Biotehnologii de obinere a enzimelor furajere utilizate n hrana animalelor Generaliti:Termenul de enzim a fost folosit pentru prima dat de ctre Kuhne (1887) pentru a numi o subtan catalitic obinut din drojdii. Mai trziu s-a stabilit faptul c enzimele sunt de fapt proteine cu activitate catalitic. Ele sunt sintetizate de toate organismele vii (microorganisme, plante i animale) i produc ansamblul reaciilor biochimice care determin metabolismul.Enzimele sunt biocatalizatori foarte eficieni, ele acioneaz n cantiti mici i au o activitate extrem de intens, putnd mri viteza de desfurare a reaciilor chimice de pn la 106 ori. Enzimele acioneaz asupra substratului pentru care manifest specificitate catalitic numai n anumite condiii de temperatur i pH, i la fel ca orice catalizator nu se consum i nu se transform n timpul reaciilor chimice.perioad ndelungat de timp din trecutul omenirii enzimele au stat la baza obinerii pinii, brnzeturilor, vinului i a berii fr a fi ns identificate.Din multitudinea de enzime care particip la reaciile metabolice, au fost identificate i caracterizate pn n prezent peste 2000 de enzime, din care ~ 200 sunt disponibile pentru utilizare n procesele industriale.Clasificarea enzimelor:Clasificarea enzimelor se face n primul rnd dup natura reaciei pe care o catalizeaz i apoi dup substratul i produii specifici. Enzimele au fost clasificate n urmtoarele clase:Oxidoreductaze catalizeaz reacii de oxido- reducere, denumite donor/ acceptor oxidoreductaze.Transferaze catalizeaz transferul unor grupri chimice de la o molecul la alta, fiind denumite gruptransferaze.Hidrolaze - catalizeaz scindarea pe cale hidrolitic a legturilor dintre un atom de carbon i ali atomi.Liaze catalizeaz scindarea moleculelor de substrat la nivelul legturilor C-C, C-O, C-N, C-S, fr a interveni n reacie molecule de ap ca n cazul hidrolazelor.Izomerazele - catalizeaz rearanjri interne n molecula substratului.Ligazele (sintetazele) catalizeaz sinteza a 2 ractani prin formarea legturilor de tip: C-C; C-O; C-N; C-S. Enzimele folosite n alimentaia animalelor sunt n exclusivitate hidrolazele, acestea avnd capacitatea de a degrada anumite substane n prezena apei, absolut necesar activitii enzimatice. La finele fiecrui ciclu de reacie enzima se regsete neconsumat alturi de produii rezultai din degradarea substatului iniial.Specificitatea i mecanismul de aciune al enzimelorSpecificitatea reprezint proprietatea de baz a enzimelor care este determinat de structura i conformaia situsului catalitic.Enzimele au o specificitate dubl:Specificitatea de substrat- unele enzime au o specificitate absolut acionnd strict asupra unui substrat, iar altele au o specificitate relativa de grup acionnd asupra mai multor substraturi cu structuri chimice asemntoare.Specificitatea de aciune- const n faptul c fiecare enzim catalizeaz numai un anumit tip de reacie. Acelai substrat poate fi catalizat de mai multe enzime ns tipurile de reacie i produii de reacie finali sunt diferii.Mecanismul de aciune al enzimelorInteraciunea enzim- substrat este una de complementaritate riguroas asemntoare modelului lact- cheie. Molecula de substrat se fixeaz la situsul catalitic, formnd un complex de tranziie din care se obine rapid unul sau mai multe produse. Interaciunea temporar a moleculei de substrat cu enzima se realizeaz prin trei tipuri de catene laterale de aminoacizi care intr n structura situsului catalitic: prima caten asigur legarea, a doua caten induce orientarea steric i a treia induce activarea substratului.Pentru a avea loc transformarea substratului ntr-un produs, este necesar ca moleculele substratului s fie activate. Energia de activare a unui substrat reprezint cantitatea de energie necesar pentru ca toate moleculele dintr-un mol de substan s ating o stare activat.Enzimele au capacitatea de a micora foarte mult energia necesar pentru activarea moleculelor de substrat i accelereaz transformarea substratului n produi de reacie.Factorii care influeneaz viteza de reacie a enzimelorViteza de reacie reprezint cantitatea de substrat care se transform n unitatea de timp. Principalii factori care influeneaz viteza de reacie sunt: concentraia enzimei, concentraia substratului, temperatura, pH-ul i efectorii enzimatici.Concentraia enzimei. Viteza de reacie este direct proporional cu creterea concentraiei enzimei (ntre anumite limite), apoi aceasta devine constant.Concentraia substratului. Creterea concentratiei substratului la o concentraie enzimatic constant determin n prima faz o cretere rapid a vitezei de reacie dup care aceasta devine constant. La concentraii mici ale substratului numai o parte dintre situsurile catalitice ale enzimelor sunt saturate cu molecule de substrat. Dup structurarea complet a situsurilor enzimatice, asigurarea unui exces de substrat nu mai determin o nou cretere a vitezei de reacie.Temperatura. Viteza de reacie a enzimelor crete o dat cu creterea temperaturii pn la anumite limite peste care efectul catalitic scade, iar n fimal dispare. Activitatea enzimatic are loc numai n anumite limite ale temperaturii, enzimele folosite n alimentaia animalelor avnd o activitate intens n intervalul 35- 400C, temperatura specific organismului animal. Temperaturile de peste 80- 900C produc denaturarea ireversibil a proteinelor avnd loc pierderea activitii enzimatice. Meninerea stabilitii enzimelor furajere la temperaturi ridicateeste de dorit n cazul granulrii nutreurilor combinate, proces care necesit temperaturi de 70- 800C.pH-ul. Enzimele au activitate catalitic intens la valori foarte diferite ale pH-ului mediului. pH-ul optim este considerat cel la care viteza de reacie este maxim. Pepsina are pH-ul optim de 2,0- 2,5, tripsina 7,8 iar fosfataza alcalin 9,0.Efectorii enzimatici acioneaz asupra enzimelor influennd pozitiv sau negativ viteza reaciilor enzimatice.Efectori enzimatici activatori sunt: Mn2+ , Ca2+ , Cl- , Mg2+ Efectori enzimatici inhibitori sunt: ireversibili: Pb2+ , Hg2+ , CO, Asreversibili- se asociaz temporar de enzim blocndu-i activitatea catalitic.Determinarea vitezei de reacie se poate realiza pe baza msurrii gradului de transformare a substratului ntr-un anumit interval de timp sau prin msurarea concentraiei de produs rezultat ca urmare a reaciei enzimatice, ntr-o unitate de timp.Biotehnologia obinerii produselor enzimatice furajereEnzimele pot fi produse din culturi de microorganisme, culturi de celule i extracte de esuturi animale sau vegetale.n momentul de fa cea mai mare parte a enzimelor sunt obinute cu ajutorul microorganismelor, n special ciuperci i bacterii.Avantajele utilizrii microorganismelor pentru obinerea enzimelor Avantajele utilizrii microorganismelor pentru obinerea produselor enzimatice sunt:microorganismele pot sintetiza o gam larg de enzime dintre care o parte nu pot fi produse de organismul animal;deoarece microorganismele sunt capabile s se adapteze unor condiii foarte variate de mediu (temperatur, pH, etc) enzimele microbiene sunt deseori mai stabile n medii mai puin favorabile fa de enzimele provenite din plante sau animale;datorit multiplicrii mai rapide a microorganismelor se pot obine cantiti mai mari de enzime; separarea enzimelor bacteriene se face relativ uor, mai ales cnd au o localizare extracelular;mediul de cultur este mai uor de sterilizat i pot fi evitate uor contaminrile;preul de cost este mai mic comparativ enzimelor obinute din culturi celulare sau extracte tisulare.Doar anumite ciuperci i bacterii au capacitatea de a se multiplica rapid i de a produce o cantitate mare de enzime. Aceste microorganisme sunt selecionate din populaiile slbatice sau sunt obinute prin tehnici de inginerie genetic n cazul crora informaia genetic a unei enzime este transferat la alt microorganism.Pentru a gsi microorganismele adecvate sintezei enzimatice au fost testate sute de genuri i specii microbiene. Compoziia mediului are de asemenea un rol foarte important n procesele de biosintez enzimatic. Acesta trebuie s conin zaharuri, proteine i sruri minerale asigurate prin: hidrolizate de amidon, zaharoz, melas, fin de cereale, rot de soia etc.Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc mediul de culturMediul de cultur trebuie s ndeplineasc cteva condiii importante:s fie accesibil n cantiti mari; s nu conin substane toxice;s aib o compoziie constant;s se obin la un pre de cost sczut;Procedee folosite pentru producerea enzimelorPrincipalele metode folosite pentru producerea enzimelor la scar industrial sunt:Procedeul la suprafa. Const n utilizarea unui mediu solid sau semisolid care conine cantiti mici de ap i este foarte bine aerat. Dup terminarea fermentaiei, mediul este omogenizat, uscat pn la 10- 12% ap i apoi mcinat sub form de pudr. Metoda este laborioas i foarte costisitoare. Totui prin acest procedeu se obin unele enzime cum sunt proteazele i pectinazele din genul Aspergillus.Procedeul submersPrin acest procedeu se obin majoritatea enzimelor microbiene. Mediile nutritive sunt lichide, iar cultivarea microorganismelor este submers. Metoda permite asigurarea unui control riguros asupra compoziiei chimice a mediului, pH-ului, temperaturii i aerrii.Bioreactoarele folosite pentru producerea enzimelor sunt nchise (se reduce riscul contaminrii cu microorganisme strine), avnd capaciti cuprinse ntre 10- 50 m3. Fermentaia dureaz ntre 30- 150 ore. Produsele de fermentaie obinute prin aceast metod sunt purificate, standardizate i supuse unui control de calitate. Enzimele eliminate de microorganisme n spaiul extracelular (n stare liber) pot fi izolate uor prin ndeprtarea masei celulare, centrifugare i filtrarea lichidului.Enzimele intracelulare sunt izolate prin dezintegrarea mecanic a membranelor celulare i mitocondriale cu ajutorul morilor cu bile, omogenizatoarelor sub presiune etc.Produsele enzimatice sunt comercializate sub form solid sau lichid, n stare brut sau cu mare puritate.Enzimele furajere se introduc n nutreurile combinate n cantiti de 1-2 kg/t avnd costuri cuprinse ntre 3-25 $/ kg.Pentru meninerea stabilitii enzimelor o period mai lung de timp, fr a fi influenat negativ activitatea lor catalitic se folosete metoda imobilizrii enzimelor. Imobilizarea se poate face folosind metode fizice i chimice. Metodele fizice mai des utilizate sunt: adsorbia enzimelor n interiorul unei matrici insolubile, acoperirea enzimelor cu gel sau ncapsularea enzimelor ntr-o membran semi- permeabil. Din punct de vedere chimic enzimele pot fi legate covalent la un suport insolubil de natur anorganic sau organic (ceramic, sticl, celuloz, nylon, polistiren).Un produs enzimatic nou aprut poate fi comercializat numai dup verificarea securitii i a siguranei aplicrii lui n producie. Testele se efectueaz pe animale de laborator i sunt foarte costisitoare putnd dura de la cteva sptmni la civa ani. Microorganismele folosite n producerea enzimelorMicroorganismele implicate n producia de enzime aparin fungilor (Aspergillus, Penicillium, Humicola i Trichoderma), bacteriilor (genurile Bacillus licheniformis i Bacillus subtilis) i chiar unor drojdii. Utilizarea enzimelor n structurile de nutreuri combinateUtilizarea enzimelor n hran a fost menionat pentru prima dat de ctre Charlton i col. (1996), acesta sugernd urmtoarele ci pentru folosirea complexelor enzimatice:simpla introducere n diet. Enzimele introduse n plus la dieta standard (fr reformulare) mbuntesc digestibilitatea nutreurilor i totodat mbuntesc performanele de cretere ale animalelor. De aceea utilizarea lor a fost sugerat n reetele prestarter i starter ale acestora.utilizarea altor materii prime n diet. Prin folosirea enzimelor se observ o mbuntire a nivelului de energie, protein brut i a digestibilitii aminoacizilor, enzimele putnd fi adugate la reete reformulate cu un cost mai redus de producie.Utilizarea produselor enzimatice n hrana animalelorUtilizarea enzimelor n alimentaia animalelor a fost necesar n urma unor constatri efectuate asupra proceselor de digestie ale animalelor cum ar fi: enzimele digestive ale animalelor monogastrice pot digera numai o parte din substanele nutritive coninute de materiile prime furajere.Porcii i psrile nu sintetizeaz unele enzime cum sunt: glucanazele, celulazele, fitazele i prin urmare nu pot valorifica eficient o serie de substane prezente n cantiti mari n nutreurile de origine vegetal etc.Totodat animalele tinere au un echipament enzimatic incomplet dezvoltat, de aceea utilizarea substanelor nutritive din hran este mai redus dect la adulte.Produsele enzimatice furajere au fost realizate innd cont de particularitile tubului digestiv i ale digestiei diferitelor specii de animale. Ele trebuie s reziste pH-ului foarte acid din stomac, la atacul enzimelor proteolitice din stomac i intestinul subire, i s aib o activitate catalitic optim la temperatura i pH-ul caracteristic animalelor crora le sunt administrate.Produsele enzimatice pot fi att de fermentaie unic ct i amestecuri enzimatice. n cazul produselor de fermentaie unic, n funcie de microorganismul utilizat i de compoziia chimic a substratului se obine o anumit enzim cu activitate catalitic specific.Produsele multienzimatice sunt amestecuri complexe de enzime bacteriene i fungice obinute prin combinarea n diferite proporii a produselor enzimatice de fermentaie unic i au o capacitate catalitic multipl.Obiectivele urmrite folosind enzimele furajere n funcie de tipul enzimelor i modul de aciune al acestora produsele enzimatice administrate ca aditivi furajeri urmresc urmtoarele obiective:Suplimentarea enzimelor endogene. Se folosesc cu precdere amilazele i proteazele n cazul animalelor tinere cum sunt puii, purceii i vieii care au echipamentul enzimatic insuficient dezvoltat n primele sptmni de via. Enzimele exogene particip alturi de cele endogene la digerarea mai bun a hranei n cazul speciilor i categoriilor amintite de animale.Prin adugarea n hran a lipazelor microbiene sunt valorificate eficient grsimile adugate n nutreul combinat pentru creterea nivelului energetic al hranei care atrage dup sine sporuri mai mari de cretere i micorarea consumurilor specifice.Asigurarea unor enzime care nu sunt produse de organismul animal. n acest scop se folosesc: celulaza, hemicelulaza, pentanaza, glucanaza, Xilanaza, - galactozidaza, fitaza. Aceste enzime hidrolizeaz anumite substraturi pentru care organismul nu are capacitatea de a sintetiza enzime specifice.Folosindu-se preparate multienzimatice compuse din enzimele amintite n hrana monogastricelor, crete capacitatea acestora de a degrada componenii pereilor celulelor vegetale, sunt nlturate efectele negative ale polizaharidelor neamidonoase, fiind mbuntit totodat utilizarea energiei i a aminoacizilor din hran. De asemenea prin utilizarea fitazelor microbiene, fosforul este eliberat din forma sa fitic cum se gsete n mare parte n cereale, tre, boabe de leguminoase i roturi, iar apoi poate fi digerat i absorbit de ctre organismul animal la nivelul intestinului subire. Totodat se reduce efectul poluant al fosfailor eliberai n mediu prin dejeciile animalelor.Modul de prezentare a preparatelor enzimatice: Produsele enzimatice sunt adugate n nutreul combinat sub form uscat sau lichid.Produsele enzimatice sub form uscat sunt diluate pe un suport de cereale, tre sau roturi, realizndu-se un premix de enzim. Dozele recomandate sunt de ~1 kg enzim/ t nutre combinat (1 kg enzim + 9 kg suport=> 10% enzim din care se d 10 kg premix cu 10% enzim / tona de nutre combinat).Produsele enzimatice sub form uscat sunt mult mai rezistente la temperaturi ridicate comparativ cu formele lichide, lucru deosebit de important n cazul granulrii nutreurilor combinate.Pentru a nltura pericolul inactivrii enzimatice, n timpul fabricrii nutreurilor combinate s-a urmrit pe de o parte obinerea unor enzime stabilizate, rezistente la temperaturi ct mai mari, iar pe de alt parte dezvoltarea unor tehnologii de producere a enzimelor lichide.Produsele enzimatice sub form lichid se adaug n nutreurile combinate prin pulverizarea granulelor. Produsele enzimatice lichide au o stabilitate de peste 6 luni. Ele pot fi imobilizate pe un suport solid i eliminnd excesul de ap, timpul de garanie este mult mai mare.Produsele enzimatice ce pot fi folosite n hrana animalelorProdusele enzimatice pe baz de fitaze: Allzyme Phytase (Alltech), Natuphos (Basf); FitaseTM (Finm Feeds International), Novo phytase (Novo Nordish).Produsul multienzimatic Allzyme SSF (Alltech) se poate obine pe subproduse furajere: mal, gru sau tre de gru, prin fermentarea acestora cu ciuperca Aspergillus niger. Produsul comercial are un coninut de 21% PB, 2,6% GB i 18% CelB i conine 7 tipuri de enzime: proteaze, amilaze, xilanaze, beta- glucanaze, pectinaze, celulaze i fitaze. Se poate introduce n hrana tuturor speciilor de animale, dar n special la porcine i pasri n doze de 0,02% din structura nutreului combinat. Dietele n care se folosete acest produs multienzimatic, pot fi reformulate prin reducerea valorii energetice a nutreului combinat cu circa 75 Kcal i reducerea coninutului n Ca i P cu 0,1% comparativ cu lotul martor, reducndu-se in acela timp preul de cost al furajelor, cu meninerea concomitent a performanelor productive la un nivel ridicat. Produsul multienzimatic KenzymeHF (Kemin Europa din Belgia) conine celulaze, gluconaz, amilaz, lipaz i proteaz, destinat reetelor cu materii prime care au mult celulaz; Avyzime- pui de carne; Porzyme- purcei i porci la ngrat.Subtilaza Z- porcinele supuse ngrrii (diger amidonul i proteinele din cereale); Aspergilaza (la purcei);Proteaza bacterian (tineret porcin nrcat- obinut la Institutul de Cercetri Chimico- Farmaceutice Bucureti);Celulaza Cx (pui de carne i porci la ngrat);Allzyme Vegpro (folosit pentru rotul de soia);Allzyme FD (pentru hidroliza enzimatic a finii de pene);Biozym x 1000 (Biomin Austria)- conine xilanaza folosit n nutreul combinat pentru psri i porci care conine mult gru;Biozym G 2000 (Biomin Austria) nutre combinat pentru porci i psri care conine mult orz;Biozym M 800 (Biomin Austria)- produs multienzimatic destinat psrilor i porcilor care primesc n hran nutre combina cu porumb, rot de floarea- soarelui i rot de soia.Compania american Alltech a obinut primul preparat enzimatic protejat pentru rumegtoare: Fibrozyme. Preparatul administrat n doz de 15 g/ zi determin creterea produciei de lapte datorit unei ingeste mai mari de hran i a unei fermentaii rumenale mai eficiente a substraturilor greu digestibile. Administrarea enzimei la tineretul taurin a determinat creterea sporului mediu zilnic.Adugarea enzimelor furajere n hrana porcilor, psrilor i mai recent a rumegtoarelor, contribuie la creterea digestibilitii substanelor nutritive din nutreuri, mbuntirea performanelor productive a animalelor, utilizarea n proporii mai mari a materiilor prime cu digestibilitate mai sczut i cu un pre de cost mai mic, reducerea costurilor pe unitate de produs i reducerea polurii mediului.