Abstaract

Pe baza testele noastre de monitorizare microbiologică efectuată în 2011, am raportat aici curent starea microbiologică a şoarecilor şi şobolanilor adăpostiţi în biobaze din Japonia. Am testat mai multe mult de 14.000 de şoareci, 6000 probe de ser, 500 mostre de fecale sau mixurile fecale, și 200 de eșantioane pulmonare din 3549 locaţii pentru şoareci din cadrul universităților japoneze și institute (U/I), companii farmaceutice și organizațiile de cercetare (P / C). Am testat, de asemenea, mai mult de 1.500 de sobolani, 1.600 de eșantioane de ser, și 20 de probe de fecale sau mixurile fecale din 772 U / I și P / C a locaţiilor pentru șobolani. Culturi bacteriene, serologie, microscopie, PCR, și analiza ADN-ului, folosindu-se probe ADN au fost efectuate. S-a întalnit Staphylococcus aureus (18,8% în unităţile pentru şoareci, 58,6% în unitățile pentru șobolani) a fost agentul cel mai răspândită în ambele tipuri de locaţii pentru şoareci și șobolani. Următorii agenți de contaminare ca raspâdire în loca®iile pentru şoareci au fost Norovirus murine (11,97%), protozoare intestinale (0.05-8.49%, din diverse specii), Pasteurella pneumotropica (5.32%), și Hepaticus helicobacter (3.17%), în timp ce protozoare intestinale (0.74-6.84% din diverse specii), Syphacia murin (6.20%), Pseudomonas aeruginosa (3.61%), și Pasteurella pneumotropica (3.05%) au fost agenți de cele mai prevalente ulterioare locaţiile pentru de șobolani. Aceste rezultate sugerează că în momentul respectiv microbi predominante la şoareci de laborator și șobolani din Japonia sunt patogeni oportuniști în principal, protozoare intestinal, și microbii cu patogenitate scăzută.

Introducere

În prezent, şoareci de laborator și șobolani sunt utilizaţi pe scară largă în experimente pe animale în multe domenii de studii. Pentru obţinerea de rezultate experimentale fiabile utilizarea de animale care sunt garantate de a avea calitate microbiologică și genetică este necesară. Monitorizarea microbiologică este definităca testarea repetată a unei colonii de animale pentru probe microbiologice selectate [11], este singura modalitate de a garanta calitatea microbiologică a laboratorului de cercetare.

Statutul microbiologic al șoarecilor și șobolanilor în biobazelor şi instituţiilor de cercetare este cunoscut pentru a schimba în timp. Numarul microbilor din elemente de testare este încă în creștere, așa cum se arată de către descoperirea de agenţi patogeni nou detectaţi, cum ar fi Helicobacter hepaticus [2] și Norovirus murine (MNV) [13]. Cunoscând situația actuală în laborator microbiologic soareci si sobolani este indispensabil din punct de vedere de selecție de articole de monitorizare microbiologice în fiecare facilitate animal. Acest studiu descrie microbiologic actual Starea de soareci si sobolani din instalațiile experimentale in Japonia. Ea se bazează pe rezultatele noastre de microbiologice rezultatele testelor de monitorizare colectate în 2011 de la instalațiile experimentale interne în universități, național sau institute private companiile farmaceutice, și organizații de cercetare de contract.

Materiale şi metode

Animale și probe

În 2011, am testat 12,885 șoareci, 2699 probe de ser, 311 probe de fecale sau mixurile fecale, și 1 probă pulmonar din 2534 facilități soareci, in universitati si institute de (U / I) în cadrul Japonia, precum și 1656 șoareci, 3,611 eșantioane de ser,215 probe de fecale sau mixurile fecale, și 248 probe pulmonar din 1015 facilități mouse-ul în companiile farmaceutice și organizații de cercetare de contract (P / C) în Japonia. Noi testat, de asemenea, 745 șobolani,

461 probe de ser, și 6 fecale sau probe cecale la 335 U / I facilități șobolan, precum și 768 șobolani, 1.173 probe de ser, și 17 probe de fecale sau mixurile fecale de la 437 P / C facilități. Animale și probe de la comercial crescători sau alte laboratoare de testare a contractului nu au fost incluse în acest studiu.

Selectarea elemente de testare

Un total de 36 de elemente de testare de monitorizare microbiologice pentru șoareci și 32 de elemente de testare microbiologice pentru șobolanii au fost folosit în acest studiu (tabelele 1 și 2). Microbii au fost clasificate în modul următor pentru patogenitate lor [12]: agenti patogeni categoria A, zoonotici și umane efectuată prin șoareci sau șobolani; Categoria B, mouse-ul autohton au agenți patogeni de șobolan care pot provoca boli simptomatic și moarte ocazional de șoareci sau șobolani; Categoria C, microbi care provoaca de obicei infectii asimptomatice de șoareci sau șobolani însoțite cu modificari in functii fiziologice; Categoria D, microbi care pot cauza oportuniste infecții; și categoria E, microbi care sunt, de obicei non patogen dar indică starea de igienă a creșterii mediu.

Teste de cultură: teste de cultură s-au efectuat pentru toate bacterii cu excepția Helicobacter hepaticus, Helicobacter Bilis, asociate cili respiratorii Bacillus (CAR bacilul), și Clostridium piliforme. Conjunctivală și traheale tampoane au fost brăzdat direct agar sânge de cal (Eiken Chemical Co, Ltd., Tokyo, Japonia) și / sau de Chanock PPLO agar [9] suplimentat cu ser de cal (Life Tehnologii, Carlsbad, CA, USA) și extract de drojdie (realizate in-house) pentru agenții patogeni respiratorii. Cuprins Cecal au fost brăzdat pe geloze selective, cum ar fi DHL agar (Eiken chimice), NAC agar (Eiken chimice), și X-SA agar (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japonia) pentru a evalua prezența agenților patogeni intestinali. Coloniile au fost recuperate din plăcile cu agar după incubations la 37 ° C timp de 24 h (DHL agar și X-SA agar), 48 h (agar cu sânge și NAC agar), sau 7 d (PPLO agar). colonii suspectate de a fi agent la punctele bacteriene au fost pasaje și a stabilit ca o cultură pură cu sânge de cal agar (Eiken chimice) sau inima infuzie agar (Eiken Chimic). Izolatele bacteriene au fost apoi identificate folosind următoarele teste: colorația gram, de testare catalaza, Testul oxidazei, și teste biochimice folosind comercial kituri disponibile, cum ar fi seria Api (Sysmex bioMérieux Co, Ltd., Tokyo, Japonia) și serie de teste de identitate (Nissui Pharmaceutical). Pentru identificarea Staphylococcus pulmonis aureus și Mycoplasma, raportate anterior Testele PCR au fost utilizați fără testele biochimice [6, 8]. Pentru izolarea dermatofiți, un mic eșantion de păr a fost obținută de la umărul și din spate a animalelor și inoculate pe dextroză de cartof agar (Eiken chimice). După incubare la 25 ° C timp de 14 d, plăcile cu agar au fost evaluate pentru existența unor colonii. Cand Coloniile suspectate a apărut pe agar, au fost identificate pe baza morfologiei lor [17].

Serologie: Testele serologice au Fost efectuate pentru M. pulmonis, C. piliforme, bacilul masina ȘI Toate elementele virale cu excepția MNV. Serurile de Testare s-au diluat 1:40 pentru ELISA Sau 01:10 pentru testele de imunofluorescență indirecta (IFA) si teste de aglutinare. Cca ONU Anticorp secundar pentru aceste teste, Proteina A ȘI anti-șobolan IgG au Fost utilizate pentru șoarece sonda ȘI Mostre de șobolan ELISA, respectiv. FITC IgG anti-șoarece marcat cu FITC ȘI anti-șobolan IgG au Fost Utilizare de deseuri cca anticorpi secundari version IFA pentru sonda DIN FIECARE derivate specie respective.

În centrul nostru, s-au efectuat cele mai multe teste serologice folosind ELISA ca test de depistare primar și IFA ca testul de confirmare. Pentru testul parvovirusul șoarece (MPV), un

antigen recombinant (vezi mai jos) a fost utilizat pentru ELISA, și virusul șoarece minute antigen s-a utilizat în IFA Anticorpii pentru a detecta reactivitate incrucisata [14]. Limfocitara virusul coriomeningitei (LCMV), virusul șobolan Kilham, și H-1 virus au fost testate cu ajutorul IFA singur. Unele serologic teste, cum ar fi cele pentru Corynebacterium kutscheri și Salmonella typhimurium, au fost realizate utilizând aglutinare teste [12]. Toate plăcile ELISA au fost preparate în centrul nostru, cu excepția testelor 5 ELISA (hepatita mouse-ul virus [MHV], M. pulmonis, hantavirus, virusul Sendai, și C. piliforme). Kituri ELISA disponibile comercial (MOBILISM , Wakamoto Pharmaceutical Co, Ltd., Tokyo, Japonia) au fost utilizate pentru aceste 5 teste. Recombinant MPV au fost furnizate de antigen [14] utilizate în testul ELISA MPV Universitatea Tsukuba de. Slide-uri antigen IFA au fost preparate de centrul nostru, cu excepția testelor IFA pentru LCMV și hantavirus, pentru care au fost furnizate diapozitive antigen de Universitatea Nagasaki Universitatea Hokkaido și, respectiv. S-au efectuat procedurile de testare serologice printr-o metodă descrisă anterior [4]. Toate Numele tulpina de bacterii și virusuri utilizate ca serologic antigene sunt enumerate în tabelul 3.

Microscopie: s-au efectuat analize microscopice pentru ectoparaziți, protozoare intestinale, oxiuri, și Pneumocystis spp. Bandă din celofan fost impresionat la fesa și / sau posterioară, precum și zona perianala pentru examinarea microscopică a ectoparaziților și pentru examinarea ovulele Syphacia spp, respectiv.. Un rect probă a fost plutea într-un vas Petri cu soluție salină pentru determinarea prezenței Aspiculuris tetraptera. Când existența oxiurilor fost observată macroscopic intr-un vas Petri, au fost identificate oxiuri pe baza morfologiei lor, prin utilizarea unui microscop. Wet monta specimenele de conținut duodenal sau mixurile fecale au fost amestecat cu o picătură de soluție salină și examinate microscopic pentru determinarea protozoare intestinale. Speciile Determinarea de protozoare intestinale a fost realizată de către Analiza morfologică precum și pe baza modelele lor de circulație caracteristice.

Proba Omogenatul pulmonar au fost microscop a examinat cu albastru de toluidină O colorare pentru Pneumocystis spp. [3]. În cazul în care existența unor Pneumocystis-ca Au fost observate chisturi, un test PCR raportate anterior pentru Pneumonia [10] a fost realizată pe alicotat probe pentru a confirma prezența acestei ciuperci.

Teste moleculare: Testele PCR de H. hepaticus și H. s-au efectuat Bilis precum RT-PCR teste pentru MNV utilizând primeri și proceduri raportate anterior [4, 5]. Probe de fecale sau cecale au fost obținute de la animale și depozitate la -80 ° C până s-au efectuat testele. Drept confirmare Teste pentru toate probele pozitive PCR de H. Hepaticus și H. Bilis, analiza ADN-ului, folosind chips-uri ADN a fost efectuat. Dispozitivul ADN cip-analiza (Analyzer, Toshiba Corporation, Tokyo, Japonia), truse de analiza (Monigene elicopter, Toshiba), și cip ADN-ului s-au folosit în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Toate PCR produse în testele MNV RT-PCR au fost esalonate direct și comparat cu datele disponibile într-o bază de date publică (GenBank) pentru verificare.

Analiza datelor

In acest studiu, o cerere a fost considerată ca o instalație de indiferent din numărul probei. Facilitățile au fost clasificate ca U / I sau informații PC utilizând furnizate de client, iar rezultatele au fost compilate pentru fiecare U / I și PC.

Bacterii

Staphylococcus aureus a fost microbiană cea mai raspandita agent la șoareci și șobolani, în ambele U / I și P / C facilități. Procentul rata de infectare pozitiv Staphylococcusaures fost 18,8% (U / I, 21.45%, și P / C, 10,87%), în mouse-ul facilități și 58.62% (U / I, 68.42%, și P / C, 40,0%) în instalațiile de șobolan. În facilitățile de mouse-ul, Pasteurella pneumotropica (6.14%), H. hepaticus (4.33%), Pseudomonas aeruginosa (2.75%), H. Bilis (0.25%), și M. pulmonis (serologice, 0,1%, și de cultură teste, 0,05%) au fost următoarele microbii cea mai raspandita in instalațiile U / I. Deși nu alți agenți bacterieni au fost detectate în soareci, in instalațiile P / C prin efectuarea testelor de cultură, s-au găsit cazuri seropozitivi de M. pulmonis (0,46%).

În instalații de șobolan, Pseudomonas aeruginosa (3,61%), Pneumotropica Pasteurella (3,05%), CAR bacilul (1,49%), C. piliforme (0,97%), și M. pulmonis (serologie, 0.57%) urmate Staphylococcus aureus ca următoarea microbi cele mai prevalente. Dintre acești agenți, Pseudomonas aeruginosa, C. piliforme, și, au fost detectate M. Pulmonis sau seropozitivi în 5,88, 1,7, și 1,08% în U / I șobolan facilități, respectiv. Cazuri seropozitivi de CAR bacilul au fost găsite doar în P / C facilitati de șobolan (2,22%).

Virusuri

În facilitățile de mouse-ul, MNV fost cele mai prevalente agent viral. Procentul rata de infectare pozitiv MNV fost 11.97% (U / I, 9.38%, iar P / C, 23.81%). MHV a fost al doilea agent viral cea mai raspandita. Pozitive procent rata de infectare a fost de 0,68% MHV (U / I, 0,5%, și P / C, 1,37%). Cazuri pozitive pentru oricare dintre celelalte agenți virali au fost detectate la șoareci din ambele U / I și P / C facilităţi. În facilitățile de șobolan, nici un caz seropozitive au fost detectate în ambele U / I și P / C facilități.

Alti agenti

În P facilități de mouse-ul / C, nu agenți de parazitare (adică, intestinal Au fost detectate protozoare, oxiuri, sau ectoparaziți). În facilități de mouse-ul U / I, The parazitare cea mai raspandita agent a fost amoeba (9,75%). Octomitus intestinalis (7.96%), murin Tritrichomonas (5.68%), Bettencourt Chilomastix (3,41%), Aspiculuris tetraptera (3.26%), Syphacia obvelata (1.51%), și Spironucleus murin (0.05%) au fost cele mai prevalente următor parazitare agenți în șoareci. Pneumonia murina a fost detectat în soareci, in ambele U / I și facilități P / C (U / I, 0,48%, și P / C, 1.41%).

Similar cu soareci in P / C facilități, nu agenți parazitare au fost detectate în șobolanii adăpostite în P / C facilități. / I facilități mai agent parazitare raspandita la șobolani adăpostite în U a fost amoeba (10.17%). Syphacia Muris (9.29%), Tritrichomonas murin (4.52%), intestinalis Octomitus (3.39%), Chilomastix Bettencourt (1.13%), Murin Spironucleus (1.09%), și Aspiculuris tetraptera (0,56%), urmate ca urmatorul parazitare mai raspandita Agenți la șobolani.

La șoarece și șobolan de necropsii, leziuni macroscopice în mare organe (38 cazuri de leziuni la nivelul ficatului, 18 cazuri de leziuni în plămâni, 9 cazuri de leziuni la nivelul pielii, 6 cazuri de leziuni in ganglionii limfatici, splină și 4 cazuri de leziuni în rinichi, 2 cazuri de leziuni în glandele de mamifere, și 1 caz de leziuni ochiului) au fost observate la 78 de șoareci și șobolani. Dintre acestea, Staphylococcus aureus a fost izolat din 2 cazuri de abcese

subcutanate in C57BL / 6 șoareci, Pasteurella pneumotropica fost izolat din 1 caz de consolidare pulmonar într-un modificate genetic mouse-ul, și pneumonia murina a fost detectat în 2 cazuri de consolidari pulmonare în modificate genetic șoareci.

Discutii

In acest studiu, am aratat microbiologice curent Starea de soareci si sobolani adăpostite în instalații experimentale în Japonia, pe baza datelor colectate de la 2011 microbiologic nostru rezultatele testelor de monitorizare. În centrul nostru, a fost dificil să verifice dacă probele provenite de la fie o facilitate SPF sau non SPF-facilitate. Prin urmare, Rezultatele au fost clasificate și analizate ca fiind originare de la U / I sau P / C.

În studiul nostru, ne-am propus pentru a înțelege tendințele actuale de microbii predominante din elemente de monitorizare selectat la șoareci și șobolani din facilități experimentale, și, de asemenea scopul de a oferi informații practice pentru lucrătorii din aceste facilități experimentale în schimb. Prin urmare, date au fost clasificate în U / I și facilități PC și macroscopic analizată pe baza numărului facilitate în acest studiu. O analiză bazată pe numărul eșantion de date noastre va prezenta rate mai mici decât cele pozitive, de instalație Analiza pe bază de număr pentru fiecare microb. În cazul în care unii microbi considerate pozitive în șoareci și șobolani, numărul de facilități testate pentru microbi, cum ar fi Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, pneumonia murina, Helicobacter hepaticus, Helicobacter Bilis, și MNV pentru soareci si Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus CAR, și pneumonia carinii pentru șobolani au fost de cel puțin 10 ori mai mică decât pentru altor microbi testate. Deși testarea unui număr mare de facilități ar trebui să dezvăluie valori mai aproape de real cifrele pentru prevalența microbii menționate de mai sus, discuția de mai jos se bazează pe premisa că datele noastre reprezintă diferența indicată în număr testate printre fiecare microb.

Am descoperit ca soarecii adapostite in facilitățile U / I au fost pozitiv pentru 17 elemente, în timp ce soareci in P / C facilități au fost pozitive pentru 5 articole. O tendință similară (U / I, 12 articole, și P / C, 3 articole) a fost observată pentru instalațiile de șobolan. Astfel, calitatea microbiologică a șoarecilor și șobolanilor adăpostite în P / C facilități este mai mare decât cea a șoarecilor și șobolanilor adapostite in instalatii U / I.

În studiul de față, Staphylococcus aureus a fost găsit a fi agentul bacterian cea mai raspandita in ambele mouse-ul și facilități de șobolan. Aceasta bacterie este privit ca un oportunist patogen pentru animale imunocompetenți și este de multe ori nu este inclus ca un element test de rutina pentru imunocompetent soareci si sobolani de o parte din reclama crescătorii din Japonia. În centrul nostru, Staphylococcus aureus a fost considerată ca un element opțional pentru imunocompetent animale. Acest context cu privire la testarea pentru acest patogen oportunist poate fi o cauza a ridicat prevalenta de Staphylococcus aureus la șoareci și șobolani, în Japonia.

Următorii agenți bacteriene cele mai prevalente găsit în facilități de mouse-ul au fost pneumotropica Pasteurella și H. hepaticus, cu Pseudomonas aeruginosa în urma indeaproape. În facilități de șobolan, Pseudomonas aeruginosa și Pasteurella pneumotropica au fost cel mai mult agenți bacterieni predominante următoarele Staphylococcus aureus. Cu excepția H. hepaticus, aceste bacterii sunt clasificate în categoria D patogeni (agenți patogeni oportuniști) în centrul nostru.

Impreuna, aceste rezultate sugereaza ca cele mai prevalente agenți bacterieni la șoarece și șobolan facilități în Japonia sunt agenți patogeni oportuniști.

Grupul nostru raportate anterior prevalența Specii de Helicobacter în colonii mouse-ului în Japonia, în 2000 [7], și H. hepaticus și H. Bilis au fost detectate în 25,5 și 2.1% din coloniile de șoarece testat, respectiv. În studiul de față, ratele de infectare pozitive ale H. hepaticus și H. Bilis au fost 3,17 și 0,17%, respectiv. Această scădere a ratelor de infectare pozitive pentru Helicobacter specii pe o perioadă de 10 ani în aceste șoarece facilități se poate datora o îmbunătățire a gradului de conștientizare de utilizare dintre acești agenți, precum și îmbunătățiri în stabilirea sisteme de testare pentru aceste medicamente în fiecare unitate de în ultimii 10 ani.

M. pulmonis a fost agentul bacterian singura categorie B (patogeni mortale) detectate în instalații mouse-ului si șobolan în acest studiu. Deși rata de infectare pozitiv pentru M. pulmonis a fost relativ scăzut (facilități de mouse-ul, 0,16%, și facilități de șobolan, 0,57%, prin teste serologice), acest agent ar trebui să fie inclus ca un element test de rutină, având în vedere sale patogenitate la șoareci și șobolani.

În termen de agenți virali, MNV a fost cel mai frecvent agent viral în instalații de mouse-ul, urmat de MHV. Nici una agenților virale testate în acest studiu au fost detectate în facilitățile de șobolan. Centrul nostru a început în mod oficial pentru a testa pentru MNV în 2009. La acel moment, am raportat o MNV pozitiv rata de infectare de 25,4% prin efectuarea PCR în mouse-ul facilități în Japonia [5]. În studiul de față, pozitive Rata de infectare a fost de 11,97% MNV. Deși pozitive rata de infectare de MNV a scăzut în ultimii 3 ani, este încă relativ ridicat. Infecția pozitiv MNV Rata poate scădea în viitor, ca fiecare instalatie începe să includ agentul, ca parte a lor de rutina microbiologice Testarea. MHV a fost agentul viral singura categorie B (fatal patogeni) pentru a fi detectate la șoareci. Aceste rezultate demonstrează că există infecții MHV sporadice în mouse-ului facilități și puternic sugerează că ar trebui să fie incluse MHV ca o parte a unui screening microbiologic de rutină, având în vedere patogenitatea sa la soareci.

Este bine cunoscut faptul că nu a protozoarelor sau oxiuri sunt detectate la șoareci și șobolani prin cezariana derivate derivate din colonii-barieră susținută. Prin urmare, acestea au fost clasificate în centrul nostru ca agenți categoria E și testate ca Indicatorii de stare microbiologice a coloniilor de animale; cele notabile excepții de la această categorie de clasificare E au fost Muris Giardia, Muris Spironucleus, și Aspiculuris tetraptera, care au fost raportate ca fiind potențial patogeni [1, 16, 18]. În studiul de față, nu prevalenta de protozoare intestinale în categoria E a fost gasit in nici P / C-ul sau de șobolan facilități. Aceste date a sugerat că stricte Sisteme de carantină și de întreținere a animalelor sunt comune în P / C facilități.

Cercetatorii intr-un laborator de diagnostic in Statele Unite ale Americii efectuat un sondaj de microbi predominante pentru un număr mare de de probe mouse-ul si sobolan în 2003 [15]. Acestea au raportat rate pozitive relativ ridicate pentru MHV (aproximativ 2%), MPV (peste 2%), diareea epizootică de șoareci sugari Virusul (aproximativ 1%), și Helicobacter spp. (peste 30%) în șoareci și pentru virusul pneumoniei de șoareci (aproximativ 1%), șobolan parvovirusul (peste 1.5%), Helicobacter spp. (circa 18%), oxiuri (peste 10%) și Pneumocystis carinii (despre 4%) la șobolani. În studiul de față, nu am detecta orice acestor microbi excepția MHV, deși Helicobacter spp. și parvovirusul șobolan nu au fost incluse în nostru

elemente de testare. Aceste rezultate sugerează că există geografică caracteristici legate de prevalenta de microbi în șoareci și șobolani. Elementele de testare menționate mai sus ar putea avea nevoie care urmează să fie examinate la șoareci și șobolani importate din SUA pe durata carantinei.

Am descris în acest studiu microbiologic actual Starea de soareci si sobolani adăpostite în instalații experimentale în Japonia pe baza rezultatelor microbiologice noastre teste de monitorizare efectuate în 2011. În rezumat, agenți microbieni predominante găsite în prezent în experimental facilități în Japonia au fost în principal oportuniste agenti patogeni, cum ar fi Staphylococcus aureus și intestinale protozoare, în ambele facilitățile la șoareci și șobolani; în plus, MNV și H. hepaticus au fost predominante în mouse-ul facilităţi. În cele din urmă, prevalența agenților patogeni mortale, cum ar ca MHV și M. pulmonis a fost relativ mic.