un număr limitat de posibilităŃi de a răspunde la numeroasele infecŃii la care este expusă, acest fapt este important de cunoscut deoarece anumite modificări histopatologice dezvoltate la nivel cutanat vor fi comune mai multor afecŃiuni. Diagnosticul histologic depinde de identificarea corectă a tipurilor de reacŃii ale pielii corelate cu aspectele micologice şi macroscopice de la nivelul leziunilor.

Biopsia cutanată s-a realizat de la marginea leziunilor obŃinându-se atât piele cu leziuni cât şi sănătoasă. SecŃiunile au fost colorate cu hematoxilină-eozină şi tricrom, coloraŃii ce au evidenŃiat foarte bine reacŃia tisulară.

În epiderm s-au evidenŃiat distrucŃii masive, cu întreruperi ale statului cornos până la distrugerea totală a acestuia. Din loc în loc epidermal este necrozat, acoperit de o crustă relative groasă formată din exsudate de natură fibrinoasă cu hematii, granulocite şi neutrofile. În Ńesutul conjunctiv epidermic se observă o discretă infiltraŃie cu granulocite şi eozinocite (Fig. 21).

În alte zone ale preparatului sub crustă, în papilele dermice se constată un infiltrat eritrocitar difuz, hemoragie şi rare elemente albe. Crusta este aderentă la epiteliu (Fig. 22).

Fig. 21, Crustă necrotico - exsudativă superficială; necroză epitelială, infiltrat discret

cu granulocite şi eozinofile în Ńesutul subiacent (Tricrom-Masson, 400x)

Fig. 22, Crustă aderentă la epiteliu, congestie şi hemoragii în dermul superficial, infiltrat cu neutrofile,

eozinofile şi limfocite în dermul profund, (Tricrom-Masson, 200x)

În zonele de reacŃie se remarcă o îngroşare a Ńesutului conjunctiv subepitelial, cu Ńesut tânăr cu

numeroase fibroblaste şi capilare de neoformaŃie (Fig. 23, 24).

Fig. 23, Proliferare vasculo - conjunctivă în derm;

capilare de neoformaŃie şi fibroblaste tinere (Tricrom-Masson 400x)

Fig. 24, Proliferare vasculo - conjunctivă în derm; fibroblaste tinere (săgeată)

şi vase de neoformaŃie (Tricrom-Masson 200x)

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCE AND VETERINARY M EDICINE

CLUJ-NAPOCA

DOCTORAL SCHOOL

FACULTY OF VETERINARY MEDICINE

DANIELA ELENA C ĂLINA

SUMMARY OF THE Ph-D THESIS

IMMUNOLOGICAL RESCARCHES IN CALVES RINGWORM AND STUDIES REGARDING

ANTI-RINGWORM VACCINES IMMUNOGENITY

Scientific coordinator

Prof. dr. Gh. Răpuntean, PhD

CLUJ-NAPOCA

2009

SUMMARY

The investigations conducted under the thesis „Immunological researches in cattle ringworm and studies regarding anti-ringworm vaccines immunogenity” was performed between the period of 2005-2009 and had as main objectives:

strains isolation as succession of meaningful number samples examination obtained from animals that presented lesions caused by Trichophyton and also from those who were clinically healthy (crusts, scales and hair).

identifying the strains, based on their morphology and cultural character. the possibility to microscopic exam is correlated with cultural, important for situations where the

diagnosis has to specify only the microscopic exam. establishing the most adequate growth mediums and the conditions that will enable this dermatophytes

to develop in the briefest time possible, taking into consideration the culture mediums offered by literature

determinating the immunizing capacity of the „Trichoben” vaccine by investigation of the local tolerability and the general one; examining the clinical evolution of the lesions after administrating the vaccine

assessing the capacity to induce antibodies in testing animals (rabbit), after the inoculation of the vaccine strain, submitted to treatment with ultrasounds (sonication).

following the dynamics of the antibodies anti-Trichophyton, determined by the immunodiffusion reaction (Ouchterlony); this will be followed both in calves with ringworm and in clinically healthy ones.

establishing a correlation between the immunodiffusion reaction and the total protein values (gamaglobulins).

monitor the hematological values of both the sick and healthy animals. studying the anatomic, clinical, histopathological changes in the laboratory animals (tisulary changes

and fungic elements near the skin lesions). The following thesis contains 197 pages and it is structured according to the current legal provisions in

two main parts: the first one entitled “Bibliographic studies”, contains 51 pages structured on 5 chapters an it represents 25.89% of the thesis. The second part „Personal research” has 146 pages, structured on 10 chapters, representing 74.11%. Inside the thesis are 82 photos and 23 charts, designed to help synthesize the results and contribute to a better understanding of the practical aspects. The Bibliography contains 181 titles of literature from the country and foreign.

The first part, entitled „Bibliographic studies” presents information about the history, taxonomy, biology and pathogenesis of the dermatophytes. Also it contains details about the morphology and cultivation of the Trichophyton species. Concerning the ecology of the dermatophytes, there are presented the species treatening to men and the animals from whom they can be isolated. The biology of Trichophyton is characterized by a parasitary or a saphrobiotic life, mainly in the soil on growth mediums. As parasites they are found through the hair are on other keratinized tissues in men and animals. The dermatophytes have the tendency to remain in the superficial structures of the skin or on the hair or nails. The pathogenic action of Trichophyton it is accompanied by other mycosis: Candida albicans, Aspergillus fumigatus: that complicates the lesions.

The genus Trichophyton contains more then 20 species of antropophil, zoophil and geophil dermatophytes, extended on large territories. The morphological and cultural aspects, vary according to the species of dermatophytes.

In the second chapter of the first part are presented a few aspects regarding the importance of these parasites both in human and animal pathology. The possibility of defense in the affected organisms, including the immune mechanism were approached, with a detailed presentation of the cellular and humoral mediated immune response.

A characterization of the bovine immune system was realized, including the description of the primary/secondary lymphoide organs and of the cells involved in the immune response.

In the ending of the the first part, there are presented a few aspects regarding profilaxy and control, with the description of some therapeutic schemes and vaccines against ringworm. The immunologic research from last years have brought important contributions understanding the immunogenicity of the Trichophyton strains; a whole series of vaccines were developed, that proved to be efficient in both prevention and control of this dermatophytosis in cattel.

The second part „Personal research” contains 10 chapters including a general discussion of the results, final conclusions and bibliography.

In the sixth chapter, entitled „Aspects regarding of morphological characterization dermatophytes from genus Trichophyton”, were presented and discussed the results obtained at the microscopic exam of the samples collected (crusts, scales and hair) from young and adults; there are described staining techniques, it was

established the tinctorial affinity and are described the morphological structures. The mycological diagnosis in all cases requires laboratory exams that will allow the direct examination of the samples collected and also the isolation of the fungi and different culture mediums.

For the microscopic diagnosis (native and colored preparations) were taken in consideration 318 samples, 88 from bovine and 230 samples from calves of 3 to 6th months. From all the animals with lesions were collected crusts, scales and hair samples. The raclation of the sections was made at the edges of the lesion, right before the healthy part, insisting until a pink-reddish serosity appeared.

The number of samples used in the microscopic investigation of the dermatophytes from the cases found in the four farms near Cluj-Napoca are presented in the no 1 chart.

Total number and location of taken samples Chart 1

Origin of the examined samples Total samples number

Jucu Berind Cojocna SDE Cojocna

318 135 72 52 59

Samples collected from young 97 55 34 44

Samples collected from adult 38 17 18 15

At the microscopic exam of the dermatophytes it was followed the identification of morphological

forms such as: macroconidia, microconidia, chlamidospores. There were used clarifying solutions, lactophenol and Lügol’s solution and also, the smears were coloured using different staining protocols: Giemsa, Gram and with toluidine blue. The best results have been achieved using Lügol’s solution and the staining with toluidine blue (the protocol was extended up to 10 minutes) allowing the optimal visibility of the structural elements.

At the microscopic exam using native preparations it was observed the presence of ramificated hyphae, rare transversally septated macrocondia and numerous spores disposed in heaps along the hair. From the colored smears it was observed the same structures coloured different, according to the protocol used and the density of the structures (Fig. 2, 3).

In the four biotopes of the farms used in the study, from the total of 318 samples examined microscopically, 217 were positive, meaning a percent of 68,24%, while 101 where negative representing a percent of 31,76. From the total of 217 samples the positive ones were collected from: 102 samples (64,16%) from the periocular region, 17 (70,84%) from the mouth regions, 34 (69,39%) from sides of the neck and 64 (74,42%) from the thoracic region. The negative samples were divided in the following regions: 57 (35,84%) periocular, 7 (29,16%) around the mouth, 15 (30,61%) on the sides of the neck, 22 (25,58%) on the thoracic region (Fig. 1).

22

15

7

57

17

102

34

64

159

24

49

86

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Periocular area

Around the mouth

Neck sides

Thoracic area

Th

e b

od

y ar

eas

exam

ined

samples number

Negative Positive Total samples

Fig. 1, The total number, positive and negative number of samples for the four body

considered in geographical areas

By knowing the microscopic structural particularities, we can understand the morphologic essence of the fungi functions, which assures a better understanding of the pathogenic processes, characteristic of the dermatophytes.

Fig. 2, Arthospores - direct microscopy with Lügol

solution (Ob. 40x) Fig. 3, Hyphae and microconidi, isolated from lesions

Giemsa stain (Ob. 100x)

In the seventh chapter entitled „Considerations regarding of isolation and cultural characters dermatophytes from genus Trichophyton” are descriebed the most adequate culture mediums that allow an easy growth of the dermatophytes and also an easy differentiation of the microorganisms. Since the microscopic examination doesn’t always allow us to identify the dermatophytes directly from the pathological material, a very important step in the process of the diagnosis is the cultural exam. The cultivation is of a great help for the direct microscopy an it is essential in all the infections of the keratinized tissues and of those who are subjected to general treatment. There are mentioned comparatively the cultural characteristics of the selective mediums: Sabouraud-dextrose agar enriched with tiamin-gentamicin and DTM, emphasizing those aspects which make iti possible to differentiate the species.

After insemination, the samples were incubated in parallel at the temperature of 30 degrees and 37 degrees in aerobic conditions. The Trichophyton species developed very well because in just a few days the cultures on the solid mediums were discernable. By keeping the Petri dishes for a long time, the cultural aspects developed better gaining a few characteristic which enables us to identify the genre and differentiate it from other microorganisms.

After 10 days, at the cultural exam on solid mediums it was observed the development of the colonies, initially of small proportions and then growing in size the following days. With the naked eye it was observed that the colonies had a diameter of approximately 10-12 mm, irregular edges, with a central white-greyish colour. It was observed a faster growth by cultivating the samples on DTM and Sabouraud-dextrose enriched with thiamin and incubating the Petri dishes at 30 degrees (Fig. 4,5).

Fig. 4, Trichophyton verrucosum colonies - front

Sabouraud dextrose agar Fig. 5, Trichophyton verrucosum colonies - reverse

Sabouraud dextrose agar

During the experiment, two of the crew members presented lesions typical ringworms initially on their forearm and then spreading to the arm and neck. There were prelevated samples which were then inseminated on medium with cloramfenicol (Fig. 6, 7).

Fig. 6, Ringworm lesion with well-shaped edge

classic ringworm lesion Fig. 7, T. verrucosum colonies, cerebriform aspect,

strain isolated from human, agar with chloramphenicol

The statistical interpretation of the results led us to affirm that there is a close correlation between the two exams (micrscopic and cultural) (Fig. 8).

112

121

51

4234

29

20 18

0

20

40

60

80

100

120

140

Per

cen

tag

e o

f po

sitiv

e sa

mp

les

Farm 1 Farm 2 Farm 3 Farm 4

Culture positive samples Microscopic positive samples

Fig. 8, Comparative situation of the positive microscopic and cultural for the 4 considered areas

In the eight chapter, entitled „Determination of immunogenity vaccines against ringworm

administratin to cattle in farm conditions”, was followed the local and general tolerance and the evolution of the clinical lesions after the administration of the Trichoben vaccine. We have to mention that in the researches conducted in the laboratory we have also taken into consideration a romanian vaccine called Tricovac, processed by the Pasteur institute. The vaccine for the testing it is produced from a strain of Trichophyton verrucosum, containing a minimum of 2,5x106 structural elements dispersed in a powder medium.

The research regarding the clinical testing of the Trichoben vaccine by administration on farm revealed the following:

cattle vaccinated therapeutically with 5 ml (corresponding to the ages 3 weeks to 3 months) presented a tendency of healing right after the first administration of the vaccine. In the animals not clinical signs of ringworm after approximately 10 days from the vaccination, appeared at the place of inoculation a trichophytosis placard with the diameter of 3-4 cm, which in 5-6 days disappeared.

at 28 days after administrating the vaccine it was observed the regression of the hyperkeratosis lesions with the thickening of the crusts and the regeneration of the hair. The healing process starts from back limbs the most difficult region to heal being around the eyes (Fig. 9, 10, 11, 12).

cattle vaccinated preventively with the doses of 5 ml (corresponding to the age of 3 to 6 months) didn’t present any reaction due the vaccination.

the healing process depends on a series of factors: the improvement of the living and feeding conditions, the isolation of the affected animals, respecting the protocol and the vaccine doses corresponding to the age and the stage of the disease.

Fig. 9, Periocular localization - multiple lesions, roud,

in the crusts phase (before vaccination)

Fig. 10, The regression phase, at 14 days from the first administration of the vaccine

Fig. 11, The healing phase, after administrating two

doses of antiringworm vaccine Fig.12, Cattle in the healing phase after a generalised

form of ringworm

The immunoprofilactic methods remain a very important aspect in controlling the disease. Nevertheless, there are a number of animals that are not protected by vaccination. It is supposed that the main factors are: bad manipulation of the vaccine strain, errors applying the vaccine and also the absence of some vaccination protocols in the farms. Based on the results obtained after the cattle vaccination, we consider that that the antiringworm vaccine can be used in our country to prevent and also to cure the ringworm in cattle, including the advanced stages.

In the ninth chapter „Researches regarding anti-Trichophyton antibodies productin by rabbits hyper-immunization” it is presented the capacity of the vaccine antigen obtained by ultrasound treatment of the commercial vaccine Trichoben, to induce an immune response, consecutively the, successive and increasing dosage, administration to rabbits. Before sonication, the vaccine was submitted to the bacterioscopic and bacteriological exam on Sabouraud dextrose and DTM mediums. This task was performed also after every sonication. The suspension obtained was divided into sterile tubes of four ml and then was centrifuged at 2500 r.p.m, during 15 minutes. The supernatant obtained, kept his initial lactascent aspect; was tested for the total protein value. The quantity of protein was of 0,4 g/dl. The sonicated vaccine strain was then inoculated to the rabbits and used as the antigen in the immunodiffusion reaction.

The serum samples were processed by using the double diffusion in agar (Ouchterlony method). In the central well it is placed the studied antigen (vaccine Ag) and then, following a certain pattern, the serums are placed. The plaques are the introduced in wet microchambers, in order to prevent that the agar dries off. The interpretation of the results is made in a raw state, after 24 and 72 hours. The vaccine strain can be inactivated by ultrasounds, but its disintegration is possible only after a long time. After the first inoculation it was not possible to distinguish the antibodies in the immunodiffusion reaction.

The formation of immunoglobulins was proved after 2 inoculations, only in two rabbits of the group. Regarding the precipitation lines, those were poorly outlined after 24 hours. After 72 hours they were much bettr observed.

In the following images there are presented the precipitation lines with the central placement of the antigen and in the others six wells of the tested serums (Fig. 13, 14).

Fig 13, Agar gel immune-difusion, precipiting lines

Ag - antigen, S - positive serum

Fig 14, Agar gel immune-difusion, precipiting lines Ag - antigen, S - positive serum

The apparition of the precipitation lines in the rabbit serum represents the activation of some specific

lymphocytes clones, having as result the formation of various Ig classes in or case type IgG. The obtained products (hyperimmune serum and antigens) can be used in the current practical activity

of retrospective diagnosis (identification of the specific antibodies in the serum of the sick animals) or in the characaterization of the antigenic structures that can be identified in these types of microorganisms.

In chapter 10, named „Evalution of the humoral immune status in cattle with ringworm ” we verified the induction of the immune response through the detection of the anti-Trichophyton antibodies using serological techniques (Ouchterlony); the dynamic evolution of the immunological parameters at the vaccinated animals; the establishment of a correlation between the reactions from the immunodiffusion and the value of the total proteins (γ-globulines), the dozation of the lysozyme.

Even trough the ringworm was evolving in the forms and some of the cattle present in the study were presented dermatophyte lesions, in the serum samples taken before the administration of the vaccine there couldn’t be evidentiated antibodies at the immunodiffusion reaction in the agar gel. This implies either the absence of the antibodies, or that they are found in low quantities, unobserved trough the immunodiffusion reaction. At the second and third prelevation the precipitation lines were evidentiated, the reaction was accentuated during the next reading that was done after 72 hours when it was observed the presence of the double precipitation lines and the antigenic community phenomenom (fig. 15, 16).

Fig. 15, Appearance of precipitation lines IInd col.

Ag -antigen, S -positive serum, SI - negative serum, M - witness with positive reaction.

Fig. 16, Appearance of precipitation lines IIIrd col. Ag -antigen, S -positive serum, M - witness with

positive reaction

S

S S

S

S

S

S S

S

S S

Ag Ag

Ag Ag SI

S S

S

M S

S

The results obtained in double immunodiffusion of the 6 farms taken in the study are presented in figures 17 and 18.

5

7

5

0

0

2

45

128

67

52

15

57

50

135

72

52

15

59

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Gadalin

Jucu

Berind

Cojocna

Carmolimp

SDE CojocnaF

arm

nam

e

samples number examined serologically

positive samples negative samples total samples

Fig. 17, The ratio of positive samples and negative control performed

before vaccination in the 6 farms

31

42

23

18

10

26

19

93

49

34

5

23

50

135

72

52

15

59

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Gadalin

Jucu

Berind

Cojocna

Carmolimp

SDE Cojocna

Far

m n

ame

samples number examined serologically

positive samples negative samples total samples

Fig. 18, The ratio of positive samples and negative control performed after the second vaccination in the 6 farms

From the data analysis obtained results that after the calves vaccination with Trichoben, there’s an

immune feed-back through the specific antibodies production, which can be evidentiated through the immunodifussion reaction on agar gel. The intensity of the immune response of calves is different between every farm. For example we obtained very good results in the farms from Cojocna and Gadalin where the calves had proper maintenance, and low results in the Jucu farm, where the calves maintenance wasn’t to well. Even if not all the vaccinated calves responded through o positive reaction, we can take into consideration the vaccination as a method to follow in farms where the classic treatments didn’t have results. If the vaccination is used a prevention method, the number of infected individuals is lower and the lesions are poorly expressed with the tendency to heal.

Undoubtedly the mechanism of immune response in cattle ringworm has still questions marks and the antigenic structure of Trichophyton strains is still in the eleaboration process to establish which of the components has a better immunognicity. The antibodies are seric proteins also known as gamma globulins. The globulins group from which the antibodies are a part of is called immunoglobulins. Through scientific researches

it was discovered that the antibodies are modified globulins during the immune response. During the performed determinations, resulted the following average values(reported to total protein) in the group of sick calves, compared to the healthy ones (Chart 2).

The protein medium values for ringworm cattle groups (statistical parameters; 103/mm3)

Chart 2

Experimental group Control group Calculated parameters

Protein g/dl

Albumin g/dl

γ Globulin g/dl

Protein g/dl

Albumin g/dl

γ Globulin g/dl

Minimum 4,38 1,88 0,8 4,64 2,23 0,75 Maximum 6,88 2,96 1,93 6,09 2,73 1,21 Average 5,92 2,48 1,22 5,56 2,52 1,01 St. dev. 0,72 0,37 0,33 0,58 0,2 0,16

The lisosyme enzyme contained within the biological samples (blood serum) determines, in contact

with a bacterial rooth Micrococcus luteus, cellular lyses with the purification of the reaction medium. After taking measurements and correlating the values of the lizozyme concentration we can observe that the average values this humoral effector are lower for the witness lot compared to the exeperimental lot at wich we had administrated the vaccine with little differences that aren’t statistical significant.

In the 11 chapter, entitled „Evalution of the cellular immune status in cattle with ringworm ” in order to emphasize the organisms methods of reaction after ringworm vaccine and to make a correlation between the clinical aspects and the hematopoetic organ activity, we took samples of blood without anticoagulant in the following days 0, 14 and 28 after the vaccination, realizing the following determinations:

the counting of total leukocytes with Türk’s solution dilution method, using the Bürker- Türk counting room and also using the Abacus Junior vet equipment and the values were expressed in 103/mm3 .

the eusinophiles counting has been done the same as in the total leukocytes case, using the Junior Vet Abacus equipment and the values were expressed in 103/mm3 .

the leukocytari formula(in percentage), using the Panoptic and May-Grünwald-Giemsa stainings. the arithmetical average and standard deviation. statistical signification of differences „t” test between variants and lots. procentual values of leukocytes population of cattle lots.

Based on results obtained from counting polimorfonuclearelor that monocytes and lymphocytes was prepared chart no. 3 which contains the arithmetic mean and standard deviation for each harvest them.

Percentage values of the leucocitary subpopulations in cattle groups

Chart 3

Experimental group Control group Collections

N E B L M N E B L M

Average 38,8 5,06 0 54,2 1,9 37,6 9,2 0 51,2 2 Ist col. St. dev. 9,39 3,31 0 9,40 1,51 7,77 6,61 0 12,3 1,22 Average 33,8 4,6 0 59,4 2,1 37,4 6,8 0 53,8 2 II ndcol. St. dev. 10,1 4,53 0 9,75 1,19 7,5 8,26 0 11,5 1,22 Average 40,6 3,8 0 53,2 2,33 40,6 2,2 0 55,6 1,6 III rdcol St. dev. 7,59 4,06 0 8,42 1,29 10,8 1,3 0 11,3 0,89

The results of the average values and the standard deviation of total leukocytes in ringworm, after both

lots were vaccinated are showed in figures no 19, 20.

38.8

33.8

40.6

5.06 4.6 3.8

54.259.4

53.2

1.9 2.1 2.33

0

10

20

30

40

50

60

Leu

cocy

tes

sub

po

pu

lati

on

s va

lues

N e u t r o p h i l s Eo si n o p h i l s L y m p h o c y t e s M o n o c y e s

Ist co l

IInd col

IIIrd col

Fig. 19, Leucocytes subpopulations dynamic in experimental ringworm cattle group

During the infection, the number of leukocytes increased, confirming a defense response of the

organism who tries to stop the evolution of skin lesions. Leukocytosis in the experimental lots, developed in association with neutrophilia and lymphocytosis indicate a stress factor or an infection in the calves of the experiment. The lymphocyte interact with the antigen (TRICHOBEN vaccin), when a new interaction appears they produce identical cell clones sensitive to the antibody.

37.637.4

40.6

9.26.8

2.2

51.253.8

55.6

2 2 1.6

0

10

20

30

40

50

60

L

euco

cyte

s su

bp

op

ula

tio

ns

valu

es

Neutrophils Eosinophils Lymphocytes Monocytes

Ist col

IInd col

IIIrd col

Fig. 20, Leucocytes subpopulations dynamic in control ringworm cattle group

In chapter 12 „Clinic and histopatological study in natural infection with dermatophytes in guinea pigs” we tried to identify the tissulary alterations and the aspects of the mycotis elements. Also, we attemped to establish if the alterations involve only the superficial layers of the skin. The dermic tissue has a limited number of defense mechanisms to responde at the various infections to which it is exposed. This fact is an important aspect to know, because it shows that the histological response will be the same in various lesions. The histological diagnosis depends on a correct identification of the lesions correlated to the mycotic and macroscopic lesions of the skin.

The skin biopsy was realized from the margins of the lesions and we obtained histological sections with pathological and normal tissue. We used as colorants hematoxylin-eozin and tricrom, that showed very well the tissulary reaction. In the epidermis we distinguished massive destruction with interruption of the corneum stratum up to total destruction of it. There were localized necrosis of the epidermis covered with crusts. The crusts were formed from fibrin, red cells, granulocytes and neutrophiles. In the epidermic connective tissue it was evidentiated a small infiltration containing granulocytes and eosinophils (fig. 21, 22).

Fig. 21, Superficial necrotic-exsudativ crust, epithelial necrosis, discrete infiltrate with granulocytes and

eosinophyles in the underlying tissue (Tricrom-Masson, 400x)

Fig. 22, Crust sticked to the epithelium, congestion and hemorrhages in the superficial dermis; infiltrate

with neutrophils, eosinophyles and lymphocytes in the deep dermis (Tricrom-Masson, 200x)

In other areas of the sample under the crust in the dermal papillae we found a diffuse infiltration of red

blood cells, hemorrhage and rare white cells. The crust was adherent at the epithelium (Fig. 23, 24).

Fig. 23, Vascular and conjunctive proliferation in

dermis; young fibroblast and capillar neo-formation (Tricrom-Masson 400x)

Fig. 24, Vascular and conjunctive proliferation in dermis; young fibroblast and capillar neo-formation

(Tricrom-Masson 200x)

BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă

1. Almeira, S.R., 2008, Immunology of Dermatophytosis, Mycopathologia, Vol. 166, Sao- Paulo. 2. Blanco, J.L., E. Marta Garcia, 2008, Immune response to fungal infections, Veterinary Immunology and

Immunopathology Vol. 12, p.5. 3. Bredahl, L., C. Gyllensvaan, 2000, Incidence and control of cattle ringworm in Scandinavia, Internet Norge

AS, Oslo, Norway, Mycoses, 43, (suppl. 1), 8-10. 4. Calderon, R.A., 1989, Immuoregulation of dermatophytosis, R. Microbiol., 16:339-368.

5. Chermette, R., J. Bussieras, 1993, Parazitologie veterinaire: Mycologie, Service de Parazitologie, Ecole National Veterinaire d’Alfort.

6. Cozma, V., Viorica Mircean, C. Gherman, C. Magdaş, A. Mihalca, Mihaela Nicolae, M. Lefkaditis, Maria Mitsiadi, 2006, ActualităŃi în epidemiologia, diagnosticul şi tratamentul dermatofitozelor la animale de rentă, Scientia Parasitologica, 3-4, p.16-44.

7. Dahl, M.V., 1993, Suppression of immunity and inflammation by products produced by dermatophytes, J. Am. Acad. Dermatol. 28:S19-23.

8. Decun, M., E. Târziu, 1999, Profilaxia şi combaterea tricofiŃiei enzootice a taurinelor cu Tricovac, Rev. Rom. Med. Vet, volum 9, (4), 375-381.

9. Decun, M., I. łibru, Ileana Nichita, 2001, Tricosan un nou produs antimicotic pentru tratamentul tricofiŃiei taurinelor, Revista Română Vet, volum 11.

10. Elad, D., E. Segal, 1995, Immunogenicity in calves of a crude ribosomal fraction of Trichophyton verrucosum: a field trial, Kimron veterinary inst., Dep. Bacteriology, Bet-Dagan, Israel, Ed.Elsevier, Oxford, 13, (1), 83-87.

11. Gudding, R., B. Naess, O. Aamodt, 1991, Immunisation against ringworm in cattle, National Veterinary Institute , Oslo, Norway, Vet Rec., 128, (4), 84-85.

12. Guillot, J., L. Latie, M. Deville, L. Halos, R. Chermette, 2001, Evaluation of the dermatophyte test medium Rapid Vet., Vet. Dermatol., 12(3):123-7.

13. Haab, C., H.U. Bertschinger, A. Rotz, 1994, Epidemiology of tricophytosis calves in regard to the prevention of leather defects, Schweiz. Arch. Tierheilkd., 136, (6-7), 217-226.

14. Hajduch, M., J. Drabek, V. Raclavsky, V. Kotala, T. Michalek, I. Zelenkova, 1999, Diversity among wild type and vaccination strains of Trichophyton verrucosum investigated using random amplified polymorphic DNA analysis, Folia Biol., (Praha), 45, (4), 151-156.

15. Hammerling, G.J., A.B. Vogt, H. Kropshofer, 1999, Antigen processing and presentation-towards the millennium, Immunol Rev, 172, p 5.

16. Holubek, R., I. Schoneboom, 2000, Clinical testing of Tricovac LTF 130 for therapeutic use, Praktische Tierarzt ,Volume 81, Issue 9, p 746-755.

17. Harkness, J.E., Patricia Turner, Susan VandeWoude, Colette Wheler, 2009, Harkness and Wagner s Biology and Medicine of Rabbits and Rodents, 5th Edition, Ed. Wiley- Blackewell.

18. Janeway, C.A., 2005, Immunology, 6th ed., Garland Science ISBN 0-443-07310-4. 19. Junie Monica, Carmen Costache, 2005, The etiology and clinic of cutaneous mycosis, Scientia

Parasitologica 1-2, 147-149. 20. Kotnik Tina, 2007, Dermatophytoses in domestic animals and their zoonotic potential, Slov Vet Res; 44 (3):

63-73. 21. Lund, A., Anna Bratberg, Inge Solbakk, 2001, In vitro release of interferon-γ by trichophytin-stimulated

whole blood cell cultures from ringworm-vaccinated and control cales experimantally inoculated with Trichophyton verrucosum, Veterinary Dermatology, Vol. 12.

22. Mayer Gene, 2006, Immunology Chapter Two: Complement, Microbiology and Immunology, On-LineTextbook.USC School of Medicine, Retrieved on 2007 01-01.

23. Mircean Viorica, V. Cozma, 2008, Ghid practic de dermatologie, Editura Risoprint, Cluj Napoca, p. 120-123.

24. Mitroiu, P., C. Toma, N. Hanzu, 2000, Încercări de reproducere a tricofiŃiei la taurine şi cabaline cu diferite specii de fungi de dermatofiŃi şi de reîmbolnăvire a viŃeilor cu T. verrucosum, T. mentagrophytes, Ed. Ceres, Bucureşti.

25. Poli, G., Alessandra Cocilovo, Paola Dall Ara, Piera Anna Martino, Wilma Ponti, 2005, Meccanismi difensivi nei confronti dei funghi, Microbiologia e immunologia veterinaria, seconda edizione, Ed. Utet, Bari.

26. Ponton, J., M.J. Omaetxebarria, N. Elguezabal, M. Alvarez, M.D. Moragues, 2001, Immunoreactivity of the fungal cell wall, Med. Mycol., 39 suppl., 1:101-10.

27. Romani, L., 2004, Immunity to fungal infection, Nat. Rev., Vol. 4. 28. Şuteu, E., N. Dulceanu, 2001, Parazitoze cutanate la animale, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, vol. XI. 29. Van Custem, J., F. Rochette, 1992, Mycoses des Animaux Domestiques, Janssen Research Foundations. 30. Weber, A., 2000, Mycozoonoses with special regard to ringworm of cattle, Mycosis, 43 (suppl. 1), 20-22. 31. Zeljka Matasin, Ljerka Zeba, 2002, Enilconazol tolerance of bee brood, adult bees and queens, Veterinarski

Arhiv 72 (4), 229-234.