biochimie

INVESTIGAŢII BIOCHIMICE ALE MARKERILOR FUNCŢIEI HEPATICE

Medicina secolului XXI se bazează mult pe investigaţiile paraclinice,

scopul tuturor acestor investigaţii fiind reducerea impreciziei examenului

clinic. Importanţa acestora variază în funcţie de caracteristicile

examenului respectiv şi de situaţia clinică. Deoarece controlul stării de

sănătate costă, este absolut necesară selectarea judicioasă a

investigaţiilor paraclinice şi în particular a celor de laborator. Un

management corect şi riguros al investigaţiilor de laborator ar trebui să

contureze un profil biochimic, imunologic, microbiologic etc. al fiecărui

organ şi sistem ce urmează a fi investigat. Pornind de la acest principiu în

prezentarea determinărilor biochimice privind evaluarea funcţiei hepatice,

am conturat un profil biochimic hepatic, prezentând determinările

biochimice obligatorii în evaluarea funcţiei hepatice, dar şi alte determinări

suplimentare ce pot fi efectuate ţinând cont de complexitatea reacţiilor

biochimice la nivel hepatic.

Datele de laborator care explorează afectarea hepatică sunt

denumite în mod obişnuit – teste funcţionale hepatice (TFH). Acestea

cuprind o baterie de analize biochimice care susţin diagnosticul de

hepatopatie. Ficatul este sediul unor multitudini impresionanate de

procese biochimice, astfel încât nu există nici un test care să poată fi

considerat indicator unic pentru disfuncţia hepatică.

Înainte de a trece la interpretarea testelor funcţionale hepatice

modificate, trebuie să menţionăm că pot apărea erori în interpretarea

testelor funcţionale hepatice.

● Unele TFH, cum ar fi măsurarea nivelului aminotransferazelor sau

a activităţii fosfatazei alcaline, nu reflectă nemijlocit funcţia hepatică, ci

exprimă lezarea parenchimului hepatic sau leziuni obstructive biliare.

● TFH nu identifică un diagnostic specific, ci ne direcţionează spre o

anumită categorie de alterare hepatică.

1

● TFH sunt de obicei nespecifice. Astfel, modificările TFH pot reflecta

afecţiuni extrahepatice, localizate, de exemplu, la nivelul sistemului osos,

muscular sau cardiovascular.

● TFH sunt frecvent lipsite de sensibilitate şi, mai ales, de

specificitate. Totuşi, TFH rămân elemente de mare utilitate pentru medicul

practician. În primul rând, TFH oferă posibilitatea evaluării noninvazive a

pacienţilor hepatici, în special a celor asimptomatici, anicterici cu

hepatopatie care evoluează subclinic, cum ar fi hepatita cronică virală şi

ciroza hepatică compensată. Utilizate împreună, TFH modificate pot

contribui la diferenţierea tipurilor de disfuncţie hepatică, cum ar fi, de

exemplu, obstrucţia biliară de hepatită virală. TFH sunt utile, de

asemenea, în evaluarea severităţii hepatopatiei, a prognosticului bolii, a

răspunsului la tratament şi a eventualelor ajustări terapeutice.

Astfel în cadrul testelor funcţionale hepatice un posibil profil

biochimic ar avea următoarea structură:

A. enzime hepatice: ALAT (alanin amino transferaza), ASAT (aspartat

aminotransferaza), ALP (fosfataza alcalină), GGT (gamma

glutamiltranspeptidaza), LDH (lactat dehidrogenaza) etc.

B. bilirubină serică

C. proteine totale

D. albumină

E. uree

Determinările suplimentare pot include: dozarea: 5'-nucleotidazei,

colinesterazei, leucin aminopeptidazei, glicemiei, colesterolului seric total.

Se poate concluziona că TFH au un rol important în depistarea unei

afecţiuni hepatice, precum şi în determinarea naturii şi magnitudinii

disfuncţiei hepatice. Nici un test nu este strict specific sau patognomonic

în evaluarea unei hepatopatii. Combinaţia însă, dintre mai multe teste,

vizând diferiţi parametri ai funcţiei hepatice, urmarite în dinamică, în timp

şi interpretate în contextul clinic, pot servi cu succes la precizarea

diagnosticului, a prognosticului, precum şi a cursului evolutiv al disfuncţiei

hepatice.

2

Fireşte, nu sunt excluse, funcţie de severitatea şi complexitatea

afecţiunii, testele hematologice, imunologice, microbiologice (dacă se

impun) precum şi alte explorări paraclinice suplimentare.

Întrucât lucrarea de faţă se adresează şi studenţilor, în tehnicile de

dozare ce le prezentăm sunt incluse determinări ce au la bază metode

manuale de dozare (cele folosite în cadrul orelor de lucrări practice), dar şi

tehnici de dozare specifice aparaturii semiautomate şi automate. Trebuie

să menţionam că metodele prezentate de noi reprezintă o variantă a

tehnicilor de dozare, iar fiecare laborator, în funcţie de aparatura pe care o

deţine şi de firmele de reactivi cu care colaborează, folosesc tehnici

specifice, dar care nu diferă din punct de vedere al principiului de bază. De

aceea este absolut necesar ca la efectuarea determinărilor biochimice se

fie precizat intervalul de valori de referinţă specific metodei de lucru

folosite.

3

CAPITOLUL I

ENZIME HEPATICE CU ROL ÎN DIAGNOSTIC

METODE DE DOZARE

I.1 Dozarea colorimetrică a alanin aminotransferazei (ALAT) şi a aspartat aminotransferazei (ASAT)

I.1.1 Dozarea enzimatică a ALAT (GPT) (metoda Merck)I.1.1.2 Dozarea enzimatică a ASAT (GOT) (metoda

Merck)I.2. Dozarea gamma-GT (-GT) (metoda cinetică)I.3. Dozarea lactat dehidrogenazei (LDH) (metoda cinetică)I.4. Dozarea fosfatazei alcaline (ALP) (metoda cinetică)I.5. Dozarea leucin-aminopeptidazei (LAP)I.6. Dozarea activităţii 5’-nucleotidazei (5’-NT)I.7. Dozarea activităţii colinesterazei (CHE) (metoda

colorimetrică cu reactiv Ellman)I.8. Dozarea activităţii ornitin carbamil transferazei (OCT)

4

CAPITOLUL I

ENZIME HEPATICE CU ROL ÎN DIAGNOSTIC

METODE DE DOZARE

I.1 DOZAREA COLORIMETRICĂ A ALANIN

AMINOTRANSFERAZEI (ALAT) ŞI A ASPARTAT

AMINOTRANSFERAZEI (ASAT)

Principiul metodei:

Enzimele ALAT (GPT) şi ASAT (sau GOT) din clasa transaminazelor

catalizează transferul unei grupe -NH2 de pe un aminoacid pe un -

cetoacid, rezultînd un nou aminoacid şi un nou cetoacid în cadrul

următoarelor reacţii:

Acid -cetoglutaric Alanină Acid glutamic Acid piruvic

Acid -cetoglutaric Acid aspartic Acid glutamic Acid oxalacetic

Piruvatul şi respectiv oxalacetatul rezultaţi reacţionează în mediul

alcalin cu 2,4-dinitrofenilhidrazina formând 2,4-dinitrofenilhidrazona,

compus de culoare brună. Intensitatea coloraţiei este direct proporţională

5

cu cantitatea de piruvat respectiv oxalacetat formată şi poate fi

colorimetrată la 520 nm.

Aparatură:

Spectrofotometru

Baie de apa la 37oC

Reactivi:

1. Soluţie tampon fosfat 0,l M pH=7,4

2. Substrat ALAT: alanină 200 mM, -cetoglutarat 2 mM în tampon

fosfat

3. Substrat ASAT: L-aspartat 100 mM, -cetoglutarat 2 mM în tampon

fosfat

4. Reactiv de culoare 2,4-dinitrofenilhidrazină 10 mM

5. Soluţie NaOH 0,4 N

Mod de lucru:

Pentru fiecare probă se face un blanc al probei.

ReactiviALAT ASAT

Proba Blanc proba Proba Blanc probaSubstrat ALT(ml) Substrat AST^

1 1 - -

Substrat AST (ml) - - 1 1

Se introduce în baie de apă la 37 C timp de 5 minuteSer nehemolizat (ml) 0,2 - 0,2 -

Se amestecă şi se incubează 30 minute la

37C

Se amestecă şi se incubează 60 minute la

37CSer nehemolizat (ml) - 0,2 - 0,2

Reactiv de culoare (ml) 1 1 1 1Se lasă în repaus la temperatura camerei 20 de minuteNaOH (ml) 10 10 10 10

Se agită şi după 5 minute se citeşte absorbanţa probei faţă de blanc

la 520 nm în cuva de l cm.

Calcularea rezultatelor:

6

Valorile absorbanţelor obţinute sunt convertite în UI cu ajutorul

tabelelor:

Tabelul I : Valorile pentru ALAT în UI (calculate conform

absorbaţei citite)

Absorbanţa

UI Absorbanţa

UI

0,02 3 0,28 550,04 5 0,30 610,06 8 0,32 680,08 12 0,34 750,10 15 0,36 830,12 19 0,38 930,14 230,16 270,18 310,20 350,22 400,24 450,26 50Tabelul II : Valorile pentru ASAT în UI (calculate conform absorbaţei

citite)

Absorbanţa

UI Absorbanţa

UI

0,02 3 0,24 720,04 6 0,26 860,06 100,08 140,10 180,12 230,14 280,16 340,18 410,20 500,22 60

1 Unitate Internaţională enzimatică (UI) reprezintă cantitatea de

enzimă ce transformă 1 mol de substrat în timp de 1 minut în condiţii

standard.

1 miliunitate (mU) = l/1000U

Intervale de referinţă:

ALAT (GPT): 2,5-17 U/l

7

ASAT (GOT): 2-19 U/l

Pentru valori mai mari de 73 U/l se recomandă diluarea serului: 1

parte ser cu 4 părţi soluţie ser fiziologic. În acest caz rezultatul se

înmulţeşte cu 5.

I.1.1 DOZAREA ENZIMATICĂ A ALAT (metoda Merck)

Principiul metodei:

Alanin aminotransferaza (ALAT) catalizează următoarea reacţie:

Acid -cetoglutaric Alanină Acid glutamic Acid piruvic

Piruvatul format este transformat în lactat de către NADH+H+ în

reacţia catalizata de LDH (lactat dehidrogenază) conform reacţiei:

Acid piruvic Acid lactic

Se măsoară viteza de diminuare a concentraţiei NADH+H+ pe

măsură ce trece în NAD+, prin scăderea absorbţiei în UV. Ea este direct

proporţională cu concentraţia în ALAT.

Aparatură:

Spectrofotometru

8

Cronometru

Reactivi:

1. Soluţie substrat; L-alanina 800 mM in tampon fosfat

100 mM şi pH=7,4

2. Amestec de: -cetoglutarat 10 mM, NADH++H+ 0,2

mM, LDH 10mg/l în tampon fosfat 100 mM, pH=7,4

Mod de lucru:

În momentul începerii determinărilor se amestecă soluţia 1 cu 2 (4

părţi reactiv 1 cu 1 parte reactiv 2 ).

Amestec de reactivi 1+2

(ml)

1Ser (ml) 0,25Se agită bine şi se citesc extincţiile la lungimea de unda de 366 nm

în cuve de l cm. Citirea se face din minut în minut timp de 3 minute la 25

C


Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul

de minute citite. Se notează cu (A/min).

Concentraţia ALAT în UI/l = (A/min) x 1520

Observaţii: dacă valoarea (A/min) creşte mai mult de 0,08 se

recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte

rezultatul cu 10. Citirile se pot efectua şi la 30 C şi 37 C.


25 C 30 C 37 CBărbaţi pînă la 22 UI/l pînă la 29 UI/l pînă la 40 UI/l

9

Femei pînă la 17 UI/l pînă la 22 UI/l pînă la 31 UI/l

10

I.1.2. DOZAREA ENZIMATICĂ A ASAT (GOT) (metoda Merck)

Principiul metodei:

Alanin aminotransferaza (ASAT) catalizează următoarea reacţie:

Acid Acid Acid Acidcetoglutaric aspartic glutamic oxalacetic

Oxalacetatul format este transformat în malat de către NADH++ H+

în reacţia catalizată de MDH (malat dehidrogenază) conform reacţiei:

Acid oxalic Acid malic

Se măsoară viteza de diminuare a cantităţii de NADH+H+ pe măsură

ce trece în NAD+, prin scăderea absorbţiei în UV. Ea este direct

proporţională cu concentraţia în ASAT.

Aparatură:

Spectrofotometru

Cronometru

11

Reactivi:

1. Soluţie substrat: aspartat 200 mM în tampon fosfat 100 mM şi

pH =7,4

2. Amestec de: -cetoglutarat 12 mM, NADH++H+ 0,2 mM, LDH

10mg/l, MDH 10 mg/l în tampon fosfat 100 mM pH=7,4

Mod de lucru:

În momentul începerii determinărilor se amesteca soluţia 1 cu 2 (4

părţi reactiv 1 cu 1 parte reactiv 2 ).

Amestec de reactivi 1+2

(ml)

1Ser (ml) 0,25Se agită bine şi se citesc extincţiile la lungimea de undă de 366 nm

în cuve de 1 cm. Citirea se face din minut în minut timp de 3 minute la

25 CCalcularea rezultatelor:

Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la

numărul de minute citite. Se notează cu (A/min). Concentraţia ALAT în

U/l = (A/min) x 1520.

Observaţii:

Dacă valoarea (A/min) creşte mai mult de 0,08 se recomandă

diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10.

Citirile se pot efectua şi la 30C şi 37C.


25 C 30 C 37 CBărbaţi pînă la 18 U/l pînă la 25 U/l pînă la 37 U/lFemei pînă la 15 U/l pînă la 21 U/l pînă la 31 U/l

Interpretarea rezultatelor:

Permeabilitatea membranei celulare hepatice creşte gradat funcţie

de suferinţă. Investigaţiile biochimice evidenţiază creşteri în ser a unor

enzime celulare (ALAT, ASAT, LDH, etc.).Nivelul seric al acestor enzime de

leziune, variază în funcţie denumărul de hepatocite afectate, de gravitatea

12

lezării fiecărei celule, de viteza cu care s-a produs leziunea şi de viteza de

eliminare din ser (t 1/2) a enzimelor respective.

Dozarea ALAT şi ASAT rămîne cea mai utilă şi sensibilă investigaţie

biochimică în caz de afectare hepatocelulară acută (virală, toxică,

medicamentoasă), valori ≥ 500 U/l sugerînd acest diagnostic.

Valori crescute:

cele mai mari creşteri 100-2000 U/l apar în hepatitele virale,

intoxicaţia cu tetraclorură de carbon, în leziuni induse de

medicamente.

creşterea rapidă şi marcantă a ASAT şi ALAT (>600 U/l şi adesea

>2000 U/l) urmată de o scădere bruscă în primele 12-72 de ore de

la debut este considerată specifică pentru obstrucţia acută a

ductelor biliare.

creşteri importante ale ASAT şi ALAT asociate cu creşteri ale

fosfatazei alcaline indică icter hepatocelular.

ASAT crescută (≤300 U/l) şi ALAT (≤200 U/l) se înregistrează în

obstrucţia biliară completă. Enzimele revin la normal în decurs de o

săptămînă de la îndepărtarea obstrucţiei.

o stare patologică particulară caracterizată prin creşterea

marcantă a enzimelor hepatice (ALAT, ASAT,OTC), a celor

musculare (creatinkinaza CK), precum şi a -amilazei şi lipazei

pancreatice se întîlneşte în sindromul Reye.

creşteri moderate al ALAT şi ASAT, asociate cu creşteri ale

fosfatazei alcaline sugerează icter colestatic.

valori mai ridicate de 150 U/l apar în hepatitele alcoolice (mai

ales dacă pacientul are şi delirum tremens).

valori ≤ 100 UI/l apar în ciroza alcoolică, nivelul ALAT este normal

în 50 % din cazuri, iar ASAT în 25% din cazuri.

creşteri abia schiţate ale ALAT şi ASAT apar în procesele

neoplazice ale ficatului, cînd leziunile celulare hepatice se produc

13

pe arii limitate în jurul infiltratului malign.(ASAT>ALAT).

ALAT şi ASAT cresc în urma transplantului hepatic, după

reperfuzia alogrefei (de 4-5 ori limita superioară a intervalului de

referinţă).

Creşterile persistente sau tardive se pot datora rejecţiei,

infecţiilor virale, abcesului hepatic sau ocluzia arterei hepatice.

creşteri moderate ale ALAT şi ASAT se evidenţiază în infecţiile

cu virus Epstein-Barr, precum şi în mononucleoza serică.

Alături de creşterile individuale ale enzimelor celulare se produc şi

modificări ale raportului dintre ele. Astfel raportul ASAT/ALAT

(raport de Ritis) la subiecţii normali este 1,3, dar poate fi modificat în

funcţie de afecţiune.

ASAT/ALAT<1 apare în hepatitele virale.

ASAT/ALAT >2, cu ALAT <300 U/l sugerează hepatită alcoolică.

ASAT/ALAT ≥3 la pacienţi cu ciroză hepatică sau cu hipertensiune

portală sugerează ciroză biliară primară.

Valori scăzute :

deficit de piridoxal fosfat ce apare în sarcină, afecţiuni hepatice

secundare consumului de alcool.

neoplazii

infecţii urinare

În majoritatea afecţiunilor hepatice sunt necesare dozări seriate ale

enzimelor, valoarea acestora indicînd evoluţia clinică .

14

I.2. DOZAREA GAMMA-GT (-GT) (metoda cinetică)

Principiul metodei:

Determinarea activităţii -GT se face folosind ca substrat L--

glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida. Reacţia este următoarea:

L-Gama-glutamil p-nitro-anilida Glicil-glicina

L-Gama-glutamil glicil-glicina p-nitro-anilina

Citirile se efectuează la 405 nm. Creşterea absorbanţei 4-

nitroanilinei pe măsură ce se formează este direct proporţională cu

activitatea -GT.

Aparatură:

Spectrofotometru

Cronometru

15

Reactivi:

1. Soluţie glicilglicina in tampon TRIS pH=8,25, 100 mmol

2. Soluţie substrat L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida, de

concentraţie 2,9 mmol/1

Mod de lucru:

1. Prepararea soluţiei de lucru:

Se amestecă 5 părţi reactivul 1 cu o parte reactiv 2. Această soluţie

este stabilă 7 zile la temperatură de 20-25 C sau 28 de zile la 2-8 C.

2. Dozarea propriu-zisă:

Soluţie de lucru (l) 500Ser (l) 50Se agită şi citesc absorbantele la 1, 2 şi 3 minute


Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul

de minute citite. Se notează cu (A/min). Concentraţia -GT (U/l) =

(A/min) x 1152.


25 C 30 C 37 CBărbaţi 6-28 U/l 8-38 U/l 11-50 U/lFemei 4-18 U/l 5-25 U/l 7-32 U/l

Observaţii:

Serul folosit trebuie să fie proaspăt şi nehemolizat, iar recoltarea se

face pe citrat, oxalat sau EDTA.

16

Linearitatea reacţiei se menţine până la valori de 280 U/l. Peste

aceste valori se recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se

înmulţeşte rezultatul cu 10.


Valori crescute:

Dozarea γ-GT este cel mai sensibil indicator şi un test de

screening folosit uzual pentru determinarea alcoolismului. În

acest caz creşterea γ-GT o depăşeşte pe cea a celorlalte enzime

hepatice dozate în mod curent. Gradul de creştere a γ-GT la un

alcoolic variază de la caz la caz şi depinde mai mult de

persistenţa îndelungată a consumului decît de cantitatea

ingerată. S-a demonstrat că o încărcare suplimentară cu alcool la

un caz de alcoolism cronic produce în decurs de 24 de ore o

creştere mult mai accentuată a activităţii serice a γ-GT (3,5x

LSN), comparativ cu o acceaşi încărcare cu alcool la un subiect

sănătos consumator ocazional de alcool.

Pacienţii alcoolici trataţi cu anticonvulsivante au valori ale γ-GT

de 50 de ori valoarea normală. La pacienţii trataţi cu

anticonvulsivante, dar care nu consumă alcool creşterile pentru γ-

GT sunt modeste.

În icterul obstructiv creşterile pentru γ-GT sunt mai rapide şi mai

importante decît cele pentru ALP şi LAP.

În colestaza mecanică şi virală γ-GT creşte cam în aceeaşi

proporţie cu ALP şi LAP, pe cînd în colestaza medicamentoasă

creşterea pentru γ-GT este mult mai mare.

În neoplasmul hepatic nivelul γ-GT creşte progresiv de la o

examinare la alta.

În ciroza biliară primară valorile pentru γ-GT sunt de aproximativ

13x LSN

În hepatita acută creşterile sunt mai puţin marcante decît a

celorlalte enzime hepatice, dar este ultima care revine la normal,

17

indicînd covalescenţa.

În hepatita cronică activă valorile pot atinge 7x LSN. În stadiul

asimptomatic al bolii poate fi singura enzimă hepatică ce prezintă

valori serice crescute.

γ-GT reprezintă markerul cel mai sensibil al rejectului (după

transplant hepatic), nivelul enzimei creşte precoce înaintea ALP şi

bilirubinei.

γ-GT prezintă creşteri importante alături de cele ale ALP în

leptospiroza icterohemoragică (boala Weil).

Valori crescute se înregistrează în tumori primitive sau

metastatice ale ficatului

În intoxicaţia cu clorpromazină valorile pentru γ-GT cresc

semnificativ.

18

I.3. DOZAREA LACTAT DEHIDROGENAZEI (LDH) (metoda cinetică)

Principiul metodei:

Lactat dehidrogenaza catalizează următoarea reacţie:

Acid piruvic Acid lactic

Piruvatul este transformat în lactat de către LDH (lactat

dehidrogenază) în mediu neutru.

Se măsoară viteza de diminuare a concentraţiei NADH++H+ pe

măsură ce trece în NAD+ la 340 nm, prin scăderea absorbţiei în UV, care

este proporţională cu activitatea LDH.

Aparatura:

Spectrofotometru

Cronometru

Reactivi:

1. Piruvat 0,6 mmol/l în tampon fosfat pH=7.5 (50 mmol/l)

2. NADH++H+ pH = 9,6 0,18 mmol/l

3. Ser sau plasma (recoltare pe heparină sau EDTA). Nu se foloseşte

ser hemolizat.

19

Mod de lucru:

1. Prepararea soluţiei de lucru:

Se amestecă 4 părţi reactiv 1 cu o parte reactiv 2. Soluţia este

stabilă 5 zile la 2-8C sau 8 ore la 15-25C. Se va feri de lumină.

2. Dozarea propriu-zisă:

Soluţie de lucru (l) 1000Ser (l) 20Se agită şi citesc absorbantele la 1, 2 şi 3 minute


Activitatea LDH (U/l) = (A/min) x 8095

Valori de referinţă:

LDH=95-150U/l.

Observaţii:

Testul este realizat pentru a determina activităţile LDH care

corespund unei A/min., maxime de 0.15. Peste această valoare se

recomanda diluarea a 0,1 ml proba cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte

rezultatul cu 10.

Nu s-au observat interferenţe pentru următoarele substrate: acid

ascorbic până la 30 mg/dl, bilirubină conjugată pînă la 60 mg/dl, bilirubină

neconjugată pînă la 25 mg/dl, trigliceride până la 2000 mg/dl.

Hemoglobina interferă deoarece LDH este eliberat de eritrocite.

Limita minimă de detecţie este de 4 U/l.

Discuţii:

Deoarece LDH are o mare răspândire în diferite organe şi ţesuturi,

determinarea acestei enzime conferă informaţii limitate datorită

specificităţii mici. LDH este un tetramer format din patru subunităţi, iar

acestea sunt de două subtipuri, H caracteristic inimii şi M de provenienţă

musculară.

20

Combinaţia acestor subunităţi formează cele 5 izoenzime: LDH1

(H4), LDH2 (H3M), LDH3 (H2M2), LDH4 (HM3), LDH5 (M4). Organele şi

ţesuturile conţin proporţii diferite din aceste izoenzime (de exemplu ficatul

conţine mai ales LDH5 pe când inima LDH1 şi LDH2). Din punct de vedere

clinic este importantă determinarea izoenzimelor pentru stabilirea

specificităţii leziunilor, mai ales pentru diagnosticarea infarctului de

miocard.

Metoda preferenţială pentru determinarea izoenzimelor LDH este

separarea electroforetică pe agaroză sau acetat de celuloză.

Intervale de referinţa: (exprimare procentuală)

LDH1 = 16-28%, LDH2 =29-37%, LDH3 = 17-23%, LDH4 = 9-15% şi

LDH5 =8-20 %.


Valori crescute:

În leziunile toxice ale ficatului (tetraclorură de carbon, diverse

tipuri de ciuperci), ciroză hepatică, icter obsctructiv.

Valori crescute ale LDH (3x valoarea normală) apar în unele

leziuni metastatice şi granulomatoase ale ficatului. Raportul

LDH4/LDH5 <1,05 indică carcinom hepatocelular, iar un raport

LDH4/LDH5 > 1,05 indică metastaze hepatice

Valori crescute ale LDH alături de ALP (fosfataza alcalină) cu

valori normale pentru ALAT, ASAT şi bilirubină sugerează

obstrucţia unui duct hepatic sau o afecţiune infiltrativă a ficatului

Trebuie precizat că o afecţiune hepatică în sine nu determină

creşteri importante ale LDH total sau LDH5.

Cu excepţia situaţiilor de mai sus determinarea LDH în sînge pentru

investigarea bolilor hepatice nu îşi găseşte o utilitate reală deoarece

izoenzimele LDH4 şi LDH5 specifice ficatului se elimină rapid din sînge.

Creşteri ale LDH total sau ale izoenzimelor LDH specifice fiecărui

ţesut mai pot apărea în :

21

Afecţiuni cardiace- mai ales infarct miocardic (IMA)

Afecţiuni hematologice- anemie hemolitică

Afecţiuni pulmonare-embolie şi infarct pulmonar

Tumori maligne

Afecţiuni musculare- eforturi fizice epuizante, arsuri,

traumatisme

Afecţiuni renale-sindrom nefrotic, glomerulonefrită, infarct

renal

Pancreatită acută

Ocluzie intestinală

Afecţiuni ale SNC- meningită bacteriană, hemoragii cerebrale.

Valori scăzute:

Post iradiere

22

I.4. DOZAREA FOSFATAZEI ALCALINE (ALP) (metoda cinetică)

Principiul metodei:

Fosfataza alcalina (ALP), în mediu alcalin (pH=8,6), catalizează

hidroliza p-nitrofenilfosfatului în p-nitrofenol şi fosfat. Reacţia este

următoarea:

p-nitrofenilfosfat Acid fosforic p-nitrofenol

Creşterea absorbanţei la 405 nm a p-nitrofenolului pe măsură ce se

formează este direct proporţională cu activitatea ALP.

Aparatura:

Spectrofotometru

Cronometru

Reactivi:

1. 2-amino-2-metil-1-propanol, pH 10,4; 0,90 mol/L

Acetat de magneziu 1,6 mmol/L

Sulfat de zinc 0,4 mmol/L

2. p-nitrofenilfosfat 16 mmol/L

3. Ser sau plasma (recoltate pe heparină)

23

Mod de lucru

1. Prepararea soluţiei de lucru: se amestecă 4 părţi reactiv 1 cu

o parte reactiv 2. Această soluţie este stabilă 5 zile la temperatură de 20-

25 C sau 28 de zile la 2-8 C.

2. Dozarea propriu-zisa:

Reactivi (l) Probă (l) Blanc (l)Soluţie de lucru 100 100Ser 20 -Apă distilată - 20Se agită şi citesc absorbanţele la 1, 2 şi 3 minute


Se face diferenţa între prima şi ultima citire atât pentru probă cât şi

pentru blanc şi se împarte la numărul de minute cronometrate. Se notează

cu (A/min probă) şi (A/min blanc). (A/min)=(A/min probă)-(A/min

blanc).

Activitatea ALP (U/l) = (A/min) x 2757


Adulţi:

ALP (U/l)Femei 20-50 ani 42-98Bărbaţi 20-50 ani 53-128Femei > 60 ani 53-141Bărbaţi > 60 ani 56-119

Copii:

Fete Băieţi ALP (U/l)1-30 zile 48-106 75-3191 lună-1 an 124-341 82-3831-3 ani 108-317 104-3454-6 ani 96-297 93-3097- 9 ani 69-325 86-31510-12 ani 51-332 42-36213-15 ani 50-162 74-39016-18 ani 47-119 52-171

24

Observaţii:

Testul este realizat pentru a determina activităţile ALP care

corespund unei A/min., maxime de 0.25. Peste aceasta valoare se

recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte

rezultatul cu 10.

Nu s-au observat interferenţe pentru următoarele substrate: acid

ascorbic până la 30 mg/dl, bilirubină conjugată până la 60 mg/dl, bilirubină

neconjugată până la 25 mg/dl, trigliceride pînă la 2000 mg/dl.

Limita minimă de detecţie este de 2 U/l.


Valori crescute:

obstrucţie biliară − (este considerată cel mai bun marker al

obstrucţiei biliare, dar nu diferenţiază colestaza intrahepatică de

obstrucţia extrahepatică). În boala hepatobiliară obstructivă

nivelul seric al ALP creşte în paralel cu cel al 5-NT (5

nucleotidazei) şi LAP (leucin aminopeptidazei).

creşteri ale ALP în paralel cu -GT şi 5-NT apar în ciroza biliară

primară.

raportul -GT/ALP5 susţine diagnosticul de boală hepatică

alcoolică. Creşteri ale -GT determinate de alcool sau

anticonvulsivante nu sunt însoţite de creşterea ALP.

Stabilirea cauzei creşterii ALP este extrem de utilă în vederea diferenţierii

diagnosticului.

Enzima serică

Obstrucţie biliară

Afecţiune osoasă

Copilărie Sarcină

ALP C C C C5-NT C N N NLAP C N N C-GT C N N N

Unde: C = valori crescute; N = valori normale

nivelul ALP creşte înaintea apariţiei icterului

25

nivele marcat crescute ale ALP apar la sugarii cu atrezie biliară

intrahepatică, dar mult mai scăzute în caz de atrezie

extrahepatică.

creşteri modeste (cam de 3 ori valoarea normală) sunt specifice şi

pot fi întîlnite în orice afecţiune hepatică (hepatită virală, hepatită

cronică, ciroză hepatică, afecţiuni hepatice infiltrative), dar şi în

alte boli cu interesare hepatică (ex. insuficienţa cardiacă

congestivă).

În afara afecţiunilor hepatice se impune să menţionăm că valori

crescute ale ALP mai apar în:

rahitism, cînd creşterea nivelului seric al enzimei precede cu 30-

45 zile apariţia semnelor clinice. Scăderea valorilor după

tratamentul cu vitamină D indică începerea procesului de

vindecare.

Boala Paget (osteita deformantă)-creşterea nivelului seric al

enzimei este direct proporţională cu severitatea şi extinderea

bolii.

Valori scăzute:

Scăderi ale ALP apar în glicogenoza de tip I (deficit de glucozo-

fosfataza).

26

I.5. DOZAREA LEUCIN-AMINOPEPTIDAZEI (LAP)

Leucin-aminopeptidaza este o enzimă proteolitică localizată în

citoplasma celulelor din diferite organe (pancreas, rinichi, intestin subţire),

dar mai ales în ficat. Este o enzimă specifică pentru ficat, deoarece

organele anterior menţionate nu pot antrena creşterea nivelului seric al

enzimei decât prin participarea ficatului. Enzima catalizează reacţia:

Principiul metodei:

Reacţia folosită universal pentru dozarea LAP constă dintr-o hidroliză

a leucil-p-nitroanilidei :

Leucil-p-nitroanilida + H2O = Leucina + p-nitroanilina

Aparatura:

1. Spectrofotometru

2. Cronometru

Reactivi:

1. Tampon fosfat 0,1M, pH=7,2

2. Substrat: leucin-p-nitroanilidă (63 mg leucin-p-nitroanilidă (25

mM) se dizolvă în 10 ml metanol p.a). Se păstrează 6 luni la frigider.

3. Ser nehemolizat

27

Mod lucru

Se pipetează în eprubete de lucru:

Soluţie tampon (ml) 3Substrat (ml) 0,1Se agită şi se ţin în repaus 5 minute la 30C.Ser (ml) 0,1Se agită şi se citesc absorbanţele din 2 în 2 minute, timp

de 10 minute la 405 nm.


Activitatea LAP (U/l) = (A/min) x 3232


LAP = 11-30 U/l

Interpretarea rezultatelor

Valori crescute:

Creşteri fiziologice:

- valori mai crescute se observă la bărbaţi.

- LAP poate fi moderat crescută pe toata perioada sarcinii.

Creşteri patologice:

- în obstrucţii biliare deoarece se secretă în canalele biliare.

- în neoplasme hepatice.

- în pancreatite acute.

Observaţii:

Deşi creşterile LAP sunt paralele cu cele ale ALP, creşterea celei

dintâi este mai utilă a fi luată în considerare în stabilirea diagnosticului,

deoarece este mult mai labilă şi mai sensibilă.

28

I.6. DOZAREA ACTIVITĂŢII 5’-NUCLEOTIDAZEI (5’-NT)

Principiul metodei

Sub acţiunea 5’-nucleotidazei din ser se eliberează fosfor anorganic

(Pa) din adenozin-5-P utilizat ca substrat. Această reacţie este catalizată şi

de o fosfatază alcalină nespecifică astfel că Pa eliberat din substrat

reprezintă o activitate combinată a ambelor enzime.

Dacă reacţia este efectuată în prezenţa ionilor de Ni2+, 5’-

nucleotidaza este inhibată, iar Pa eliberat provine doar din acţiunea

fosfatazelor nespecifice. Diferenţa dintre Pa eliberat din AMP în absenţa şi

în prezenţa ionilor Ni2+, inhibitori, reprezintă Pa eliberat din reacţia

catalizată de 5’-nucleotidază. Concentraţia Pa astfel obţinut reprezintă

activitatea 5’-nucleotidazei.

5’-AMP Adenozină

Aparatură

Spectrofotometru

29

Reactivi

1. Acid tricloracetic

2. Soluţie MnSO4 , pentru activarea enzimei, 0,32 g% în apă

bidistilată

3. Soluţie NiCl2 . 6 H2O, pentru eliberarea enzimei, 2,4 g% în apă

bidistilată

4. Substrat AMP 0,01 M (347 mg în 18 ml NaOH 0,1 N adus la 100 ml

cu apă bidistilată)

5. Tampon barbituric pH= 7,8

6. Etalon fosfat 0,4394 g KH2PO4 în 1000 ml apă bidistilată

7. Soluţie etalon de lucru: 1 ml etalon stoc la 10 ml apă bidistilată

(1 ml = 10 µg Pa/ml)

8. Acid molibdic

9. Acid ascorbic 1% în HCl 0,1 N

Mod de lucru

1.Reacţia de eliberare a Pa

În două eprubete de centrifugă se pipetează:

Reactivi (µl) Blanc (µl) Probă (µl)

Sol.tampon 1300 1500

MnSO4 100 100

NiCl2 200 -

Produs biologic (ser) 200 200

Se incubează la 37C, timp de 5 minute. Se adaugă:

Substrat AMP 200 200

Se adaugă acid tricloracetic:

Acid tricloracetic 2000 2000

Se centrifughează la 3000 t/minut, timp de 5-10 minute. Se

păstrează supernatantul pentru a efectua reacţia de culoare.

30

2.Reacţia de culoare

Reactivi (µl) Blanc (µl) Etalon

(µl)

Probă

(µl)

Supernatant blanc 1000 - -

Supernatant probă - - 1000

Soluţie etalon - 1000 -

Acid molibdic 1000 1000 1000

Acid ascorbic 500 500 500

Apă bidistilată 2500 2500 2500

Se lasă în repaus 10 minute

Se citesc absorbţiile etalonului şi probelor faţă de martor la 620 nm.


Exprimarea activităţii 5’-nucleotidazei se face în U.I. (micromoli Pa

eliberaţi pe minut la 1 litru de ser la 37C şi pH 7,8.

Se ţine cont că incubarea s-a efectuat 30 minute, că etalonul conţine

10 µg Pa/ml şi că în probă şi martor se dozează Pa din 1000 µl ser.

Intervale de referinţă: 1,6 – 1,7 mU/ml

Observaţii:

Determinarea activităţii 5’-nucleotidazei este mult afectată de

capacitatea unor fosfataze acide şi alcaline de a hidroliza esteri fosfaţi.

31

107,6xAE - AM

AP - AMU.I./l =

U.I./l =AP - AMAE - AM

10

31

1000

0,1

130

x x x

107,6

Această problemă esenţială nu a fost pe deplin rezolvată, toate metodele

propuse pentru dozarea ei având imperfecţiunile lor.


Valori crescute:

Chiar dacă distribuţia 5’-nucleotidazei (5’−NT) este similară cu a

fosfatazei alcalinei (ALP), creşterea primei enzime este mult mai specifică

bolilor hepatobiliare (creşterea 5’-nucleotidazei fiind observată la 70-92%

dintre pacienţii cu boli hepatobiliare).

Valori crescute mai apar în icter extrahepatic, ciroză primară

biliară şi metastaze hepatice.

Spre deosebire de fosfatza alcalină, 5’-nucleotidaza nu este

afectată de graviditate sau adolescenţă. Acest argument

indică dozarea 5’-nucleotidazei la copii şi adolescenţii cu

creştere rapidă pentru diferenţierea afecţiunilor osoase de cele

hepatobiliare.

32

I.7. DOZAREA ACTIVITĂŢII COLINESTERAZEI (CHE)

(metoda colorimetrică cu reactiv Ellman)

Colinesteraza face parte din grupul carboxilesterazelor. Există mai

multe tipuri de colinesteraze cu localizări diferite. Funcţie de topografia

enzimei şi a substratului asupra căror acţionează, acestea pot fi

prezentate astfel:

Tabel nr.1 – Clasificarea tipurilor de colinesterază (după G.H.Manle şi

colab., 2005, modificată)

Tipul colinesterazeiDistribuţia în

ţesuturiAcţiunea fiziologică

Acetilcolinesteraza

- terminaţii

nervoase

colinergice

- celulele Kupffer

Influenţează transmiterea

impulsului nervos

-colinesteraza

(colinesterază

specifică)

- eritrociteRol în metabolismul

hematiei

Pseudocolinesteraza

(cu 5 izoenzime)- hepatocite Rol în metabolismul proteic

Principiul metodei:

Esterii acetilcolinei sunt hidrolizaţi în reacţia catalizată de

colinesterază, iar tiocolina formată reacţionează cu DTNB (acid 5-5’-ditio-

bisnitrobenzoic) sau reacţia Ellman, formând 5’-MNBA (acid 5’-mercapto-2-

nitrobenzoic), un compus colorat în galben, fotocolorimetrabil la 412 nm.

Intensitatea coloraţiei este direct proporţională cu activitatea

colinesterazei.

33

Reacţia este următoarea:

Butiriltiocolina Tiocolina Butirat

(ester de acetilcolina)

34

Aparatură

Spectrofotometru

Reactivi:

1. Substrat (butirilcolina) – 6,6 mM. Se dizolvă 1 comprimat din test

în 5 ml apă bidistilată. Soluţia este stabilă 2 săptămâni.

2. Reactiv Ellman: 20 mg DTNB dizolvat în 180 ml apă bidistilată şi

completat cu alcool etilic 95% până la 250 ml. Soluţia este stabilă

2 săptămâni.

3. Ser (diluat 1/11 cu ser fiziologic )

Mod de lucru

Reactivi (µl) Blanc (l) Probă (l) Substrat 200 200Ser diluat - 20

Incubare la 25C timp de 10 minuteReactiv de culoare - Elleman 2000 2000Ser diluat 20 -

Se lasă în repaus timp de 10 minute.

Se citeşte absorbţia probei faţă de martor la 412 nm.

Activitatea colinesterazei UI/l = AP x 8978

O unitate de activitate enzimatică este corespunzătoare cantităţii de

enzimă care hidrolizează 1 µmol butiriltiocolină în timp de 1 minut la 25C.


3000 – 8000 UI/l (25oC)

4000 – 12000 UI/l (37oC)


Valori scăzute:

Scăderi fiziologice:

35

Fiziologic nivelul seric al pseudocolinesterazelor scade în sarcină

Scăderi patologice:

intoxicaţia cu organo-fosfarate (din insecticide mai ales) – nivelul

seric al pseudocolinesterazelor este cu 50% mai redus datorită

inhibiţiei colinesterazei de către pesticidele ce conţin fosfaţi

organici.

reducerea valorilor serice cu 40% la apariţia primului simptom de

ingestie acută.

reducerea valorilor serice cu 80% în momentul apariţiei efectelor

neuromusculare

pacienţii cu expunere cronică la doze scăzute pot fi asimptomatici

chiar la nivele scăzute ale colinesterazei.

Observaţii: muncitorii care sunt expuşi la organofosforate nu

trebuie să-şi reia lucrul până când valoarea colinesterazei nu creşte la 75%

din normal. (colinesteraza serică se regenerează într-un ritm de 25% în 7-

10 zile şi revine la nivelul bazal în 4-6 săptămâni).

ciroze hepatice decompensate

metastaze hepatice

distrofii musculare

Studii statistice arată că valoarea serică a pseudocolinesterazei se

corelează cu nivelul albuminei şi cu cel al protrombinemiei. Reducerea

progresivă, în mod paralel a cotei albuminemiei şi a nivelului seric al

pseudocolinesterazei este un element care indică constituirea leziunilor

hepatice ireversibile.

36

I.8. DOZAREA ACTIVITĂŢII ORNITIN CARBAMIL TRANSFERAZEI

(OCT)

Principiul metodei:

Ornitin carbamil transferaza (OCT) catalizează reacţia de transfer a

grupei carbamil de pe carbamil fosfat pe ornitină cu formarea citrulinei.

Reacţia are loc la nivelul mitocondriei hepatice. Dozarea OCT în ser este

extrem de utilă în investigarea ficatului, datorită faptului că provine doar

de la acest organ.

Reacţia:

Carbamil fosfat Ornitina Citrulina

Metoda de dozare constă în adăugarea ureazei pentru a elimina

ureea din probă, iar apoi citrulina va reacţiona cu diacetilmonoxima şi

antipirina formând un complex fotocolorimetrabil la 460 nm. Intensitatea

coloraţiei este direct proporţională cu activitatea ornitin carbamil

transferazei.

Aparatură

Etuva

Spectrofotometru

Reactivi:

1. Tampon trietanolamina, pH=7,7. Se dizolvă 74,2 g de

trietanolamina în 900 ml apă. Se ajustează pH-ul la 7,7 cu soluţie

37

de NaOH 1N, iar apoi se aduce la 1000 ml cu apă distilată.

2. Ureaza. 200 mg urează, 5000U/g, se dizolvă în 200 ml tampon de

trietanolamina.

3. Soluţie carbamilfosfat 50mM. Soluţia se prepară extemporaneu

prin dizolvarea a 150 mg carbamilfosfat sare de litiu în 20 ml

tampon trietanolamina.

4. Soluţie diacetilmonoxima. Se dizolvă 10,1g în 1000 ml de apă

distilată.

5. Soluţie antipirina. Se dizolvă 12,2 g antipirina şi 3,4 g FeCl3 6H2O

într-un amestec format din 625 ml acid fosforic 85% şi 375 ml

apă distilată.

6. Standard de citrulina 15 mM. Se dizolvă 263 mg citrulina în 100

ml apă distilată.

7. Acid tricloracetic 22 g%.

Mod de lucru:

Reactivi (ml) Blanc (ml) Proba (ml) Proba martor (ml)Tampon (1) 0,1 0,4 -Ornitina 0,4 - 0,4Ser - 0,1 0,1

Incubare 5 minute la 37Carbamil fosfat 0,4 - 0,4Ureaza - 0,4 -

Se agită şi se incubează la 37 C 30 de minuteAcid tricloracetic 1 1 1

Se agită, se centrifughează 10 minute la 5000 rot/min

Reacţia de culoare:

Reactivi (ml) Blanc (ml) Proba (ml) Proba martor (ml)

Supernatant martor 1 - -Supernatant proba - 1 -Supernatant proba martor - - 1Antipirina 4 4 4Diacetilmonoxima 1 1 1

Se lasă 20 minute pe baie de apă, se răceşte

Se citesc la 460 nm proba şi proba martor faţă de martor.

38

Pentru standardizare se foloseşte etalonul de citrulina în diluţie de

1/50 şi 1/100 şi se lucrează la fel ca probele. Valorile sunt de 150 şi

respectiv 300 µmoli/l.

O unitate a activităţii enzimei se defineşte prin cantitatea de OCT ce

produce 1µmol de citrulina/min/l sau 30 µmoli de citrulina/min/l. Cele două

valori standard vor corespunde la 150/30=5 U/l, 300/30=10 U/l.


0-5 U/l


Valori crescute:

Datorită valorilor scăzute ale enzimei în ser la pacienţii sănătoşi

orice creştere a valorilor enzimei oferă indicii asupra stării de funcţionare a

ficatului. Creşteri marcante ale activităţii OCT se întâlnesc în hepatitele

virale acute şi alte forme de necroză a ficatului.

Valori moderat crescute apar în:

- Icter obstructiv

- Ciroză

- Carcinom metastatic

- Infarct miocardic în condiţiile unei complicaţii congestive

hepatice.

Valori scăzute:

Deficitul de OCT este o afecţiune recesivă X-linkată ce determină:

- La nou născut hiperamonemie severă cu alcaloza respiratorie.

- La adult valorile amonemiei sunt de 2-10 X valori normale.

Scăderea OCT poate aparea dupa o infecţie bacteriană sau virală,

determinând confuzii cu sindromul Reye.

39

biochimie

Documents