CATALAZA Peroxid de hidrogen:peroxid de hidrogen oxidoreductaza

(EC 1.11.1.6)

Sursa de obtinere: celule aerobeLocalizare : peroxizomiFunctie: protectia celulelor de efectele toxice ale peroxidului de hidrogen prin catalizarea reactiei de descompunere a acestuia in oxigen molecular si apa, prevenind formarea radicalilor liberi Structura cuaternara: tetramer alcatuit din 4 holosubunitatiMasa moleculara: 220.000 – 350.000 kD Grupare prostetica: 1 molecula hem / subunitate Cofactor: suplimentar NADH/NADP in cazul unor specii

Reactie totala: 2 H2O 2 ------> 2 H2O +O2

Mecanism propus:

H2O2 + Fe(III)-E --> H2O +O=Fe(IV)-E (1) H2O2 + O=Fe(IV)-E --> H2O + Fe(III)-E (2)

CATALAZA (EC 1.11.1.6),

Escherichia coli Proteus mirabilis

Biosinteza catalaza de origine microbianaSursa de obtinere : celule de Micrococcus lysodeikticus Bacterie Gram + Sensibilitate la actiunea lizozimului (muramidaza-EC 3.2.1.17) asupra peptido- glucanului din peretele celular ce actioneaza asupra legaturilor -1,4 dintre acidul muramic si resturile glucozamidiceParametrii biosintezei volum de lucru raport inoculare temp de lucru debit de aer in perioada de lag si in urmatoarele ore agitare pH mediu initial antispumant durata procesuluiProcedee de conditionare a albusului de ou

DeshidratareLiofilizare in absenta de conservanti/stabilizatori in prezenta de zaharoza 10% in prezenta zaharoza 10% si gelatina 20%Atomizare

SCHEMA DE LUCRUMod de lucru

Preinocul pe tuburi cu geloza inclinata24 h 370 C

Inocul: cultura agitata pe mediu la 300 C, 24 h

Mediu minimal de geloza

Mediu nutritiv agarizatColonii izolate din cultură conservata prin liofilizare

Selectie naturala in functie de capacitatea de biosinteza a catalazei

Biosinteza in cultura submersa, la 300 C, 18-20h

Separare prin centrifugare

Purificare parţială Celule

Mediu de cultura sterilizat

Liza enzimatica Lizozim

Tampon fosfat de sodiu 0,1M pH 7,0 in prezenta de NaCl 0,5-2%

Celule Micrococcus lysodeikticus

Precipitare fractionata cu alcool etilic 50-80% v/v

Conditionare albus de ouTemp 370 C

Centrifugare

Supernatant

Proteine balast

Debriuri celulare

Temp 250 C

Temp 50 C

Precipitare fractionata cu alcool etilic 0-50% v/v

Centrifugare

Supernatant 80% alcool etilic

Precipitat

Alcool etilic 90% v/v

Alcool etilic 90% v/v

Recuperarealcool etilic

Solubilizare

Omogenizare prin agitare magnetica

Centrifugare Particule insolubile

Solutie de catalaza

Conditionare

Produs finit: CATALAZA

Aspect: lichid de culoare bruna, fara rezidii de decantare

Proprietati fizico-chimice: complex solubil in apa

Activitate catalazica: min 50.000 UI

Proprietati microbiologice : nu se admite prezenta germenilor patogeni

Filtrare sterila

Glicerina

Apa distilata

Metoda colorimetrica de dozarea activitatii catalazeiPrincipiul metodei: bicromatul de potasiu in mediu acid este redus de peroxidul de hidrogen la acetat cromic, care poate fi colorimetrat la 570 nm.

Catalaza2H2O2 ------> 2H2O +O2

+K2Cr2O7(mediu acid)----->acetat cromic

Reactivi si solutii:1.Reactiv bicromat-acid acetic glacial2. Tampon fosfat de potasiu 0,01 M pH 73. Solutie H2O2 0,08 M (solutie stoc pentru construirea curbei etalon)

Determinarea activitatii enzimaticeProba Martor Blanc

Preparat enzimatic (ml) 0,1 - -

Apa distilata - - 0,1

Tampon (ml) 0,4 0,4 0,4

Solutie apa oxigenata 0,16M (ml)

0,5 0,5 0,5

Timp de reactie 30 secunde

Reactiv bicromat (ml) 2,0 2,0 2,0

Preparat enzimatic (ml) - 0,1 -

Incubare 10 min pe baia de apa la fierbere

Racire probe la temperatura camerei

Colorimetrare la 570 nm

Calculare rezultate pe baza curbei de etalonare si exprimarea activitatii in moli H 2O2 consumat/ml preparat enzimatic/min