cristina cĂrĂbuȘ (căs. apetrei) - old.unitbv.roold.unitbv.ro/portals/31/sustineri de...
TRANSCRIPT
Investeşte în oameni!
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013
Axa prioritară 1 „Educaţie şi formare profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere”
Domeniul major de intervenţie 1.5. „Programe doctorale şi post-doctorale în sprijinul cercetării”
Titlul proiectului: Burse doctorale si postdoctorale pentru cercetare de excelenta
Numărul de identificare al contractului: POSDRU/159/1.5/S/134378
Beneficiar: Universitatea Transilvania din Braşov
Partener:
UNIVERSITATEA „TRANSILVANIA” BRAŞOV
Școala Doctorală Interdisciplinară
Departament: Silvicultură
Ing. Mihaela-Cristina CĂRĂBUȘ (căs. APETREI)
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și
cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.) în populații din România:
evaluări cu markeri ADN
Genetic diversity of hornbeam (Carpinus betulus L.) and oriental
hornbeam (Carpinus orientalis Mill.) in Romanian populations:
evaluations using DNA markers
Rezumatul tezei de doctorat
Summary of the PhD Thesis
Conducător ştiinţific
Prof.univ.dr.ing. Neculae ŞOFLETEA
BRAŞOV, 2017
MINISTERUL EDUCAŢIEI NAŢIONALE
UNIVERSITATEA TRANSILVANIA DIN BRAŞOV
BRAŞOV, B-DUL EROILOR NR. 29, 500036, TEL. 0040-268-413000, FAX
0040-268-410525
RECTORAT
D-lui (D-nei) ...............................................................................................
COMPONENŢA
Comisiei de doctorat
Numită prin ordinul Rectorului Universităţii „Transilvania” din Braşov
Nr. 8521 din 15.03.2017
PREŞEDINTE: Prof.univ.dr.ing. Ovidiu IONESCU
PRODECAN: Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere,
Universitatea Transilvania din Brașov
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof.univ.dr.ing. Neculae ȘOFLETEA
Universitatea Transilvania din Brașov
REFERENŢI: Conf.dr.ing. Liviu FĂRTĂIŞ
Universitatea ,,Ştefan cel Mare” Suceava
Cercet.st.gr. I – Dr. Ing. Flaviu-Eugen POPESCU
Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare în Silvicultură
,,Marin Dracea”
Prof.dr.ing. Alexandru Lucian CURTU
Universitatea Transilvania din Brașov
Data, ora şi locul susţinerii publice a tezei de doctorat: 28.04.2017, 11.00, sala SP4,
Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere
Eventualele aprecieri sau observaţii asupra conţinutului lucrării vă rugăm să le transmiteţi
în timp util, pe adresa Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere, Brașov, Șirul Beethoven,
nr. 1, 500123, la numărul de fax: 0268.475705 sau la adresa de e-mail
Totodată vă invităm să luaţi parte la şedinţa publică de susţinere a tezei de doctorat.
Vă mulţumim.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
3
Mulțumiri
Următoarea teză este o lucrare personală, dar nu ar fi fost posibilă fără sprijinul,
îndrumarea și eforturile depuse de numeroase persoane. În acești ani s-au legat relații frumoase
cu mulți oameni generoși de la care am primit îndrumări ştiinţifice de calitate realizate cu
profesionalism şi exigenţă. Prin intermediul acestei lucrări, profit de această oportunitate de a-
mi exprima recunoștința sinceră tuturor care m-au ajutat pe tot parcursul proiectului meu.
În primul rând îmi exprim recunoștința profundă și sinceră conducătorului de doctorat,
domnului Prof.univ.dr.ing. Neculae ȘOFLETEA care m-a sprijin și îndrumat necondiționat din
primele zile până la sfârșitul studiului. Dumnealui mi-a oferit încurajări, sfaturi bune, comentarii
prețioase și sugestii clare. Ca rezultat, acestea m-au ajutat să dezvolt și să îmbunătățeasc
abilitățile mele, să termin această teză, iar viața de cercetare a devenit ușoară și plină de
satisfacție pentru mine. Fără ajutorul dumneavoastră visele mele şi lucrarea mea nu ar fi fost
materializate.
,,Vă spun de la început ca nu va fi o temă ușoară. Carpenul este poliploid în cea mai mare
parte și de aici o interpretare mai dificilă a electroforegramelor”
Sunt afirmațiile domnului Decan Alexandru Lucian CURTU care mi-a dat șansa de a
începe studiul, de a finaliza cercetarea și nu în ultimul rând pentru a îmbunătăți cunoștințele
geneticii moleculare o dată cu deplasarea la Gottingen. Vă mulțumesc pentru încrederea avută în
potențialul meu și susținere încă din perioada ciclului de liciență, dar nu în ultimul rând de
răbdarea de care ați dat dovadă.
Îi mulțumesc în continuare domnului Rector Ioan Vasile ABRUDAN care a avut un rol
important în cadrul desfășurării analizelor de laborator. Acestea nu s-ar fi realizat la timp dacă
nu ar fi aprobat suplimentarea fondului de cercetare.
Doresc să mulțumesc membrilor comisiilor de susținere a referatelor științifice pentru
sugestiile valoroase, discuțiile constructive și pentru citirea manuscrisul cu mare atenție și grijă.
În mod deosebit aș dori să mulțumesc profesorilor care mi-au călăuzit sinuosul drum spre
tainele ştiinţei, pentru sprijinul lor în timpul studiului meu dar și în timpul facultății. Sunt profund
recunoscătoare pentru contribuțiile lor critice și abile acestei teze.
Adresez mulțumiri personalului de la INCDS “Marin Dracea”, în special domnului dr.ing.
Flaviu POPESCU și domnului dr.ing. Dragoș POSTOLACHE, pentru colaborarea și dicuțiile
științifice valoroase pe care le am avut privind analiza ADN-ului cloroplastic.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
4
Mulțumiri aderesez domnișoarei dr.ing. Elena Ciocîrlan pentru asistența ei, pentru
îndrumarea în analiza datelor și pentru sfaturile cu privire la modul de a rezolva problemele pe
care le-am confruntat în laborator asupra analizelor genetice.
Sunt deosebit de recunoscătoare colegilor și prietenilor mei pentru consultanță științifică,
asistență tehnică, schimbul de idei și nu în ultimul rând de sprijinul puternic și minunat. Le
mulțumesc pentru prietenia lor și multe discuții academice și non-academice interesante.
Aş dori să îmi extind recunoştinţa mea sinceră faţă de socrii mei (Ioan și Elena) pentru
înțelegerea și suportul moral acordat, precum și cumnatei mele (Laura) și viitorului ei soț (Ionuț)
pentru încurajare și încredere.
Sunt profund recunoscătoare și nu aș putea să le mulțumesc îndeajuns părințiilor mei
(Gheorghe și Meluzina), pentru dragostea neclintită şi de neegalat, pentru sprijinul necondiționat
și încurajarea lor pe tot parcursul studiului meu. Doresc să-i mulțumesc surioarei mele Adelina-
Nicoleta pentru încurajările primite din partea ei și nu în ultimul rând de faptul că de fiecare dată
m-a făcut să zâmbesc în momentele grele. Le mulțumesc în continuare bunicilor mei (Elena,
Gheorghe și Stela), cei care m-au vegheat în perioada copilăriei și care mi-au modelat spiritul.
Voi sunteți simbolul copilăriei mele fericite.
Mulțumiri speciale și adevărate doresc să le exprim soțului meu, Ionuț, pentru dragostea
lui, pentru sprijinul și încurajările fără sfârșit, pentru răbdarea și stresul pe care i l-am provocat
și care a sacrificat timpul și resursele lui pentru a-mi permite să fac această lucrare. El merită
fiecare succes și reușită a mea, pentru că fără el nu ar fi existat această teză.
Vă mulțumesc și vă dedic această lucrare...
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
5
CUPRINS
Pg.
teza
Pg.
rezumat
INTRODUCERE………………………………………………………………………9………..9
Capitolul I. ANALIZA STADIULUI ACTUAL AL CUNOȘTINȚELOR……..……..10……...10
1.1 Consideraţii generale privind genul Carpinus…………………………….10...…….10
1.2 Originea şi evoluţia genului Carpinus.........................................................12............11
1.3 Diversitatea genetică a carpenului și cărpiniței (studii de ADN)…………..22..….…12
1.3.1 Date privind ADN-ul extranuclear………………………………….22.…..…12
1.3.2 Date privind ADN-ul nuclear.............................................................26...........13
Capitolul II. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR....................................30...........14
2.1 Scopul cercetărilor........................................................................................30...........14
2.2 Obiectivele cercetărilor................................................................................30...........14
Capitolul III. MATERIAL ȘI METODE DE CERCETARE………………………….31....…...15
3.1 Localizarea studiului și materialul de cercetare……………………………31……...15
3.2 Metode de cercetare………………………………………………………..35...…....17
3.2.1 Analiza ADN-ului nuclear cu markeri de tipul SSRs…………….....35.......…17
3.2.1.1 Pregătirea probelor și izolarea ADN-ului…………………...35...……17
3.2.1.2 Testarea calității și concentrației ADN-lui izolat...................36...........17
3.2.1.3 Reacția de polimerizare în lanț (PCR)....................................38...........18
3.2.1.4 Electroforeza capilară.............................................................40..........19
3.2.2 Analiza ADN-ului cloroplastic cu markeri de tipul SSRs…………..43..…....19
3.3 Programe și metode statistice utilizate în analiza datelor..............................44...........20
3.3.1 Analiza ADN-ului nuclear..................................................................44...........20
3.3.1.1 Determinarea erorilor de citire a electroforegramelor.….......44...........20
3.3.1.2 Calculul indicilor de diversitate genetică...............................46...........21
3.3.1.3 Analiza structurilor genetice spațiale ....................................47...........21
3.3.1.4 Testul ,,bottleneck’’................................................................49..........23
3.3.2 Analiza ADN-ului cloroplastic............................................................50..........23
Capitolul IV. REZULTATE ȘI DISCUȚII......................................................................52..........25
4.1 Structura alelică și diversitatea genetică la nivelul ADN-ului nuclear...........52..........25
4.1.1 Stabilirea protocolului de interpretare a electroforegramelor pentru specia
octoploidă C. betulus........................................................................52..........25
4.1.2 Diversitatea genetică în populațiile de Carpinus betulus..................56..........29
4.1.2.1 Structura alelică......................................................................56.........29
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
6
4.1.2.2 Indicii de diversitate genetică.................................................59.........31
4.1.2.3 Diferențierea genetică.............................................................61.........33
4.1.2.4 Analiza structurii genetice spațiale intrapopulaționale...........62.........33
4.1.2.5 Analiza structurii genetice spațiale interpopulaționale...........66.........35
4.1.3 Diversitatea genetică în populațiile de Carpinus orientalis...............71.........39
4.1.3.1 Testarea echilibrului Hardy-Weinberg, a dezechilibrului linkage și
identificarea alelelor nule...................................................................71.........31
4.1.3.2 Structura alelică......................................................................73.........41
4.1.3.3 Indicii de diversitate genetică..................................................75.........42
4.1.3.4 Diferențierea genetică.............................................................79.........44
4.1.3.5 Analiza structurii genetice spațiale intrapopulaționale...........80.........45
4.1.3.6 Analiza structurii genetice spațiale interpopulaționale...........83.........46
4.1.3.7 Testarea efectului de ,,bottleneck” în populațiile de cărpiniță.88.........49
4.2 Structura alelică și diversitatea genetică la nivelul ADN-ului cloroplastic.....89.........50
4.2.1 Haplotipurile identificate și frecvențele relative ale acestora în populații.89......50
4.2.2 Distribuția geografică a haplotipurilor...................................................91.........51
4.2.3 Diversitatea genetică intra și interpopulațională....................................93.........54
4.2.4 Relațiile filogenetice între haplotipuri...................................................96.........56
Capitolul V. CONCLUZII FINALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. DISEMINAREA
REZULTATELOR. DIRECȚII VIITOARE DE CERCETARE.......................................98.........59
5.1 Concluzii finale................................................................................................98........59
5.1.1 Concluzii rezultate din analiza markerilor genetici nucleari..................98........59
5.1.2 Concluzii rezultate din analiza markerilor genetici cloroplastici..........100........61
5.2 Contribuții originale.......................................................................................100........61
5.3 Diseminarea rezultatelor.................................................................................101........62
5.4 Direcții viitoare de cercetare...........................................................................102........63
BIBLIOGRAFIE..............................................................................................................103........64
REZUMAT......................................................................................................................147........71
CURRICULUM VITAE..................................................................................................148........72
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
7
CONTENT
Summary Thesis
INTRODUCTION...................................................................................................................9......9
Chapter I. ANALYSIS OF THE CURRENT STATE OF KNOWLEDGE...........................10.....10
1.1 General description of genus Carpinus...............................................................10.....10
1.2 Origin and evolution of genus Carpinus.............................................................12.....11
1.3 Genetic diversity of hornbeam and oriental hornbeam (DNA studies)...............22.....12
1.3.1 Extranuclear DNA data.............................................................................22.....12
1.3.2 Nuclear DNA data.....................................................................................26.....13
Chapter II. AIM AND RESEARCH OBJECTIVES.............................................................30.....14
2.1 Aim of the study...................................................................................................30.....14
2.2 Objectives............................................................................................................30.....14
Chapter III. MATERIAL AND METHODS.........................................................................31.....15
3.1 Location of study and research material...............................................................31.....15
3.2 Research methods................................................................................................35.....17
3.2.1 Nuclear DNA analysis with SSRs markers................................................35.....17
3.2.1.1 Sample preparation and DNA isolation.........................................35.....17
3.2.1.2 Testing the quality and the concentration of DNA........................36.....17
3.2.1.3 Polymerase chain reaction (PCR)..................................................38.....18
3.2.1.4 Capillary electrophoresis..............................................................40.....19
3.2.2 Chloroplast DNA analysis with SSRs markers..........................................43.....19
3.3 Programs and statistical methods used in dataset analysis...................................44.....20
3.3.1 Nuclear DNA analysis...............................................................................44.....20
3.3.1.1 Determination the reading errors of electropherograms................44.....20
3.3.1.2 Genetic diversity indices...............................................................46.....21
3.3.1.3 Spatial genetic structure................................................................47.....21
3.3.1.4 ,,Bottleneck” test...........................................................................49.....23
3.3.2 Chloroplast DNA analysis.........................................................................50.....23
Chapter IV. RESULTS AND DISCUSSION........................................................................52.....25
4.1 Allelic structure and genetic diversity at the nuclear DNA level..........................52.....25
4.1.1 Establishment of the protocol for electropherograms interpretation of the C.
betulus octoploid species.......................................................................................................52.....25
4.1.2 Genetic diversity in the Carpinus betulus populations...............................56.....29
4.1.2.1 Allelic structure.............................................................................56.....29
4.1.2.2 Genetic diversity indices...............................................................59.....31
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
8
4.1.2.3 Genetic differentiation..................................................................61.....33
4.1.2.4 Spatial genetic structure between populations...............................62.....33
4.1.2.5 Spatial genetic structure within populations..................................66.....35
4.1.3 Genetic diversity in the Carpinus orientalis populations...........................71.....39
4.1.3.1 Testing the Hardy-Weinberg equilibrium, linkage disequilibrium and
null allele identification.........................................................................................................73.....39
4.1.3.2 Allelic structure.............................................................................73.....41
4.1.3.3 Genetic diversity indices...............................................................75.....42
4.1.3.4 Genetic differentiation..................................................................79.....44
4.1.3.5 Spatial genetic structure between populations...............................80.....45
4.1.3.6 Spatial genetic structure within populations.................................83.....46
4.1.3.7 Testing of the ,,bottleneck” effect in the oriental hornbeam
populations............................................................................................................................88.....49
4.2 Allelic structure and genetic diversity at the chloroplast DNA level....................89.....50
4.2.1 Identified haplotypes and their relative frequency in the population.........89.....50
4.2.2 Geographical distribution of the haplotypes..............................................91.....51
4.2.3 Genetic diversity between and within populations.....................................93.....54
4.2.4 Phylogenetic relationships between haplotypes.........................................96.....56
Chapter V. FINAL CONCLUSIONS. ORIGINAL CONTRIBUTIONS. DISSEMINATION OF
RESULTS. FUTURE RESEARCH DIRECTIONS..............................................................98.....59
5.1 Final Conclusions................................................................................................98.....59
5.1.1 Conclusions resulted of the nuclear genetic markers analysis....................98.....59
5.1.2 Conclusions resulted of the chloroplast genetic markers analysis............100.....61
5.2 Original contributions........................................................................................100.....61
5.3 Dissemination of results....................................................................................101.....62
5.4 Future research directions..................................................................................102.....63
REFERENCES...................................................................................................................103.....64
ABSTRACT........................................................................................................................147.....71
CURRICULUM VITAE.....................................................................................................148.....72
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
9
INTRODUCERE
Variația genetică în interiorul speciilor de arbori este o componentă importantă a
biodiversității pădurilor (Kramer et al. 2016). Arborii s-au confruntat de-a lungul istoriei lor
evolutive cu schimbările globale de mediu, însă cei mai mulți dintre ei au supraviețuit (Hamrick,
2004). În acest context, capacitatea de replicare a variației genetice cu ajutorul genelor care
controlează trăsăturile adaptative este deosebit de importantă, deoarece permit supraviețuirea
populațiilor de arbori în condițiile schimbărilor de mediu.
Carpinus betulus și C. orientalis ar putea avea un rol important în menținerea vegetației
forestiere în arborete marginale: carpenul (specie octoploidă) mai ales ca urmare a capacității sale
foarte mari de concurență cu alte specii (Șofletea și Curtu, 2007; Paridari et al. 2013; Purina et al.
2015) și a puținilor factori biotici și abiotici care l-au afectat până în prezent (Zhu et al. 2012;
Şulea et al. 2013), respectiv cărpinița (specie diploidă) datorită adaptabilității de excepție dovedite
pentru zonele cu climat arid din silvostepă.
Nivelul de poliploidie a fost asociat cu creșterea toleranței față de factorii ecologici
limitativi (McIntyre, 2007; Leitch și Leitch, 2008), o dovadă binecunoscută în acest sens fiind
creșterea frecvenței poliploizilor la altitudini mari sau în arealele nordice (Ramsey, 2011).
Capacitatea speciilor diploide și poliploide de-a reacționa în moduri diferite față de încălzirea
climatului și alte modificări ale habitatului prezintă implicații potențiale pentru estimarea
distribuției viitoare a speciilor de arbori, așa cum s-a afirmat că speciile poliploide ocupă nișe
distincte și mai largi în raport cu speciile diploide (McIntyre, 2012). Poliploidia ar putea explica
de ce unele specii prezintă un succes mai ridicat decât altele, prin urmare, crește potențialul lor de-
a fi invazive (te Beest et al. 2012).
Relațiile filogenetice joacă un rol important asupra biologiei evolutive a structurii speciilor
și a populațiilor (Xu et al. 2015). Barierele montane influențează istoria evolutivă a populaților
prin izolarea lor (Bănărescu și Boşcaiu, 1973; Ortiz-Ramírez et al. 2016). Izolarea pe termen lung
în refugiile glaciare și procesul migrațional au jucat, de asemenea, un rol important în modelarea
diversității genetice a multor specii.
Această lucrare a plecat de la premisa că nu există nicio informație completă cu privire la
modelele de variație genetică, prin prisma markerilor SSRs nucleari și cloroplastici, pentru cele
două specii de Carpinus cu niveluri diferite de poliploidie. Mai mult decât atât, lipsesc în
continuare informații cu privire la diversitatea genetică și structura spațială a acestor specii, atât
la nivel regional cât și în arealul general al acestora. În contextul schimbărilor climatice
preconizate, obținerea din timp a acestor cunoștințe noi de genetică moleculară, chiar și pentru
specii care au în prezent o valoare economică redusă, prezintă utilitate pentru managementul
riscurilor în silvicultura viitorului.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
10
CAPITOLUL I. ANALIZA STADIULUI ACTUAL AL CUNOȘTINȚELOR
1.1 Consideraţii generale privind genul Carpinus
Genul Carpinus a fost definit de Linnaeus (1737) și în clasificarea actuală aparţine familiei
Betulaceae, inclusă în mod tradiţional în cadrul ordinului Fagales (Thorne, 1973; Cronquist,
1981; Tutin et al. 1993; EuroMed Plant Database), deşi unii autori, cum ar fi Hickey și Wolfe
(1975), l-au considerat un ordin separat. Studiile taxonomice mai vechi (Winkler, 1904) sau mai
recente (care se ocupă exclusiv cu analiza organelor de reproducere; Crane, 1989) susţin divizarea
familiei Betulaceae în șase genuri care sunt distribuite în două triburi: Betuleae şi Coryleae (Crane
et al. 1990; Crane, 1998). Primul trib include genurile Alnus Mill. (29-35 specii) şi Betula L. (42-
50 specii), iar cel de al doilea trib Carpinus L. (26-35 specii), Corylus L. (16 specii), Ostrya Scop.
(5-9 specii) şi Ostryopsis Decne. (3 specii) (Hall, 1952; Crane et al. 1990; Grimm și Renner,
2013). Totodată, unii autori au inclus genurile Carpinus şi Ostrya într-un al treilea trib, Carpineae,
pe baza caracterelor morfologice florale (Abbe, 1935; Furlow, 1990).
Genurile Carpinus L. Ostrya Scop. şi Ostryopsis Decne. cuprind circa 47 de specii de
arbori şi arbuşti răspândite în regiunile temperate nordice (Winkler, 1904; Crane, 1989).
Aproximativ 35 de specii de arbori şi arbuşti cuprinde genul Carpinus, cu o distribuţie largă în
America de Nord (C. caroliniana şi C. tropicalis), Europa de Sud-Est şi Centrală (C. betulus L.
şi C. orientalis Mill.) şi în Asia (aproximativ 31 de specii) (Rehder, 1960; Heywood, 1993; Chen,
1994; Sun, et al. 2011).
Involucrul fructifer este un descriptor folosit pentru a diferenția cele două specii: la carpen
acesta este de 3-5 cm, trilobat, frunzos, cu marginea întreagă şi lobul median de 2-3 ori mai lung
decât cei laterali, în timp ce la cărpiniță are doar 1-2 cm, este nelobat şi neregulat serat pe margine
(Săvulescu, 1952; Șofletea și Curtu, 2007; Savill, 2013). Inflorescența în stadiul de fructificaţie
atinge în ansamblu 6-12 cm în cazul carpenului și respectiv doar 3-6 cm la cărpiniţă (Șofletea și
Curtu, 2007).
Carpenul este o valoroasă specie de amestec în arboretele de foioase, mai ales în pădurile
dominate de specii de cvercinee, manifestând o mare capacitate de competiție față de acestea în
stadiul juvenil (Petre et al. 2012). În ceea ce privește cărpinița, aceasta se remarcă mai ales prin
capacitatea de-a vegeta în zone aride (Șofletea și Curtu, 2007; Bergmeier și Dimopoulos, 2008;
Čarni et al. 2009; Lachashvili et al. 2016), fiind o specie promițătoare pentru menținerea
vegetației lemnoase în zone care ar putea fi afectate în viitor de modificările climatice preconizate.
Dealtfel, cărpinița este o specie caracteristică pentru unități de vegetație termofilă (Doniță et al.
2005; Chifu et al. 2006; Chifu și Irimia, 2014; Coldea et al. 2015).
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
11
1.2 Originea şi evoluţia genului Carpinus
Din punct de vedere etimologic, numele genului provine din latinescul ,,carpinus” (Nelson
și Deam, 1919) ce este compus din cuvintele celtice ,,karr” care înseamnă ,,lemn” şi ,,pen”, cu
semnificația ,,cap”, adică ,,juguri de lemn” (Mauric, 2000), referindu-se la faptul că lemnul său
extrem de tare, asemănător ca un corn (engl. horn = corn) (San-Miguel-Ayanz et al. 2016), a fost
folosit de romani pentru carele lor, mai exact la realizarea jugurilor boilor (Heath, 2012).
Carpenul a recolonizat Europa foarte târziu, în timpul Holocenului, deși cercetările
palinologice indică existența acestuia, uneori chiar abundentă, încă din perioada interglaciară
(Pop, 1932; Fărcaș și Tanțău, 1999). Istoria mai recentă a speciei şi unele procese biologice şi
ecologice caracteristice acesteia ar putea fi explică prin diseminarea relativ limitată a semințelor.
Genul Carpinus a fost detectat pentru prima dată în timpul Paleocenului, în Europa
Centrală, din granule de polen care au fost integrat în genul Carpinuspollenites Krutzsch (Muller,
1981). Resturi de frunze și fructe au fost găsite în Eocen în Kursk (Rusia), Siberia, Manciuria,
Japonia, Alaska, Oregon și Idaho (Jentys-Szaferowa, 1958). Polenul de tip Ostrya (care include
date pentru două specii: Carpinus orientalis şi Ostrya carpinifolia) apare de la perioada Terţiară
încoace, având însă o abundenţă scăzută (Tzedakis, 1994).
Din datele palinologice reiese atestări ale carpenului în sudul Spaniei acum cca. 17 500
de ani, iar în nord-vestul ei, de cca. 11 500 de ani, ca în prezent să fie aproape inexistent în
Peninsula Iberică (Grivet și Petit, 2003). Involucrul cărpiniţei este prezent în mai multe depozite
neogene din Europa de Vest (Fărcaş et al. 2006).
În Bulgaria există semnalări ale carpenului în Tardiglaciar (Alleröd), în Munţii Rila şi
Pirin (Bozilova, 1975), autoarea include specia chiar într-un sistem de etajare a vegetaţiei.
Carpenul a fost atestat acum ± 8 500 ani lângă litoralul Mării Negre, la Durankulak (Bozilova şi
Tonkov, 1985; Bozilova şi Atanassova, 1989). Momentul expansiunii carpenului s-a înregistrat
acum ± 7 000 de ani, iar faza de maximă răspândire a sa a fost semnalată acum ± 5 800 de ani,
deci în ultima parte a Atlanticului (Bozilova, 1996; Fărcaş et al. 2006).
Polenul bradului şi al cărpiniţei (nu şi cel al carpenului) apar în spectrele polinice
tardiglaciare în Ungaria (Willis et al. 1995, 1997; Willis, 1997).
În România, primele atestări ale carpenului, în spectre polinice, sunt cele de la Peşteana
(Munţii Poiana Ruscă), de acum ± 12 800 ani şi Luci (Munţii Harghitei), de acum 12 350 ani, ce
sunt considerate „infecţii”, deoarece sunt apariţii izolate ale carpenului în spectrele polinice,
urmate de o lungă pauză, înaintea altor atestări (Fărcaş et al. 2006).
Începând cu 5 000 de ani B.P., are loc expansiunea și optimul de Carpinus, ca mai apoi
fagul să disloce și apoi să elimine acest etaj al cărpinetelor, alcătuind cele mai recente asociații
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
12
silvestre postglaciare (făgetele) (Fărcaş et al. 2006). Cercetările de paleobotanică relevă o fază a
carpenului în Carpații românești în timpul Subborealului, astfel încât etajul cărpinetelor a fost cu
mult mai extins pe altitudine (Diaconeasa și Fărcaș, 1998b).
1.4 Diversitatea genetică a carpenului și cărpiniței (studii de ADN)
1.4.1 Date privind ADN-ul extranuclear
Materialul genetic extranuclear este constituit din ADN-ul cloroplastic (întâlnit la plante)
și ADN-ul mitocondrial (întâlnit la plante și animale). Pe baza datelor din literatură a rezultat că,
până în prezent, cele două specii de Carpinus au fost studiate doar la nivelul ADN-ului
cloroplastic, nu și al celui mitocondrial.
Prin analiza ADNcp cu markeri ADN s-au putut identifica rutele de migrare postglaciară
ale mai multor specii forestiere şi centrele de refugii în timpul glaciațiunilor cuaternare (Petit et
al. 2002a; Bassil et al. 2012; Papageorgiou et al. 2014).
Majoritatea laboratoarelor au analizat două tipuri de fragmente cloroplastice: fragmente
mari (1,5-4 kilobaze), în care polimorfismul este detectat prin utilizarea unei enzime de restricție
(RFLP), și fragmente mai mici (100-200 bp), denumite microsateliți (SSRs), care conțin diferite
repetiții ale mononucleotidelor (Grivet, 2002).
Petit et al. 2003 au analizat 18 populații din arealul carpenului unde au fost identificate 4
haplotipuri. Indicele de diferențiere genetică a atins valoarea de GST = 1,00, de unde se poate
deduce că populațiile de carpen s-au conformat cel mai bine la modelul global de divergență.
În cadrul studiului la nivel european efectuat de Grivet şi Petit (2003) asupra carpenului
(C. betulus) şi cărpiniţei (C. orientalis) s-au analizat 36 de populaţii de carpen şi 5 de cărpiniţă din
12 ţări. Din România s-au analizat probe de ADNcp pe de o parte, prin procedura PCR-RFLP,
utilizând două fragmente: K1K2 (restricţionat cu enzima HinfI) şi CD (restricţionat cu enzima
TaqI). Separarea fragmentelor restricţionate s-a făcut pe geluri de poliacrilamidă, care în urma
interpretării au condus la identificarea a trei haplotipuri. Pe de altă parte, prin procedura SSRs s-
au utilizat trei perechi de primeri (ccmp4, ccmp7 şi ccmp10), în urma cărora au rezultat şapte
haplotipuri. Cele două tehnici (PCR-RFLP şi SSRs) au condus la determinarea a opt combinaţii
de haplotipuri cloroplastice, dintre care două sunt prezente numai în populaţiile de cărpiniţă din
Italia, Grecia şi Ungaria. La carpen au fost detectate 6 haplotipuri specifice, dintre care haplotipul
1se întâlnește în toate populaţiile din nordul şi vestul Europei. Celelalte 5 au fost întâlnite în estul
Europei (trei haplotipuri identificate numai în România) şi sudul Italiei. Două haplotipuri specifice
au fost detectate și la C. orientalis, haplotipul 7 respectiv haplotipul 8, sugerând absența fluxului
genetic între cele două specii. Centrele de refugiu ale celor două specii au fost în Peninsula Italică
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
13
(haplotipul 8) şi în Peninsula Balcanică. Diversitatea genetică haplotipică totală a carpenului la
nivel european a fost hT = 0,683, iar indicele de diferențiere între populații a avut valoarea GST =
0,972, ceea ce indică o pondere mare a diversității la nivel interpopulațional.
Fărcaş et al. (2006) au evaluat diversitatea genetică a 15 populaţii de carpen din România,
la nivelul ADN-ului cloroplastic, prin procedura PCR-RFLP, amplificând un fragment de
ADNcp (CD) restricționat cu ajutorul enzimei TaqI. În urma studiului au rezultat trei haplotipuri
şi anume: haplotipul 5 (57,3%) întâlnit în 8 populaţii pure și una în amestec cu haplotipurile 2 și
3; haplotipul 3 întâlnit în 6 populaţii pure și una în amestec cu haplotipurile 2 și 5; haplotipul 2
întâlnit într-o singură populație, împreună cu haplotipurile 3 și 5. Toate cele trei haplotipuri sunt
de origine balcanică. Variabilitatea genetică ridicată din Carpaţii de Curbură, poate sugera
existenţa unui refugiu glaciar pe teritoriul României sau apropiat de acesta.
Sintetizând datele din literatură (Grivet și Petit, 2003; Fărcaș et al. 2006), până în prezent
au fost descrise un număr de șase haplotipuri cloroplastice la carpen, trei haplotipuri bazându-se
pe variaţia ADNcp, iar celelalte trei haplotipuri pe variaţia SSRs cloroplastici.
Interpretarea datelor polen-analitice și corelarea cu cele obținute prin cercetări de genetică
moleculară au indicat două posibile refugii glaciare, unul în Peninsula Italică și respectiv altul în
Peninsula Balcanică, de unde în postglaciar ar fi migrat spre nordul și vestul Europei.
1.5.2 Date privind ADN-ul nuclear
Recent, au fost investigați SSRs nucleari din genul Carpinus și utilizați pentru genotipare
și evaluarea diversității genetice (Prinz și Finkeldey, 2015; Cărăbuș et al. 2015). Nu au existat
informații detaliate asupra markerilor codominanți (SSRs nucleari) pentru Carpinus, singurele
informații referindu-se doar studiile realizate de Barbará et al. (2007) și Gürcan și Mehlenbacher
(2010) cu privire la caracterizarea markerilor polimorfi din familia Betulaceae, în general.
Coart et al. (2005) au realizat un studiu bazat pe markeri AFLP pentru a caracteriza
structura genetică a populaţilor de C. betulus în Europa şi de-a formula câteva recomandări pentru
utilizarea acestei specii în plantaţiile din Flandra (Belgia). S-au luat în studiu 18 populații de
carpen (379 exemplare) din Flandra, iar din Europa 19 populații de carpen (196 exemplare) și 5
de cărpiniță (41 exemplare). Aceste populații au fost analizate cu trei combinații de primeri pentru
studiul diversității genetice: EcoRI-AAC + MseI-CAC, EcoRI-ACA + MseI-CAG și EcoRI-ACG
+ MseI-CAC. Cei trei markeri au reliefat existenţa a 118 alele, iar valoarea heterozigoţiei
aşteptate (He) a fost de 0,33 la nivel european și 0,30 în Flandra pentru C. betulus și 0,27 pentru
populațiile de C. orientalis.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
14
CAPITOLUL II. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
2.1 Scopul cercetărilor
Cercetările întreprinse au avut ca scop evaluarea diversității genetice a carpenului
(Carpinus betulus) şi cărpiniței (Carpinus orientalis) cu ajutorul markerilor genetici de tipul
microsateliţilor nucleari şi cloroplastici în populațiile autohtone. Această evaluare a urmărit
cuantificarea diversităţii genetice intra/interpopulaţionale a celor două specii în vederea
caracterizării structurii lor genetice şi a identificării particularităţilor existente în diferite zone din
arealul lor natural în România. Analizele de ADN cloroplastic urmăresc în principal decelarea
haplotipurilor specifice existente în zona cercetată, pe baza cărora pot fi descrise căile de migrație
postglaciară din refugiile existente pentru cele două specii analizate.
2.2. Obiectivele cercetărilor
Pentru atingerea scopului propus s-au stabilit următoarele obiective de cercetare:
Stabilirea protocolului de interpretare a electroforegramelor pentru specia octoploidă C.
betulus.
Evaluarea diversității genetice a carpenului (Carpinus betulus) şi cărpiniţei (Carpinus
orientalis) din România cu ajutorul microsateliților, la nivelul ADN-ului nuclear.
Analiza haplotipurilor existente la nivelul ADN-ului cloroplastic și verificarea ipotezelor
referitoare la rutele de migrare postglaciară a celor două specii.
Având în vedere folosirea pentru prima dată la carpen/cărpiniță a markerilor nucleari și
cloroplastici de tipul SSR, cercetările au un caracter exploratoriu. Pe de altă parte, datele astfel
obținute vor putea fi comparate cu cele din cercetări anterioare având la bază alte tipuri de markeri
genetici.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
15
Capitolul III. MATERIAL ȘI METODE DE CERCETARE
3.1. Localizarea studiului și materialul de cercetare
Cercetările s-au efectuat pe material biologic recoltat din populații reprezentative pentru
arealul celor două specii în România. O condiție avută în vedere a fost includerea în eșantionaj a
zonelor în care apar ambele specii, în vederea comparării structurii genetice haplotipice ale
acestora. Materialul de studiu pentru analiza ADN-ului nuclear (Tabelul 3.1) a fost recoltat din
14 populații (8 populații de carpen și 6 populații de cărpiniță), iar pentru analiza ADN-ului
cloroplastic (Tabelul 3.1) a fost recoltat din 24 de populații (18 populații de carpen și 6 populații
de cărpiniță). Aceste populații se află atât la limita arealului de distribuție, cât și în centrul
acestuia, inclusiv în zone în care cercetările anterioare nu au furnizat informații despre diversitatea
genetică, lipsind mai ales datele despre ADN-ul nuclear. La alegerea populațiilor de studiu s-a
avut în vedere, de asemenea, ca prin determinările ce vor fi efectuate să se obțină date care să fie
relevante pentru caracterizarea de ansamblu a genofondurilor existente pentru cele două specii în
România.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
16
Tabelul 3.1 Localizarea geografică a populațiilor analizate
Table 3.1 Location of the analyzed populations
Nr. Denumirea
populației-Abreviere
Zona geografică Latitudine Longitudine Altitudinea
medie
Nr. de probe
(ADNn/ADNcp)
Specia
1 Apa Sărată (MM) Depresiunea Maramureș 47040’ 23029’ 265 m 50/5
C. b
etulu
s
2 Teaca (BN) Depresiunea Colinară a Transilvaniei-
Subcarpații Transilvaniei
46052’ 24032’ 465 m 50/5
3 Roșcani (IS) Podișul Moldovei - Câmpia Moldovei 47026’ 27024’ 146 m 50/5
4 Panciu (VN) Subcarpații de Curbură - Subcarpații Vrancei 46004’ 27001’ 303 m 50/5
5 Babadag (TL) Podișul Dobrogei - Podișul Babadag 44051’ 28041’ 110 m 50/5
6 Măcin (TL) Podișul Dobrogei - Munții Măcin 45014’ 28011’ 160 m 0/5
7 Warthe (BV) Carpații de Curbură - Munții Postăvarul 45039’ 25034’ 615 m 0/5
8 Tâmpa (BV) Carpații de Curbură - Munții Postăvarul 45038’ 25035’ 660 m 0/5
9 Gura Teghii (BZ) Subcarpții de Curbură - Subcarpații Buzăului 45032’ 26028’ 665 m 0/8
10 Măgura (BZ) Subcarpții de Curbură - Subcarpații Buzăului 45016’ 26033’ 255 m 0/8
11 Colți (BZ) Subcarpții de Curbură - Subcarpații Buzăului 45022’ 26023’ 452 m 0/5
12 Lotrișor (VL) Carpații Meridionali - Munții Lotrului 45017’ 24012’ 995 m 50/7
13 Leamna (DJ) Câmpia Română - Câmpia Olteniei 44018’ 23042’ 119 m 50/5
14 Baia de Aramă (MH) Podișul Mehedinți 44057’ 22045’ 482 m 50/5
15 Stârmina MH) Câmpia Română-Câmpia Olteniei 44030’ 22046’ 112 m 0/3
16 Lugoj (TM) Câmpia de Vest-Câmpia Banatului 45042’ 21058’ 230m 0/5
17 Săvârșin (AR) Depresiunea Mureșului 46000’ 22013’ 150 m 0/5
18 Huedin (CJ) Carpații Occidentali - Munții Apuseni 46056’ 22049’ 485 m 0/5
Total 400/96
1 Roșcani (IS) Podișul Moldovei - Câmpia Moldovei 47026’ 27024’ 162 m 50/6
C.o
rien
tali
s 2 Murfatlar (CT) Podișul Dobrogei - Podișul Dobrogei de Sud 44009’ 28023’ 55 m 50/6
3 Cândești (BZ) Subcarpații de Curbură - Subcarpații Buzăului 45016’ 26040’ 212 m 50/5
4 Leamna (DJ) Câmpia Română - Câmpia Olteniei 44017’ 23043’ 155 m 50/5
5 Baia de Aramă (MHA) Podișul Mehedinți 44057’ 22045’ 491 m 50/5
6 Stârmina (MHS) Câmpia Română - Câmpia Olteniei 44029’ 22045’ 200 m 50/5
Total 300/32
ADNn – ADN-ul nuclear; ADNcp – ADN-ul cloroplastic.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
17
Probele de analiză (lujeri cu muguri sau frunze) au fost recoltate din 754 de arbori maturi
(454 de C. betulus și 300 de C. orientalis). Pentru analizele de ADN nuclear s-au recoltat câte 50
probe din fiecare populație, iar pentru cele de ADN cloroplastic s-au efectuat determinări la câte
5-8 arbori/populație. De altfel, literatura de specialitate (Pons și Petit, 1995) consideră că sunt
suficienți 5 arbori/populație pentru a caracteriza structura genetică haplotipică, eșantionaje
similare fiind utilizate în multe studii efectuate la cvercinee (Slade et al. 2008; Pliura et al. 2009).
În cazul de față nu s-a pus condiția ca distanța între exemplare să fie de cel puțin 50 m
(condiție care urmărește evitarea sau diminuarea probelor ca exemplarele să fie înrudite),
deoarece un obiectiv secundar al cercetărilor efectuate a avut în vedere efectuarea de analize
genetice spațiale intrapopulaționale. Poziția în teren a fiecărui arbore a fost înregistrată cu GPS-
ul. Conservarea materialului vegetal s-a realizat prin depozitarea într-un freezer (-600C), în pungi
etichetate, până în momentul extragerii ADN-ului.
3.2 Metode de cercetare
3.2.1 Analiza ADN-ului nuclear cu markeri de tipul SSR
3.2.1.1 Pregătirea probelor și izolarea ADN-ului
Pregătirea probelor în vederea izolării ADN-ului presupune secționarea a 5-6 muguri (se
înlătură solzi), respectiv tăierea cât mai mărunt a unei frunze din care se va recolta materialul
necesar analizei (aproximativ 50 mg pentru fiecare arbore).
Pentru extragerea ADN-ului din țesutul mugurelui/frunzei s-a utilizat protocolul CTAB
(Doyle și Doyle, 1987), care presupune o succesiune de pași: încărcarea materialului vegetal în
tuburile furnizate, adăugarea bilelor de wolfram (la Byozime tuburile sunt încărcate cu bile mai
mici de cuarţ), măcinarea la o moară electronică la frecvenţe mari, centrifugarea, adăugarea de
soluţii specifice pe bază de etanol (furnizate în kit), extragerea supernatantului, spălarea ADN cu
diferite substanţe pe bază de etanol, păstrarea ADN-ului (substanţele folosite sunt pe bază de apă
deoarece astfel ADN-ul devine solubil).
3.2.1.2 Testarea calității și concentrației ADN-ului izolat
Testarea ADN-ului pe gel de agaroză
Determinarea calității și cantității ADN-ului s-a realizat cu ajutorul electroforezei
orizontale într-un gel de agaroză de 100 ml soluție TAE (tris-acetat-EDTA 1%) și 1,5 g agaroză,
la o tensiune de 100 V, timp de 45 de minute, în tampon de migrare TAE1x. Ulterior, gelul a fost
colorat într-o soluţie de Gel Red (1%) timp de 20 de minute. În final, cantitatea de ADN a fost
estimată în lumina ultravioletă a transiluminatorului UVP, cu ajutorul scării prestabilite.
a) a)
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
18
Măsurarea cantității de ADN cu spectrofotometrul NanoDrop8000
A doua metodă de testare a calității și concentrației ADN-ului s-a realizat cu ajutorul
spectrofotometrului NanoDrop 8000 (Thermo Scientific; USA). Acest dispozitiv măsoară până la
96 de probe într-un interval de timp scurt și nu necesită o cantitate mare de ADN (1 µl).
3.2.1.3 Reacția de polimerizare în lanț (PCR)
Toate reacțiile de polimerizare în lanț s-au efectuat pe mașina termocycler ,,Corbett Palm-
Cycler CG1-96”, aptă să scadă și să ridice temperatura din tuburile de reacție după un protocol
prestabilit. ADN-ul nuclear s-a analizat cu ajutorul a șapte markeri moleculari la carpen, respectiv
cinci la cărpiniță, pentru o bună diferențiere a speciilor (Tabelul 3.2). Acești markeri genomici
(SSRs) au fost dezvoltați pentru Carpinus spp. într-un singur studiu european de către Prinz și
Finkeldey (2015).
Procedura de lucru adoptată a presupus gruparea SSRs nucleari în două kituri multiplex la
cărpiniță și patru kituri multiplex la carpen (din kitul K.2.2 a făcut parte și markerul Cb_12b, dar
în urma citirii electroforegramelor acesta a fost exclus). Volumul unei reacții a fost de 10 µl, dintre
care: 2,00 µl ADN, 1,50 µl PCR Puffer, 1,50 µl MgCl2, 1,00 dNTPs µl, 0,10 µl Promega Taq
Polymerase, 0,90 µl H2O şi fiecare primer la diferite concentrații (Tabelul 3.2).
Tabelul 3.2 Gruparea microsateliților în multiplexe PCR
Table 3.2 The grouping of markers in PCR multiplexes
Kitul Marker Concentrația
primerilor (µl)
Temperatura
de legare
Specia
K1.1 Cb_17 0.7 61 °C
C
. b
etulu
s
Cb_33 0.8
K1.2 Cb_29 0.8 61 °C
Cb_48a 0.7
K2.1 Cb_15b 0.8 60 °C
Cb_49a 0.7
K2.2 Cb_37a 0.8 61 °C
K1 Cb_37a 0.7 60 °C
C.
ori
enta
lis Cb_49a 0.7
K2 Cb_29 0.7
61 °C Cb_33 0.7
Cb_48a 0.8
Reacţia de polimerizare în lanţ este precedată de diluţia ADN-ului, care constă în
adăugarea unei anumite cantităţi de apă bidistilată peste soluţia obţinută (1:30, adică la 2 μl de
ADN s-au adăugat 58 μl de apă nucleară pură).
După terminarea procesului, produsul PCR a fost testat prin electroforeză orizontală în
1,5% gel de agaroză, la tensiunea de 100 V, timp de 25 minute. Scopul acestui test este de a selecta
a)
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
19
markerii cei mai buni care arată amplificare de succes și pentru a identifica intensitatea produselor
PCR pentru scanarea secvențelor genomului analizat.
3.2.1.4 Electroforeza capilară
Protocolul de laborator pentru determinarea genotipurilor prevede reactivi ce sunt compuși
din: 2 µl produs PCR diluat (1:20), 37,6 µl Sample Loading Solution (SLS400) și 0,32 µl Size
Standard, pentru o singură probă. Markerii sunt vizualizați sub formă de semnale florescente pe
electroforegrame, utilizând metoda FRAG-3, pe secvențiatorul Beckman Coulter GeXP.
Preluarea datelor se face vizual deoarece interpretarea electroforegramelor este una
dificilă, asfel încât lecturarea manuală a putut evita erorile care pot apărea dacă această operație
s-ar fi realizat automat. Carpenul este o specie octoploidă și, ca atare, poate prezenta până la opt
variante alelice pentru orice marker dat, ceea ce face ca interpretarea electroforegramelor să fie
una laborioasă. Genotipurile au variat de la o singură alelă până la opt alele diferite. Cărpinița
fiind o specie diploidă, prezintă două alele pentru fiecare genotip.
Datele obținute în urma citirii electroforegramelor se introduc într-un fișier Microsoft
Excel, în scopul rounjiri lungimii alelelor la numere întregi, deoarece aceeași alelă poate varia de
la 0,1-1 pb în cadrul unui locus genic. În acest mod se realizează structura genotipică a fiecărui
arbore pentru fiecare marker luat în studiu.
3.2.2 Analiza ADN-ului cloroplastic cu markeri de tipul SSRs
În cadrul acestei metode s-a utilizat ADN-ul total obținut tot prin metoda CTAB (Doyle
și Doyle, 1987) de izolare. Din fiecare populație s-au analizat probe de la câte 5-8 arbori.
Analizele s-au efectuat pentru trei primeri cloroplastici universali și anume: ccmp4, ccmp7
și ccmp10 dezvoltați de Weising și Gardner (1999).
În continuare s-a procedat în mare parte la fel ca la analizele de ADN nuclear, singurele
diferențe s-au înregistrat, în primul rând, la protocolul PCR, iar în al doilea rând, diferă modul de
citire, interpretare și prelucrare a datelor obținute. Analiza SSRs cloroplastici diferă de analiza
SSRs nucleari, deoarece cloroplastele sunt haploide și moștenite uniparental. Prin urmare, SSRs
din același organism sunt descriși ca un ,,haplotip” care devine unitatea de analiză (spre deosebire
de alelele din cadrul SSRs nucleari) (Ebert și Peakall, 2009).
Genotiparea s-a realizat tot cu ajutorul secvenţiatorului Beckman-Coulter, iar semnale
fluorescente care redau valorile specifice perechilor de baze se introduc într-un fișier Microsoft
Excel. Baza de date astfel rezultată se va exporta, astfel încât să fie utilizată ca input pentru diferite
soft-uri cu care se va lucra mai departe.
a)
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
20
3.3 Programe și metode statistice utilizate în analiza datelor
3.3.1 Analiza ADN-ului nuclear
3.3.1.1 Determinarea erorilor de citire a electroforegramelor
Testarea markerilor genetici pentru echilibrul Hardy-Weinberg (abv. HWE) a devenit o
rutină în aproape toate studiile genetice, deoarece reprezintă un instrument important pentru
detectarea erorilor genotipului, astfel încât abaterile de la acest echilibru pot indica
consangvinizarea, stratificarea populației și chiar probleme în genotipare (Wigginton et al. 2005;
Graffelman și Weir, 2016). Pentru a vedea dacă există abateri de la acest echilibru, ca o urmare a
excesului/deficitului de heterozigoți, s-a folosit programul GENEPOP ver. 4.2.1 (Rousset, 2008).
Dezechilibrul linkage (engl. linkage desequilibrum, abv. LD) reprezintă asocierea non-
aleatoare a alelelor la unu sau mai mulți loci (Mackay și Powell, 2007; Slatkin, 2008) și este la
rândul său afectat de mai mulți factori genetici și non-genetici, inclusiv: recombinarea, driftul
genetic randomizat, selecția, fluxul de gene (Gaut și Long, 2003), chiar și temporar. S-a calculat
cu ajutorul testului Fisher, bazat pe analiza ,,Markov chain” (10 000 randomizări, 100 loturi și 5
000 iterații/lot), tot în programul GENEPOP ver. 4.2.1 (Rousset, 2008). Inițial s-a realizat un fișier
input cu ajutorul programului GeneAlEx 6.5 (Peakall și Smouse, 2012), după care a fost importat
în programul GENEPOP ver. 4.2.1. (Rousset, 2008).
O altă analiză genetică preliminară a constat în identificarea alelelor nule. O alelă este
considerată nulă atunci când nu reușește să se amplifice în reacția PCR datorită prezenței unor
mutații într-o secvență de legare a primerilor la locusul respectiv sau care nu se observă din cauza
eșantionării incomplete (Chapuis și Estoup, 2007). Pentru a determina frecvența alelelor nule în
cadrul populațiilor de cărpiniță s-a utilizat programul MICROCHECKER 2.2.3 (Van Oosterhout
et al. 2004). Programul MICROCHECKER a utilizat teste ce au presupus 1 000 de randomizări
ale alelelor la fiecare locus din oricare populație, cu un interval de încredere de 95%.
Codificarea genotipurilor la speciile poliploide este sensibilă la prezența alelelor nule. Nu
avem însă niciun program care să testeze prezența alelelor nule la aceste specii comparativ cu cele
diploide (Dufresne et al. 2014). În cazul nostru ne bazăm pe ipoteza că acești markeri au fost
dezvoltați special pentru carpen deoarece, de obicei, frecvența alelelor nule crește rapid atunci
când SSR sunt transferați la alte specii (Li et al. 2003). În cazul dat al carpenului, presupunem că
alelele nule ar fi minime și cu o influență redusă asupra indicilor de diversitate genetică. Aceste
erori de citire s-au efectuat doar pentru cărpiniță, pentru că majoritatea metodelor și programelor
statistice au fost dezvoltate inițial pentru speciile diploide, astfel încât speciile poliploide prezintă
niște goluri din acest punct de vedere.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
21
3.3.1.2 Calculul indicilor de diversitate genetică
Cu ajutorul programului GenAlEx 6.5 (Peakall şi Smouse, 2012) s-au calculat următorii
indici de diversitate genetică pentru carpen: Ne (numărul efectiv de alele pe locus), Na (numărul
mediu de alele pe locus), He (heterozigoția așteptată; diversitatea genetică); PPL (proporția locilor
polimorfi), precum și numărul de alele private pentru fiecare populație; respectiv pentru cărpiniță:
Ne (numărul efectiv de alele pe locus), Na (numărul mediu de alele pe locus), Ho (heterozigoția
observată), He (heterozigoția așteptată; diversitatea genetică), F (indicele de fixare), PPL
(proporția locilor polimorfi). Compararea valorilor indicilor de diversitate genetică între cele două
specii nu este concludentă deoarece baza de date este una diferită (codominant - cărpiniță,
dominant - carpen). S-a testat semnificația statistică între valorile indicilor de diversitate estimați
pe baza SSRs cu ajutorul testului parametric t Student.
Diferențierea genetică (GST) a fost calculată pentru carpen folosind programul POPGEN
version 1.32 (Yeh et al. 1997), iar pentru cărpiniță (FST) utilizând programul ARLEQUIN 3.5
(Excoffier și Lischer, 2010).
Diversitatea genetică între și în interiorul populațiilor a fost examinată prin analiza
varianței moleculare (AMOVA), luând în considerare toate speciile simultan, diferite perechi de
grupuri de specii/populații. Testul AMOVA s-a realizat pe baza matricelor datelor binare, pentru
a măsura diferențierea populațiilor (Excoffier, 1992) dar și pentru a calcula valorile de
semnificație, utilizând programul GenAlEx 6.5 (Peakall şi Smouse, 2012). Aceaste valori de
semnificație au fost estimate prin măsurarea parametrului PhiPT, un analog al indicelui FST
calculat ca parte a procedurii AMOVA. Valuarea lui p pentru estimarea indicilor de diferențiere
a fost obținută după 9 999 de permutări (Excoffier,1992).
3.1.1.3 Analiza structurii genetice spațiale
Structura genetică spațială intrapopulațională a fost determinată cu ajutorul programului
GenAlEx 6.5 (Peakall și Smouse, 2012) pentru toți indivizii luați în studiu, pe populații. S-a
calculat coeficientul de autocorelație r, pentru fiecare clasă de distanță, dintre matricea distanțelor
genetice și matricea distanțelor geografice. Distanțele geografice au fost determinate cu ajutorul
coordonatelor spațiale (latitudine și longitudine) luate cu GPS-ul pentru fiecare individ și
transformate în coordonate Stereografice 70. Distanțele genetice atât pentru datele dominante
(carpen) cât și pentru datele codominante (cărpiniță) au fost calculate pe baza metodei propuse de
Peakall și Smouse (2012).
Coeficientul de autocorelație oferă o măsură de asemănare dintre perechile de indivizi a
cărei separare geografică se încadrează în clasa de distanță specificată. O abatere semnificativă
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
22
de la ipoteza nulă (r = 0) este obținută atunci când valoarea lui r este pozitivă ori negativă și
depășește intervalul de încredere de 95%. Când valorile lui r nu depășesc intervalul de încredere
de 95% rezultă absența structurii genetice spațiale. O valoare apropiată de 0 arată lipsa unei
corelații între distanțele genetice și distanțele geografice, adică o distribuție genetică randomizată.
Valorile negative sugerează un model spațial dispersat. Pe baza informațiilor redate de Degen et
al. (2001), unde fiecare clasă de distanțe să cuprindă cel puțin 30 de perechi de arbori, astfel încât
s-a stabilit mărimea intervalului de distanță la 25 m pentru 10 clase de mărime, oferind o evaluare
între 0 și 250 m. Testul neparametric de eterogenitate a lui Smouse et al. (2008) s-a determinat
folosind 999 de permutări aleatorii și 1 000 de estimări bootstrap.
Structura genetică spațială interpopulațională pentru carpen și cărpiniță a fost estimată
utilizând programul STRUCTURE (Pritchard, et al. 2000), care are la bază metoda Bayesiană.
Structura genetică pentru fiecare populație a fost analizată în mod independent, folosind 100 000
de pași pentru burn-in, urmată de 200 000 repetări Markov Chain Monte Carlo (MCMC) pentru K
= 1-9 la carpen și K = 1-7 la cărpiniță, fiecare cu 10 serii independente, utilizând opțiunea frecvența
alelelor corelate (Allele Frequencies Correlated) și un model mixt (Admixture Model; la carpen
fără opțiunea LOCPRIOR, iar la cărpiniță cu opțiunea LOCPRIOR - ceea ce presupus includerea
în model a localizării geografice a indivizilor eșantionați). S-a utilizat atât probabilitatea
posterioară a datelor pentru valoarea dată de K (Ln Pr (X/K)), cât și rata de schimbare (ΔK).
Numărul adecvat de grupuri omogene din punct de vedere genetic (K) s-a determinat
utilizând tot programul STRUCTURE (Pritchard, et al. 2000). În secțiunea ,,simulation summary”
programul afișează valorile medii ale logaritmului probabilității de estimare Ln Pr(X/K), astfel
încât mai multe studii evocă faptul că numărul de clustere corespunde acelei valori K pentru care
valoarea parametrului Ln Pr(X/K) este maximă (Ciofi et al. 2002).
O metoda mai precisă a fost cea descrisă de Evanno et al. (2005). Metoda a fost
implementată în programul ce este disponibil online, STRUCTURE HARVESTER V.0.6 (Earl și
VonHoldt, 2012) și calculează parametrul ΔK, care indică cel mai probabil număr de clustere.
Analiza cluster pentru cele două specii s-a realizat cu ajutorul programului PAST
(Hammer et al. 2001) având la bază și un suport statistic al clusterelor (1 000 bootstrap). Matricea
distanțelor genetice Nei a fost calculată în programul GenAlEx 6.5 (Peakall și Smouse, 2012) și
exportată în programul amintit mai sus. Populațiile cercetate au fost grupate prin metoda
,,aglomerativă” UPGMA (engl. Unweighted Pair Group Method Arithmetic Average).
Testul Mantel (Mantel, 1967) a fost utilizat pentru a estima corelația între distanțele
genetice și distanțele geografice între populațiile eșantionate folosind programul GenAlEx ver.
6.5 (Peakall și Smouse, 2012).
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
23
3.3.1.4 Testul ,,bottleneck”
Programul BOTTLENECK (Piry et al. 1999) calculează pentru fiecare populație/locus,
distribuția heterozigoției așteptate și numărul de alele observate în ipoteza echilibrului dintre
mutație și deriva genetică (generate de rata de mutație și numărul efectiv de alele). Trebuie să se
țină cont de relația dintre excesul heterozigoției și numărul de alele observate în funcție de timpul
scurs de la începutul blocajului (Cornuet și Luikart, 1996). Este determinată valoarea lui ,,p”
(p<0,05) pentru heterozigoția observată și distribuția frecvenței alelelor pentru a detecta dacă a
existat o schimbare provocată de blocajele recente (Cornuet și Luikark, 1996).
Programul cuprinde trei modele diferite de analiză utilizate pentru a compara excesul
heterozigoției observate și heterozigoția așteptată: modelul IAM (engl. Infinite Allele Model),
modelul SMM (engl. Stepwise Mutation Model) și modelul TPM (engl. Two Phase Model).
S-a ales testul simplu de semnificație (engl. sing test) pentru a evalua dacă s-a produs sau
nu un blocaj genetic recent la nivelul populațiilor. Acest test măsoară excesul temporar de
heterozigoți care rezultă dintr-o populație redusă (Luikart et al. 1998). O valoare pozitivă a
testului de semnificație (He-Heq) indică un exces de heterozigoție. În cazul în care numărul de
markeri cu exces de heterozigoție este semnificativ mai mare decât jumătate, sugerează că
populația a trecut recent printr-un blocaj genetic.
Testele utilizate în detectarea blocajului genetic pot duce la concluzii eronate cu privire la
pierderea diversității genetice în populațiile care au supraviețuit mai multor generații, chiar dacă
condițiile de testare sunt îndeplinite (Peery et al. 2012).
Testul ,,bottleneck” s-a aplicat doar pentru populațiile de cărpiniță, pentru că arealul
acestei specii este fragmentat, cu populații mici și izolate. Neaplicarea testului în populațiile de
carpen luate în studiu a fost determinat atât din faptul că acestea prezintă un număr mare de
exemplare, cât și ca urmare a conectivității lor cu arealul reprezentativ al speciei în România.
3.3.2 Analiza ADN-ului cloroplastic
Pentru analiza haplotipurilor s-au analizat probe de la 96 arbori de carpen și 32 arbori de
cărpiniță. Haplotipurile au fost definite ca o combinație de alele (secvențe ADN) găsite la fiecare
locus pe un cromozom, care sunt moștenite împreună de la un singur părinte (Lloyd et al. 2015).
Programul PERMUT & CpSSR (Pons și Petit, 1996) a fost utilizat pentru a calcula indicii
de diversitate genetică (hs = diversitate intrapopulațională, ht = diversitatea totală și GST =
diferențierea genetică pentru toate populațiile). Nivelurile de diferențiere în genomul cloroplastic
pentru alelele neordonate (GST) și alele ordonate (RST) au fost calculate folosind același program.
O analiză ierarhică a varianței moleculare (AMOVA) a fost realizată pentru a estima distribuția
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
24
variației genetice între și în interiorul populațiilor, folosind programul GenAlEx 6.5 (Peakall și
Smouse, 2012). Distanța genetică a fost calculată cu HAPLOTYPE ANALYSIS© ver. 1.05
(Eliades and Eliades, 2009).
Pentru a determina relațiile filogenetice dintre populații, s-a utilizat metoda
,,aglomerativă” UPGMA (Unweighted Pair Group Method Arithmetic Average), din cadrul
programului PAST (Hammer et al. 2001), având la bază și un suport statistic al clusterelor (1 000
bootstrap). Pentru a detecta relațiile intraspecifice ale ADN-ului din haplotipurile cloroplastice a
fost construită o rețea de haplotipuri MJ (engl. Median Joining) utilizând programul NETWORK
versiunea 4.6 (Bandelt et al. 1999) (disponibil la adresa: http://www. fluxus
engineering.com/sharenet_rn.htm).
Analiza corelației dintre matricele v distanțelor genetice (Nei) și distanțele geografice
(GGD) s-a analizat cu ajutorul testului Mantel (Mantel, 1967), utilizând software-ul GenAlEx 6.5
(Peakall și Smouse, 2012).
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
25
Capitolul IV. REZULTATE ȘI DISCUȚII
4.1 Structura alelică și diversitatea genetică la nivelul ADN-ului nuclear
4.1.1 Stabilirea protocolului de interpretare a electroforegramelor pentru specia
octoploidă Carpinus betulus
Utilizarea microsateliților la speciile poliploide nu este, în general, atât de simplă ca în
cazul speciilor diploide. În trecut, această metodă de a determina numărul de copii de alele SSR
la speciile poliploide a fost descrisă ca fiind în cea mai mare parte fără succes (Falque et. al. 1998).
În prezent, se fac numeroase studii pentru a obține informații utile despre distanțele genetice sau
identificarea cultivarelor (Esselink et al.2004), precum și despre genetica populației și analize de
paternitate. În concluzie, genotipurile nu pot fi determinate cu certitudine, folosind astfel de
metode, în timp ce indicii de diversitate genetică populaționali pot fi estimați.
Interpretarea variației dimensiunilor fragmentelor este mai laborioasă la speciile poliploide
față de speciile diploide. Speciile octoploide prezintă mai puțin de opt variante alelice, sau chiar
opt alele, pentru orice locus dat (Ashley et al. 2003), însă acest număr uneori este chiar mai mare
în cazurile în care duplicările genelor oferă un număr mai mare de loci. La carpen (specie
octoploidă) pot să apară homozigoți (o alelă; fig. 4.1a) sau heterozigoți compleți (opt alele; fig.
4.1b), dar pentru cei parțial heterozigoți (fig.4.1c ) numărul de copii ale alelelor este imposibil de
determinat cu certitudine. Esselink et al. (2004) au propus o metodă pentru a estima numărul de
copii, folosind dimensiunea vârfurilor microsateliților. Această metodă este mai greu de aplicat
atunci când crește poliploidia. La speciile diploide există maximum două alele/locus (când cele
două alele sunt diferite individul este heterozigot la locusul respectiv, iar când cele două alele sunt
identice individul este homozigot).
a) b)
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
26
c)
Figura nr. 4.1 Exemple de electroforegrame pentru un individ homozigot (a), heterozigot total
(b) și heterozigoți parțiali (c)
Figure nr. 4.1 Examples of electroforegrame for a homozygous individual (a), total
heterozygous (b) and partial heterozygous (c)
Metoda abordată în această lucrare a fost cea a citirii manuale a electroforegramelor, astfel
încât s-a luat ca alelă adevărată cea care a înregistrat o intensitate mai mare, precum și alelele cu
o intensitate mai scazută. Această metodă a fost utilizată, de exemplu, într-un studiu realizat de
Esselink et al. (2004). De obicei, alelele mai lungi pot fi omise atunci când citirea se realizează
automat cu ajutorul programului, ca urmare a amplificării mai slabe a ADN-ului (fig. 4.2). De
asemenea, prezența unor alele care diferă doar printr-o singură pereche de baze (engl. stuttering)
poate fi neglijată.
Figura 4.2 Exemplu de electroforegramă unde alelele mai lungi prezintă intensitate scăzută
Figure 4.2 Exemple of electrophoregrame where longer alleles have low intensity
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
27
Interpretarea manuală a electroforegramelor a avut drept scop reducerea acestor erori de
citire generate de preluarea automată a datelor. În cazul în care dimensiunea alelei este întâlnită
între mai multe perechi de baze, interpretarea devine dificilă, astfel încât trebuie să se facă
distincția între ,,benzi false” (engl, ,,sttuter band”) și alela adevărată (Flores-Rentería și Krohn,
2013). Pentru a reduce aceste erori de interpretare, citirea electroforegramelor s-a realizat de trei
ori, în mod independent.
Microsateliții sunt considerați markeri codominanți la speciile diploide (Bai, 2014), având
un avantaj diferit cu privire la identificarea exactă a genotipurilor. Pentru a evalua diversitatea
genetică la speciile poliploide cu acești markeri, datele microsateliților codominanți au fost tratate
ca date binare dominante (în cazul în care o alela a fost prezentă, aceasta s-a marcat cu valoarea 1,
iar când este absentă i s-a atribuit valoarea 0), ceea ce reduce conținutul de informații și se opune
unei analize care să ia în considerare heterozigoții direct observabili sau distribuția frecvențelor
alelelor (Dufresne et al. 2014; Clark și Schreier, 2015). În acest mod s-au generat genotipuri binare
pentru toți indivizii luați în studiu. O justificare suplimentară pentru utilizarea acestui tip de analiză
pentru markeri codominanți utilizați la speciile poliploide a decurs din modalitățile similare de
interpretare găsite în studiile realizate de: Sampson și Byrne (2012), Clark și Schreier (2015) etc.
Deoarece benzile de stutter apar de obicei înainte de vârfurile principale (Prinz și Finkeldey, 2015),
vârfurile microsateliților au fost citite în ordine descrescătoare. Datorită profilelor SSR mult mai
diverse, în multe studii la speciile popliploide genotiparea s-a realizat cu mai puțini markeri
(Esselink et al. 2004; Andreakis et al. 2009). Acest tip de analiză permite determinarea indicilor
de diversitate genetică, a structurii și diferențierii genetice.
Cu alte cuvinte, majoritatea instrumentelor, tehnicilor de lucru și a programelor statistice
pentru evaluarea diversității genetice populaționale, care au fost dezvoltate pentru speciile
diploide, de cele mai multe ori nu dau randament și pentru speciile poliploide.
O primă problemă pe care o întâlnim pentru utilizarea SSR la speciile poliploide o
reprezintă alelele nule. Testele pentru alelele nule (engl. null alleles) și alte artefacte (engl. artifact)
rezultate în urma reacției PCR nu pot fi utilizate pe aceste specii, deoarece necesită calcularea
frecvențelor alelelor exacte (Dufresne et al. 2014). Determinarea alelelor ,,stuttering” (cauzate de
alunecarea de replicare din timpul reacției PCR) la microsateliții care prezintă mai multe alele este
mai dificilă și de mare importanță pentru evaluarea calității amprentelor (Pfeiffer et al. 2011).
Narayan et al. (2015) au prezentat o tehnică pentru identificarea alelelor nule, însă aceasta
presupune utilizarea mai multor tipuri de țesuturi pentru un singur arbore. Acest protocol în
vederea analizei de genotipare este unul robust, însă costisitor. Pe de altă parte, frecvența alelelor
nule crește rapid atunci când markerii SSR sunt transferați la alte specii. În cazul nostru ne bazăm
pe faptul că acești markeri au fost dezvoltați special pentru carpen, ceea ce ar presupune ca alelele
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
28
nule să nu aibă incidență sporită. De aceea, presupunem că alelele nule ar fi minime și cu o
influență redusă asupra indicilor de diversitate genetică.
O altă problemă o reprezintă determinarea frecvenței alelelor, care au un rol important în
analiza geneticii populaționale. În primul rând, frecvențele alelelor prezintă o mare importanță în
studierea factorilor care influențează structura demografică a populației (migrația, creșterea
populației, bottleneck) (Dufresne et al. 2014), iar în al doilea rând ajută la calcularea indicilor de
diversitate genetică și la estimarea diferențierii genetice a populațiilor și a structurii acestora. În
cazul speciilor poliploide, lucrurile nu stau la fel de bine comparativ cu cele diploide, deoarece
calculul frecvenței alelelor rar poate fi efectuat. Cu ajutorul programului SPAGEDI (Hardy și
Vekemans, 2002) s-a putut estima frecvența alelelor în cazul poliploizilor, astfel încât se consideră
că fiecare dintre alelele din heterozigoții parțiali are o probabilitate egală de a fi prezentă în mai
mult de o copie (Dufresne et al. 2014). Însă dezavantajul este că rezultatul duce la o minimalizare
a frecvențelor alelelor comune și o supraestimare a frecvențelor alelelor rare (Clark și Jasieniuk
2011). Cu alte programe (ATETRA, Van Puyvelde et al. 2010; STAMPP, Pembleton et al. 2013)
s-au calculat frecvențele alelelor și nivelurile de heterozigoție numai pe baza genotipurilor lipsite
de precizie și ignorând genotipurile cu date lipsă. Acest lucru poate duce la o frecvență subiectivă
a alelelor, deoarece heterozigoții parțiali sunt ignorați (Dufresne et al. 2014). Pentru a omite aceste
erori, s-a creat o matrice binară (1-prezența alelelor; 0-absența alelelor) și s-au aplicat programele
utilizate pentru markerii dominanți, determinând astfel frecvența alelelor.
Structura și diferențierea genetică se află printre obiectivele principale ale analizei genetice
populaționale. Aceste obiective au la bază principiul că populația trebuie să fie în echilibru Hardy
Weinberg, dar devierea de la acesta să fie minimă (Pritchard, et al. 2000). S-au făcut numeroase
studii la diferite specii poliploide unde s-a aplicat analiza Bayesiană (Sampson și Byrne, 2012;
Thomson et al. 2015; Samah et al. 2016) și au avut rezultate concludente. Programul cel mai
utilizat în literatura de specialitate (STRUCTURE, Pritchard et al. 2000) are la bază un algoritm
care determină genotipuri complete pentru fiecare individ pe baza genotipurilor parțiale ale
acestora, dar poate prezenta lipsă de claritate datorită prezenței heterozigoților parțiali (Falush et
al. 2007). În cadrul studiului nostru, s-a utilizat programul STRUCTURE, folosind opțiunea
alelelor recesive, care reprezintă genotipurile ambigue ale poliploizilor. În acest capitol cu obiectiv
metodologic s-a trecut nu numai date bibliografice, precum și metodele și analizele efectuate în
laborator. Acestea din urmă sunt necesare în elaborarea și stabilirea modalităților de interpretare a
electroforegramelor, în scopul reducerii erorilor de citire.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
29
4.1.2 Diversitatea genetică în populațiile de Carpinus betulus
4.1.2.1 Structura alelică
Alegerea unui anumit marker devine o problemă complexă, astfel încât poate avea un rol
important în determinarea structurii și a diferențierii genetice a populațiilor. Testarea markerilor
pe un număr mare de exemplare ar putea avea o influență remarcată asupra reducerii costurilor
precum și o semnificație evolutivă asupra rezultatelor.
La nivelul întregului eșantion (400 arbori), la cei șapte markeri analizați s-au observat 162
de alele, dintre care 151 (93,2%) sunt comune celor opt populații. Intervalele de variație a alelelor
la markerii analizați se încadrează sau chiar depășesc intervalele raportate de Prinz și Finkeldey
(2015) - cercetări efectuate, de asemenea, la carpen. Media de alele identificate pe marker a fost
aproximativ de 23 alele. Într-un studiu realizat pe un eșantion de 100 arbori de carpen, Cărăbuș et
al. (2016) au comunicat 148 de alele, ceea ce corespunde tendinței logice ca numărul de alele să
fie influențat de marimea eșantionajului. Secvențierea repetitivă a fost în general de 2 pb și nu sunt
alele care să se abată de la acestă unitate de repetare (excepție fac câteva alele care nu respectă
pasul secvenței repetitive, care determină o distanță între alele de o pereche de baze). Există câteva
zone din interval unde nu s-au identificat alele în nicio populație cercetată. Alelele au variat de la
1 la 8 pe arbore (Tabelul 4.1). Trei până la opt alele pe marker au fost observate cel mai frecvent
pentru fiecare arbore.
Numărul de alele per populație a variat între 11, pentru markerul Cb_17 în populația
Babadag, până la 25 de alele pentru markerul Cb_37 în populația Leamna (Tabelul 4.2). Cel mai
mare număr de alele (28 alele) s-a recenzat la markerul 37_Cb. Numărul de alele observate pentru
fiecare marker a variat cu 1-7 alele/marker față de cele raportate de către Prinz și Finkeldey (2015).
Cărăbuș et al. (2015) au relatat un număr relativ scăzut de alele/marker, pentru un eșantion de 98
de arbori genotipați la 4 markeri.
Alelele private au fost detectate în șase din cele opt populații analizate așa cum se poate
observa în tabelul 4.2. Aceste alele au avut o frecvență foarte scăzută (<2%), încadrându-se în
categoria alelelor considerate rare. Markerul Cb_48a s-a semnalat cel mai mare număr de alele
specifice doar într-o populație din cele opt (două alele). Acestea au avut o frecvență destul de
redusă (<2%), motiv pentru care considerarea lor ca alele private este discutabilă. Populațiile Apa
Sărată și Panciu nu a prezentat nicio alelă privată. Estimarea frecvenței alelelor nu a fost posibilă
la carpen, datorită nivelului ridicat de poliploidie.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
30
Tabelul 4.1 Variația numărului de alele observate pe individ
Table. 4.1 Variation of number alleles observed per sample
Marker Numărul de alele pe individ
Apa Sărată Teaca Roșcani Babadag Panciu Lotrișor Leamna Baia de Aramă
Cb_17 1-5 1-6 2-8 1-7 1-6 1-8 1-8 1-7
Cb_33 2-8 2-7 1-8 1-8 1-8 1-8 3-8 1-8
Cb_29 3-8 2-8 3-7 2-8 2-8 2-8 2-8 2-8
Cb_48a 2-8 1-8 3-8 2-8 3-8 2-8 3-8 3-8
Cb_15b 4-8 3-8 3-8 1-8 3-8 3-8 2-8 2-8
Cb_49a 3-8 3-8 3-8 2-8 3-8 4-8 3-8 2-8
Cb_37a 2-8 3-8 3-8 3-8 3-8 4-8 3-8 1-8
Tabelul 4.2 Numărul de alele observate în cele opt populații de carpen
Table 4.2 Alleles scored in the eight hornbeam populations
Marker Lungimea
perechilor de baze
Numărul de alele pe populație Numărul
total de alele Apa Sărată Teaca Roșcani Babadag Panciu Lotrișor Leamna Baia de Aramă
Cb_17 56-97 17 14 15 11 18 19 15 18 22
Cb_33 121-182 15 17 20 17 17 18 19 19 22
Cb_29 55-99 20 20 21 17 17 16 20 21 24
Cb_48a 126-188 13 18 17 16 17 18 17 17 20
Cb_15b 67-123 20 19 22 20 20 22 19 23 26
Cb_49a 147-185 18 18 20 19 18 19 16 16 20
Cb_37a 74-132 20 23 24 24 23 22 25 21 28
Numărul de alele private 0 2 2 1 0 2 3 1 11
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
31
4.1.2.2 Indicii de diversitate genetică
După cum se poate observa în tabelul 4.3, în cele opt populații luate în studiu, valorile au
fost ușor diferite pentru numărul mediu de alele pe locus (Na) și asemănătoare pentru numărul
efectiv de alele (Ne). Valorile maxime ale primului indice de diversitate genetică (Na) s-au
înregistrat în populația Roșcani (Na = 1,716), iar valoarea minimă pentru populația Apa Sărată (Na
= 1,531). Interesant este faptul că acestea sunt cele mai nordice populații analizate, însă prima este
în nord-estul României, respectiv cea de-a doua este din zona de nord, nord-vest, la circa 400 km
față de prima. Comparativ cu numărul mediu de alele pe locus, la numărul efectiv de alele se
observă o altă clasificare a populațiilor: valoarea maximă s-a obținut pentru populația Leamna (Ne
= 1,292) iar cea minimă pentru populația Teaca (Ne = 1,274), însă amplitudinea de variație de
0,018 a fost mult mai mică decât pentru Na (0,185).
Heterozigoția așteptată, cunoscută și sub denumirea de diversitatea genetică, este indicele
cel mai utilizat pentru caracterizarea variaţiei genetice intrapopulaţionale. Valoarea maximă a
diversității genetice se înregistrează în populația Leamna (He = 1,88), iar valoarea minimă în
populația Teaca (He = 1,75). Diversitatea genetică prezintă valori aproximativ similare în toate
populațiile, ceea ce face ca diferențele între valorile obținute pentru cele opt populații de carpen
să nu fie semnificative din punct de vedere statistic. Valoarea medie a diversității genetice obținută
în acest studiu (He = 0,181) este mai scăzută comparativ cu analizele efectuate cu ajutorul
markerilor AFLP în populația Săvârșin, situată în sud-vestul României (He = 0,3197; Coart et al.
2005). Aceste diferențe ar putea fi rezultatul determinării cu markeri diferiți, dar nu este exclusă
nici influența eșantionului redus de arbori evaluați în populația Săvârșin (doar 11 arbori, față de
50/populație în studiul de față). De altfel, se recomandă ca atunci când diversitatea genetică este
evaluată cu ajutorul markerilor SSR nucleari să se preleveze probe din cel puțin 20-30 de indivizi,
mai ales atunci când se efectuează evaluări într-o populație care are un nivel necunoscut de
diversitate (Pruett și Winker, 2008). Totuși, comparativ cu datele studiului de față, valori mai
ridicate ale diversității genetice s-au observat și pentru trei populații de carpen din România
analizate cu doar 4 markeri SSRn (He = 0,309; Cărăbuș et al. 2015).
Proporția locilor polimorfi a variat de la 76,54% în populația Apa Sărată, până la 85,80%
în populația Roșcani.
La nivelul indicilor de diversitate genetică analizați, populația Leamna înregistrează valori
puțin mai ridicate decât celelalte populații analizate, cu excepția numărului mediu de alele pe locus
(Na) și a proporției locilor polimorfi.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
32
Tabelul 4.3 Valori ale indicilor de diversitate genetică în populațiile de carpen
Table 4.3 Values of genetic diversity indices in hornbeam populations
Populația Na Ne I He PPL (%)
Apa Sărată
Media 1,531 1,282 0,284 0,178 76,54
Eroarea standard 0,067 0,025 0,019 0,013
Teaca Media 1,593 1,274 0,281 0,175 79,63
Eroarea standard 0,063 0,025 0,019 0,013
Roșcani Media 1,716 1,284 0,296 0,183 85,80
Eroarea standard 0,055 0,024 0,018 0,013
Babadag Media 1,543 1,277 0,289 0,179 77,16
Eroarea standard 0,066 0,024 0,018 0,013
Panciu Media 1,617 1,278 0,284 0,177 80,86
Eroarea standard 0,062 0,025 0,019 0,013
Lotrișor Media 1,654 1,278 0,293 0,180 82,72
Eroarea standard 0,060 0,024 0,018 0,013
Leamna Media 1,630 1,292 0,303 0,188 81,48
Eroarea standard 0,061 0,024 0,018 0,013
Baia de Aramă Media 1,667 1,284 0,296 0,184 83,33
Eroarea standard 0,059 0,024 0,018 0,013
Total Media 1,619 1,281 0,291 0,181 80,94
Eroarea standard 0,022 0,009 0,006 0,005
Na - numărul mediu de alele pe locus; Ne - numărul efectiv de alele pe locus; I - Indicele Shannon;
He – Heterozigoția așteptată (diversitatea genetică); PPL – proporția locilor polimorfi.
Speciile poliploide sunt mai puțin sensibile la eroziunea genetică datorită capacității lor de
a acumula o mare diversitate genetică în seturi de cromozomi și sensibilitate mai mică la efectele
alelelor dăunătoare (Comai, 2005; Palop-Esteban et al. 2011). Analiza indicilor de diversitate
moleculară nu a relevat diferențe semnificative statistic între populațiile luate în studiu. Valorile
consemnate pentru întregul set de indici ai diversității genetice indică o relativă uniformitate a
populațiilor de carpen din România, aspect care ar putea decurge din posibilitatea realizării cu
intensitate destul de mare a fluxului de gene interpopulațional care s-ar fi putut derula de-a lungul
centurii subcarpatice, dar și prin trecătorile/pasurile care traversează Carpații Meridionali sau cei
Orientali.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
33
4.1.2.3 Diferențierea genetică
Distribuția diversității genetice în interiorul și între populații este determinată de procesele
genetice cum ar fi: selecția, deriva genetică și fluxul de gene, precum și de caracteristicile
ecologice, demografice și istorice ale plantelor (Duminil et al. 2009).
Indicele de diferențiere genetică (GST) indică o valoare scăzută (0,033), ceea ce sugerează
un flux de gene ridicat la nivelul ADN-ului nuclear, care poate fi consecința arealului
cvasicontinuu al speciei în zonele subcarpatice. Această valoare scăzută denotă că cea mai mare
parte a variabilității genetice se regăsește la nivelul intrapopulațional.
Aplicarea testului AMOVA (GenAlEx 6.5; Peakall și Smouse, 2012) relevă un aport de
4% a variației genetice între populații, iar cea mai mare parte a acesteia este deținută în interiorul
populațiilor (96%). Valoarea lui PhiPT a fost foarte semnificativă (PhiPT = 0,043; P = 0,0001).
Această diferențiere genetică scăzută între populații ar putea fi explicată de un flux de gene activ,
datorită lipsei unor bariere.
Sunt puține studii care descriu diversitatea genetică în interiorul și între populații speciilor
poliploide. Într-un studiu realizat la Juniperus thurifera a rezultat că diversitatea genetică în
interiorul populațiilor a fost de 90%, între populații de 4% iar între regiuni de 6% (Teixeira et al.
2014). În cazul poliploizilor este de așteptat să se mențină un nivel ridicat al diversității genetice
din cauza multiplicării genomului. La carpen, specie octoploidă, variabilitatea genetică ridicată la
nivel intrapopulațional poate fi explicată, într-o anumită măsură, și prin faptul că rezultă
combinații între mai mult de două alele la un marker genic.
4.1.2.4 Analiza structurii genetice spațiale intrapopulaționale
Valori ale acestui coeficient au fost observate în afara intervalelor de încredere de 95% (U
- sus și L - jos) ale ipotezei nule pentru șase din cele opt populații analizate (fig. 4.4. a-f). Cu
excepția populațiilor Roșcani și Panciu, valori semnificative atât pozitive cât și negative, s-au
întâlnit în toate populațiile. În cinci populații, valorile coeficientului de autocorelație au fost
semnificative în prima clasă de distanțe (25 m), cu cea mai mare valoare negativă a lui r = -0,109
în populația Teaca, respectiv pozitivă (r = 0,043), în populația Baia de Aramă. Structurile genetice
spațiale sunt dependente și de densitatea populației, deoarece în cazurile de densitate mică crește
distanța de dispersie a polenului, și invers (Vekemans și Hardy, 2004; Curtu et al. 2015). Ori, în
populațiile Teaca și Baia de Aramă, proporția de participare a carpenului este foarte mare, iar
arboretele au consistență ridicată (peste 0,8), ceea ce ar putea avea repercusiuni asupra valorii
ridicate a lui r la prima clasă de distanță. Totuși, acestea sunt doar prezumții, deoarece considerăm
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
34
că în cazul carpenului s-ar impune cercetări de amănunt care să cuantifice structurile spațiale atât
în funcție de participarea speciei în compoziția arboretelor, cât și în funcție de consistența acestora.
În urma testului statistic de eterogenitate, care presupune compararea SGS între perechile
de indivizi, pentru fiecare clasă de distanțe a rezultat că în patru din cele opt populații analizate
valorile sunt semnificative (p˂0,01) din acest punct de vedere (Roșcani, Babadag, Leamna și Baia
de Aramă).
-0.060
-0.040
-0.020
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Co
efic
ien
tul
de
core
lați
e
(r)
Distanța (m)
r
U
L
Apa Sărată
a)
-0.150
-0.100
-0.050
0.000
0.050
0.100
0.150
25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Co
efic
ien
tul
de
core
lați
e
(r)
Distanța (n)
r
U
L
Teaca
b)
-0.060-0.040-0.0200.0000.0200.0400.0600.0800.100
25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
Co
efic
ien
tul
de
core
lați
e
(r)
Distanța (m)
r
U
L
Babadag
c)
-0.060
-0.040
-0.020
0.000
0.020
0.040
0.060
25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Co
efic
ien
tul
de
core
lați
e
(r)
Distanța (m)
r
U
L
Lotrișor
d)
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
35
Figura 4.4 Structura genetică spațială pentru fiecare populație de carpen analizată. Cele două linii
cu roșu reprezintă intervalul de încredere de 95% în jurul unei ipoteze nule (sus - U și jos - L)
Figure 4.4 Spatial genetic structure for each hornbeam population analyzed. The two red
lines represent 95% confidence interval around a null hypothesis (up - U and down - L)
4.1.2.5 Analiza structurii genetice spațiale interpopulaționale
Structura genetică a populațiilor reflectă interacțiunile diverșilor factori, inclusiv evoluția
istoriei pe termen lung a speciei (fragmentarea habitatului, modificarea arealului și izolarea
populației), drift genetic, fluxul de gene și selecția (Schaal et al. 1998).
Programul STRUCTURE (Pritchard et al. 2000) a fost utilizat pentru a analiza structura
genetică a populațiilor și de-a efectua un test de grupare asupra indivizilor analizați. Această
analiză a fost realizată cu ajutorul metodei de grupare Bayesiene, care are la bază un model ce
presupune că fiecare individ a moștenit o anumită proporție de la strămoșii săi din fiecare dintre
cele K populații (Pritchard et al. 2000).
Valoarea optimă a lui K a fost determinată atât în funcție de probabilitatea logaritmică de
estimare (L(K)(±SD)) cât și prin determinarea valorilor lui ΔK (Evanno et al. 2005). Determinarea
prin prima metodă (L(K)(±SD) a celui mai probabil număr de grupuri omogene este 5 (K = 5; fig.
4.5.a). Cea de a doua metodă, de a identifica valorile lui ΔK, relevă un număr de grupuri omogene
pentru K = 2 (fig. 4.5.b). De asemenea se poate constata în fig. 4.5.b și o probabilitate ușor ridicată
pentru K = 5.
-0.060
-0.040
-0.020
0.000
0.020
0.040
0.060
25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Co
efic
ien
tul
de
core
lați
e
(r)
Distanța (m)
r
U
L
Leamna
e)
-0.060
-0.040
-0.020
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Co
efic
ien
tul
de
core
lați
e
(r)
Distanța (m)
r
U
L
Baia de
Aramă
f)
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
36
a) b)
Figura 4.5 Determinarea numărului cel mai probabil de clustere genetice prin procedeul bazat pe:
a) valoarea medie L(K)(±SD); b) valoarea obținută pentru ΔK
Figure 4.5 Determination of the number most probably of genetic clusters by the process based
on: a) mean of estimated of L(K)(±SD); b) the value obtained for ΔK
În urma rulării programului STRUCTURE (Pritchard et al. 2000) a rezultat histograma
pentru K = 2 (fig. 4.6), ce denotă o bună grupare a genotipurilor multilocus pe populații și de
asemenea arată o structură genetică bine diferențiată între acestea. Acest rezultat, corelat cu cel
din testul AMOVA, care indică o diferență de 4% a variației genetice între cele două populații
statistice (clustere) astfel constituite, relevă, totuși, existența unor particularități genetice suficient
de mari ale acestora, cu probabilitate mare de a fi fixate genetic. Fiecare individ în graficul de mai
jos este reprezentat de o linie verticală unică, ce este împărțită în segmente de K culori, cu
lungimile proporționale fiecăreia dintre cele două clustere identificate. Fiecare culoare reprezintă
gradul de apartenență a individului la clusterul aferent culorii respective (%).
Din graficul pentru K = 2, considerat a fi cel mai potrivit pentru gruparea arborilor analizați,
se poate observa că populațiile din sud-vestul României (Baia de Aramă, Leamna și Lotrișor)
relevă o structură genetică foarte bine diferențiată față de restul populațiilor luate în studiu.
Populațiile de carpen analizate sunt grupate în concordanță cu divizarea lor în locații geografice
de prelevare a probelor. În populația Roșcani, proporția coeficientului de apartenență (Q) din cele
două clustere este aproximativ egală la toți arborii luați în studiu. Cea mai bine conturată ca entitate
genetică în raport cu genotipurile multilocus este populația Baia de Aramă, în care doar doi arbori
prezintă valori ale coeficientului de apartenență (Q) specifice celuilalt cluster (Q = 0,858 și
respectiv 0,935). Analiza efectuată permite reliefarea proporției de apartenență a fiecărui exemplar
la genotipurile multilocus astfel generate.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
37
Figura. 4.6. Rezultatele grupării pe populații pentru K=2, fără opțiunea LOCPRIOR
Figure 4.6 The results of the population assignment for K = 2, without the option LOCPRIOR
Gradul de apartenență la clusterul genetic corespunzător unei populații este dat de ponderea
culorii (roșu = Cluster 1; verde = Cluster 2). Cu ajutorul acestor valori ale coeficientului
(probabilității) de apartenență s-a putut realiza distribuția spațială a clusterelor pentru populațiile
analizate de pe teritoriul țării (fig. 4.7).
Figura 4.7 Distribuția geografică a clusterelor genetice (K = 2), fără opțiunea LOCPRIOR
Figure 4.7 Geographical distribution of genetic custer (K = 2), without the option LOCPRIOR
În fig. 4.8 este redată histograma pentru K = 5, unde se poate observa și de data aceasta o
corespondență bună între clustere și localizarea geografică. Primul grup este alcătuit din
populațiile Apa Sărată și Teaca, aflate în zona de nord a României. Al doilea grup este format din
populațiile Roșcani și Panciu, situate în nord-estul și respectiv estul României. Un alt model pentru
genotipurile multilocus este caracteristic populației Babadag, din sud-estul României. Populațiile
Lotrișor și Baia de Aramă constituie grupul 4 iar populația Leamna formează singură grupul 5.
Figura 4.8 Rezultatele grupării pe populații pentru K=5, fără opțiunea LOCPRIOR
Figure 4.8 The results of the population assignment for K = 5, without the option LOCPRIOR
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
38
În urma analizei Baiesyene s-au identificat și genotipuri intermediare, care ar putea fi o
consecință a fluxului de gene determinat de migrarea polenului. Parametrul ∆K ne-a determinat să
constatăm că cea mai bună diviziune a celor 400 de arbori luați în studiu corespunde la două
grupuri omogene (K = 2). Acest rezultat a indicat că au existat diferite grade de introgresie în
populațiile cercetate, detectate ca diferențe de frecvențe ale alelelor în rândul populațiilor. Premoli,
et al. (2001) au constatat că nivelul de eterogenitate genetică între populații este mai mare la specii
cu răspândire geografică disjunctă decât la specii cu răspândire continuă.
O altă modalitate de analiză a structurilor genetice spațiale s-a efectuat prin clasificarea
ierarhică ,,aglomerativă”, bazată pe algortimul UPGMA și distanțele genetice Nei dintre perechile
populațiilor analizate. Rezultatele acestei analize confirmă pe cele identificate în urma analizei
Bayesiene (fig. 4.9). Se observă în mod evident apartenența indivizilor la două grupuri, care
corespund cu localizarea geografică a populațiilor. Primul grup este constituit din populațiile din
sud-vestul țării (Baia de Aramă, Leamna și Lotrișor), iar cel de al doilea grup este format din
celelalte populații de carpen luate în studiu. Un suport statistic destul de scăzut se poate observa
între populațiile Roșcani și Panciu (bootstrap = 21). Cealaltă extremă a suportului statistic este
întâlnită între populațiile Apa Sărată și Teaca (bootstrap = 76), dar suficient de mare și pentru
încadrarea populațiilor Leamna și Baia de Aramă în același subcluster.
Figura 4.9 Dendrograma UPGMA pe baza distanțelor genetice Nei
Figure 4.9 UPGMA dendrogram constructed based on genetic distances Nei
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
39
În schimb, testul Mantel a relevat o corelație nesemnificativă între distanța genetică și
distanța geografică a populațiilor (R = 0,233, P = 0,38). Prin urmare, uneori se speculează că
structura genetică a populațiilor de carpen poate fi afectată de distanța geografică, dar diferențierea
sporită ar putea rezulta și din barierele geografice (Munții Carpați) și/sau evenimentele istorice.
4.1.3 Diversitatea genetică în populațiile de Carpinus orientalis
4.1.3.1 Testarea echilibrului Hardy-Weinberg, a dezechilibrului linkage și
identificarea alelelor nule
În urma testării echilibrului Hardy-Weinberg s-a semnalat un deficit de heterozigoți la
markerul Cb_33 (p<0,05) doar în trei populații (Leamna, Stârmina și Baia de Aramă) din cele șase
luate în studiu (Tabelul 4.4). Aceste populații care prezintă deviații de la starea de echilibru
genetic, nu sunt în concordanță cu criteriile unei ,,populații ideale” (panmictică, lipsa mutațiilor,
migrației, derivei și a selecției; Selkoe și Toonen, 2006).
Cu toate acestea, la niciun marker nu s-au observat abateri de la această stare de echilibru
din cauza excesului de heterozigoți, ceea ce denotă că numărul de homozigoți nu a fost mai mic
decât se aștepta.
Tabelul. 4.4 Testarea echilibrului Hardy-Weinberg
Table 4.4 Testing for Hardy Weinberg equilibrium
Marker Roșcani Murfatlar Cândești Leamna Stârmina Baia de Aramă
Deficit de heterozigoți
Cb_37a 0,3572 0,2693 0,2017 0,7613 0,4105 0,4755
Cb_49a 0,0680 0,8937 0,7826 0,0772 0,4019 0,1197
Cb_29 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000
Cb_33 0,0887 0,258 0,1221 0,0016 0,0044 0,0004
Cb_48a 0,7798 0,7491 0,5003 0,1300 0,0827 0,2610
Exces de heterozigoți Cb_37a 0,8301 0,8822 0,9226 0,4930 0,8025 0,7576
Cb_49a 0,9441 0,1066 0,2218 0,9259 0,5981 0,8843
Cb_29 0,8454 0,7928 0,6054 0,3503 0,9374 0,7885
Cb_33 0,9261 0,9743 0,8799 0,9984 0,9956 0,9994
Cb_48a 0,2303 0,2578 0,5016 0,8700 0,9184 0,7398
-deficit de heterozigoți; ns = nesemnificativ, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001
Dezechilibrul linkage a fost testat pentru cei cinci markeri luați în studiu, în cadrul fiecărei
populații (Tabelul 4.5). Din cele 60 de situații posibile între perechile de markeri, s-au identificat
10 cazuri pentru care există o probabilitate semnificativă (p<0,05), ca acest dezechilibru linkage să
existe. Un puternic dezechilibru s-a observat la nivelul grupului de markeri Cb_33 - Cb_48a, având
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
40
o probabilitate extrem de semnificativă. Acest lucru se poate datora cel mai probabil
polimorfismului ridicat la ambii markeri.
Tabelul 4.5 Testarea dezechilibrului linkage
Table 4.5 Testing of linkage disequilibrium
Nr. critic Marker 1 Marker 2 Semnificație
1 Cb_37 Cb_49a
Diferențe nesemnificative
(p<0,05)
2 Cb_37 Cb_29
3 Cb_49a Cb_29
4 Cb_37a Cb_33
5 Cb_49a Cb_33
6 Cb_29 Cb_33
7 Cb_37a Cb_48a
8 Cb_49a Cb_48a
9 Cb_29 Cb_48a
10 Cb_33 Cb_48a Diferențe foarte semnificative (p<0,001)
Alelele nule (neamplificate) sunt o caracteristică comună în genotiparea indivizilor cu
ajutorul microsateliților și pot duce la estimări eronate ale frecvențelor alelelor și genotipurilor,
astfel pot stopa analizele genetice ale populațiilor (Van Oosterhout et al. 2006). La genotiparea
exemplarelor pot să apară erori cauzate atât de apariția alelelor nule, cât și de prezența unei
concentrații reduse a ADN-ului, o amplificare ridicată în favoarea alelelor scurte, precum și erori
de citire datorită omiterii unor alele de lungime mare (engl. large allele drop-out) sau erori
rezultate în urma alelelor care diferă print-o singură pereche de baze (engl. stuttering) (Van
Oosterhout et al. 2004). La cărpiniță, aceste erori au fost evaluate cu ajutorul programului
MICROCHECKER (Van Oosterhout et al. 2004), care a confirmat atât absența alelelor nule, cât
și a erorilor de citire (engl. large allele drop-out și engl. stuttering) (Tabelul 4.6). Acest rezultat
conferă datelor experimentale un nivel adecvat de acuratețe și poate fi datorat și nivelului scăzut
de polimorfism al markerilor SSRs.
Tabelul 4.6 Identificarea alelelor nule cu programul Microchecker
Table 4.6 Identification of null alleles with Microchecker program
Marker Dovezi pentru
alelele nule
Dovezi pentru ,,large
allele drop-out’’
Dovezi pentru
,,scoring error
due to stuttering’’
Chakraborty Brookfield
Cb_37a Nu Nu Nu 0,04 0,027
Cb_49a Nu Nu Nu 0,08 0,061
Cb_29 Nu Nu Nu -0,03 -0,007
Cb_33 Nu Nu Nu 0,07 0,056
Cb_48a Nu Nu Nu -0,04 -0,032
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
41
4.1.3.2 Structura alelică
În cele șase populații de cărpiniță (300 de arbori) s-au identificat 18 alele, la nivelul celor
cinci markeri. Dintre acestea, 16 sunt comune celor șase populații analizate. Media de alele
observate pe marker a fost de aproximativ 4 alele. În graficul de mai jos (fig. 4.10) sunt redate
frecvențele relative ale alelelor pentru fiecare marker genic.
Figura 4.10 Frecvența relativă a alelelor pentru cei cinci markeri analizați
Figure 4.10 Relative frequency of the alleles for the five markers analyzed
Analizând structura alelică a celor șase populații de cărpiniță, pe baza celor cinci markeri
SSRs se observă faptul că numai markerul Cb_33 prezintă alele private.
Alelele identificate de noi la cei 300 de arbori de cărpiniță, nu le putem compara cu studiul
realizat de Prinz și Finkeldey (2015) pentru că genotiparea în studiul amintit s-a realizat doar pe
un singur exemplar de cărpiniță.
Numărul redus de variante alelice la markeri luați în studiu se poate datora ratei mutațiilor
ușor scăzute. O altă ipoteză ar fi că acești markeri au fost dezvoltați inițial pentru carpen, specie
cu un nivel diferit de poliploidie, comparativ cu cărpinița care este o specie diploidă. Gürcan și
Mehlenbacher, (2010) a realizat un studiu pe câteva specii din familia Betulaceae, transferând
perechi de markeri între specii cu polimorfism mai ridicat decât în studiul nostru. Numărul mic de
fragmente repetitive în genomul cărpiniței sau structura secvențelor repetitive ar putea fi o altă
ipoteză care să explice diferențele față de carpen. Variații importante ale numărului de alele pot fi
determinate de fenomene precum: deriva genetică, efectul ,,gâtului de sticlăˮ (engl. bottleneck),
precum și „efectul de fondator” (engl. founder effect). Mai mult decât atât, este de așteptat ca
polimorfismul să fie mai mare la speciile poliploide, dar diferențe de polimorfism pot fi generate
și din cauza efectivelor populaționale, care sunt evident mai mari la carpen decât la cărpiniță,
supoziție care are în vedere amploarea recombinărilor la împerechere dependentă de dimensiunea
populației.
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
74 80 159 169 171 61 63 142 144 146 148 150 154 156 144 146 148 150
Cb_37a Cb_49a Cb_29 Cb_33 Cb_48a
Fre
cven
ța
Marker
Frecvența alelelorRoșcani-IS
Murfatlar-CT
Cândești-BZ
Leamna-DJ
Stârmina-MH
Baia de Aramă-MH
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
42
4.1.3.3 Indicii de diversitate genetică
Valorile principalilor indici de diversitate genetică estimaţi pentru cele 6 populaţii de
cărpiniță sunt prezentate în tabelul 4.7. Aceste valori sunt discutate și comparate cu alte studii din
literatura de specialitate.
Tabelul 4.7 Diversitatea genetică în populații de cărpiniță din România
Table 4.7 Genetic diversity of C. orientalis for each population from Romania
Na - numărul mediu de alele pe locus; Ne - numărul efectiv de alele pe locus; I - Indicele Shannon;
Ho – Heterozigoția observată; He – Heterozigoția așteptată (diversitatea genetică); F – indicele de fixare.
Populația Marker Na Ne I Ho He F
Roșcani
Cb_37a 2,00 1,99 0,69 0,46 0,50 0,08
Cb_49a 3,00 2,98 1,09 0,56 0,66 0,15
Cb_29 2,00 1,13 0,23 0,13 0,12 -0,07
Cb_33 4,00 2,98 1,13 0,57 0,67 0,14
Cb_48a 4,00 2,51 1,07 0,65 0,60 -0,09
Media 3,00 2,32 0,84 0,47 0,509 0,045
Eroarea standard 0,45 0,35 0,17 0,09 0,10 0,05
Murfatlar
Cb_37a 2,00 1,99 0,69 0,44 0,50 -0,14
Cb_49a 3,00 2,83 1,07 0,74 0,65 -0,08
Cb_29 2,00 1,15 0,26 0,14 0,13 0,08
Cb_33 4,00 3,45 1,30 0,65 0,71 -0,13
Cb_48a 4,00 3,40 1,29 0,80 0,71 -0,14
Media 3,00 2,57 0,92 0,55 0,539 -0,030
Eroarea standard 0,45 0,44 0,20 0,12 0,11 0,05
Cândești
Cb_37a 2,00 1,89 0,66 0,40 0,47 0,15
Cb_49a 3,00 2,67 1,03 0,68 0,63 -0,09
Cb_29 2,00 1,22 0,33 0,20 0,18 -0,11
Cb_33 5,00 3,48 1,34 0,61 0,71 0,15
Cb_48a 4,00 3,29 1,28 0,74 0,69 -0,06
Media 3,20 2,51 0,93 0,53 0,538 0,008
Eroarea standard 0,58 0,43 0,19 0,10 0,10 0,06
Leamna
Cb_37a 2,00 1,75 0,62 0,46 0,43 -0,07
Cb_49a 3,00 2,67 1,04 0,54 0,63 0,13
Cb_29 2,00 1,32 0,41 0,28 0,24 -0,16
Cb_33 5,00 3,56 1,39 0,63 0,72 0,13
Cb_48a 4,00 3,13 1,22 0,70 0,68 -0,03
Media 3,20 2,48 0,94 0,52 0,539 0,001
Eroarea standard 0,58 0,42 0,19 0,07 0,09 0,06
Stârmina
Cb_37a 2,00 1,85 0,65 0,43 0,46 0,07
Cb_49a 3,00 2,61 1,01 0,67 0,62 -0,09
Cb_29 2,00 1,09 0,17 0,08 0,08 -0,04
Cb_33 6,00 4,11 1,59 0,65 0,76 0,15
Cb_48a 4,00 3,47 1,30 0,67 0,71 0,06
Media 3,40 2,62 0,95 0,50 0,525 0,028
Eroarea standard 0,75 0,54 0,25 0,11 0,12 0,04
Baia de Aramă
Cb_37a 2,00 1,81 0,64 0,43 0,45 0,04
Cb_49a 3,00 2,77 1,06 0,57 0,64 0,11
Cb_29 2,00 1,16 0,26 0,15 0,14 -0,08
Cb_33 5,00 4,10 1,50 0,65 0,76 0,15
Cb_48a 4,00 3,55 1,33 0,69 0,72 0,04
Media 3,20 2,68 0,96 0,50 0,539 0,051
Eroarea standard 0,58 0,54 0,23 0,10 0,11 0,04
MEDIA GENERALĂ 3,17 2,53 0,92 0,51 0,531 0,017
Eroarea standard 0,22 0,17 0,08 0,04 0,04 0,02
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
43
Din analiza diversității genetice cu ajutorul celor cinci markeri moleculari s-a constatat că
populațiile analizate prezintă un grad scăzut de polimorfism, fapt dovedit de numărul mic de alele
identificate la fiecare marker. Numărul mediu de alele pe locus (Na) este în medie de 3,17, iar
numărul efectiv de alele pe locus (Ne) este de 2,53. Cel mai polimorfic marker este Cb_33, la care
s-au observat 7 alele, dintre care două alele sunt private pentru populațiile Baia de Aramă (156 pb)
și Stârmina (154 pb). Numai două alele pe locus au înregistrat markerii Cb_37a și Cb_29. Cele
mai mari valori ale numărului efectiv de alele s-au observat tot la markerul Cb_33, urmat de
Cb_48a și Cb_49a.
La nivel de populație atât indicele de diversitate genetică Na cât și Ne prezintă o valoare
aproximativ constantă pentru întregul eșantion luat în studiu, neprezentând diferențe semnificative
între populații, rezultând din această perspectivă o relativă uniformitate a speciei.
Heterozigoția observată este un indice de diversitate genetică care corespunde valorii
proporției heterozigoților din populațiile analizate. La nivelul markerilor, heterozigoția observată
a variat destul de mult, de la 0,164 la markerul Cb_29, la 0,706 la markerul Cb_48a. Valorile
extreme se găsesc la acești doi markeri și în toate populațiile luate în studiu. Cea mai mare valoare
a heterozigoției se înregistrează în populația Murfatlar (Ho = 0,554), iar cea mai scăzută în
populația Roșcani (Ho = 0,474).
Heterozigoția așteptată, cunoscută și sub denumirea de diversitatea genetică, a înregistrat
valoarea medie 0,53, care este ușor mai mare decât heterozigoția observată. Așa cum era de
așteptat, datorită nivelului ridicat de polimorfism, valoarea cea mai mare a diversității genetice
poate fi observată la markerul Cb_33a (He = 0,720). Markerul Cb_29 a atins valoarea cea mai
scăzută a diversității genetice dintre cei 5 markeri analizați (He = 0,148). De la acest marker se
așteaptă puțini heterozigoți în cele 6 populații analizate, în primul rând din cauza nivelului scăzut
al polimorfismului, iar în al doilea rând datorită valorii scăzute a heterozigoției observate.
În ceea ce privește analiza acestui indice de diversitate genetică la nivel de populație, putem
constata faptul că valoarea maximă se înregistrează în populațiile Murfatlar, Leamna și Baia de
Aramă (He = 0,539), iar valoarea minimă în populația Roșcani (He = 0,509). Valoarea mai scăzută
a diversității genetice se poate datora și faptului că populația Roșcani este situată la limita nordică
a arealului din Europa, fiind totodată și o populație izolată. O reducere a dimensiunii populației și
absența fluxului de gene poate duce la reducerea diversității genetice, ceea ce ar putea genera o
capacitate limitată de a se adapta la schimbările climatice preconizate, culminând cu creșterea
riscului de dispariție. Valori mici ale diversității genetice se găsesc și la fag, în cadrul populațiilor
marginale izolate (He = 0,538 în populația Tălășmani din estul României) (Ciocîrlan, 2014). Pe
ansamblu întregului eșantion de populații cercetate, care acoperă și reflectă arealul speciei în
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
44
România, nivelul diversității genetice a fost relativ ridicat și nu au existat diferențe semnificative
între populațiile analizate, valorile pentru He varind între 0,509 și 0,539.
Analiza indicilor de diversitate moleculară nu a relevat diferențe semnificative statistic
între populațiile luate în studiu.
Indicele de fixare - F (Hartl și Clark, 1997) redă măsura în care o populație se abate de la
starea de echilibru Hardy-Weinberg. Atunci când F = 0 semnifică absența consangvinizării (Keller
și Waller, 2002). Din tabelul 4.7 se constată că la patru din cei cinci markeri valorile acestui indice
sunt apropiate de 0, ceea ce înseamnă că încrucișările s-au realizat cel mai probabil în mod
aleatoriu. La markerul Cb_33 se observă că valorile indicelui de fixare sunt cu puțin peste 0,1,
ceea ce sugerează că încrucișările nu au fost întâmplătoare. Valoarea medie a indicelui de fixare
tinde spre 0 (F = 0,017), ceea ce evidențiază că populațiile analizate sunt apropiate de starea de
echilibru genetic Hardy-Weinberg. Ca atare, în populațiile cercetate fenomenul de consangvinizare
nu joacă un rol important, având o incidență infimă, în schimb cel mai probabil se regăsește
acțiunea factorilor evolutivi (selecția). Pe ansamblul markerilor analizați, în populațiile Baia de
Aramă (F = 0,051), Roșcani (F = 0,045) și Stârmina (F = 0,028) a rezultat un ușor exces de
homozigoţi. La cealaltă extremă se întâlnește populația Murfatlar cu un exces de heterozigoți (F
= -0,030). Faptul că populația Roșcani nu prezintă un dezechilibru Hardy-Weinberg de
homozigotare la markerii analizați indică viabilitatea acesteia, care trebuie să fie în legătură cu
mărimea sa suficient de mare, care nu a favorizat consangvinizarea.
4.1.3.4 Diferențierea genetică
Indicele de diferențiere (FST) redă diferența dintre populații sau specii (Wright, 1951).
Pentru populațiile luate în studiu, indicele de diferențere calculat ca medie pentru cei cinci markeri
redă o diferență genetică scăzută pentru probabilitatea de 95% (FST = 0,030; P < 0,05) (Tabelul
4.8). Această valoare nu poate fi însă atribuită lipsei barierelor dintre populații, deoarece arealul
speciei este, așa cum bine se cunoaște, puternic fragmentat. Mai degrabă valoarea scăzută a
indicelui de diferențiere poate fi interpretată prin prisma conservatorismului ereditar general al
speciei, inclusiv în condiții de izolare a populațiilor sale. Coeficientul FST prezintă o valoare
maximă la markerul Cb_37a (0,067) urmat de markerul Cb_48a (0,040). Acești doi markeri se
diferențiază cel mai bine între cele șase populații analizate. Într-un studiu efectuat pe stejarul
pedunculat și stejarul brumăriu, Toader (2011) a comunicat valori scăzute pentru ambele specii
(FST-Q.robur = 0,018 și FST-Q.pedunculiflora = 0,016), ceea ce denotă un nivel scăzut de departajare
interpopulațională. Valori tot scăzute ale indicelui de diferențiere s-au înregistrat și la Alnus
glutinosa (FST = 0,014; Mingeot et al. 2016), Fagus sylvatica (FST = 0,017; Pluess et al. 2016).
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
45
Tabelul 4.8 Valorile indicelui de diferențiere FST pentru fiecare marker genic
Table 4.8 FST differentiation index values for each genic marker
Marker Cb_37a Cb_49a Cb_29 Cb_33 Cb_48a Media Eroarea standard
FST 0,067 0,008 0,006 0,018 0,040 0,030 0,010
După cum se poate observa în tabelul de mai jos (Tabelul 4.9), o diferențiere genetică
moderată s-a semnalat între populațiile Leamna și Roșcani (FST = 0,067), aflate totuși la o distanță
geografică mare, de peste 400 km, dar și între populații mai apropiate din sud-vestul României:
Baia de Aramă și Leamna (FST = 0,059), respectiv Stârmina și Leamna (FST = 0,058). În aceste
populații fie izolate (Roșcani) sau fie cu un număr mic de exemplare (Stârmina), deriva genetică
și fluxul de gene ar putea juca un rol important, observându-se o ușoară pierdere a diversității
genetice. Cea mai scăzută diferențiere s-a observat între populațiile Baia de Aramă și Murfatlar
(FST = 0,007), Baia de Aramă și Stârmina (FST = 0,007), urmate de populațiile Stârmina și
Murfatlar (FST = 0,008), respectiv Cândești și Roșcani (FST = 0,009). Valoarea scăzută a indicelui
de diferențiere poate indica o oarecare similitudine a variației genetice.
Tabelul 4.9 Valorile indicelui de diferențiere FST între populațiile analizate
Table 4.9 FST differentiation index values between the analyzed populations
Populația Roșcani Murfatlar Cândești Leamna Stârmina Baia de Aramă
Roșcani 0,000
Murfatlar 0,023 0,000
Cândești 0,009 0,012 0,000
Leamna 0,067 0,026 0,037 0,000
Stârmina 0,039 0,008 0,031 0,058 0,000
Baia de Aramă 0,033 0,007 0,031 0,059 0,007 0,000
- populațiile în care diferențierea genetică este înalt semnificativă (p<0,01); - populațiile la care diferențierea
genetică este semnificativă (p<0,05); - populațiile în care diferențierea genetică este nesemnificativă (p>0,05).
4.1.3.5 Analiza structurii genetice spațiale intrapopulaționale
Autocorelația spațială permite măsurarea structurii genetice a întregului eșantion luat în
studiu cu datele rezultate în urma analizei cu markerii SSRs. Această analiză s-a realizat la 10 clase
de distanțe egale, pe o distanță totală de 250 m (fig. 4.11. a-b). Corelația dintre matricea distanțelor
genetice și matricea distanțelor geografice a fost semnificativă, cu valoare pozitivă pentru
populația Cândești și cu valoare negativă pentru populația Baia de Aramă (fig. 4.11. a-b). Testul
de eterogenitate arată valori semnificative tot pentru cele două populații (p ˂0,01). Pentru celelalte
patru populații coeficientul de corelație nu se abate de la ipoteza nulă a distribuției randomizate a
genotipurilor în orice clasă de distanțe.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
46
Figura 4.11 Corelogramele pentru cele șase populații de cărpiniță.Liniile roșii punctate delimitează
intervalul de încredere a ipotezei nule pentru probabilitatea de 95%. Liniile negre din jurul valorii
coeficientului r reprezintă intervalele de încredere pentru 95%, generate prin bootstrapping
Figure 4.11 The correlograms for the six oriental hornbeam populations. The dashed red
lines represent confidence intervals for the probability of 95%. Black lines around coefficient r
represent 95% confidence intervals generated by bootstrapping.
Prezența unei structuri genetice spațiale în două din cele șase populații luate în studiu ar
putea fi explicată de răspândirea limitată a semințelor. Cu cât este mai slabă SGS, cu atât este mai
intens fluxul de gene intrapopulațional. Rezultatele noastre au arătat că la scară mică SGS este
sensibilă la fragmentare și poate fi utilă ca un indicator timpuriu al consecințelor negative ale
fragmentării populațiilor de plante.
4.1.3.6 Analiza structurii genetice spațiale interpopulaționale
Pentru determinarea structurii genetice s-a folosit analiza Bayesiană disponibilă în
software-ul STRUCTURE (Pritchard et al. 2000), așa cum s-a menționat în capitolul anterior.
Numărul de grupuri omogene din punct de vedere genetic (K) a fost determinat prin cea
mai mare valoare a probabilității posterioare Ln (P(D)) (fig. 4.12.a), dar și prin metoda bazată pe
cea mai mare valoare a lui ΔK (fig. 4.12.b), evocată de Evanno et al. (2005).
Numărul optim de clustere (K = 3), s-a stabilit prin cea de-a doua metodă, dar același număr
optim de clustere a fost comfirmat și de prima metodă.
-0.150-0.100-0.0500.0000.0500.1000.1500.2000.250
25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
Co
efic
ien
tul
de
core
lați
e
(r)
Distanța (m)
r
U
L
Cândești
a)
-0.300
-0.200
-0.100
0.000
0.100
0.200
25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
Co
efic
ien
tul
de
core
lați
e
(r)
Distanța (m)
r
U
L
Baia de
Aramă
b)
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
47
a) b)
Figura 4.12 Detectarea grafică a celor două etape pentru a determina numărul de clustere
Figure 4.12 Graphical detection of the two stages to detect the number of clusters
Rezultatele analizei Bayesiene indică ipoteza unei structuri genetice cu trei clustere (fig.
4.13), dar separarea acestora nu se realizează tranșant. După cum se poate observa în histograma
de mai jos, cele șase populații analizate se pot grupa doar aproximativ în conformitate cu aria
geografică. Populațiile Roșcani, Murfatlar și Cândești prezintă o structură genetică diferită față de
celelalte populații. De asemenea, între aceste populații există cel mai mare grad de afinitate
structurală, fapt dovedit și de analiza coeficientului de diferențiere genetică. Structura genetică a
populației Leamna se diferențiază bine față de restul populațiilor. În populațile Stârmina și Baia
de Aramă se poate observa că doar 11 exemplare aparțin celui de-al treilea cluster, cu o proporție
a coeficientului de apartenență (Q) de peste 76%. În populațiile analizate au fost identificate
numeroase genotipuri multilocus intermediare, deși distanțele geografice mari între populații și
fragmentarea arealului nu susțin producerea fluxului genic interpopulațional.
Figura 4.13 Structura genetică a celor șase populații de C. orientalis, cu opțiunea LOCPRIOR
Figure 4.13 The genetic structure of the six C. orientalis populations, with LOCPRIOR option
Cu ajutorul valorilor probabilității de apartenență a fiecărei populații la unul din cele 3
clustere s-a generat o hartă cu distribuția genotipurilor multilocus în fiecare populație (fig. 4.14).
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
48
Figura 4.14 Distribuția geografică a clusterelor genetice (K = 3)
Figure 4.14 Geographical distribution of genetic clusters (K = 3)
În urma construit arborele filogenetic UPGMA (Unweighted Pair Group Method
Arithmetic Average) pe baza distanțelor genetice Nei, cu programul PAST (Hammer et al. 2001)
(fig. 4.15), se pot observa aceleași relații genetice ale populațiilor cu cele identificate prin analiza
Bayesiană. Populațiile din sud-vestul României (Leamna, Stârmina și Baia de Aramă) s-au separat
de celelalte, respectiv cele foarte apropiate geografic (Stârmina și Baia de Aramă, aflate la nu mai
mult de 100 km distanță) s-au grupat în același subcluster. Pe ramura celuilalt cluster se remarcă
separarea populației nord-estice Roșcani, aflată la circa 250 km de populația Cândești, aceasta din
urmă constituind un sub-cluster cu populația Murfatlar. Suportul statistic puternic de grupare a
populațiilor Stârmina și Baia de Aramă (valori bootstrap = 96), precum și pentru gruparea
populațiilor din estul arealului cercetat conferă acestei metode de analiză un nivel ridicat de
încredere.
Figura 4.15 Dendrograma UPGMA construită pe baza distanțelor genetice Nei
Figure 4.15 UPGMA dendrogram constructed based on genetic distances Nei
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
49
Testul AMOVA calculat pentru populațiile de cărpiniță, a arătat că cea mai mare parte a
variației se întâlnește în interiorul populațiilor (95%) și s-a observat doar 5% între populații.
Diferențierea genetică a fost foarte semnificativă (PhiST = 0,047, p <0,0001). Diferențele din
punct de vedere genetic se găsesc la nivel de individ și nu la nivel de populație, ceea ce rezultă că
izolarea nu s-a realizat de mult timp.
Testul Mantel a arătat o corelație nesemnificativă între distanțele geografice și cele genetice
ale populațiilor de cărpiniță analizate (R2 = 0,098; P = 0,388). Au fost efectuate 999 de permutări.
4.1.3.7 Testarea efectului de ,,bottleneck” în populațiile de cărpiniță
Prin reducerea masivă a numărului de indivizi dintr-o populație (,,gâtului de sticlă” - engl.
‚,bottleneck”) duce la reducerea variației genetice în interiorul populațiilor, ca urmare a pierderii
alelelor rare prin deriva genetică (Meffe și Carroll, 1997). Acest efect ,,gât de sticlă” poate rămâne
într-o populație mai multe generații, chiar dacă populația depășește perioada de criză prin refacerea
echilibrului demografic. Însă procesele genetice și demografice pot grăbi dispariția unor populații
aflate într-o astfel de criză, dacă nu se aplică măsurile de conservare a genofondului populațional.
Cauzele unui blocaj genetic depind de: rapiditatea reducerii mărimii populației, lungimea
intervalului blocajului genetic și de rata creșterii populației ca urmare a evenimentului de blocaj
(Nei et al. 1975).
Datele obținute în urma analizei testului statistic de semnificație (engl. sing test) pentru
cele trei modele (IAM, SMM și TPM), a relevat că o singură populație din cele șase luate în studiu
(Leamna) prezintă dovezi ale unui blocaj genetic relativ recent (Tabelul 4.10).
Tabelul 4.10 Rezultatele testului ,,bottleneck” pentru cele șase populații de cărpiniță
Table 4.10 Results of genetic ,,bottleneck” test for six oriental hornbeam populations
Populația He p-sing-IAM p-sing-SMM p-sing-TPM
Roșcani 0,515 0,168 0,241 0,217
Murfatlar 0,545 0,163 0,239 0,220
Cândești 0,543 0,165 0,242 0,215
Leamna 0,545 0,025 0,043 0,038
Stârmina 0,530 0,170 0,243 0,216
Baia de Aramă 0,544 0,169 0,240 0,220
He = heterozigoția așteptată; p<0,05 - valoarea semnificativă detectată prin testul de semnificație este
îngroșată; IAM = infinite allele model; SMM = stepwise mutation model; TPM = two-phased model.
Efectele recente ale blocajului asupra habitatului nu sunt în totalitate detectabile. Au fost
luate în acest studiu și populații cu un număr mic de exemplare care ar fi putut să fie influențate
de efectul ,,bottleneck”.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
50
Populația Roșcani constituită dintr-un număr redus de exemplare, posibil mai mare în
trecutul îndepărtat, nu a arătat nicio dovadă a blocajelor recente, dar indicele de fixare arată că
populația este într-un oarecare dezechilibru genetic (există un deficit de heterozigoți, F = 0,045).
Acest rezultat poate sugera că în viitor se poate înregistra un dezechilibru genetic determinat de
efectivul mic din populație, la fel ca și în populația Stârmina (populație cu un număr mic de
exemplare).
Literatura de specialitate menționează că speciile care se confruntă cu fragmentarea
habitatului se pot afla într-un dezechilibru genetic. Structura genetică actuală a populațiilor de
cărpiniță analizate indică în mod evident că a existat o conectivitate istorică între populații iar
diversitatea genetică pe total nu a fost erodată în mod semnificativ, în conformitate cu date similare
din literatura de specialitate (Farias et al. 2015).
4.2 Structura alelică și diversitatea genetică la nivelul ADN-ului cloroplastic
4.2.1 Haplotipurile identificate și frecvențele relative ale acestora în populații
În urma genotipării celor 24 de populații (18 de carpen – 96 de exemplare, respectiv 6 de
cărpiniță – 32 de exemplare), cu ajutorul markerilor ccmp s-au identificat 8 alele.
Dintre cei trei markeri luați în studiu doar markerul ccmp7 a arătat polimorfism în
populațiile de C. betulus (Tabelul 4.11). Având în vedere alelele identificate la cei trei markeri,
două haplotipuri pentru carpen au fost detectate (H1 și H2), cu H1 întâlnit în toate cele optsprezece
populații (82%) și H2 a fost găsit în șapte populații.
În populațiile de C. orientalis s-au observat două alele la nivelul markerului ccmp10, iar
ceilalți doi au relevat monomorfism (Tabelul 4.11). Perechea de baze 115 a fost găsită doar într-o
singură populație la toți arborii luați în studiu. În urma combinării alelelor identificate la cărpiniță
au dus la concretizarea a două haplotipuri (H3 și H4) în șase populații analizate, cu specificația că
haplotipul H4 a fost întâlnit numai în populația izolată Roșcani (Tabelul 4.11).
Tabelul 4.11 Haplotipurile de ADNcp identificate
Table 4.11 Chloroplast DNA haplotypes identified
Marker C. betulus C. orientalis Numărul de
alele H1 H2 H3 H4
ccmp4 118 pb 118 pb 129 pb 129 pb 2
ccmp7 158 pb 157 pb 159 pb 159 pb 3
ccmp10 110 pb 110 pb 117 pb 115 pb 3
Numărul de indivizi 79 17 26 6
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
51
Variația scăzută la nivelul genomului cloroplastic poate fi asociată atât cu evenimentele
istorice (numărul de refugii glaciare și modul de colonizare), cât și cu impactul activității umane
și/sau o rată de mutație scăzută (Palme, 2002).
A rezultat că cele două specii nu dețin haplotipuri comune. La alte genuri de arbori
forestieri, dimpotrivă, se cunosc cazuri de deținere în comun a haplotipurilor cloroplastice, ca de
exemplu la genul Quercus, pentru specii din cele încadrate la stejarii albi europeni (Moldovan et
al. 2010).
Tabelul 4.12 Frecvențele haplotipurilor în populațiile analizate
Table 4.12 The haplotype frequencies in analyzed populations
4.2.2 Distribuția geografică a haplotipurilor
În urma combinării lungimi fragmentelor observate la acești trei markeri, un total de două
haplotipuri au fost identificate la carpen, respectiv două haplotipuri la cărpiniță. Distribuția
Populația Abreviere
Frecvența Specia
H1 H2 H3 H4
Apa Sărată-Maramureș MM-CB 2 3
C. b
etulu
s
Teaca-Bistrița-Năsăud BN-CB 4 1 Roșcani-Iași IS-CB 4 1
Panciu-Vrancea VN-CB 4 1 Babadag-Tulcea TLB-CB 5 0 Măcin-Tulcea TLM-CB 5 0
Warthe-Brașov BVW-CB 5 0 Tâmpa-Brașov BVT-CB 5 0
Gura-Teghii-Buzău BZGT-CB 2 6 Colți-Buzău BZC-CB 1 4
Măgura-Buzău BZM-CB 7 1 Lotrișor-Vâlcea VL-CB 7 0 Bucovăț-Dolj DJ-CB 5 0
Baia de Aramă-Mehedinți MHBA-CB 5 0 Stârmina-Mehedinți MHS-CB 3 0
Lugoj-Timișoara TM-CB 5 0 Săvârșin-Arad AR-CB 5 0 Huedin-Cluj CJ-CB 5 0 Roșcani-Iași IS-CO 6 0
C. o
rien
tali
s
Murfatlar-Constanța CT-CO 5 0
Cândești-Buzău BZ-CO 5 0
Leamna-Dolj DJ-CO 5 0
Stârmina-Mehedinți MHS-CO 5 0
Baia de Aramă-Mehedinți MHBA-CO 0 6
Frecvența relativă 82% 18% 81,2% 18,8%
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
52
geografică și frecvența relativă a haplotipurilor de ADN cloroplastic pentru fiecare populație este
prezentată în fig. 4.16.
Figura 4.16 Distribuția haplotipurilor de carpen (a) și cărpiniță (b) în România
Figure 4.16 Distribution of hornbeam (a) and oriental hornbeam (b) chloroplast haplotypes in
Romania
Majoritatea indivizilor (82%) aparțin haplotipului 1, care este cel mai frecvent haplotip în
aproape toate populațiile de carpen analizate, dintre care 11 sunt monomorfe. Mai mult, acest
haplotip este preponderent (80-87,5%) în 4 din cele 7 populații bihaplotipice. Ponderea ridicată a
haplotipului 1 poate fi explicată prin recolonizarea postglaciară din sud, din refugiul balcanic, prin
căile de comunicare din trecătorile carpatice, care ar fi putut avea un astfel de efect omogenizator.
Ca atare, datele din cercetările noastre converg spre ideea că haplotipul predominant H1 provine
din refugii sudice, cu mare probabilitate din Peninsula Balcanică, fiind probabil corespondentul
haplotipului 5 identificat în zona respectivă de Grivet și Petit (2003) cu ajutorul markerilor PCR-
RFLP. Această ipoteză privind originea haplotipului 1 în zona Balcanilor este susținută și în studiul
realizat de Fărcaș et al. (2006).
Haplotipul 2 este dominant în nordul și sud-estul Carpaților, cu o frecvență de 18%. Acesta
este întâlnit împreună cu haplotipul H1. Interesant este faptul că H2 este majoritar în două populații
aflate la curbura externă a Carpaților (Gura Teghii - 75% și respectiv Colți - 80%), zonă pentru
care prin analize palinologice s-a ajuns la concluzia că ar fi existat refugii glaciare pentru carpen
la altitudini mici din ținuturi subcarpatice (Magyari, 2002; Willner et al. 2009).
O a treia populație (Apa Sărată) în care predomină haplotipul H2 (60%) este situată în zona
de nord-vest a arealului cercetat. Reapariția în proporție ridicată a acestui haplotip în zona
respectivă reprezintă un caz de discontinuitate spațială, care ar fi putut fi generat de existența și a
altor refugii la aceste latitudini. Într-adevăr, date din literatură (Magyari, 2002) indică posibilitatea
existenței unui refugiu glaciar pentru carpen pe teritoriul Ungariei, în Munții Matra, care sunt de
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
53
altitudine mică, iar Mitka et al. (2014) indică refugii posibile și în Carpații Nordici, context în care
se pune întrebarea dacă recolonizarea postglaciară s-ar fi putut realiza și dinspre aceste zone. Și
alte surse bibliografice susțin posibilitatea existenței refugiilor în zone din centrul și vestul Europei
(Magri, 2010) sau de est (Pott, 1997; Komar et al. 2009). Supozițiile referitoare la originea
haplotipului H2 în refugii carpatice și/sau din Munții din nordul Ungariei reclamă continuarea
cercetărilor prezente. Totodată, în contextul acestei ipoteze de origine a haplotipului H2, ținând
seama de prezența acestuia și în curbura externă a Carpaților, se poate aprecia că arealul său
preglaciar era mai extins decât cel identificat prin cercetările de față.
Pentru haplotipul H2, în afară de ipoteza originii sale din mici refugii glaciare locale, ar
rămâne valabilă doar revenirea sa din refugii balcanice, dar datele din cercetările noastre nu pot
explica absența sa din zone aflate mai la sud în arealul cercetat. Din moment ce acest haplotip are
o pondere atât de mare în cele două populații din zona Buzăului, iar prezența sa, chiar diminuată,
a fost identificată în Vrancea și apoi spre nord, se pune, totuși, întrebarea: ar fi putut exista un
refugiu secundar pentru carpen în zona curburii externe a Carpaților?
În populațiile de cărpiniță au fost identificate două haplotipuri specifice, ce diferă prin
două perechi de baze.
Haplotipul 3 prezintă frecvența cea mai mare (81,2%), fiind întâlnit în cele cinci populații
care acoperă arealul cărpiniței pe teritoriul României. Existența sa în zona cercetată în arealul din
ținuturile silvostepice, indică pe de-o parte originea comună a acestor populații, probabil ca
rezultat al recolonizării din refugiul balcanic. Într-un studiu european realizat de Grivet și Petit
(2003) s-au identificat două haplotipuri specifice la C. orientalis cu markeri PCR-RFLP și SSRcp,
unde se consideră că acestea își au originea în refugiile sudice (Peninsula Balcanică pentru
haplotipul 7, respectiv Peninsula Italică pentru haplotipul 8).
Haplotipul H4 identificat prin cercetările de față numai în populația Roșcani (Iași)
reprezintă un caz aparte, în primul rând ca urmare a faptului că este izolată, aflată la peste 200 km
distanță de cea mai apropiată populație de la granița nordică a arealului cvasicontinuu al cărpiniței.
Populații de cărpiniță mai sunt întâlnite la Vaslui (Bogdana, Lupești, Stănilești) (Chifu et al. 2006),
la o distanță de 100-110 km față de populația Roșcani. Structura haplotipică diferită față de
celelalte populații studiate, dar monomorfică, poate fi rezultatul originii ancestrale diferite, aspect
care presupune continuarea și extinderea evaluărilor în afara arealului cercetat prin studiul de față.
Ipoteza transferului de materiale de reproducere din alte zone este puțin plauzibilă, deoarece nu
există date care să confirme o astfel de practică la această specie.
În concluzie, numărul de haplotipuri (patru) este destul de scăzut în comparație cu alte
genuri de angiosperme, ca de exemplu cele din genul Quercus, la care diversitatea haplotipică este
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
54
mare (Petit et al. 2005; Moldovan et al. 2010). Fragmentarea puternică a habitatului, în cazul
cărpiniței, ar fi dus la absența sau slaba variație a haplotipurilor cloroplastice din anumite zone.
Cercetările noastre au reliefat că cele două specii nu prezintă haplotipuri comune, ceea ce denotă
un nivel mare de divergență genetică. Cu toate că cele două specii prezintă interferențe arealistice,
hibridarea are loc numai prin încrucișări controlate (Santamour, 1995), ceea ce explică separarea
haplotipurilor celor doi taxoni. De asemenea o altă ipoteză ar putea fi ca rezultatul diferenței
genetice majore să fie determinat de faptul că nivelul lor de poliploidie este diferit: 2n = 8x = 64
la carpen (Petrova, 2006), respectiv 2n = 2x = 16 la cărpiniță (Santamour, 1995). Studiul nostru
arată că nu există nicio asemănare din punct de vedere al structurii genetice, nu s-a identificat nicio
alelă comună celor două specii la niciun marker. Ambele specii sunt în mod clar diferențiate, astfel
încât markerii ADNcp ar putea fi utilizați ca markeri de diagnostic pentru diferențierea între specii
(Gailing și Finkeldey, 2016).
4.2.3 Diversitatea genetică intra și interpopulațională
Rezultatele obținute pentru analiza diversității genetice cu ajutorul soft-ului Permut (Pons
și Petit, 1996) sunt prezentate în tabelul 4.13.
Tabelul 4.13 Diversitatea și diferențierea genetică între cele două specii
Table 4.13 Genetic diversity and differentiation between species
Specia Numărul de
indivizi
Numărul de
haplotipuri
hS
(E.S.)
hT
(E.S.)
GST
((E.S.)
RST
(E.S.)
C. betulus 96 2 0,160
(0,051)
0,277
(0,087)
0,422
(0,094)
0,422
(0,093)
C. orientalis 32 2 0,000
(0,000)
0,333
(0,222)
1,000
(NC)
1,000
(NC)
Carpinus ssp. 128 4 0,120
(0,041)
0,563
(0,083)
0,787
(0,074)
0,998
(0,001)
hS - diversitatea genetică intrapopulațională; hT - diversitatea genetică totală; GST - indicele de diferențiere
genetică; RST = indicele de diferențiere specific diferențelor dintre haplotipuri; E.S. – eroarea standard.
În populațiile de carpen diferențierea genetică este mai mare (GST = 0,422) decât
diversitatea totală a haplotipurilor (hT = 0,277) și a diversității genetice intrapopulaționale (hS =
0,160) (Tabelul 4.13). Grivet și Petit (2003) au raportat o valoare a lui hT de 0,683 pentru carpen,
deci semnificativ mai mare decât cea determinată de noi. Valoarea mai mică a acestui indice de
diversitate genetică pe teritoriul României se poate datora numărului mai mic de haplotipuri
identificate. Diversitatea genetică intrapopulațională a înregistrat o valoare mai mare în studiul
nostru comparativ cu cel realizat de Grivet și Petit (2003). Diferențierea genetică relativ scăzută
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
55
în rândul populațiilor poate fi explicată în principal ca urmare a impactului antropic asupra acestei
specii, dar poate fi și rezultatul polimorfismului ancestral împărtășit între specii (Muir și
Schlötterer 2005), chiar și în absența fluxului de gene. Testul pentru structura geografică este
nesemnificativ deoarece RST (0,422) prezintă aceeași valoare cu GST. Această structură reflectă
faptul că haplotipuri diferit amestecate în aceeași populație sunt, în medie, mai strâns legate decât
haplotipuri diferite din populații diferite. Analiza variației moleculare (AMOVA) a arătat în
continuare că a fost găsită o variabilitate mică (42%) între populații, iar majoritatea variației (58%)
a fost întâlnită în interiorul populațiilor. Cercetările efectuate de Grivet și Petit (2003) pentru un
număr mai mare de populații distribuite în arealul general al speciei au condus la o valoare mult
mai mare a lui GST (0,972). Valori scăzute pentru GST, similare celor determinate pentru carpen în
zona luată în studiu, au fost raportate la Castanea sativa (GST = 0,43, Fineschi et al. 2000) sau la
Betula pendula (GST = 0,424, Palme, 2003). Dealtfel, se apreciază că, în medie, la angiospermele
lemnoase indicele de diferențiere între populații este de 0,73 (Petit, 1999).
Diversitatea totală a haplotipurilor pentru populațiile de cărpiniță a fost de hT = 0,333
(Tabelul 4.13). Această valoare mai ridicată a diversității genetice comparativ cu cea identificată
la carpen, se poate datora haplotipului 4 identificat în populația Roșcani. Această populație este
complet izolată de zona sa de răspândire, la o distanță de circa 220 de km față de stațiunea cea mai
nordică din arealul său din România (Jideni - Râmnicu Sărat), cu excepția celor de la Vaslui
amintite mai sus. De asemenea reprezintă doar fragmente relicte ale arealului său mai vechi și mai
întins din terțiar (Haralamb, 1963). Valorile indicilor de diferențiere (GST/RST) sunt egale cu 1, ceea
ce înseamnă că diversitatea genetică este foarte bine divizată. Fixarea unui haplotip unic creează
scenariul când cea mai mare parte a diversității genetice se întâlnește în rândul populațiilor.
Valoarea ridicată a diferențierii genetice între populații indică o structură geografică puternică.
Valorile ridicate ale indicelui de diferențiere au fost găsite și la alte specii: Quercus robur, Q.
petraea, Q. pubescens (GST = 1,03; 0,84 și respectiv 0,85; Petit et al. 2002); Fagus sylvatica (GST
= 0,855, Vettori et al. 2004); Fraxinus excelsior, F. ornus, F. angustifolia (GST = 0,870; 0,982 și
respectiv 0,964; Heuertz et al. 2006).
În concluzie, acest studiu relevă un nivel relativ scăzut de diversitate genetică și o
diferențiere genetică semnificativă ce există între populații. Recolonizarea postglaciară poate
conduce la o pierdere a diversității genetice, inclusiv pentru cea determinată de organitele celulare,
fenomen care este mai accentuat la speciile cu dificultăți de diseminare pe distanțe mari (Bialozyt
et al. 2006) și cu dispersie leptocurtică (Hewitt, 1996; Newton et al. 1999), respectiv în fazele
timpurii ale recolonizării (Davies et al. 2004). Însă, la cele două specii nu s-a produs recolonizare
timpurie, deoarece expansiunea lor în teritoriul cercetat s-a înregistrat spre mijlocul Holocenului
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
56
(Feurdean et al. 2010; Fărcaș et al. 2013). Pe de altă parte, fructele de carpen sunt considerate
grele, fiind încadrate de Bhagwat și Willis (2008) alături de cele ale cvercineelor și fagului, ceea
ce le conferă o capacitate redusă de dispersie. Totodată, aceste specii nu sunt considerate printre
cele cu capacitate foarte mare de dispersie a fructelor, deoarece modele experimentale au arătat că
distanța de dispersie de 100 m sau ceva mai mare se realizează cu greu la viteze ale vântului de 20
m/s (Fonger și Pütz, 2002). Dispersia de model leptocurtic, mai ales în cazul cărpiniței, și un blocaj
puternic înainte de ultima colonizare postglaciară ar putea fi o cauză plauzibilă pentru nivelul
foarte scăzut de variație genetică la cele două specii de Carpinus. Fluxul de gene mediat prin polen
și semințe joacă un rol determinant în stabilirea structurii genetice (Heuertz et al. 2003). Reducerea
diversității ADNcp și legătura cu extinderea populațiilor a fost, de asemenea, observată la fag
(Demesure și et al. 1996) și la alun (Palmé, 2002). Rezultatele celor mai multe dintre aceste studii
sugerează că evenimentele istorice cheie (de exemplu, evenimentele glaciare) au un efect profund
asupra structurii geografice a variației ADNcp. Condițiile climatice, activitatea umană și
concurența cu alte categorii de specii de arbori ar fi putut afecta rata de răspândire.
4.2.4 Relațiile filogenetice între haplotipuri
În această rețea (utilizând programul NETWORK, Bandelt et al. 1999) se observă clar
separarea haplotipurilor identificate la carpen de cele identificate la cărpiniță precum și frecvența
lor (fig. 4.17). Prezența haplotipului 1 ca haplotip central, care înregistrează o frecvență mai mare
sugerează că este un haplotip ancestral. Haplotipul 2 are o strânsă relație cu acesta, care se
diferențiază printr-o singură deleție observată la markerul ccmp7. Haplotipul 3 identificat la
cărpiniță diferă față de haplotipul 4 printr-o mutație cromozomială, adică prin două inserții
observate la nivelul markerului ccmp10. Haplotipurile 2 și 3 prezintă cea mai mare distanță
filogenetică față de celelalte haplotipuri.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
57
Figura 4.17 Rețeaua filogenetică ,,maximum parsimony” între cele 4 haplotipuri pentru cei 3
markeri SSRcp. Cercurile sunt proporționale cu frecvența medie a haplotipurilor
Figure 4.17 Maximum parsimony phylogenetic network among the 4 haplotypes for 3 cpSSR
markers. Circles are proportional to the haplotype mean frequency
Dendrograma UPGMA (Unweighted Pair Group Method Arithmetic Average) a permis
relevarea unor informații despre dispunerea spațială a structurilor genetice haplotipice. Aceasta a
arătat o separare clară între cele două specii, fiecare specie fiind reprezentată de un cluster (fig.
4.18). Astfel, la carpen se remarcă gruparea în același subcluster a populațiilor din sud-vestul și
vestul arealului cercetat, care sunt în continuare apropiate structural de cele din Dobrogea și zona
Brașov. Populațiile polimorfe de carpen se grupează majoritar în alt cluster, fără însă ca în
interiorul acestuia structura să fie unitară. Pe de altă parte, populațiile de cărpiniță indică
uniformitate structurală, cu excepția populației Roșcani. Acest aspect poate fi determinat de
puternica fragmentare a arealului cărpiniței în zona cercetată, unde specia se află la limita
răspândirii sale în nordul Balcanilor. De asemenea se poate observa și faptul că, ramurile
clusterelor majore se structurează în mare parte în funcție de poziția geografică a populațiilor,
descrise dealtfel în prezentarea arealului actual al acestor taxoni.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
58
Figura 4.18 Dendrograma UPGMA bazată pe distanțele genetice Nei între subpopulații
(C. betulus - CB; C. orientalis - CO.)
Figure 4.18 UPGMA dendrogram based on genetic distances Nei between supbopulations
(C. betulus - CB; C. orientalis - CO)
Testul Mantel nu a relevat o corelație între matricea distanțelor genetice și cea a distanțelor
geografice pentru carpen (R2 = 0,0062; p = 0,52). Aceasta indică faptul că izolarea prin distanță
nu este suficientă pentru a explica structura genetică prezentă. Pentru cărpiniță testul Mantel a
relevat de asemenea o corelație nesemnificativă (R2 = 0,995; p = 0,21).
În urma evaluării structurilor genetice a celor două specii cu markeri nucleari, respectiv
cloroplastici, s-au putut observa structuri diferite. De exemplu, populația de cărpiniță de la Roșcani
a prezentat o structură genetică cloroplastică diferită față de restul populațiilor luate în studiu.
Acest rezultat pare în contradicție cu cel al analizei ADN-ului nuclear, care a arătat că această
populație prezintă o structură genetică mai apropiată de populațiile Murfatlar și Cândești.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
59
Capitolul V. CONCLUZII FINALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. DISEMINAREA
REZULTATELOR. DIRECȚII VIITOARE DE CERCETARE
5.1 Concluzii Finale
5.1.1 Concluzii rezultate din analiza markerilor genetici nucleari
Concluzii rezultate din stabilirea protocolului de interpretare a
electroforegramelor pentru specia octoploidă C. betulus
Pentru reducerea erorilor de citire, la speciile poliploide, cum este și carpenul, se
recomandă ca lecturarea și interpretarea electroforegramelor să se facă manual.
O particularitate în construirea bazei de date la speciile poliploide este de-a
considera microsateliții markeri dominanți, spre deosebire de speciile diploide, la care sunt
considerați markeri codominanți.
Diversitatea genetică a carpenului
Numărul de alele pe populații a variat de la 11 până la 25, întregistrând o medie de
aproximativ 23 de alele/populație. Corelarea acestui număr de alele identificate cu starea de
octoploidie a speciei, putem aprecia că polimorfismul carpenului pentru markerii analizați este
moderat.
Populațiile de carpen din sud-vestul României (Leamna și Baia de Aramă) prezintă
un nivel ușor mai ridicat de diversitate genetică (He mai mare cu 2,8% față de media generală a
eșantionului cercetat), dar și cel mai mare număr de alele private. Totuși, nu se conturează un
model de diversitate genetică gradientală, deoarece următoarea populație ca valoare He superioară
mediei generale se află în nord-estul țării (populația Roșcani).
Atât indicele GST cât și testul AMOVA relevă o diferențiere scăzută între populații
și o diversitate ridicată în interiorul acestora. Fluxul de gene ar fi una din cauzele acestui rezultat,
deoarece este determinat în mare parte de evoluțiile istorice ale speciilor, care sunt condiționate în
modelarea structurii populațiilor.
În patru din cele opt populații analizate din perspectiva existenței structurilor
genetice spațiale au rezultat corelații pozitive semnificative, reduse, pentru prima clasă de distanțe.
Conturarea unor structuri familiale la acest nivel ar putea avea diverse cauze (biologia reproducerii
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
60
speciei, densitatea populației și respectiv a arboretelor etc.), pentru care însă nu s-au făcut evaluări
prin cercetările de față.
Analiza bayesiană a permis identificarea unor diferențe evidente între clusterele
generate de program (STRUCTURE). Populațiile din sud-vestul României prezintă o structură
genetică mai asemănătoare, comparativ cu restul populațiilor luate în studiu.
Analiza cluster a surprins o grupare a populațiilor analizate în două grupuri
omogene din punct de vedere genetic. Această structură genetică poate fi determintă de evoluțiile
istorice ale speciei.
Diversitatea genetică a cărpiniței
Din cele 18 alele recenzate, 16 sunt comune celor șase populații. Markerul Cb_33
prezintă cel mai mare număr de alele identificate (7 alele).
Diversitatea genetică este relativ ridicată, însă cu diferențe nesemnificative între
populații din punct de vedere statistic, ceea ce sugerează păstrarea intactă a informaţiei genetice
între generaţii.
Indicele de fixare variază de la exces la deficit de heterozigoţi, indicând faptul că
selecţia, dar și panmixia a acţionat diferit în cazul populațiilor.
La nivel intrapopulațional, structura genetică spațială (SGS) a înregistrat o valoare
pozitivă până la distanța de 25 m în populația Cândești și o valoare negativă în populația Baia de
Aramă, având o intensitate redusă dar semnificativă din punct de vedere statistic.
Modelele multilocus rezultate prin analiza bayesiană, indică pe de o parte o
diferențiere structurală slabă (singura populație cu o structură genetică diferită față de restul
populațiilor, este populația Leamna), iar pe de altă parte o grupare discretă a populațiilor în funcție
de poziția lor geografică. Acest rezultat este confirmat și de analiză cluster.
Valorile indicelui de diferențiere genetică (FST) și analiza varianței moleculare
(AMOVA) a arătat că cel mai mare procent de variație genetică există, ca și la carpen, în interiorul
populațiilor, în condițiile în care diferențirea genetică între populațiile de cărpiniță a fost
semnificativă (PhiST = 0,047; p <0,0001).
Rezultatele noastre sugerează că doar populația Leamna ar fi trecut recent printr-un
,,gât de sticlă” dar nu este exclus ca în populațiile cu un număr mic de exemplare sau cele izolate,
în viitorul apropiat, să se înregistreze un dezechilibru genetic.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
61
5.1.2 Concluzii rezultate din analiza markerilor genetici cloroplastici
Prin analizele de ADN cloroplastic s-au identificat patru haplotipuri specifice,
dintre care două sunt întâlnite în populațiile de carpen, respectiv două în populațiile de cărpiniță
(cel mai frecvent haplotip la carpen este H1, iar la cărpiniță H3).
O structură haplotipică particulară s-a observat în populația de cărpiniță Roșcani,
populație care trebuie inclusă în categoria resurselor genetice ale acestei specii.
Haplotipurile cloroplastice identificate pe teritoriul României provin, cel mai
probabil, din refugiile glaciare balcanice, aspect susținut de distribuția spațială a haplotipurilor și
de structura genetică relativ asemănătoare cu haplotipurile identificate în alte studii. Absența
datelor din regiunile de est din arealul cărpiniței este o limitare particulară în ceea ce privește
originea haplotipului 4.
Diversitatea genetică totală a haplotipurilor a fost mai mare pentru C. orientalis, în
comparație cu C. betulus, deși diferențele rămân nesemnificative din punct de vedere statistic.
Diferențierea genetică a fost semnificativ mai mare în populațiile de cărpiniță (GST
= 1,00) comparativ cu populațiile de carpen (GST = 0,422).
Prin creionarea relațiilor filogenetice s-a putut observa o separare clară între cei doi
taxoni, precum și o dispunere spațială a structurilor genetice haplotipice.
În urma evaluării nivelului de variație a ADN-ului cloroplastic s-a constatat că
există diferențe semnificative a structuriilor genetice a celor două specii înrudite, considerate
izolate reproductiv, fapt dovedit de lipsa haplotipurilor comune, cu toate că arealul lor se
suprapune.
5.2 Contribuții originale
Prezentul studiu aduce informaţii noi atât pe plan naţional cât şi internaţional,
privind diversitatea genetică și structura populațiilor celor două specii din genul Carpinus, prin
prisma analizării pentru prima dată a microsateliților nucleari.
Este pentru prima dată când, în România, s-au efectuat astfel de evaluări genetice
la o specie poliploidă (carpen), în condițiile în care astfel de studii sunt extrem de puține și la nivel
internațional.
S-a testat pentru prima dată funcționarea unui set de markeri SSRs pe un număr
mare de exemplare eșantionate în populațiile de carpen, și, de asemenea s-a testat funcționarea și
transferabilitatea markerilor respectivi la cărpiniță.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
62
În premieră, s-au realizat cercetări referitoare la structura genetică spaţială în
arborete de carpen și cărpiniță, oferind date preliminare pentru studii viitoare care să cuantifice
factorii favorizanți în generarea unor structuri familiale.
S-a derulat primul studiu la nivelul ADN-ului cloroplastic cu markeri SSRs la
cărpiniță, în România, în urma căruia au fost identificate două haplotipuri, între care cel particular
din populația Roșcani.
5.3 Diseminarea rezultatelor
Lucrări ISI:
➢ CĂRĂBUȘ, M.C. CURTU, A.L. POSTOLACHE, D. CIOCÎRLAN, E. ȘOFLETEA, N.
2017: Evidence of low chloroplast genetic diversity in two Carpinus species in the northern
Balkans. (lucrare trimisă spre publicare la revista ,,Notulae Botanicae Horti Agrobotanici
Cluj-Napoca”).
Lucrări BDI:
➢ CĂRĂBUŞ, M.C. și ŞOFLETEA, N. 2014: Carpenul (Carpinus betulus L.) și cărpinița
(C. orientalis Mill.): aspecte relevante privind originea, evoluția, fitocenologia și genetica
speciilor. Revista de silvicultură și cinegetică, nr. 35: 28-33.
➢ CĂRĂBUȘ, M.C. LEINEMANN, L. CURTU, A.L. și ȘOFLETEA, N. 2015: Preliminary
results on the genetic diversity of Carpinus betulus in Carpathian populations. Bulletin of
the Transilvania University of Brasov. Forestry, Wood Industry, Agricultural Food
Engineering. Series II, 8(2), 1.
➢ CĂRĂBUȘ, M.C. CURTU, A.L. ŞOFLETEA, N. 2016: Testarea funcționării primerilor
nucleari SSR la carpen (Carpinus betulus L.) și cărpiniță (C. orientalis Mill.). Evaluări ale
diversității genetice în fitocenoze de coexistență a celor două specii. Revista de silvicultură
și cinegetică, nr. 38: 15-20.
Lucrări prezentate în cadrul unor conferințe/manifestări științifice
➢ CĂRĂBUȘ, M.C. CURTU, A.L. FINKELDEY, R. LEINEMAN, L. ŞOFLETEA, N.
Nuclear and chloroplast microsatellite genetic structure in Romanian population of
Carpinus spp. Forest and Sustainable Developement, Brașov, România 24-25 Octombrie
2014.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
63
➢ CĂRĂBUȘ, M.C. CURTU, A.L. ŞOFLETEA, N. Assessment of genetic diversity in two
mixed community of Carpinus betulus and C. orientalis. Forest and Sustainable
Developement, Brașov, România 7-8 Octombrie 2016.
5.4 Direcții viitoare de cercetare
Pentru a spori nivelul de cunoștințe despre diversitatea și structura genetică a speciilor de
Carpinus, care au fost puțin cercetate până în prezent, ar fi utilă o analiză suplimentară folosind
markeri moleculari dominanți, pentru a avea o putere de rezoluție mai bună, cu privire la analiza
comparativă a celor două specii cu niveluri diferite de poliploidie.
Un punct de plecare, în ceea ce privesc analizele ADN-ului cloroplastic, ar putea fi
continuarea cercetărilor privind diversitatea haplotipurilor în partea de sud-est, dar și în vestul și
nordul României, precum și analiza populațiilor marginale/izolate sau periferice din țară, în scopul
stabilirii rutelor de migrație postglaciară.
De asemenea, un alt punct de plecare ar fi recoltarea probelor de cărpiniță din afara
arealului din România, pentru a vedea dacă se mai găsește haplotipul 4 identificat în partea de vest
sau de est a Europei.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
64
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
Abbe, E.C., 1935: Studies in the phylogeny of the Betulaceae. Floral and inflorescence anatomy. Botanical Gazette
97: 1–67.
Andreakis, N., Kooistra, W.H.C.F., Procaccini, G., 2009: High genetic diversity and connectivity in the polyploid
invasive seaweed Asparagopsis taxiformis (Bonnemaisoniales) in the Mediterranean, explored with
microsatellite alleles and multilocus genotypes. Mol Ecol 18:212–226. doi:10.1111/j.1365-
294X.2008.04022.x.
Ashley, M.V., Wilk, J.A., Styan, S.M.N., Craft, K.J., Jones, K.L., Feldheim, K.A., Lewers, K.S., Ashman, T.L., 2003:
High variability and disomic segregation of microsatellites in the octoploid Fragaria virginiana Mill.
(Rosaceae). Theor Appl Genet 107:1201–1207.
Bai, F.Y., 2014: Association of genotypes with infection types and antifungal susceptibilities in Candida albicans as
revealed by recent molecular typing strategies.Mycology, 5(1), 1-9.
Bandelt, H-J., Forster P., Röhl, A., 1999: Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Mol Biol
Evol 16:37-48.
Barbara, T., Palma-Silva, C., Paggi, G.M., Bered, F., Fay M.F., Lexer, C., 2007: Cross-species transfer of nuclear
microsatellite markers: Potential and limitations. Molecular Ecology 16:3759 – 3767.
Bassil, N., Boccacci, P., Botta, R., Postman, J., Mehlenbacher, S., 2013: Nuclear and chloroplast microsatellite
markers to assess genetic diversity and evolution in hazelnut species, hybrids and cultivars. Genet Resour
Crop Evo. 60:543–568.
Bănărescu, P., și Boşcaiu, N., 1973: Biogeografie. Perspectivă genetică şi istorică. Ed. Ştiinţifică, Bucureşti.
Bergmeier, E., și Dimopoulos, P., 2008: Identifying plant communities of thermophilous deciduous forest in Greece:
species composition, distribution, ecology and syntaxonomy. Plant Biosystems, 142(2), 228-254.
Bhagwat, S.A., și Willis, K.J., 2008: Species persistence in northerly glacial refugia of Europe: a matter of chance or
biogeographical traits?Journal of Biogeography, 35(3), 464-482.
Bialozyt, R., Ziegenhagen, B., Petit, R.J., 2006: Contrasting effects of long distance seed dispersal on genetic diversity
during range expansion. Journal of evolutionary biology, 19(1), 12-20.
Bozilova, E., 1975: Correlation of the vegetational development and climatic changes in the Rila and Pirin Mountains
during the Late Glacial and Post-Glacial time compared to the other areas. In: Problems of Balkan Flora and
Vegetation, Bulg. Acad. Sci. Sofia, 61-71.
Bozilova, E., Tonkov, S., 1985:Palaeoecological studies in Lake Durankulak.Ann Univ Sofia Fac Biol(Bot)76:25-30
Bozilova, E., Atanassova, J., 1989: Palaeoecological conditions and vegetation history in the area of Lake
Durankulak. In: Todorova H (ed) Durankulak 1. Bulg Acad Sci, Sofia, pp 197-202 (in Bulgarian).
Bozilova, E., 1996: Palaeoecological Events During the Last 15000 Years. Bulgaria. In: Berglund BE et al. (eds)
Wiley, Chichester, pp 701-715, 719-721, 726-728.
Čarni, A., Košir, P., Karadžić, B., Matevski, V., Redžić, S., Škvorc, Ž., 2009: Thermophilous deciduous forests in
Southeastern Europe. Plant Biosystems 143(1), 1-13.
Cărăbuș, M.C., Leinemann, L., Curtu, A.L., Șofletea, N., 2015: Preliminary results on the genetic diversity of
Carpinus betulus in carpathian populations. Bulletin of the Transilvania University of Brasov. Forestry, Wood
Industry, Agricultural Food Engineering. Series II, 8(2), p.1.
Cărăbuș, M.C., Curtu, A.L., Şofletea, N., 2016: Testarea funcționării primerilor nucleari SSR la carpen (Carpinus
betulus L.) și cărpiniță (C. orientalis Mill.). Evaluări ale diversității genetice în fiotocenoze de coexistență a
celor două specii. Revista de silvicultură și cinegetică, nr. 38.
Chapuis, M.P., și Estoup, A., 2007: Microsatellite null alleles and estimation of population differentiation. Molecular
Biology and Evolution 24: 621–631.
Chen, Z-D., 1994: Phylogeny and phytogeography of the Betulaceae. Acta Phytotaxonomica Sinica 32: 1–32, 101–
153 (in Chinese with English summary).
Chifu, T., Mânzu, C., Zamfirescu, O., 2006: Flora şi vegetaţia Moldovei. Univ.„Al. I. Cuza” Iaşi. Pp – 42.
Chifu, T., Irimia, I., 2014: Diversitatea fitosociologica a vegetației României. vol. 3 - Vegetația pădurilor și tufișurilor.
Ed. Institutul European. Iași.
Ciocîrlan, E., 2014: Structura genetică în populații marginale de fag (Fagus sylvatica L.) din România – evaluări cu
markeri moleculari. Teză. Universitatea Transilvania din Brașov.
Ciofi, C., Milinkovitch, M.C., Gibbs, J.P., Caccone, A., Powell, J.R., 2002: Microsatellite analysis of genetic
divergence among populations of giant Galápagos tortoises. Molecular Ecology, 11, 2265–2283.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
65
Clark, L.V., Jasieniuk, M., 2011: Polysat: an R package for poly ploid microsatellite analysis. Molecular Ecology
Resources, 11, 562 566.
Clark, L.V., Schreier, A.D., 2015: Resolving microsatellite genotype ambiguity in populations of allopolyploid and
diploidized autopolyploid organisms using negative correlations between alleles. bioRxiv, 020610.
Coart, E., Van Glabeke, S., Petit, R.J., Van Bockstaele, E., Roldan-Ruiz, I., 2005: Range wide versus local patterns
of genetic diversity in hornbeam (Carpinus betulus L.). Conservation Genetics, 6(2), pp.259-273.
Coldea, G., Indreica, A., Oprea, A., 2015: Les associations végétales de Roumanie. Tome 3 – Les associations
forestiéres et arbustives. Ed. Presa Universitară Clujeană. Cluj-Napoca.
Comai, L., 2005: The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature reviews genetics, 6 (11), 836-846.
Cornuet, J.M., și Luikark, G., 1996: Description and power analysis of two tests for detecting recent population
bottlenecks from allele frequency data. Gene 144: 2001–2014.
Crane, P.R., 1989: Early fossil history and evolution of the Betulaceae. In Evolution, systematics, and fossil history
of the Hamamelidae. Vol 2: “Higher” Hamamelidae. Crane PR and Blackmore S eds, Clarenton, Oxford. Pp
87-116.
Crane, P.R., Manchester, S.R., Dilcher, D.L., 1990: A preliminary survey of fossil leaves and well-preserved
reproductive structures from the Sentinel Butte Formation (Paleocene) near Almont, North Dakota. Fieldiana
Geology, New Series, no. 20: 1–63.
Crane, P.R., 1998: The phylogenetic position and fossil history of the Magnoliaceae. In: D. Hunt (ed.) Magnolias and
their allies, pp. 21-36. Milborne Port, David Hunt.
Cronquist, A., 1981: An integrated system of classification of flowering plants. Columbia University Press, New York.
Curtu, A. L., Craciunesc, I., Enescu, C. M., Vidalis, A., Sofletea, N., 2015: Fine-scale spatial genetic structure in a
multi-oak-species (Quercus spp.) forest. iForest-Biogeosciences and Forestry, 8(3), 324.
Davies, S., White, A., Lowe, A., 2004: An investigation into effects of long-distance seed dispersal on organelle
population genetic structure and colonization rate: a model analysis. Heredity, 93(6), 566-576.
Degen, B., Caron, H., Bandou, E., Maggia, L., Chevallier, M. H., Leveau, A., Kremer, A., 2001: Fine-scale spatial
genetic structure of eight tropical tree species as analysed by RAPDs. Heredity, 87(4), 497-507.
Demesure, B., 1996: Analyse de la diversite chloroplastique en utilisant des fragments-PCR chez des FagacCes:
Fagus sylvatica L. et Qwcus ssp. Ph.D. Thesis, University of Bordeaux I, France.
Diaconeasa, B., Fărcaș, S., 1998b: Contribuția carpenului în structurile silvestre cuaternare din România. Studia
Univ. ,,Babeș-Bolyai,,, ser. Boil. Cluj-Napoca, XLIII (1-2), 11-26.
Doniţă, N., Popescu, A., Paucă-Comănescu, M., Mihăilescu, S., Biriş, I.A., 2005: Habitatele din România (Vol. 1).
Ed. Tehnică Silvică.
Doyle, J.J., și Doyle, J.L., 1987: A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.
Phytochemical Bulletin, 19, p: 11-15.
Dufresne, F., Stift, M., Vergilino, R. și Mable, B.K., 2014: Recent progress and challenges in population genetics of
polyploid organisms: an overview of current state‐of‐the‐art molecular and statistical tools. Molecular
ecology,23(1), pp.40-69.
Duminil, J. Hardy, O.J. și Petit, R.J. 2009: Plant traits correlated with generation time directly affect inbreeding
depression and mating system and indirectly genetic structure. BMC Evolutionary Biology, 9, 177.
Earl, D.A., și VonHoldt B.M., 2011: STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing
STRUCTURE output and implementing the Evanno method. Conservation Genetics Resources, 4, 359–361.
Ebert, D., și Peakall, R., 2009: Chloroplast simple sequence repeats (cpSSRs): technical resources and
recommendations for expanding cpSSR discovery and applications to a wide array of plant species. Molecular
Ecology Resources. 9: 673-690.
Eliades, N.G., și Eliades, D.G., 2009: Haplotype analysis: software for analysis of haplotypes data. Distributed by
the authors. Forest Genetics and Forest Tree Breeding, Georg-Augst University Goettingen, Germany.
Esselink, G.D., Nybom, H., Vosman, B., 2004: Assignment of allelic configuration in polyploids using the MAC-PR
(microsatellite DNA allele counting-peak ratios) method.Theoretical and Applied Genetics,109(2),pp.402-408
Evanno, G., Regnaut, S., Goudet, J., 2005: Detecting the number of clusters of individuals using the software
STRUCTURE: a simulation study. Molecular ecology, 14, 2611–2620.
Excoffier L., Smouse P.E., Quattro J.M., 1992: Analysis of molecular variance inferred from metric distances among
DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction sites. In: Genetics, vol. 131, pp. 479–
491.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
66
Excoffier, L., și Lischer, H.E. L., 2010: Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population
genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources. 10: 564-567.
Falush, D., Stephens, M., Pritchard, J.K., 2007: Inference of population structure using multilocus genotype data:
dominant markers and null allele. Molecular Ecology Notes, 7, 574– 578.
Falque, M., Keurentjes, J., Bakx-Schotman, J.M.T., van Dijk, P.J., 1998: Development and characterization of
microsatellite markers in the sexual-apomictic complex Taraxacum officinale (dandelion). Theor Appl Genet
97:283–292.
Farias, I.P., Santos, W.G., Gordo, M., Hrbek, T., 2015: Effects of Forest Fragmentation on Genetic Diversity of the
Critically Endangered Primate, the Pied Tamarin (Saguinus bicolor): Implications for Conservation. Journal
of Heredity, 106(S1), 512-521.
Fărcaș, S., Tanțău, I., 1999: L’analyse palynologique du profil tourbeaux ,,Între afini’’ (Monts Călimani). Acta
Paleont. Rom., 2, 157-162.
Fărcaș, S., Popescu, F., Tantau, I., 2006: Spatial and temporal distribution of pedunculate oak, common ash and
hornbeam during late glacial and postglacial period in Romania. Ed. Presa Universitara Clujeana (in
Romanian).
Fărcaş, S., Tanţău, I., Mîndrescu, M., Hurdu, B., 2013: Holocene vegetation history in the Maramureş mountains
(Northern Romanian Carpathians). Quaternary International, 293, 92-104.
Feurdean, A., Willis, K.J., Parr, C.L., Tanţău, I., Fărcaş, S., 2010: Postglacial patterns in vegetation dynamics in
Romania: homogenization or differentiation? Journal of Biogeography, 37(11), 2197-2208.
Fineschi, S., Taurchini, D., Villani, F., Vendramin, G.G., 2000: Chloroplast DNA polymorphism reveals little
geographical structure in Castanea sativa Mill.(Fagaceae) throughout southern European countries.
Molecular Ecology, 9(10), 1495-1503.
Flores-Rentería, L., și Krohn, A., 2013: Scoring Microsatellite Loci. Microsatellites: Methods and Protocols,319-336.
Fonger, P., și Pütz, N., 2002: Take-off in anemochorus dispersal units of Carpinus betulus and Clematis vitalba:
Observation in wind tunnel experiments and measurement of the basic force. Botanische Jahrbücher, 124(1),
105-114.
Furlow, J.J., 1990: The genera of Betulaceae in the southeastern United States. Journal of the Arnold Arboretum 71:
1–67.
Gailing, O., Finkeldey, R., 2016: Genetic diversity and structure of teak (Tectona grandis L. f.) and dahat (Tectona
hamiltoniana Wall.) based on chloroplast microsatellites and Amplified Fragment Length Polymorphism
markers. Genetic Resources and Crop Evolution, 63(6), 961-974.
Gaut, B.S., și Long, A.D., 2003: The lowdown on linkage disequilibrium. Plant Cell 15: 1502–1506.
Graffelman, J., și Weir, B.S., 2016: Testing for Hardy–Weinberg equilibrium at biallelic genetic markers on the X
chromosome. Heredity, 116(6), pp.558-568.
Grimm, G.W., și Renner, S.S., 2013: Harvesting GenBank for a Betulaceae supermatrix, and a new chronogram for
the family. Botanical Journal of the Linnean Society 172: 465-477.
Grivet, D., 2002: Phylogéographie et évolution moléculaire comparée d'arbres forestiers à l'aide des marqueurs
chloroplastiques. (Doctoral dissertation, Université Henri Poincaré Nancy 1. Faculté des sciences et
techniques).
Grivet, D., și Petit, R., 2003: Chloroplast DNA phylogeography of the hornbeam in Europe: Evidence for a bottleneck
at the outset of postglacial colonization. Conservation Genetics, 4, 47-53.
Gürcan, K., și Mehlenbacher, S.A., 2010: Transferability of microsatellite markers in the Betulaceae. Journal of the
American Society for Horticultural Science 135 : 159 – 173.
Gürcan, K., Mehlenbacher, S.A., Botta, R., Boccacci, P., 2010: Development, characterization, segregation, and
mapping of microsatellite markers for European hazelnut (Corylus avellana L.) from enriched genomic
libraries and usefulness in genetic diversity studies. Tree Genet Genomes 6:513–531.
Hall, J.W., 1952: The comparative anatomy and phylogeny of the Betulaceae. Botanical Gazette 113: 235–270.
Hammer, Ø., Harperm, D.A.T., Ryan, P.D., 2001: PAST: Paleontological Statistics Software Package for education
and data analysis. Palaeontolia Electronica 4: 1-9.
Hamrick, J.L., 2004: Response of forest trees to global environmental changes. Forest ecology and
management, 197(1), pp.323-335.
Haralamb, A.T., 1963: Cultura speciilor forestiere. Editura Agro-Silvică București. 257-275.
Hardy, O.J., și Vekemans, X., 2002: SPAGeDi: a versatile computer program to analyse spatial genetic structure at
the individual or population levels. Molecular Ecology Notes 2: 618-620.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
67
Hartl, D.L., și Clark, A.G., 1997: Principles of Population Genetics. Vol. 116. Sinauer Associates, Sunderland.
Heath, F.G., 2012: Tree Lore. David & Charles. Pp. 65.
Heuertz, M., Carnevale, S., Fineschi, S., Sebastiani, F., Hausman, J.F., Paule, L., Vendramin, G.G., 2006: Chloroplast
DNA phylogeography of European ashes, Fraxinus sp. (Oleaceae): roles of hybridization and life history traits.
Molecular Ecology, 15(8), 2131-2140.
Hewitt, G.M., 1996: Some genetic consequences of ice ages, and their role in divergence and speciation. Biol. J. Linn.
Soc. 58, 247–276.
Heywood, V.H., 1993: Flowering plants of the world. B. T. Batsford, London.
Hickey, L.J., Wolf, J.A., 1975: The bases of angiosperm phylogeny: vegetative morphology. Annals of Missouri
Botanical Garden 62: 538-589.
Jentys-Szaferowa, J., 1958: The Genus Carpinus in Europe in the paleobotanical literature. Monographiae Botanicae
7:3–59.
Keller, L.F., și Waller, D.M., 2002: Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution, 17(5),
230-241.
Komar, M., Łanczont, M., Madeyska, T., 2009: Spatial vegetation patterns based on palynological records in the
loess area between the Dnieper and Odra Rivers during the last interglacial–glacial cycle. Quaternary
International, 198(1), 152-172.
Kramer, K., Geburek, T., Jansen, S., 2016: Does the Transfer of Forest Reproductive Material Significantly Affect
Local Tree Diversity?. EU.
Lachashvili, N.J., Eradze, N.V., Khetsuriani, L.D., 2016: Conspectus of trees and shrubs of Tbilisi environs (East
Georgia, South Caucasus). Annals of Agrarian Science.
Leitch, A.R., Leitch, I.J., 2008: Genomic plasticity and the diversity of polyploid plants. Science, 320(5875),481-483.
Li, G., Hubert, S., Bucklin, K., Ribes, V., Hedgecock, D., 2003: Characterization of 79 microsatellite DNA markers
in the Pacific oyster Crassostrea gigas. Molecular Ecology Notes, 3(2), pp.228-232.
Linnaeus, C., 1737: Genera plantarum. Leiden.
Lloyd, S.S., Steele, E.J., Dawkins, R.L., 2015: Analysis of Haplotype Sequences.
Luikart, G., Allendorf, F., Cornuet J-M., Sherwin, W., 1998: Distortion of allele frequency distributions provides a
test for recent population bottlenecks. Journal Heredity, 89, 238-247.
Mackay, I., și Powell, W., 2007: Methods for linkage disequilibrium mapping in crops. Trends in plant science, 12(2),
pp.57-63.
Magri, D., 2010: Persistence of tree taxa in Europe and Quaternary climate changes. Quaternary International,
219(1), 145-151.
Magyari, E., 2002: Holocene biogeography of Fagus sylvatica L. and Carpinus betulus L. in the Carpathian-Alpine
Region. Folia Historico-Naturalia Musei Matraensis, 26(1): 15-35.
Mantel, N.A., 1967: The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Res., 27,
209–220.
Mauric, N., 2000: Carpinus betulus [archive]. Jardin! L'Encyclopédie, Société des gens de lettres
(http://nature.jardin.free.fr/arbre/ft_carpinus_be.html).
McIntyre, P.J., 2007: Polyploidy and species responses to climate change: Using ecological niche models to explore
predicted range shifts in polyploid and diploid members of the Claytonia perfoliata (Portulacaceae) complex.
COS 102-3.
McIntyre, P.J. 2012: Polyploidy associated with altered and broader ecological niches in the Claytonia perfoliata
(Portulacaceae) species complex. American Journal of Botany, 99(4), pp.655-662.
Meffe, G.K., și Carroll, C.R., 1997: Principles of conservation biology. 2nd edition. Sinauer Associates, Sunderland,
Massachusetts.
Mingeot, D., Husson, C., Mertens, P., Watillon, B., Bertin, P., Druart, P., 2016: Genetic diversity and genetic structure
of black alder (Alnus glutinosa [L.] Gaertn) in the Belgium-Luxembourg-France cross-border area. Tree
Genetics and Genomes, 12(2), 1-12.
Mitka, J., Bąba, W., Szczepanek, K., 2014: Putative forest glacial refugia in the Western and Eastern Carpathians.
Modern Phytomorphology, 5, 85-92.
Moldovan, I.C., Sofletea, N., Curtu, A.L., Abrudan, I.V., Postolache, D., Popescu, F., 2010:Chloroplast DNA diversity
of oak species in Eastern Romania. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 38(3), 301-307.
Muir, G., Schlötterer, C., 2005: Evidence for shared ancestral polymorphism rather than recurrent gene flow at
microsatellite loci differentiating two hybridizing oaks (Quercus spp.). Molecular Ecology 14: 549–561.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
68
Muller, J., 1981: Fossil pollen records of extant angiosperms. Botanical Review, 47: 1-142.
Narayan, L., Dodd, R.S., O’Hara, K.L., 2015: A genotyping protocol for multiple tissue types from the polyploid tree
species Sequoia sempervirens (Cupressaceae). Applications in plant sciences, 3(3).
Nei, M., Maruyama, T., Chakraborty, R., 1975: The bottleneck effect and genetic variability in populations. Evolution,
1-10.
Nelson, J.C., și Deam, C.C., 1919: Deam's Trees of Indiana. 188-191.
Newton, A.C., Allnutt, T.R., Gillies, A.C.M., Lowe, A.J., Ennos, R.A., 1999: Molecular phylogeography, intraspecific
variation and the conservation of tree species. Trends in Ecology & Evolution, 14(4), 140-145.
Ortiz-Ramírez, M.F., Andersen, M.J., Zaldívar-Riverón, A., Ornelas, J.F., Navarro-Sigüenza, A.G., 2016: Geographic
isolation drives divergence of uncorrelated genetic and song variation in the Ruddy-capped Nightingale-
Thrush (Catharus frantzii; Aves: Turdidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 94 (Part A):74-86.
Palmé, A.E., 2002: Chloroplast DNA variation, postglacial recolonization and hybridization in hazel, Corylus
avellana. Molecular ecology, 11(9), 1769-1779.
Palmé, A., 2003: Evolutionary history and chloroplast DNA variation in three plant genera: Betula, Corylus and
Salix.: The impact of post-glacial colonisation and hybridisation. Acta Universitatis Upsaliensis.
Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and Technology 795, 59 pp.
Uppsala. ISBN 91-554-5509-3.
Palop-Esteban, M., Segarra-Moragues, J.G., González-Candelas, F., 2011: Polyploid origin, genetic diversity and
population structure in the tetraploid sea lavender Limonium narbonense Miller (Plumbaginaceae) from
eastern Spain. Genetica, 139(10), 1309-1322.
Papageorgiou, A.C., Tsiripidis, I., Mouratidis, T., Hatziskakis, S., Gailing, O., Eliades, Nicolas-George H., Vidalis,
A., Drouzas, A.D., Finkeldey, R., 2014: Complex fine-scale phylogeographic patterns in a putative refugial
region of Fagus sylvatica L. (Fagaceae).Botanical Journal of the Linean SocietyVolume 174, Issue 4,516-528
Paridari, I.C., Jalali, S.G., Sonboli, A., Zarafshar, M., Bruschi, P., 2013: Leaf macro-and micro-morphological
altitudinal variability of Carpinus betulus in the Hyrcanian forest (Iran). Journal of Forestry Research, 24(2),
301-307.
Peakall R., Ruibal M., Lindenmayer D.B., 2003: Spatial autocorrelation analysis offers new insights into gene flow
in the Australian bush rat, Rattus fuscipes. Evolution 57, 1182–1195.
Peakall, P.E., Smouse, R.. 2012: GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching
and research—an update. Bioinformatics, 28, 2537-2539.
Peery, M.Z., Kirby, R., Reid, B.N., Stoelting, R., Doucet-Bëer, E., Robinson, S., Vásquez-Carrillo, C., Pauli, J.N.,
Palsbøll, P.J., 2012: Reliability of genetic bottleneck tests for detecting recent population declines. Molecular
Ecology 21: 3403–3418.
Pembleton, L.W., Cogan, N.O., Forster, J.W., 2013: STAMPP: an R package for calculation of genetic differentiation
and struc ture of mixed ploidy level populations. Molecular Ecology Resources, 13, 946 952.
Petit, R.J., 1999: Diversité génétique et histoire des populations d’arbres forestiers. Dossier d’habilitation à diriger
des recherches, Université de Paris-Sud, Université formation de recherche Scientifique d’Orsay, Paris.
Petit, J.P., Csail, U.M., Bordács, S., Burg, K., Coart, E., Cottrell, J., Van Dam, B., Deans, J.D., Dumolin-Lapègue, S.,
Fineshi, S., Finkeldey, R., Gillies, A., Glaz, I., Goicoechea, P.G., Jensen, J.S., König, K., Lowe, A.J., Madsen,
S.F., Mátyás, G., Munro, R.C., Olalde, M., Pemonge, M-H., Popescu, F., Slade, D., Tabbener, H., Taurchini,
D., de Vries, S.G.M., Ziegenhagen, B., Kremer, A., 2002a: Chloroplast DNA variation in European white
oaks: Phylogeography and patterns of diversity based on data from over 2600 populations. Forest Ecology
and Management,156.
Petit, R.J., Aguinagalde, I., de Beaulieu, J.L., Bittkau, C., Brewer, S., Cheddadi, R., ... & Mohanty, A., 2003: Glacial
refugia: hotspots but not melting pots of genetic diversity. Science, 300(5625), 1563-1565.
Petit, R.J., Duminil, J., Fineschi, S., Hampe, A., Salvini, D., Vendramin, G.G., 2005: Comparative organization of
chloroplast, mitochondrial and nuclear diversity in plant populations. Mol Ecol 14:689–701.
Petre, M., Nicolescu, V.N., Ghirda, B., 2012: Competition and natural mortality in two mixed sessile oak (Quercus
petraea (Matt.) Liebl.) dominated stands. Spanish journal of rural development, Vol. 3, Nº. 4: 41-50.
Petrova, A., 2006: Mediterranean chromosome number reports 16 (1584--1603). Fl. Medit. 16: 431–435.
Pfeiffer, T., Roschanski, A.M., Pannell, J.R., Korbecka, G., Schnittler, M., 2011: Characterization of microsatellite
loci and reliable genotyping in a polyploid plant, Mercurialis perennis (Euphorbiaceae).J.Hered.102:479-488.
Piry, S., Luikart, G., Cornuet, J-M., 1999: BOTTLENECK: a computer program for detecting recent reductions in the
effective population size using allele frequency data. Journal of Heredity, 90, 502–503.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
69
Pliura, A.L.F.A.S., Rungis, D.A.I.N.I.S., Baliuckas, V., 2009: Population structure of pedunculate oak (Quercus
robur L.) in Lithuania based on analysis of chloroplast DNA haplotypes and adaptive traits. Baltic Forestry,
15(1), 2-12.
Pluess, A.R., Frank, A., Heiri, C., Lalagüe, H., Vendramin, G.G., Oddou‐Muratorio, S., 2016: Genome–environment
association study suggests local adaptation to climate at the regional scale in Fagus sylvatica. New
Phytologist.
Pons, O., și Petit. R.J., 1995. Estimation, variance and optimal sampling of gene diversity. 1. Haploid locus.
Theoretical and Applied Genetics 90: 462–470.
Pons, O., și Petit R.J., 1996: Measuring and testing genetic differentiation with ordered versus unordered alleles.
Genetics 144: 1237-1245.
Pop, E., 1932: Contribuții la istoria pădurilor din Nordul Transilvaniei. Bul. Grăd. Bot. Muz. Bot. Univ. Cluj, XII
(1-2), 29-102.
Pott, R., 1997: Invasion of beech and e stablishment of beech forests in Europe. Annali di Botanica, 55: 27-58.
Premoli, A.C., Souto, C.P., Allnutt, T.R., Newton, A.C., 2001: Effects of population disjunction on isozyme variation
in the widespread Pilgerodendron uviferum. Heredity, 87(3), 337-343.
Prinz, K., Finkeldey, R. 2015: Characterization and transferability of microsatellite markers developed for Carpinus
betulus (Betulaceae) 1. Applications in plant sciences, 3(10).
Pritchard, J.K.M., Stephens Donnelly, P., 2000: Inference of population structure using multilocus genotype data.
Genetics 155: 945-959.
Pruett, L.C., Winker, K., 2008: The effects of sample size on population genetic diversity estimates in song sparrows
Melospiza melodia. Journal of Avian Biology, 39(2), 252-256.
Purina, L., Matisons, R., Katrevics, J., Jansons, A., 2015: Regeneration and sapling growth of European hornbeam
at its northern limit in Latvia. In Research for Rural Development. International Scientific Conference
Proceedings (Latvia). Latvia University of Agriculture.
Ramsey, J., 2011: Polyploidy and ecological adaptation in wild yarrow. PNAS 108, 7096-7101.
Rehder, A., 1960: Manual of cultivated trees and shrubs hardy in North America exclusive of subtropical and warmer
temperate regions. 2nd ed. Macmillan, New York.
Rousset, F., 2008: Genepop’007: a complete re-implementation of the genepop software for Windows and Linux.
Molecular ecology resources, 8, 103–106.
Samah, S., Pardo, C.V.D.T., Cruz, M.A.S., Valadez-Moctezuma, E., 2016: Genetic diversity, genotype
discrimination, and population structure of Mexican Opuntia sp. determined by SSR markers. Plant Molecular
Biology Reporter, 34(1), pp.146-159.
Sampson, J.F. și Byrne, M. 2012: Genetic diversity and multiple origins of polyploid Atriplex nummularia Lindl.
(Chenopodiaceae). Biol. J. Linn. Soc. 105: 218–230.
San-Miguel-Ayanz, J., de Rigo, D., Caudullo, G., Houston Durrant, T., Mauri, A., 2016: European Atlas of Forest
Tree Species. Publications Office of the European Union, Luxembourg.
Santamour, F.S., 1995: Survival, growth, and fertility of Carpinus hybrids. Hort. Science. vol. 30, 6, pp. 1151-1192.
Savill, P.S., 2013: The silviculture of trees used in British forestry. CABI.
Săvulescu, T., 1952: Flora Republicii Populare Române I. Editura Academiei Republicii Populare Române,
București, 190-195.
Schaal, B.A., Hayworth, D.A., Olsen, K.M., Rauscher, T., Smith, W.A., 1998: Phylogenetic studies in
plants: problems andprospects. Molecular Ecology, 7, 465–474.
Selkoe, K.A., și Toonen, R.J., 2006: Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating
microsatellite markers. Ecology letters, 9(5), 615-629.
Slade, D., Ballian, D., Gracan, J., Papes, D., 2008: The Chloroplast DNA Polymorphisms of White Oaks of Section
Quercus in The Central Balkans. Silvae Genetica, 57(4), 227.
Slatkin, M., 2008: Linkage disequilibrium—understanding the evolutionary past and mapping the medical
future. Nat. Rev. Genet. 9:477-485.
Smouse, P.E., Peakall, R.O.D., Gonzales, E.V.A., 2008: A heterogeneity test for finescale genetic structure. Molecular
Ecology 17: 3389-3400.
Sun, Y.L., Wang, D., Lee, H.B., Park, W.G., Kwon, O.W., Hong, S.K., 2011: Phylogeny of Korean Hornbeam
(Carpinus turczaninowii) based on nuclear ribosomal ITS sequence. African Journal of Biotechnology Vol.
10(76), pp. 17435-17442.
Şofletea, N., Curtu, L., 2007: Dendrologie. Editura Universităţii Transilvania, Braşov, p. 182-187.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
70
Şulea, C., Oroian, I., Covrig, I., Ioan, T.Ă.U.T., Burduhos, P., 2013: Assessing the importance of biotic factors in tree
development. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca.
Agriculture, 70(2), 317-320.
Teixeira, H., Rodríguez-Echeverría, S., Nabais, C., 2014: Genetic diversity and differentiation of Juniperus thurifera
in Spain and Morocco as determined by SSR. PloS one, 9(2), e88996.
Thomson, A.M., Dick, C.W., Pascoini, A.L., Dayanandan, S., 2015: Despite introgressive hybridization, North
American birches (Betula spp.) maintain strong differentiation at nuclear microsatellite loci. Tree Genetics &
Genomes, 11(5), pp.1-12.
Thorne, R.F., 1973: The ‘‘Amentiferae’’ or Hamamelidae as an artificial group: a summary statement. Brittonia
25:395–405.
Toader, A.V., 2010: Evaluarea variației genetice a stejarului pedunculat (Quercus robur L.) și stejarului brumăriu
(Quercus pedunculiflora K. Koch.) din România cu ajutorul markerilor izoenzimatici și a ADN-ului
cloroplastic. Teză. Universitatea Transilvania Brașov.
Tutin, T.G., Heywood, V.H., Burges, N.A., Valentine, D.H., Walters, S.M., Webb, D.A., 1993: Flora Europea. Vol.
1. 2nd ed. Cambridge University Press, Cambridge, U.K.
Tzedakis, P.C., 1994: Vegetation change through glacial-interglacial cycles: A long pollen sequence perspective.
Philos. Trans. R. Soc. Lond. B, 345, 103–432.
Van Oosterhout, C., Hutchinson, W.F., Wills, D.P.M., Shipley, P., 2004: MICROCHECKER: software for identifying
and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes, 4, 535–538.
Van Oosterhout, C., Weetman, D., Hutchinson, W.F., 2006: Estimation and adjustment of microsatellite null alleles
in nonequilibrium populations. Molecular Ecology Notes, 6(1), 255-256.
Van Puyvelde, K., Van Geert, A., Triest, L., 2010: ATETRA, a new software program to analyse tetraploid
microsatellite data: comparison with TETRA and TETRASAT. Molecular Ecology Resources, 10, 331 334.
Vekemans, X., și Hardy, O.J., 2004: New insights from fine-scale spatial genetic structure analyses in plant
populations. Molecular Ecology 13: 921-935.
Vettori, C., Vendramin, G.G., Anzidei, M., Pastorelli, R., Paffetti, D., Giannini, R., 2004: Geographic distribution of
chloroplast variation in Italian populations of beech (Fagus sylvatica L.). Theoretical and Applied Genetics,
109(1), 1-9.
Weising, K., Gardner, R.C., 1999: A set of conserved PCR primers for the analysi of simple sequence repeat
polymorphisms in chloroplast genomes of dicotyledonous angiosperms. Genome 42: 9–19.
Wigginton, J.E., Cutler, D.J. and Abecasis, G.R., 2005: A note on exact tests of Hardy-Weinberg equilibrium. The
American Journal of Human Genetics, 76(5), pp.887-893.
Willis, K.J., Sumegi, P., Braun M., Toth, A., 1995: The Late Quaternary history of Batorliget, NE Hungary.
Palaeogeogr, Palaeoclim. Palaeoecol. 118, 25-47.
Willis K.J., 1997: The impact of early agriculture upon the Hungarian landscape. In Landscape in Flux - Central and
Eastern Europe in Antiquity. Oxbow Books, Oxford, 193-207.
Willis, K.J., Sumegi, P., Braun M., Toth, A., 1997: Does soil change causes vegetation change of vice versa? A
temporal perspective from Hungary. Ecology, 78, 740-750.
Willner, W., Di Pietro, R., Bergmeier, E., 2009: Phytogeographical evidence for post‐glacial dispersal limitation of
European beech forest species. Ecography, 32(6), 1011-1018.
Winkler, H., 1904: Betulaceae. In: Engler A ed. Pflanzenreich IV. Lepeig. 61: 1–149.
Wright, S., 1951: The genetical structure of populations. Ann. Eugen. 15: 323–354.
Yeh, F.C., Yang, R.C., Boyle, T.J.B., Ye, Z.H. și Mao., J.X., 1997: POPGENE, the user-friendly shareware for
population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Centre, Univ. Alberta, Edmonton, AB,
Canada. Available online at http://www. ualberta.ca/~fyeh/.
Xu, J., Deng, M., Jiang, X.L., Westwood, M., Gang Song, Y., Turkington R., 2015: Phylogeography of Quercus
glauca (Fagaceae), a dominant tree of East Asian subtropical evergreen forests, based on three chloroplast
DNA interspace sequences Tree Genet. Genomes, 11, pp. 1–17.
Zhu, Z.L., Lin, Q.M., Xu, Y.Y., 2012: Formative arts and landscape application of european hornbeam. In Advanced
Materials Research (Vol. 461, pp. 620-623). Trans Tech Publications.
*** http://ww2.bgbm.org/EuroPlusMed/ [accessed DATE].
*** http://lemn.fordaq.com/news/paduri_suprafata_volum_crestere_44662.html.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
71
Rezumat
Distribuția diversității genetice a celor două specii de Carpinus (Carpinus betulus L. şi C.
orientalis Mill.), cu o suprapunere a arealului în România, dar cu cerințe ecologice distincte, a fost
investigată cu ajutorul markerilor genetici ADN de tipul microsateliţilor nucleari (7 la carpen și 5
la cărpiniță) şi cloroplastici (3 markeri).
Prin intermediul SSRn, s-a constatat că, la carpen, populația Leamna din Oltenia a
întregistrat valoarea cea mai ridicată a diversității genetice. Analiza bayesiană și analiza cluster au
permis identificarea unor diferențe evidente între populațiile de carpen din sud-vestul României și
cele din celelalte regiuni. În populațiile de cărpiniță, diversitatea genetică este relativ ridicată (He
= 0,531), iar analiza bayesiană și analiza cluster au surprins o grupare a populațiilor analizate în
trei grupuri omogene.
Analizele la nivelul ADN-ului cloroplastic au reliefat o diversitate foarte scăzută în cele 24
populații, cu doar două haplotipuri specifice pentru fiecare specie. S-a observat, de asemenea, o
structură genetică proprie fiecărei specii, fără a exista haplotipuri comune, ca rezultat că cele două
specii s-au separat cu mult timp în urmă. O structură haplotipică particulară a fost observată într-
o populație izolată de cărpiniță (Roșcani, la nord de Iași), populație care trebuie inclusă în categoria
resurselor genetice ale acestei specii.
Abstract
Distribution of genetic diversity for two Carpinus species (C. betulus and C. orientalis)
with overlapping geographic distribution in Romania but with distinct ecological requirements
was investigated with DNA nuclear microsatellite markers (7 at hornbeam and 5 at oriental
hornbeam) and chloroplast microsatellite markers (3 markers).
Using SSRn, in Leamna population from Oltenia was întregistrat the higher genetic
diversity, at hornbeam. Bayesian analysis and cluster analysis allowed the identification of obvious
differences between southwestern Romania hornbeam populations and other regions. At oriental
hornbeam, genetic diversity is relatively high (He = 0,531), and both bayesian and cluster analysis
have surprised a grouping in three homogeneous clusters.
The analyzes to the chloroplast DNA level have revealed a very low diversity in the 24
populations, with only two specific haplotypes for each species. Also, we observed the specific
genetic structure of each species without there being common haplotypes, without there being
common haplotypes, as a result that the two species have been separated a long time ago. A
particular haplotype structure was observed in a C. orientalis isolated population (Roșcani, at north
of Iași), population which is to be included in the genetic resources category of this species.
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
72
CURRICULUM VITAE
Date personale:
Nume și prenume: CĂRĂBUȘ (căs. APETREI) Mihaela Cristina
Cetățenie: Română
Stare civilă: căsătorită
Data nașterii: 12/04/1988
Domiciliu: Str. Ioan Popasu, Nr. 15, Bl. C10, Et. 3, Ap. 32, Oraș Brașov, Județul Brașov,
România
Telefon mobil: +40 767 644 373
E-mail: [email protected]
Educație și formare profesională:
2013 - 2017 - Doctorand - Universitatea Transilvania din Brașov/ Facultatea de Silvicultură
și Exploatări Forestiere
20011 - 2013 - Diplomă de master - Managementul Ecosistemelor Forestiere - Universitatea
Transilvania din Brașov/ Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere
2007 - 2011 - Diplomă de inginer - Universitatea Transilvania din Brașov/ Facultatea de
Silvicultură și Exploatări Forestiere
2003 - 2007 - Diplomă de bacalaureat - Liceul Teoretic „Radu Vlădescu’’ Pătârlagele, Buzău
– România.
Limbi străine: Engleză (Nivel B2), Franceză (Nivel B1)
Publicații:
A. Lucrări publicate în reviste ISI: 1 (prim autor; în analiza spre publicare)
B. Lucrări publicate în reviste indexate BDI/B+: 3 (prim autor)
C. Lucrări prezentate la conferințe și simpozioane internaționale: 2
Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)
în populații din România: evaluări cu markeri ADN
73
CURRICULUM VITAE
Personal data:
Name and surname: CĂRĂBUȘ (married APETREI) Mihaela Cristina
Nationality: Romanian
Marital status: married
Date of birth: 12/04/1988
Address: Str. Ioan Popasu, Nr. 15, Bl. C10, Et. 3, Ap. 32, Oraș Brașov, Județul Brașov,
România
Mobile phone: +40 767 644 373
E-mail: [email protected]
Education:
2013 - 2017 - Doctoral studies - Transylvania University of Brasov/ Faculty of Silviculture
and Forest Engineering
2011 - 2013 – Master diploma in Management of Forest Ecosystems - Transylvania
University of Brasov/ Faculty of Silviculture and Forest Engineering
2007 - 2011 - Diploma Engineer in Forestry - Transylvania University of Brasov/ Faculty of
Silviculture and Forest Engineering
Foreign languages: English (B2), French (B1)
Publications:
A. Papers published in SCI journals: 1 (first author; in press)
B. Papers published in indexed BDI/B+ journals: 3 (first author)
C. Papers presented at international conferences and symposia: 2