13

Cuvânt înainte

Fenomenul de dispariţie a unor celule prin moarte naturală în cursul dezvoltării organismelor a fost observat încă din a doua jumătate a secolului al XIX-lea, dar a fost neglijat o lungă perioadă de timp. Confirmarea lui a venit de abia în intervalul 1965-1972, în urma unor experienţe efectuate de Kerr şi colaboratorii săi pe ficatul de şobolan, în care s-a observat că prin întreruperea fluxului de sânge în unii lobi hepatici unele celule dispăreau printr-un proces morfologic diferit de necroza celulară tipică. Acest tip de moarte celulară, observat de autor şi în celulele bazale de carcinom şi în alte forme de tumori maligne netratate, a fost confirmat apoi de numeroşi alţi autori şi a primit numele de apoptoză. Fenomenul de apoptoză a fost recunoscut şi acceptat ca modalitate distinctă şi importantă de moarte celulară programată la animale după publicarea rezultatelor obţinute de Horvitz (1999) în studiile sale de acest gen întreprinse la nematodul Caenorhabditis elegans.

Necroza celulară este un proces pasiv, o formă patologică de moarte celulară cauzată de agenţi nocivi de natură fizică, chimică etc, în care are loc distrugerea integrităţii membranei plasmatice, pierderea conţinutului celular şi apariţia unui proces inflamator, iar eliminarea celulelor afectate se realizează prin fagocitoza sistemului mononuclear. Apoptoza este un fenomen fiziologic normal, activ, este o moarte celulară programată, nedestructivă, care se produce cu consum de energie, în care celulele animale îşi păstrează integritatea membranei plasmatice, dar se micşorează, iar nucleul lor se condensează, apoi conţinutul acestora se separă în fragmente delimitate de membrane (corpi apoptotici), a căror eliminare de către macrofage se face fără urme, nefiind însoţită de un proces inflamator. Prin apoptoză un organism pluricelular elimină unele celule nedorite, realizându-şi astfel homeostazia celulară. În timp ce modificările celulare provocate de apoptoză sunt coordonate şi programate genetic, cele specifice necrozei au un nivel ridicat de autonomie, sunt mai mult procese de natură reactivă faţă de acţiunea nocivă a unor factori fizici şi chimici diverşi.

Prin apoptoză se modelează forma unui organism pluricelular sau a unor organe ale acestuia, sunt eliminate celule aflate în exces, nefuncţionale sau greşit plasate, celule care se dezvoltă anormal (care au material genetic grav lezat şi nereparabil), celule potenţial periculoase (celule canceroase, celule autoreactive ale sistemului imun, celule infectate de virusuri etc), sunt produse celule diferenţiate lipsite de organite celulare etc. Se consideră că în corpul uman sunt produse prin mitoză cca 100.000 de celule în fiecare secundă şi cam tot atâtea mor prin apoptoză. Apoptoza este un fenomen complex, multifazic, în care intervin semnale (din interiorul şi din exteriorul celulei), precum şi unii receptori specifici. Arsenalul proteinelor şi enzimelor care participă la iniţierea şi desfăşurarea apoptozei este impresionant. Principalii „actori” ai apoptozei sunt însă caspazele, enzime care au capacitatea de a scinda legăturile peptidice ale substratului după un rest de acid aspartic. Caspazele apoptotice sunt de două categorii: caspaze iniţiatoare (apicale) şi caspaze de execuţie (efectoare sau din aval). Ele au o organizare în cascadă, cele iniţiatoare fiind situate în amonte, iar cele de execuţie în aval. Substratul caspazelor poate fi constituit din proteine citoplasmatice şi nucleare, proteine ce iau parte la metabolismul şi reparaţia

14

ADN-ului, protein-kinaze, proteine implicate în transducţia semnalului şi în exprimarea genelor, în reglarea ciclului celular şi a proliferării celulare etc. Activarea caspazelor se poate produce fie pe calea apoptotică mediată de receptorii morţii (în care receptorii din familia TNF activează caspaza-8 din amonte), fie pe calea mitocondrială (în care, prin eliberarea cyt. c din mitocondrii, este activată caspaza-9 din amonte). Ambele căi duc în final la activarea unei caspaze efectoare majore din aval (în principal a caspazei-3), iar prin acţiunea caspazelor de execuţie apar modificările morfologice specifice celulelor animale intrate în apoptoză, dezasamblarea celulară, fragmentarea nucleului şi a citoscheletului, formarea corpilor apoptotici şi fagocitarea lor de către macrofage, dispariţia fără urme a celulei în cauză şi fără consecinţe pentru celulele din jur.

Apoptoza este un proces controlat, dereglarea acesteia – fie în sensul intensificării, fie în sensul reducerii ei – ducând la stări patologice. O apoptoză deficitară poate conduce la cancer, autoimunitate (incapacitatea de a elimina limfocitele autoreactive), infecţii persistente (incapacitatea de a eradica celulele infectate) etc, în timp ce o apoptoză excesivă poate contribui la boli neuro-degenerative (bolile Alzheimer, Parkinson, Huntington, scleroza laterală amiotrofică), la autoimunitate (inducerea apoptozei necontrolate în organe specifice), la SIDA (depleţia limfocitelor T) şi ischemie (atac de cord, infarct miocardic) etc.

Moartea celulară programată (MCP) nu este un fenomen specific doar animalelor. Ea însoţeşte şi creşterea şi dezvoltarea plantelor din momentul germinării seminţelor, până la maturarea şi senescenţa plantelor. Deşi MCP la plante are unele asemănări cu apoptoza la animale, ea prezintă totuşi diferenţe importante, întrucât plantele nu au un sistem imun, nu conţin fagocite, iar peretele celular specific plantelor împiedică formarea corpilor apoptotici. MCP la plante este implicată într-o serie de procese specifice acestora, cum ar fi: formarea embrionului, degenerarea stratului de aleuronă în timpul germinării seminţelor la monocotiledonate, formarea elementelor traheale ale xilemului, formarea aerenchimului în rădăcini şi a unor tipuri de trichomi epidermali, ablaţia organelor florale, eliminarea celulelor primordiilor de stamine la florile femele ale speciilor monoice, degenerarea celulelor tapet ale anterei, auto-incompatibilitatea polenului, formarea lobilor şi perforaţiilor foliare, dehiscenţa fructelor sau spargerea păstăilor etc. La plante, factori de stres cum ar fi hipoxia, deficitul hidric, radiaţiile UV, salinitatea, temperaturile extreme, poluanţii, toxinele, metalele grele etc, pot induce un stres oxidativ ce poate fi urmat de moartea celulară. MCP poate interveni la plante şi ca răspuns la agenţii patogeni.

În ciuda progreselor înregistrate în ultimul timp în domeniul MCP, la plante nu s-au găsit omologi strâns înrudiţi cu caspazele, dar s-a identificat o familie de proteaze ancestrale implicate în MCP – metacaspazele. Aceste enzime sunt specifice doar eucariotelor lipsite de caspaze şi execută activităţi caspase-like, fiind implicate în moartea celulară, deşi nu pot cliva substraturile caspazelor. S-ar putea însă ca pe viitor să asistăm la unele surprize, pentru că recent Sundström et al. (2009) de la Universitatea de Ştiinţe Agricole din Upsala (Suedia) au constatat că o proteină cu funcţie anti-apoptotică bine conservată evolutiv, TSN (Tudor Staphylococcal Nuclease), este degradată în timpul MCP de proteaze specifice: de caspaze în cazul celulelor animale şi de metacaspaze în

15

cazul celulelor plantelor (fapt ce anulează funcţia ei anti-apoptotică). Celulele cărora le lipseşte proteina TSN, suferă frecvent MCP prematură. La plante s-a identificat şi o altă familie de proteaze – enzimele de procesare vacuolară (VPE) care execută activităţi de tip caspază. VPE sunt cistein-proteaze şi deşi nu sunt înrudite cu caspazele şi metacaspazele, au unele proprietăţi enzimatice comune cu ale caspazei-1. Metacaspazele şi VPE par să fie primii candidaţi cu responsabilităţi de activităţi caspase-like la plante.

Deşi în ultimele două decenii s-au înregistrat progrese însemnate în cunoaşterea căilor şi mecanismelor morţii celulare programate la animale şi la plante, domeniul acesta are încă destule incertitudini. Dacă la animale lucrurile sunt ceva mai clare, în sensul existenţei unui program unic al MCP (cu două căi principale de realizare), la plante par să existe mai multe programe operaţionale ale MCP. Este evident însă că sistemele MCP la animale şi la plante nu sunt similare, pentru că nici unul din sistemele de moarte celulară descrise la plante nu pare să aibă toate trăsăturile specifice apoptozei de la animale, (Krishnamurthy et al., 2000). Împărtăşim opinia unor autori care consideră că MCP ar fi la fel de veche ca şi celula primordială, fiind prezentă nu numai la eucariotele pluricelulare, ci şi la unele procariote şi eucariote unicelulare. Pe parcursul evoluţiei organismelor pluricelulare, MCP ar fi fost „fin acordată” pentru a îndeplini unele roluri, cum ar fi controlul social al membrilor celulari într-un organism.

÷÷÷÷÷ Mi-am dorit de ceva vreme să mă apropii de subiectul abordat în această

carte, întrucât el îmi apărea a fi unul extrem de incitant şi voiam să-i cunosc unele detalii şi taine, dar am avut mereu alte priorităţi. Ocazia s-a ivit în urmă cu 5 ani, când mi s-a oferit să prezint un curs despre apoptoză studenţilor de la şcoala doctorală. Îmi procurasem mai demult un volum cu lucrări pe această temă, apărut în 1999 chiar sub coordonarea celui care a fondat domeniul - profesorul F. R. J. Kerr, volum pe care nu avusesem însă răgazul să-l deschid până atunci. Mi-au fost de mare folos la început şi informaţiile ample conţinute în două lucrări monografice apărute în România în acelaşi an, semnate de specialişti în acest domeniu, una de către profesorul Dănăilă şi colaboratorii săi, iar cealaltă de către Moldoveanu şi Popescu (autori citaţi frecvent în această carte). Aveam să constat curând că în domeniul apoptozei s-a lucrat şi s-a scris enorm, astfel încât sarcina oricui de a face o sinteză a cunoştinţelor acumulate în acest domeniu nu este defel una uşoară Nici nu mi-am propus de altfel acest lucru, ci mai degrabă am vrut să scriu o carte care să se constituie într-un fel de abecedar al domeniului, o încercare de a face cât de cât accesibil tuturor celor interesaţi, indiferent de domeniul lor de competenţă, un subiect suficient de complex şi de complicat, pe lângă care nu poţi trece indiferent, fără oarecare emoţie şi chiar sfială. În ce măsură am reuşit în tentativa mea, numai cititorul va putea să decidă. Aş vrea să cred totuşi că lucrarea de faţă va stârni interes şi prin faptul că ea tratează nu doar moartea celulară programată în regnul animal, ci şi modalităţile şi mecanismele acestui proces în regnul vegetal, fiind din acest punct de vedere inedită în peisajul ştiinţific românesc.

Publicarea acestei lucrări a fost posibilă şi datorită sprijinului acordat de domnul prof. univ. dr. Aurel Ardelean – rector fondator şi preşedinte al Universităţii „Vasile Goldiş” din Arad, un om pe care îl respect şi preţuiesc în

16

mod deosebit pentru că este un român adevărat şi pentru contribuţia sa la dezvoltarea biologiei şi a învăţământului superior în România.

Mi-au fost aproape în acest demers mai tinerii mei colegi biologi, dr. Mihaela Hârţan, dr. Diana Elena Maftei şi dr. Daniel Ioan Maftei, cărora le aduc mulţumiri pentru sprijinul acordat în tehnoredactarea, ilustrarea şi punerea în pagină a lucrării, în traducerea rezumatului ei, în realizarea copertei, pentru unele sugestii etc

Autorul

17

1. Apoptoza – definiţie, istoric În condiţii normale de viaţă o celulă (aparţinând unui organism pluricelular, fie reprezentând un organism monocelular) îşi urmează ciclul specific de viaţă, care cel mai adesea se sfârşeşte cu diviziunea ei şi cu formarea a două celule identice. S-a constatat totuşi că în condiţiile cultivării in vitro celulele nu se divid la infinit, chiar dacă dispun de condiţii optime de creştere (prin suplimentarea mediului nutritiv cu factori de creştere). Astfel, în timp ce fibroblastele provenite de la un fetus uman se divid în cultură de 80 de ori, cele provenite de la un adult în vârstă de 40 de ani se divid de numai 40 de ori, (Dănăilă et al., 1999). Celulele au deci o capacitate limitată de prolifereare, după care îşi încetează funcţiile vitale, printr-un mecanism care nu depinde de factorii favorabili sau nefavorabili în care trăiesc. Într-un organism pluricelular adult, diviziunea şi moartea celulară, două procese contradictorii, asigură menţinerea unui număr constant de celule într-un anumit organ. Acest echilibru, homeostazia (alţii o numesc homeodinamie), se realizează atunci când într-un ţesut rata mitozei este compensată de rata morţii celulare, iar în cazul când acest echilibru este perturbat, pot avea loc două evenimente importante şi nedorite: 1) fie celulele se divid mai rapid decât ele mor şi atunci se iniţiază un proces de dezvoltare tumorală; 2) fie celulele se divid mai încet decât ele mor şi atunci au loc pierderi de celule (cazul unor boli neuro-degenerative). La începutul anilor 1960 se acorda un interes deosebit studiului lisosomilor (organite celulare descoperite anterior de De Duve şi colaboratorii săi) şi implicării acestora în producerea morţii celulare în urma acţiunii unor agenţi dăunători, care ar determina eliberarea enzimelor digestive din lisosomi (ipoteza fiind cunoscută sub numele de “suicide bag” – sacul sinucigaş). Un aport important la descoperirea morţii celulare normale (programate) şi la definirea termenului de apoptoză au avut cercetările efectuate de Kerr şi colaboratorii săi între 1965 şi 1972. În investigaţii efectuate pe ficatul de şobolan, autorii au întrerupt fluxul de sânge prin ramurile venei porte în unii lobi hepatici şi au studiat consecinţele acestei obstrucţii. După câteva ore de la operaţie s-a instalat necroza celulelor situate în jurul venulelor terminale hepatice. S-a observat însă, în parenchimul din jurul portei, că unele celulele hepatice erau suprimate progresiv printr-un proces, care morfologic, era diferit de necroză: celulele respective se transformau în mase citoplasmatice mici – de formă rotundă sau ovoidală, care conţineau frecvent una sau mai multe particule de cromatină nucleară condensată. Lizozomii prezenţi aici se colorau discret prin anumite tehnici histochimice, fapt ce arăta că ei sunt intacţi. În aceeaşi situaţie se aflau şi ribozomii şi mitocondriile. Observaţiile l-au determinat pe autor să considere iniţial că această condensare celulară ce ducea la formarea maselor amintite ar fi efectul digestiei progresive a componenţilor citoplasmatici de către lizozomii intacţi, idee neconfirmată însă de investigaţiile de microscopie electronică. Aceste observaţii evidenţiau în ficatul de şobolan corpi rotunjiţi dispuşi în spaţiul extracelular, corpi formaţi din fragmente de citoplasmă condensată înconjurate de membrană, cu organite bine conservate, iar unii dintre ei prezentau mase de cromatină condensată (care aparent erau lipsite de membrană). Fenomenul a fost denumit de Kerr (1965) “necroză condensată”, (“shrinkage necrosis”), constatând ulterior că ea este un tip de moarte celulară care se produce şi în ţesuturile normale (nelezate). Acest tip de necroză, pus în evidenţă în lobii de ficat lipsiţi de aportul de sânge, a fost apoi observat de autor şi în celulele

18

bazale de carcinom, precum şi în alte forme de tumori maligne netratate, (Kerr şi Searle, 1972), fiind confirmată de numeroşi alţi autori. Era un tip special de moarte celulară care sugera autodistrugerea celulară şi nu degenerarea specifică din necroza clasică. Ea are loc spontan în ţesuturile adulte normale, în ţesuturile endocrin-dependente, în tumorile maligne, poate fi indusă de agenţi care determină necroza clasică şi în multe cazuri este implicată în reglarea dimensiunilor ţesutului, având un rol opus mitozei.

Termenul de apoptoză pentru moartea celulară de acest tip a fost sugerat de J. Cormack, profesor la Universitatea din Aberdeen, termen care în greaca veche descrie căderea frunzelor din copaci sau a petalelor de la flori (apo = din, de pe; ptosis = cădere), termen adoptat şi consacrat de Kerr et al. (1972), care au diferenţiat modificările morfologice celulare care apar în timpul morţii celulare programate (MCP), de cele specifice necrozei celulare. Conform Wikipedia, termenul de apoptosis a fost folosit de către Hippocrate din Cos (460-377 î. Hr.) pentru descrierea „căderii oaselor” în procesul descompunerii ţesuturilor după moarte. Prin apoptoză se înţelege moartea programată a celulelor, încetarea funcţiilor lor vitale, printr-un mecanism care nu depinde de factorii (favorabili sau nocivi) din mediul extracelular.

Fenomenul a fost observat, se pare, de pe la jumătatea secolului al XIX-lea, dar a fost neglijat. După cum arăta Dănăilă et al. (1999), încă în 1842 (la scurt timp după elaborarea teoriei celulare de organizare a organismelor vii), Vogt avansa ideea că unele celule mor în mod natural în cursul dezvoltării lor. În 1864, Weismann descria moartea celulară pe parcursul dezvoltării la Dipterae, iar în 1872 Stieda se apropia de înţelesul actual al noţiunii de apoptoză prin observaţiile lui privitoare la moartea condrocitelor în timpul osificării. În 1879 se efectuau primele observaţii microscopice asupra morţii celulare, fiind introduşi şi unii termeni de profil: cariorexie – care însemna dezintegrarea nucleului şi carioliză – care descria dispariţia lui (Van Cruchten şi Van Den Broek, 2002). Mecinikov constata în 1883 că în muşchii mormolocilor de broască fagocitoza era asociată cu moartea celulară, iar în 1889, Berd observa că pe parcursul dezvoltării embrionului de peşte o serie de neuroni sunt supuşi morţii celulare. În 1885, Flemming descria un fenomen de regresie normală a foliculilor ovarieni pe care l-a denumit cromatoliză, considerat de Gräpper (1914) un mecanism de contrabalansare a mitozei, (Kerr, 1999). În 1890, Arnheim a introdus termenii picnoză şi marginaţia cromatinei (Van Cruchten şi Van Den Broek, 2002). Într-o serie de lucrări apărute între cele două războaie mondiale se sugera posibilitatea existenţei morţii celulare normale în timpul dezvoltării embrionare, dar nu se intuia încă rolul acestui fenomen şi faptul că el este implicat în numeroase procese biologice normale, dar şi într-o serie de boli, inclusiv în cancer. Mai târziu, Gluecksmann (1951) avansa ideea că, pe parcursul dezvoltării nevertebratelor şi vertebratelor, apare fenomenul de moarte celulară normală. Într-o lucrare publicată în 1964, Lockshin şi Williams folosesc termenul de moarte celulară programată pentru a defini fenomenul de moarte celulară care apare în zone şi în momente precise pe parcursul dezvoltării fluturelui de mătase. Doi ani mai târziu, Tata (1966) arăta că moartea celulară normală putea fi contracarată prin intervenţia cu inhibitori ai sintezei ARN şi a proteinelor, iar Saunders (1966) evidenţia un fapt deosebit de important şi anume că această moarte celulară normală putea fi prevenită de substanţele produse de alte celule şi ţesuturi, că deci ea putea fi influenţată prin semnale provenite de la alte celule, (Dănăilă et al., 1999).

19

Apoptoza a fost în cele din urmă recunoscută şi acceptată ca modalitate distinctă şi importantă de moarte celulară programată la animale după publicarea rezultatelor obţinute de Horvitz (1999) în studiile sale de acest gen întreprinse la nematodul Caenorhabditis elegans.

Neglijarea mult timp a apoptozei s-a datorat faptului că ea “este un fenomen

criptic, iar dimensiunile mici ale multor corpi apoptotici, viteza cu care ei sunt dispuşi

în celulele adiacente şi absenţa unor exudate inflamatorii au contribuit la ignorarea

procesului în ţesuturile adulte normale, unde rata de producere a lui este redusă”, (Kerr, 1999).

În timp ce necroza celulară este o formă patologică de moarte celulară, datorată unor leziuni mecanice, hipoxiei, acţiunii unor agenţi fizici dăunători sau unor toxine etc, care determină distrugerea integrităţii membranei plasmatice, pierderea conţinutului celular şi apariţia unui proces inflamator, iar eliminarea celulelor afectate se realizează prin fagocitoza sistemului mononuclear, în apoptoză celulele îşi păstrează integritatea membranei plasmatice, celulele se zbârcesc, nucleul celulei se condensează, conţinutul lor se separă în fragmente delimitate de membrane (corpi

apoptotici), care sunt fagocitate de macrofage, iar eliminarea lor nu este însoţită de un proces inflamator. Apoptoza este un proces fiziologic normal, care se produce cu consum de energie, după un program genetic bine definit, înscris în genomul celulei, nedestructiv, care se finalizează cu moartea celulei, prin care un organism pluricelular elimină unele celule nedorite, realizându-şi astfel homeostazia celulară. Potrivit definiţiei propuse de Willie et al., (1980), „apoptoza este un proces fiziologic strict

reglat, caracterizat parţial de condensarea nucleară şi micşorarea volumului celular,

cu păstrarea intactă a membranei plasmatice, culminând cu distrugerea cromatinei

nucleare şi digestia ADN-ului genomic, ca eveniment ireversibil”, (Dănăilă et al., 1999).

Deşi unii specialişti fac distincţie între moartea celulară programată (prin care înţeleg moartea celulară fiziologică normală, înscrisă în programul genetic) şi apoptoză (prin care înţeleg moartea fiziologică asociată cu fenomenele de condensare a citoplasmei, fragmentarea ADN-ului şi formarea corpilor apoptotici), în prezent se consideră că ambele denumiri desemnează unul şi acelaşi fenomen, admiţându-se sintagma „moarte celulară programată prin apoptoză”. Termenul de moarte celulară programată (MCP) a fost folosit înaintea celui de apoptoză, fiind propus de către Lokshin şi Williams (în 1964) în observaţiile acestor autori asupra dezvoltării ţesuturilor la insecte. Investigaţiile în domeniul apoptozei s-au bucurat în ultimele decenii de un interes cu totul deosebit şi de eforturi de cercetare însemnate, rezultatele unor specialişti în acest domeniu fiind onorate în anul 2002 cu Premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină, acordat cercetătorilor Sydney Brenner (Marea Britanie), Robert Horvitz (SUA) şi John Sulston (Marea Britanie).

Se pare totuşi că apoptoza prezintă mai multe faţete, variante, în sensul că în unele cazuri pot fi întâlnite modificările nucleare tipice apoptozei (apoptoză „nucleară”), în timp ce în altele apar doar modificări în citoplasmă (condensarea ei, umflarea mitocondriilor şi ruperea ribozomilor), lipsind fenomenele de fragmentare a ADN-ului şi formarea de vezicule de cromatină dispuse în partea internă a membranei nucleare (apoptoză „citoplasmatică”). Având în vedere multitudinea de manifestări ale acestui fenomen, unii autori preferă termenul generic de moarte celulară programată

20

(MCP), cel de apoptoză fiind folosit, cum notam anterior, doar atunci când apar modificări morfologice celulare. Acest tip de moarte celulară (MC) trebuie delimitat totodată de „moartea celulară prin mitoză” (mitotic cell death), realizată de către agenţii mutageni cu acţiune antimitotică (cum ar fi radiaţiile ionizante, unii agenţi alkylanţi etc), în care moartea celulară se produce ca urmare a incapacităţii celulelor de a se divide (datorită blocării mitozei), (Dănăilă et al., 1999).

Între timp au apărut şi alte puncte de vedere în acest concept de moarte celulară, după cum urmează: 1) apoptoza a fost definită ca fiind moartea celulară mediată de caspaze - având trăsăturile morfologice descrise anterior; 2) necroza reprezintă moartea celulară accidentală, necontrolată, haotică;

Fig. 1.1. - Ilustrarea oncozei, necrozei şi apoptozei (după Majno şi Joris, 1995; modificată).

3) oncoza (de la „onkos” – umflare) este considerată o stare pre-letală ce duce la moartea celulară datorită depleţiei rezervelor energetice celulare şi perturbării pompelor ionice din membrana plasmatică şi se caracterizează prin umflarea celulei, umflarea organitelor celulare, creşterea permebilităţii membranei. Este provocată de ischemie şi posibil de agenţi toxici care interferează cu generarea de ATP sau determină creşterea permebilităţii membranei plasmatice. De regulă, este însoţită de

21

carioliză, iar distrugerea ADN are loc într-o manieră nespecifică, (Majno şi Joris, 1995; Fink şi Gookson, 2005). Se pare că celulele ce intră în oncoză sunt supuse necrozei, având ca element esenţial natura inflamatorie, (fig. 1.1.). 4) piroptoza – este considerată o formă de moarte celulară determinată de infecţia cu specii de Salmonella şi Shigella, este inflamatorie şi ar fi dependentă doar de caspaza-1 (caspază care nu este implicată în moartea celulară apoptotică). Activarea caspazei-1 în macrofagele infectate cu cele două specii de bacterii determină procesarea citokinelor IL-1β şi IL-18 şi moartea celulei gazdă. Se consideră că piroptoza (de la pyro=foc, febră; ptosis=cădere) ar juca un rol important în MC din sistemele imun, cardiovascular şi nervos, unde a fost observată activarea caspazei-1, (Fink şi Gookson, 2005). Într-o lucrare de sinteză dedicată apoptozei, Elmore (2007) arăta că au fost descrise şi alte forme de MC. Una din ele, denumită de Formigli et al., (2000) aponecroză, prezintă unele trăsături morfologice specifice atât necrozei cât şi apoptozei. O formă distinctă de MCP, denumită de Sperandio et al. (2000) paraptoză, nu răspunde la inhibitorii de caspază sau la Bcl-XL şi ar fi coordonată de o formă alternativă de activitate caspază-9, independentă de Apaf-1.

Mai nou, sistemele de moarte celulară (MC) la animale au fost clasificate în 3 categorii (tipuri): apoptoza (MC de Tipul I), autofagia (MC de Tipul II) şi necroza (MC de Tipul III), (Lockshin şi Zakeri, 2004). După alţii, tipul III de MC ar fi moartea celulară nelizozomală, (Iakimova et al., 2005). În tabelul 1.1 sunt prezentate tipurile de moarte celulară aşa cum au fost definite de Clarke, (1990).

Tabel nr. 1.1 – Tipuri de moarte celulară (după Clarke, citat de Van Cruchten şi

Van Den Broek, 2002)

Tipul de moarte celulară (MC)

Starea nucleului Starea membranei

celulare

Starea citoplasmei Eliminarea heterofagă

Tipul 1

Apoptoză

Condensarea nucleului, îngrămădirea cromatinei care conduce la picnoză

Cutată, formează umflături

Pierderea ribozomilor de pe RER şi polisomi; citoplasmă redusă ca volum şi care devine electron-densă

Proeminentă şi importantă

Tipul 2

MC autofagică

Picnoză în unele cazuri; segmente nucleare se pot umfla sau segrega

Endocitoză, posibil umflare

Vacuole autofagice abundente; RE şi mitocondriile uneori dilatate; aparatul Golgi adesea mărit

Ocazională şi târzie

Tipul 3A

MC ne-lisosomală

Vacuolizare târzie urmată de dezintegrare

Rupturi Dezintegrare generală; dilatarea organitelor, care formează spaţii goale ce fuzionează unul cu altul şi cu spaţiul extracelular

Absentă

Tipul 3B

MC citoplasmatică

Creşterea târzie a granularităţii cromatinei

Umflarea celulei

Vacuolizare provocată de dilatarea RE, a membranei nucleare, aparatului Golgi şi uneori a mitocondriilor

Prezentă

22

În apoptoză, celulele supuse MC se transformă în corpi apoptotici, care vor fi înghiţiţi şi digeraţi de către macrofage. Autofagia reprezintă un proces catabolic major la eucariote, în care porţiuni de citoplasmă şi organite celulare sunt sechestrate în vezicule cu membrană dublă şi sunt livrate lizozomilor (la animale) şi vacuolei (la plante şi fungi), unde vor fi digerate de enzimele hidrolitice (www.slu.se/Bozhkov; Elmore, 2007). Bozhkov consideră că autofagia, în funcţie de magnitudinea ei poate fie să salveze, fie să ucidă celula. În condiţii de stres sau înfometare, autofagia poate asigura supravieţuirea celulară prin eliminarea organitelor sau proteinelor lezate, aprovizionând celula cu produşii de degradare rezultaţi în procurarea energiei sau pentru procesele de sinteză. Dacă autofagia depăşeşte un anumit prag şi, prin acţiunea ei elimină porţiuni mari de citosol şi organite, în final celulele afectate mor, ea fiind în acest caz un executor al MCP. Termenul de autofagie („self-eating”) derivă din latină şi are înţelesul de auto-distrugere, autoliză, proces în care componenţii citoplasmatici sunt degradaţi de către maşinăria lisosomală a celulei (Reape et al., 2007). Acest mecanism al MCP este bine reprezentat pe parcursul dezvoltării embrionare a vertebratelor şi constă în vacuolizarea celulei, degradarea citoplasmei, o uşoară condensare a cromatinei. Autofagia se caracterizează prin formarea vacuolelor autofagice, dilatarea mitocondriilor şi a reticulului endoplasmatic, o uşoară lărgire a aparatului Golgi (Bras et al., 2005). Autofagia începe cu sechestrarea de material citoplasmatic în vezicule cu membrană dublă – autofagosomi, proces care se produce sub controlul GTP-azelor şi a fosfatidil-inositol-kinazelor. Autofagosomii fuzionează apoi cu lizozomii. In vivo, celulele supuse autofagiei pot fi fagocitate de celulele învecinate, (Fink şi Gookson, 2005). Procesul de autofagie a fost împărţit în etape (trepte): 1) inducţia; 2) formarea autofagosomului; 3) fuziunea cu lisosomul sau vacuola; 4) degradarea corpului autofagic şi reciclarea produşilor (Elmore, 2007). Al treilea tip morfologic de MCP ar fi reprezentat de MCP nelizozomală, sau MCP asemănătoare necrozei (necrosis-like PCD) şi implică umflarea organitelor şi formarea în citoplasmă de „spaţii goale” lizozom-independente, având asemănări cu necroza, (Iakimova et al., 2005).

Moartea celulară programată (MCP) apare ca fiind un proces activ, programat, dependent de semnale celulare codificate genetic şi de activităţi specifice în celulele care mor. Necroza, este privită ca un proces opus MCP, deoarece reprezintă o prăbuşire a celulei datorită acţiunii directe a unor stimuli externi (care poate fi prevenită doar de absenţa acestora), proces care nu reclamă activitate celulară (coordonată). Unii consideră că formele sub care se poate manifesta moartea celulară programată (MCP) sunt apoptoza, autofagia şi piroptoza. Se constată însă că în ce priveşte cel de al III-lea tip de MCP opiniile specialiştilor sunt împărţite. Cert este faptul că majoritatea autorilor fac distincţie între MCP prin apoptoză şi alte tipuri de MCP (prin autofagie, asemănătoare-apoptozei, sau asemănătoare-necrozei etc).

2. Necroza şi apoptoza – două forme diferite ale morţii celulare La animale, există două tipuri majore de moarte celulară: apoptoza, proces înalt

reglat, programat, dependent de enegie şi necroza, care rezultă în urma unor leziuni. Apoptoza sau moartea celulară programată (MCP) la animale, aşa cum a descris-o Kerr et al (1972) se caracterizează prin rotunjirea şi micşorarea celulei, condensarea cromatinei (picnoza), fragmentarea nucleului (cariorexie), formarea de vezicule

23

(blebbing) la suprafaţa externă a membranei celulare, clivajul internucleosomal al ADN-ului în fragmente caracteristice de 180 pb şi formarea de corpi apoptotici. Membrana plasmatică în celulele mamiferelor rămâne intactă până în stadiile târzii ale apoptozei, fapt ce previne instalarea unui răspuns inflamator, (Vercammen et al., 2007). Necroza se caracterizează prin umflarea celulelor (oncoză), dilatarea organitelor, care determină ruperea membranei plasmatice şi a endo-membranelor, având drept consecinţă eliberarea rapidă a enzimelor hidrolitice. De altfel, una din diferenţele esenţiale între apoptoză şi necroză este aceea că în apoptoză membrana celulară îşi păstrează integritatea până la formarea şi fagocitarea corpilor apoptotici.

MCP la animale este un proces fiziologic prin care are loc eliminarea unor celule nedorite. Iată câteva exemple de acest gen, asupra cărora vom reveni în capitolele ce urmează:

- dispariţia unor celule care au avut funcţii temporare (cum e cazul resorbţiei celulelor cozii mormolocului de broască în cursul metamorfozei);

- celule care au fost produse în exces, cum sunt neuronii la vertebrate; - celule prezente în poziţii neadecvate, cum sunt cele ale ţesuturilor interdigitale,

a căror dispariţie asigură formarea degetelor la mamifere; - eliminarea celulelor musculare în metamorfoza insectelor; - moartea a 131 de celule din cele 1090 de celule somatice iniţiale, pe parcursul

dezvoltării nematodului Caenorhabdites elegans; - moartea unor celule pe parcursul procesului de specializare celulară, cum este

cazul keratinocitelor de la suprafaţa pielii etc. Perturbarea procesului de moarte celulară programată a anumitor tipuri celulare

poate determina stări de boală, cum ar fi: moartea celulelor T helper în cazul SIDA, sau moartea în exces a neuronilor cerebrali care poate duce la boli neuro-degenerative ca: maladia Alzheimer, boala Huntington, boala Parkinson, boala Lou Gehrig, (Pennell şi Lamb, 1997).

Deşi apoptoza şi necroza se soldează în final cu moartea unor celule, între cele două procese sunt diferenţe notabile în privinţa manifestării lor, a mecanismelor şi consecinţelor asupra celulelor şi organismelor, unele deja prezentate în capitolul anterior. În timp ce apoptoza este, cum spuneam, o formă normală de moarte celulară, necroza este o formă patologică de moarte celulară.

Cum s-a arătat deja, necroza poate fi provocată de o multitudine de factori de natură fizică, chimică şi biologică (radiaţiile, hipo- sau hipertermia, hipoxia, toxinele şi alţi agenţi chimici, infecţiile virotice sau cu alţi agenţi patogeni etc), fiind însoţită de un proces inflamator. Până la un anumit nivel modificările induse de necroză în celule sunt reversibile:desfacerea proteinelor care formează citoscheletul, alterarea integrităţii şi permeabilităţii membranelor, perturbarea activităţii pompei ionice din membrane etc, după care ele devin ireversibile. Modificările morfologice provocate de necroză sunt precedate de reducerea nivelului de ATP, ceea ce privează celula de suportul energetic pentru refacerea schimbărilor induse. În timp ce în apoptoză cantitatea de calciu ionic în citosol creşte, în necroză are loc reducerea gradientului de calciu datorită perturbării pompei de calciu, dar şi pierderii integrităţii membranelor. În citosol sunt activate fosfolipazele şi proteazele, sinteza proteinelor se reduce, iar ulterior încetează. Cantitatea de apă în celulă creşte, având loc şi redistribuirea apei în interiorul ei. Schimbarea gradienţilor cationici determină lărgirea reticulului

24

endoplasmatic, celula îşi modifică forma şi dimensiunile, iar cromatina nucleară ia aspect floculos. În necroză nucleul celulei nu se fragmentează în porţiuni delimitate de membrană ca în apoptoză, cromatina are tendinţa de condensare, dar nu se redistribuie, iar aglomerările de cromatină sunt neregulate şi slab conturate. Într-o fază ulterioară, schimbările declanşate de necroză devin ireversibile. Lezarea structurii şi funcţiilor membranei plasmatice şi a membranelor endoplasmatice se accentuează, mitocondriile se hidratează puternic şi se dilată, iar în interiorul lor apar granule dense (bogate în lipide), cromatina se dispersează sub forma unor particule libere – iar la sfârşitul necrozei cromatina dispare (se degradează odată cu organitele celulare, degradarea ADN-ului nuclear şi a histonelor producându-se la întâmplare), are loc distrugerea progresivă şi digestia enzimatică a organitelor celulare, citoplasma se vacuolizează, celulele devin eozinofile, lizozomii se umflă şi în final eliberează enzimele litice, celulele se umflă şi ele şi în cele din urmă se dezintegrează. Mecanismele prin care se produc modificările ireversibile celulare specifice necrozei ar fi: reducerea nivelului ATP sub cel critic, apariţia radicalilor toxici ai oxigenului, eliberarea enzimelor litice în celulă, activarea fosfolipazelor dependente de calciu legate de membranele interne. Modificările celulare provocate de necroză au un nivel ridicat de autonomie, nu sunt coordonate şi programate genetic precum sunt cele din apoptoză, ci sunt mai mult procese de natură reactivă faţă de acţiunea nocivă a unor factori fizici şi chimici diverşi, (Dănăilă et al., 1999; Moldoveanu şi Popescu, 1999; Krishnamurthy et al., 2000; Ricci, 2002; Elmore, 2007).

Tabel nr. 2.1 – Comportarea unor parametri celulari şi tisulari în cazul necrozei şi

apoptozei (Hetts, citat după Dănăilă et al., 1999)

Parametri analizaţi Necroză Apoptoză

Factori iductori Toxine, hipoxie, lezări masive, depleţia ATP

Condiţii fiziologice sau patologice; depleţia ATP nealterată

Energia necesară Se desfăşoară fără consum de energie

ATP- dependentă

Aspecte histologice Balonizarea celulară, distrugerea organitelor, moartea mai multor celule

Condensarea celulei, a cromatinei, formarea corpilor apoptotici, moartea unei singure celule

Modul de degradare a cromatinei (ADN-ului)

Întâmplător, rezultând fragmente de diverse dimensiuni

Clivarea internucleosomală a cromatinei în fragmente de 180 pb sau multipli de 180 pb

Starea membranelor plasmatice

Lizate Intacte (cu suprafaţa crenelată sau veziculată, zbârcite)

Fagocitoza celulelor moarte

Fagocite care migrează în zona de necrorză

Fagocite şi celule învecinate

Reacţia tisulară Inflamaţie Reacţie inflamatorie absentă Spre deosebire de apoptoză, unde celula „se pregăteşte” pentru eliminarea ei

prin fagocitoză, în necroză acest fenomen nu are loc, ci dimpotrivă, datorită lezării sistemului de membrane celulare, sunt eliberate în celulă enzimele de degradare, care duc în cele din urmă la dezintegrarea ei, fenomenul fiind însoţit de un proces inflamator. Faţă de apoptoză, necroza este un proces ne-fiziologic, care nu este asociat în mod normal cu dezvoltarea, nu apare în urma unui semnal de transducţie controlat genetic, nu necesită activitatea proteazelor şi nucleazelor pentru o degradare controlată

25

a celulei, nu reclamă Ca2+ sau schimbări în fosforilarea proteinelor, (Pennell şi Lamb, 1997).

Tabel nr. 2.2. – Modificări induse de necroză şi apoptoză la nivel celular

(prelucrare după Dănăilă et al., 1999; Ricci, 2002)

Parametri

analizaţi

Necroză Apoptoză

Trăsături morfologice

Apariţie. Începutul procesului

Afectează grupuri mari de celule; alterare tisulară masivă. Creşterea volumului celular (umflarea citoplasmei şi a mitocondriilor)

Afectează o singură celulă. Reducerea volumului celular (condensarea citoplasmei şi a nucleului)

Membranele nucleare şi plasmatice

Distruse în fazele timpurii Persistă integral până în ultimele stadii; suprafaţa zbârcită (crenelată), cu circumvoluţiuni

Cromatina Mase mici de cromatină slab delimitate, dispersate întâmplător, ulterior lizate

Cromatina se condensează în mase adiacente membranei nucleare şi ulterior se fragmentează

Organitele celulare

Umflarea şi dezintegrarea lor în fazele timpurii

Mitocondriile capătă pori prin implicarea proteinelor din familia Bcl-2

Vezicule Nu se formează vezicule, se produce liza completă

Se formează vezicule mărginite de membrană (corpi apoptotici)

Faza terminală Are loc liza celulară totală Celula se fragmentează în corpi mai mici

Trăsături biochimice

Reglare Se pierde reglarea homeostaziei ionilor

Proces strict reglat, care implică activare şi parcurge trepte enzimatice

Input energetic Procesul nu reclamă energie (se produce pasiv şi are loc şi la 40C)

Proces activ, dependent de energia ATP (nu se produce la 40C)

ADN Fragmentare şi degradare întâmplătoare (inclusiv a histonelor)

Fragmentare internucleozomală nerandomizată Activarea endonucleazelor

Timing Fragmentare ADN postlitică (eveniment tardiv în moartea celulară)

Fragmentare ADN prelitică

Evenimente biochimice

- Eliberarea de factori diverşi (cit. c, AIF) în citoplasmă de către mitocondrii; - Activarea cascadei de caspaze; - Alterări ale asimetriei membranei (translocarea fosfatidil-serinei din citoplasmă spre partea externă a membranei)

Impact fiziologic

Proporţii Afectează grupuri de celule învecinate

Efecte localizate care distrug celule individuale

Inducţie Determinată de factori ne-fiziologici (atacul complememtului, virusuri litice, hipotermie, hipoxie, ischemie, toxine metabolice)

Indusă de stimuli fiziologici (lipsa factorilor de creştere, schimbări în mediul hormonal)

Fagocitoza Fagocitoză realizată de macrofage Fagocitoză realizată de către celule adiacente sau de macrofage

Sistemul imun Răspuns inflamator semnificativ Răspuns inflamator absent

26

În cazul necrozei, fragmentele rezultate în urma dezintegrării aleatorii a celulei moarte sunt fagocitate de macrofage întocmai ca particulele străine pătrunse în organism, de unde şi apariţia reacţiei inflamatorii (Dănăilă et al., 1999). Unele din trăsăturile morfo-fiziologice şi biochimice celulare care însoţesc necroza şi apoptoza sunt sintetizate în tabelele 2.1 şi 2.2.

Spre deosebire de necroză, apoptoza este un proces activ, afectează celule izolate, decurge rapid după iniţiere, se desfăşoară cu consum de energie, după un program genetic prestabilit, în care membranele plasmatice rămân intacte, chiar dacă ele se cutează (zbârcesc) şi capătă aspect vezicular. Citoplasma şi nucleul celulei se condensează, volumul celular scade aproape la jumătate (datorită, se pare, pierderii de apă şi de ioni), celulele capătă formă alungită sau neregulată, dar organitele citoplasmatice nu prezintă modificări specifice (se menţin aparent normale). Condensarea şi rotunjirea celulei se datorează distrugerii citoscheletului proteic de către caspaze. În faza incipientă a apoptozei concentraţia calciului ionizat din citosol ar creşte, fapt ce activează trans-glutaminazele, enzime care contribuie la reducerea volumului celular (ele leagă încrucişat proteine citoplasmatice prin formarea de legături transversale de tipul έ-lizil-γ-glutamil). Menţinerea integrităţii membranelor celulare permite desfăşurarea activităţii enzimatice, evită pierderea de proteine, contribuie la păstrarea echilibrului osmotic celular şi la realizarea proceselor biochimice „specifice” apoptozei, (Dănăilă et al., 1999; Moldoveanu şi Popescu, 1999; Ricci, 2002; Fink şi Gookson, 2005; Elmore, 2007).

Fig. 2.1 - Celulă secretoare din glanda mamară în ziua a 3-a de involuţie, aflată În stadiul timpuriu de apoptoză (după Vallan et al., 1998); se observă codensarea cromatinei la marginea membranei nucleare interne)

Un efect vizibil în apoptoză, încă de la declanşarea ei, este condensarea treptată

a cromatinei nucleare, cu formarea de mase compacte, de formă emisferică sau concavă, care se dispun la periferia nucleului (aderă la suprafaţa internă a membranei nucleare - picnoză), iar membrana nucleară devine discontinuă (fig. 2.1). Faţă de condensarea normală a cromatinei specifică mitozei, în apoptoză se produce o condensare rapidă a cromatinei, urmată de intervenţia imediată a endonucleazelor, care

27

o degradează în fragmente specifice de ADN de cca 180-200 pb (la nivelul zonelor internucleosomale, proces considerat a fi un marker important al apoptozei), fenomen denumit cariorexie (karyorrhexis).

S-a stabilit de altfel că primele modificări morfologice ale celulelor apoptotice coincid cu fragmentarea genomului în zona de unire a doi nucleosomi învecinaţi (Moldoveanu şi Popescu, 1999), ceea ce sugerează că moartea celulară s-ar datora clivării ADN-ului. Şi nucleolul suferă modificări, formând mase granulare, rotunde sau ovale, osmiofile, care se dispun în centrul acestuia, mase care se pot dezintegra în fragmente mai mici, mai slab osmiofile (mai bogate se pare în proteine). La microscopul optic, o celulă intrată în apoptoză este mai mică, ratatinată (zbârcită), mai densă, nucleul este picnotic şi prezintă mase dense de cromatină, eozinofile. Se pare că pierderea apei, a electroliţilor şi blocarea sistemului de transport al ionilor (Na+, Cl-, K+) contribuie la ratatinarea celulelor, proces uşor de observat în culturile celulare prin pierderea contactului celulei apoptotice cu celulele învecinate (a desmozomilor) şi a structurilor specializate de la suprafaţa ei (a pseudopodelor, microvililor etc). Spre sfârşitul apoptozei, nucleul celulei se dezintegrează în fragmente mai mici de cromatină condensată, fragmente învăluite de o membrană dublă.

Un rol important în integrarea şi propagarea semnalelor morţii determinate de leziunile ADN, stresul oxidativ, chimioterapice etc îl joacă mitocondriile. Factorii amintiţi pot duce la perturbarea potenţialului transmembranar intern al mitocondriei (Dy) şi aşa-numitei permeabilităţi de tranziţie (PT). S-a observat în acelaşi timp o umflare a mitocondriilor, datorită influxului apei în matrix, care poate duce la ruperea membranei externe a mitocondriei şi la eliberarea proteinelor pro-apoptotice din spaţiul inter-membranar în citoplasmă. Printre proteinele cu acest rol se numără citocromul c - care activează apoptozomul, dar şi alţi factori cum ar fi factorul de inducere a apoptozei (AIF), endonucleaza endoG, proteina Smac/Diablo etc, (GEWIES, 2003). Perturbările produse Dy şi PT determină pierderea homeostaziei biochimice a celulei: sinteza ATP este sistată, moleculele redox (NADH, NADPH şi glutationul) sunt oxidate, speciile reactive ale oxigenului (ROS) cresc cantitativ (provocând oxidarea lipidelor, proteinelor şi acizilor nucleici).

Membrana plasmatică formează invaginări spre interiorul celulei care duc la generarea de vezicule interne ce conţin porţiuni de citoplasmă cu organite celulare intacte şi fragmente nucleare, structurile formate fiind denumite corpi apoptotici. Unele modificări morfologice celulare care se produc în necroză şi apoptoză sunt ilustrate în figura 2.2.

Unii autori consideră că înaintea formării corpilor apoptotici, membrana nucleară se dezintegrează, iar fragmentele rezultate s-ar dispersa în citoplasmă, unde împreună cu porţiuni din citoplasmă şi organite celulare intacte ar genera aceşti corpi, alţii apreciază că integritatea membranei nucleare se păstrează şi că părţi din ea însoţesc fragmentele nucleare în momentul constituirii corpilor apoptotici. De îndată ce se formează veziculele, se produc şi modificări morfologice şi biochimice specifice ale membranelor, care permit recunoaşterea celulelor apoptotice de către macrofage sau alte celule învecinate. Corpii apoptotici se desprind din celula moartă printr-un proces de „înmugurire”. Structura, mărimea şi numărul corpilor apoptotici depind de dimensiunile celulelor şi ale nucleilor.

28

Fig. 2.2. – Schemă care relevă unele modificări morfologice celulare care apar în necroză şi apoptoză

Corpii apoptotici rezultaţi ajung în spaţiul dintre celule, unde sunt recunoscuţi şi

rapid fagocitaţi de către macrofage sau de către alte celule din vecinătate (celule de natură epitelială sau fibroblastică), fiind degradaţi de către enzimele lizozomale, fără ca procesul să fie însoţit de o reacţie inflamatorie, (Dănăilă et. al., 1999; Păunescu, 2006). Lipsa reacţiei inflamatorii s-ar datora faptului că: - celulele apoptotice nu eliberează conţinutul şi constituienţii lor în ţesutul din jur; - fagocitoza lor are loc rapid de către celulele învecinate şi astfel este prevenită necroza secundară; - celulele apoptotice înghiţite (ingerate) nu produc citokine inflamatoare (Elmore, 2007).

Fig. 2.3 - Cronologia fenomenelor apoptotice în celule HeLa (inducţia pe calea TNFα a apoptozei cu actinomicină D; internet)

29

Fenomenul de înlăturare a celulelor moarte de către celulele fagocitare din vecinătate este denumit eferocitoză (efferocytosis). Timpul scurs între declanşarea procesului de apoptoză şi formarea corpilor apoptotici este scurt, de ordinul minutelor sau zecilor de minute), iar digestia corpilor apoptotici durează în medie câteva ore (fig. 2.3).

Deoarece moartea celulară prin apoptoză decurge rapid şi nu este însoţită de fenomene inflamatorii, apoptoza a fost mult timp neglijată, aşa cum am arătat şi în capitolul anterior.

Celulele intrate în apoptoză au pe suprafaţa lor markeri moleculari, liganzi pentru receptorii macrofagelor, care asigură recunoaşterea şi captarea lor. Între aceştia se numără fosfatidil-serina pentru receptorii fosfatidil-serinei, trombospondina pentru receptorii tromobspondinei, lanţuri glucidice pentru lectine, sau (ca mecanism alternativ) proteine din clasa integrinelor în cazul receptorilor pentru vitronectină, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

Apoptoza este, cum am arătat deja, un proces relativ punctiform, care implică o celulă sau un număr mic de celule. Ea poate cuprinde un număr mare de celule pe parcursul dezvoltării embrionare a unor organisme şi un număr mai mic de celule în cazul organelor deja constituite.

Citând o serie de autori, Elmore (2007) arată că moartea unei celule prin necroză sau apoptoză ar depinde de natura semnalului MC, de tipul de ţesut şi stadiul lui de dezvoltare, de mediul fiziologic, cele două procese putând avea loc simultan, funcţie de intensitatea şi durata stimulului, de mărimea depleţiei ATP şi de disponibilitatea caspazelor.

3. Modificări biochimice prezente în apoptoză Evenimentele biochimice produse în apoptoză sunt complexe, se petrec după un

anume program şi au loc în cascadă. Dintre acestea, degradarea nucleului şi a organitelor celulare, produsă de enzime specifice, reprezintă în fapt procesul biochimic cel mai important.

Unul din componenţii normali ai membranei plasmatice este fosfatidil-serina (PS), proteină localizată pe suprafaţa internă a acesteia (spre citoplasmă). În anumite condiţii, are loc translocarea acestei proteine de pe faţa internă, pe cea externă a membranei. Este un fenomen întâlnit frecvent în procesul de transformare malignă a celulelor, care a fost semnalat şi în apoptoză (la începutul ei). S-au evidenţiat şi situaţii în care apoptoza s-a produs fără translocarea PS de faţa internă pe cea externă a membranei. Translocarea acestei proteine precede fragmentarea nucleară şi degradarea organitelor celulare. De altfel, inhibitorii apoptozei şi a enzimelor care au rol esenţial în acest proces (caspazele), inhibă şi translocarea PS pe faţa externă a membranei plasmatice. Deşi această translocare a fost semnalată şi în alte procese fiziologice şi patologice, ea este considerată ca un fenomen specific în apoptoză, care face ca celula în cauză să fie mai uşor recunoscută şi apoi fagocitată de către macrofage, (Dănăilă et al., 1999).

Un eveniment biochimic foarte important, ce se petrece după translocarea fosfatidil-serinei este, cum arătam, fragmentarea ADN-ului nuclear, care face ca moartea celulară prin apoptoză să devină inevitabilă. Fragmentarea nucleului este precedată, aşa cum am precizat în capitolul anterior, de condensarea şi marginalizarea cromatinei. Iniţial se formează fragmente ale fibrei de cromatină de dimensiuni mai

30

mari, de 300 kbp şi 500 kbp şi ulterior fragmente de 180 pb sau multipli ai acestui număr. Fragmentarea fibrei de cromatină şi ADN-ului la locurile de legătură dintre nucleosomi se face prin intervenţia unor endonucleaze ca NUC1, DN-aza I şi DN-aza II prezente în nucleu, enzime activate de Ca2+ şi Mg2+, dar inhibate de Zn2+, sau de unele nucleaze activate de caspaze, cum ar fi CAD (caspase activated DN-ase) sau factorul de fragmentare a ADN de 40 kDa (DFF40), (Jan et al., 2008). Fragmentele ADN pot fi determinate prin metoda TUNEL a grupărilor 3’-OH. Dacă în apoptoză clivarea fibrei de cromatină are loc în fragmente cu un anumit număr de perechi de baze şi duce la păstrarea organizării ei nucleosomale, în necroză această clivare este – cum am arătat deja, întâmplătoare şi determină şi degradarea histonelor. Se consideră totodată că în cursul apoptozei are loc transferul activ din citoplasmă în nucleu a unor proteaze, care determină degradarea unora din proteinele nucleare. În cazul când apoptoza este indusă prin medierea receptorului Fas, în prima fază procesele specifice acestui fenomen se petrec în citoplasmă, de unde se transmite semnalul tanatogen spre nucleu, iar într-o fază ulterioară se produce un semnal tanatogen invers – din nucleu spre citoplasmă (prin molecule semnal). Acest transport nuclear activ ce însoţeşte apoptoza se face cu consum de energie.

S-a observat că în timpul apoptozei devin active unele enzime ca adenozin-

monofosfat-kinaza, creşte cantitatea unor enzime ca: trans-glutaminaza, ribonucleaza, gamma-glutamil-transpeptidaza, catepsina etc. Implicaţiile acestor modificări enzimatice în procesul de apoptoză sunt încă insuficient cunoscute. Ceea ce se ştie totuşi, este faptul că trans-glutaminaza ar avea un rol important la cutarea (încreţirea) membranei plasmatice şi menţinerea integrităţii ei, la împiedicarea dispersiei constituenţilor celulari în spaţiul extracelular, la formarea corpilor apoptotici şi recuonoaşterea lor de către fagocite.

Un rol deosebit în apoptoză par să aibă şi unele protein-kinaze. Tirozin-kinaza, de exemplu, s-ar asocia cu unele proteaze şi ar contribui la inducerea semnalului apoptotic. O altă kinază – PKA (serin-treonin-kinaza), enzimă a cărei activitate este reglată de GTP-ază (guanozin-trifosfatază), este de asemenea implicată în apoptoză, fiind responsabilă de modificările ce se produc la nivelul citoscheletului. Protein-

kinaza B (sau AKT) are şi ea un rol în apoptoză. S-a observat că prezenţa ei în exces în neuroni a crescut rezistenţa acestora la apoptoză. Se pare că această kinază manifestă o acţiune anti-apoptotică certă. Se consideră, de altfel, că în desfăşurarea apoptozei protein-kinazele şi procesul de fosforilare a proteinelor efectoare au un rol deosebit, ele asigurând totodată şi activarea endonucleazelor. O altă enzimă implicată în apoptoză, al cărei rol este insuficient clarificat, este poli-(ADP-ribozil)-polimeraza

(PARP). În multe tipuri de moarte celulară programată s-a semnalat fragmentarea acestei enzime. S-a constatat însă că între fragmentarea PARP şi fragmentarea ADN-ului nu există o legătură certă.

Printre alte modificări biochimice în celulele ce urmează calea apoptotică, s-a observat creşterea cantităţii de beta-tubulină citoplasmatică, proteină necesară în procesul de formare a corpilor apoptotici. Având în vedere că apoptoza se produce cu consum de energie, cu siguranţă ea presupune şi modificări ale metabolismului glucidic celular, care sunt însă puţin studiate şi cunoscute.

Şi unii produşi lipidici au implicaţii în apoptoză. Fosfolipidele sunt mesageri secunzi care iau parte la reglarea activităţii enzimelor implicate în apoptoză:

31

proteinkinaze, fosfataze, proteaze. În supravieţuirea celulei sfingomielina are un rol important. Sfingomielinele sunt fosfolipide prezente în membrana plasmatică, iar degradarea lor se face de către sfingomielinază. Prin intervenţia acestei enzime, semnalul tanatogen din apoptoză determină transformarea sfingomielinei în ceramide (N-acil sfingozine), mesageri pentru efectorii apoptozei. Sfingozina are capacitatea de inhibare a activităţii proteinkinazei-C, enzimă cheie în reglarea procesului de proliferare şi în diferenţierea apoptozei. Sfingozina influenţează agregarea trombocitelor, inhibă coagularea, are efect anticancerigen şi antimicrobian, poate induce apoptoza. Ea ar avea rol dublu: în citosol reglează enzimele ce transmit semnalul apoptozei (fosfokinaze şi proteaze), iar în nucleu favorizează degradarea ADN-ului. În figura 3.1. este redată o schemă reprezentând interacţiunile posibile între calea TNF şi cea a sfingomielinei.

Sunt păreri conform cărora activarea căii sfingomielinice s-ar realiza atât direct, prin acţiunea exercitată de agenţi externi, cât şi prin intermediul receptorilor Fas şi TNF (tumor necrosis factor). În situaţia din urmă ar fi implicate domeniile tanatogene (DD – death domain) ale acestor receptori, astfel încât celula este dirijată spre apoptoză.

Fig. 3.1 - Mecanisme posibile de interacţiune între TNF şi calea sfingomielinei (adaptată de Moldoveanu şi Popescu, 1999 - după Haimovitz-Friedman, 1997).

(SM – sfingomielină; SMN – sfingomielinază neutră; CAPK – kinaza activată de ceramide; FAN – proteina-adaptor la SMN; NSD – domeniul de legătură cu SMN; DD – domeniul morţii; ASM – sfingomielinază acidă; TRADD – proteină asociată domeniului morţii din receptorul 1 al TNF; FADD/MORT1 – proteină cu domeniul morţii asociată Fas; SEK1 – stress kinaza; RAC – subfamilie a familiei RAS).

32

În unele cercetări s-a evidenţiat că în transmiterea semnalului apoptotic ar fi implicat şi sistemul SAPK-JNK (SAPK desemnează protein-kinazele activate de factori de stres; JNK desemnează protein-kinazele c-JUN cu NH-terminal). Sfingomielinaza şi ceramidele determină creşterea cantităţii de SAPK active, urmată de hidroliza JNK – c-JUN, procese cu rol important în apoptoză. Unii factori de stres ca radiaţiile ionizante şi UV, dar şi TNF, proteinele şocului termic, proteinele şocului oxidativ etc, au capacitatea de a genera ceramide şi de a activa sistemul SAPK-JNK. Pe lângă rolul de mesager secundar al căii sfingomielinice de declanşare a apoptozei, ceramidele pot avea şi funcţia de efector direct, fiind implicate în fragmentarea ADN-ului (prin activarea receptorului pentru TNF), modificare tipică în apoptoză, (Dănăilă et al., 1999).

Deşi formarea complexului adaptor TRADD-FADD-FLICE (care primeşte semnale prin receptorii Fas/TNF) determină activarea caspazelor, independent de via activarea ceramidelor, s-a constatat totuşi că eliminarea domeniului tanatogen (DD) al celor doi receptori, precum şi lipsa acestui domeniu la proteinele adaptor FADD/MORT1, inhibă atât inducerea ceramidelor cât şi a apoptozei. Unele cercetări arată că ceramidele se pot constitui în semnale de activare a caspazelor (proteazele ICE-Ced-3), efectorii apoptozei, (Friedman et al., 1997). În legătură cu apoptoza mediată de ceramide se apreciază că deşi ele pot iniţia procesul apoptotic, celulele pot evita intrarea în apoptoză, întrucât de-a lungul acestei căi de semnalizare ar exista o serie de puncte de control în care procesul poate fi blocat. Astfel de puncte sunt cele controlate, de exemplu, de PKC şi Bcl-2. Proteina Bcl-2 exercită acest control în apropierea punctului de „orientare” (commitment) către apoptoză, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

S-a observat de asemenea că fracţiunile oxidate ale lipidelor cu densitate scăzută (LDL) determină producţia în exces a ceramidelor şi acumularea lor în celule. Aceste fracţiuni oxidate ale lipidelor ar avea capacitatea de a induce apoptoza, fie prin intermediul ceramidelor, fie a caspazelor. Chiar şi acizii graşi ar fi capabili să inducă apoptoza, acest proces fiind mijlocit tot de ceramide.

Creşterea concentraţiei de calciu intracelular determină activarea unor enzime hidrolitice, între care şi a proteazelor şi endonucleazelor, despre ale căror implicaţii în apoptoză am discutat anterior. De altfel, se consideră că ionul de calciu ar avea rol important în primele faze ale apoptozei şi că de fapt creşterea cantităţii lui în citosol ar putea declanşa acest proces. Într-o serie de experienţe s-a evidenţiat că zincul ar juca rol de moderator al apoptozei. În condiţiile unor concentraţii ridicate de zinc extracelular (500-1000 µM) este blocată apoptoza, iar la concentraţii mici (80-200 µM) zincul ar putea induce apoptoza. Intervenţia s-ar realiza prin acţiunea ionilor de zinc asupra endonucleazelor, prin inhibiţia sau activarea lor şi implicit a blocării sau activării fragmentării ADN-ului nuclear, (Dănăilă et al., 1999).

4. De ce a fost „inventată” apoptoza? Celulele somatice proliferează folosind ca mecanism mitoza. Totodată,

apoptoza este un proces obişnuit în organismele multicelulare şi serveşte la eliminarea celulelor nedorite sau lezate. Numeroase studii au arătat că în ţesuturile care proliferează există un număr mare de celule care dispar prin apoptoză. Acest proces poate fi observat în diverse zone ale organismului precum celulele criptelor intestinale,

33

în spermatogonii, în centrii nodulilor limfatici, pe parcursul dezvoltării sistemului nervos etc. Este atât de strânsă legătura dintre ciclul celular şi moartea celulară încât unii îşi pun problema dacă apoptoza nu reprezintă o formă aberantă a mitozei, (Brady şi Gil-Gomez, 1999). King şi Cidlowski (1995) au denumit incapacitatea celulei de a progresa în ciclul celular, datorită unei mitoze anormale ce poate duce la moartea celulei – „catastrofă mitotică”. Celulele în cauză manifestă o serie de schimbări morfologice, despre care am discutat deja. Aşa de exemplu, celulele cultivate de mamifere, care sunt supuse catastrofei mitotice, devin ne-adezive, se rotunjesc, volumul celular se reduce, iar cromatina lor se agregă.

Fiind un proces antagonist mitozei, apoptoza se constituie într-un mecanism de reglare a homeostaziei celulare, a raportului mitoză/apoptoză şi implicit a numărului specific de celule dintr-un ţesut. Se consideră că în corpul uman sunt produse prin mitoză cca 100.000 de celule în fiecare secundă şi cam tot atâtea mor prin apoptoză, (Vaux şi Korsmeyer, citaţi de Gewies, 2003). Apoptoza contribuie atât la eliminarea celulelor în exces, cât şi a celulelor care se dezvoltă anormal (care au, de exemplu, material genetic grav alterat şi nereparabil), a unor celule potenţial periculoase (cum ar fi celulele canceroase, celulele autoreactive ale sistemului imun, celulele infectate cu virusuri etc). Prin apoptoză se modelează forma unui organism pluricelular, sau a unor organe ale acestuia. Am amintit anterior că la vertebrate, de exemplu, pe parcursul dezvoltării membrelor apoptoza asigură eliminarea ţesutului mezenchimal interdigital şi contribuie la formarea degetelor (inhibarea morţii acestor celule împiedică şi formarea degetelor). Alte exemple de intervenţie a apoptozei pe parcursul dezvoltării organismelor pot fi: regresia cozii la mormolocul de broască; dispariţia la embrionul de găină a celulelor din partea posterioară a aripii, pentru modelarea ulterioară a aripilor; moartea prin apoptoză a 131 din cele 1090 de celule somatice generate în cursul dezvoltării la viermele nematod hermafrodit Caenorhabditis elegans (al cărui adult numără 959 de celule), moartea celulară masivă care are loc pe parcursul dezvoltării timpurii a sistemului nervos (peste 50% din toţi neuronii mor), dar şi a majorităţii celulelor B şi T (peste 95%) ale sistemului imun pe parcursul maturării lor (Gewies, 2003) etc.

În cazul ţesuturilor somatice adulte la om, apoptoza este implicată în eliminarea celulelor în cursul refacerii ţesutului epitelial, în atrofia prostatei şi a cortexului adrenal datorită insuficienţei hormonului trofic, în atrofia glandei mamare după lactaţie, în eliminarea limfocitelor B sau T la sfârşitul reacţiilor imunologice, în echilibrarea mitozei în ţesuturile epiteliale din sân şi endometru, în înlăturarea polimorfonuclearelor din ţesuturile inflamate după terminarea răspunsului inflamator etc, (Moldoveanu şi Popescu, 1999). Prin apoptoză sunt eliminate şi celulele care au leziuni severe ale ADN-ului ce nu pot fi reparate, celulele autoreactive ale sistemului imun, celulele infectate cu virusuri etc. Unele disfuncţii sau dereglări ale procesului de apoptoză pot conduce la cancer, la boli autoimune şi la răspândirea infecţiilor virale, după cum apoptoza excesivă poate provoca tulburări neuro-degenerative, SIDA şi boli ischemice (Gewies, 2003).

În majoritatea tipurilor de tumori maligne cunoscute s-a semnalat prezenţa apoptozei spontane, fără a se putea efectua aprecieri de ordin cantitativ (în cancer proliferarea celulară fiind un proces mult mai intens decât cel de apoptoză). S-a constatat totuşi că genele supresoare de tumori şi produşii acestora au capacitatea de a

34

induce apoptoza. Unele dintre aceste gene au atât capacitatea de a induce cancerul cât şi apoptoza, tipică în acest sens fiind oncogena c-myc. Sunt şi situaţii în care apoptoza poate fi alterată sau încetinită, cum ar fi unele boli neuro-degenerative, hepatita, cardiopatia ischemică sau degenerativă, infecţia cu HIV etc, ceea ce duce la tulburări funcţionale importante ale unor ţesuturi. Prin urmare, dereglarea procesului de apoptoză, fie în sensul intensificării lui (bolile neuro-degenerative şi hematologice), fie a inhibării acestuia (procesele tumorale), poate duce la stări patologice.

Cum se face că o celulă, care uneori aparţine unui grup de celule foarte asemănătoare cu ea, intră în apoptoză? Se apreciază că în cazul mamiferelor fenomenul s-ar datora:

- lipsei unor stimuli externi care asigură supravieţuirea; - prezenţei unor stimuli care determină apoptoza; - dereglării unor mecanisme prin care celula îşi poate repara unele leziuni

apărute la nivelul organitelor celulare sau a materialului nuclear, (Raff, citat de Dănăilă et al., 1999).

Potrivit unor cercetări, pentru supravieţuire, celulele au nevoie de factori de creştere (substanţe cu rol de hormoni trofici), pentru care ar exista o competiţie între celule şi în lipsa cărora celula poate intra în apoptoză. Ritmul de producere a acestor factori trofici într-un ţesut influenţează raportul mitoză/apoptoză şi implicit numărul optim de celule în ţesutul respectiv. S-a constatat, de exemplu, că în culturi de celule endometriale de şoarece sunt secretaţi în mod ciclic fie factori care controlează diviziunea celulară, fie factori ce controlează apoptoza, raportul dintre ei determinând oscilaţii zilnice ale numărului de celule în jurul unei valori care este relativ constantă pe termen lung, (Lynch, citat de Dănăilă et al., 1999). Homeostazia unor ţesuturi şi celule, cum ar fi celulele ţesutului hematopoietic, ale cortexului suprarenal, celulele epiteliale ale prostatei, celulele neuronale în timpul dezvoltării lor etc, ar fi asigurată de semnalele transmise de factorii trofici sau de cei ce declanşează apoptoza, nefiind încă clar dacă aceşti factori au specificitate de ţesut sau ei sunt asemănători în întregul organism. Comunicarea dintre celule prin intermediul mesagerilor chimici extracelulari, a unor stimuli mecanici proveniţi din citoschelet etc, ar juca un rol foarte important în decizia unei celule de a intra în apoptoză.

Apoptoza spontană este întâlnită şi în tumorile maligne, în special în jurul zonelor de necroză, factorii inductori fiind diverşi şi insuficient elucidaţi. Intrarea în apoptoză a unor celule tumorale poate fi un proces intrinsec acestora (activarea unor antioncogene), poate fi datorată factorului de necroză a tumorilor - TNF (citokină secretată de macrofagele activate), atacului limfocitelor T asupra acestor celule, poate fi indusă prin tratamentele chimioterapice etc, (Dănăilă et al., 1999).

5. Factori care induc şi care inhibă apoptoza 5.1. Factori care induc apoptoza Din cele prezentate anterior am reţinut faptul că apoptoza unor celule este un

fenomen fiziologic normal, care contribuie la homeostazia ţesuturilor, la modelarea acestora şi a organismelor vii, potrivit unor instrucţiuni (semnale) provenite din interiorul celulei, dar şi din exteriorul ei (de la celulele învecinate). Apoptoza însă poate fi declanşată şi sub acţiunea unor agenţi externi de natură fizică şi chimică, care provoacă în special alterări ale materialului genetic şi indirect modificări ale

35

proceselor biochimice celulare (nu se ştie dacă apoptoza ar putea fi indusă de agenţii externi şi prin acţiunea lor directă asupra proceselor biochimice din celule). Se pare că şi în această situaţie decizia intrării în apoptoză a unei celule se ia tot pe baza semnalelor primite de la celulele învecinate, care au fost probabil „avizate” de leziunile provocate materialului genetic al celulei în cauză, (Dănăilă et al., 1999). Gama factorilor fizici, chimici şi biologici care pot induce apoptoza este variată: radiaţiile ionizante şi neionizante, hipertermia, câmpurile electromagnetice de frecvenţă joasă, hipoxia, substanţele chimioterapice (metothrexatul, ciclosporina A, vincristina, cisplatina, majoritatea citostaticelor), medicamentele citotoxice, hormonii, interferonul, retinoizii, virusurile, unii anticorpi, limfocitele citotoxice etc. Se consideră că inducţia apoptozei de către unii din factorii amintiţi depinde în mare măsură de capacitatea lor de a influenţa activitatea genelor p53 şi bcl-2. În continuare vom discuta pe scurt acţiunea apoptotică a unora dintre aceşti factori.

Radiaţiile ionizante şi neionizante. S-a constatat că radiaţiile ionizante, în doze mici şi moderate (care nu periclitează supravieţuirea celulelor), se constituie într-un fel de trigeri (declanşatori) efectori ai apoptozei prin schimbările induse la nivelul ADN-ului celular. Se apreciază că produşii genelor p53 (care au rol de monitorizare a integrităţii genomului celular) determină (la concentraţii ridicate) oprirea ciclului celular în G1, procurând un timp mai îndelungat de intervenţie a proceselor de reparaţie a ADN-ului lezat, iar în cazul în care aceste leziuni nu pot fi înlăturate, produşii genelor p53 declanşează apoptoza. Existenţa unui astfel de mecanism a fost demonstrat în unele experienţe. Astfel, timocitele a căror gene p53 au fost blocate, au rezistat la doze letale de iradiere, iar deblocarea acestor gene a determinat redobândirea capacităţii de apoptoză sub influenţa radiaţiilor. S-a observat de asemenea că o concentraţie sporită de produşi ai genelor p53 a indus apoptoza în tumorile derivate din timocite (Clarcke et al., 1993 şi Yonish-Rouach et al., 1991 – citaţi după Dănăilă et al., 1999). Intrarea în apoptoză în urma iradierii depinde şi de rata de proliferare specifică celulelor unui ţesut, care creşte odată cu această rată (cazul celulelor din criptele intestinale, ale celor din ţesutul spermatic sau al limfocitelor), deşi sunt situaţii în care radiaţiile induc o frecvenţă ridicată a apoptozei fără să existe o asemenea legătură (cazul celulelor din glandele salivare sau lacrimale). În cazul iradierii terapeutice, frecvenţa apoptozei diferă de la o tumoră la alta şi nu există o relaţie directă între radiosensibilitatea tumorii şi nivelul apoptozei.

Şi radiaţiile neionizante (ultraviolete) au capacitatea de a induce apoptoza în ţesuturile sau celulele care vin în contact direct cu acest tip de radiaţii. Potrivit unor informaţii prezentate de Dănăilă et al. (1999), prin iradierea UV a unei culturi de polimorfonucleare timp de 15 minute s-a indus moartea prin apoptoză a cca 70-90% din celule în interval de 4 ore de la iradiere. S-a constatat de asemenea că iradierea UV a unei culturi de celule leucemice a indus dispariţia prin apoptoză a cca 50% din celule datorită alterării materialului nuclear, restul de celule afectate de acest fenomen având ca mecanism activarea caspazei-3. Aşa cum se ştie, radiaţiile UV au capacitatea de a produce dimeri pirimidinici la nivelul ADN, blocând transcripţia şi translaţia ADN şi probabil astfel se explică intrarea în apoptoză a celulelor afectate.

Hipertermia. S-a observat că tratamentele hipertermice moderate au calitatea de

a induce apoptoza, deşi mecanismul de acţiune rămâne obscur. Valoarea

36

temperaturilor la care se înregistrează un nivel ridicat al apoptozei depinde de la un ţesut la altul, frecvenţa apoptozei fiind mai înaltă în cazul ţesuturilor cu proliferare înaltă (ţesuturile limfoide şi tumorale, de exemplu). Ţesuturile supuse acţiunii unor agenţi fizici (inclusiv hipertermiei) prezintă un nivel crescut al proteinei Bax (pro-apoptotică).

Hipoxia. Hipoxia este un factor care poate induce atât apoptoza cât şi necroza

celulelor. Hipoxia însoţeşte frecvent tumorile care depăşesc dimensiunea de 1-2 mm. Apoptoza apare ca fenomen cert în celulele tumorale hipoxice, dar hipoxia poate fi un factor care induce apoptoza şi în celulele normale. S-a observat că inactivarea genei p53 sau prezenţa în exces a proteinei Bcl-2 reduce frecvenţa de intrare în apoptoză a celulelor în caz de hipoxie. În zonele ischemice ale miocardului apoptoza indusă de hipoxie apare ca un factor distructiv, întrucât contribuie la eliminarea unor miocite, în timp ce distrugerea prin apoptoză a unor celule tumorale datorită hipoxiei în unele forme de cancer solid apare ca un mecanism de acţiune antitumorală al organismului, (Dănăilă et al., 1999).

Radicalii liberi. Nivelul radicalilor liberi din celulă interferează cu apoptoza.

Potenţialul redox din celulă influenţează activitatea unor factori de transcripţie. Investigaţiile in vitro pe culturi de celule animale au arătat că speciile reactive de

oxigen (ROS) pot induce apoptoza, după cum unii antioxidanţi pot bloca acest proces. ROS pot provoca peroxidarea lipidelor, pot induce leziuni unor macromolecule (inclusiv ADN-ului), pot inactiva unele enzime, cu toate consecinţele ce decurg din aceste reacţii. Dacă unele din aceste leziuni nu pot fi anulate prin intervenţia sistemelor reparatorii din celulă, atunci celula poate urma calea apoptotică. Speciile reactive ale oxigenului (radicalul superoxid, apa oxigenată, radicalul oxidril activ etc) au rol important în controlul unor procese biologice (pot activa expresia unor gene, pot influenţa răspunsul la citokine şi proliferarea celulelor etc), de unde ideea că ele ar putea exercita rolul de molecule semnal în anumite condiţii fiziologice, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

Prezentăm în continuare unele din sistemele reparatorii ale leziunilor oxidative din celulă, ale căror dereglare poate induce apoptoza: - Tioredoxina (TRX). Tioredoxinele sunt proteine redox de dimensiuni mici (12 kDa) prezente în toate organismele vii (bacterii, plante, mamifere etc). TRX este o oxido-reductază cu funcţii antioxidante, care are în structura ei un motiv CXXC (cu două cisteine învecinate), cele două resturi de cisteină conferindu-i capacitatea de a reduce alte proteine. Enzima are numeroase substraturi, printre care şi ribonucleaza, factori de coagulare, corion-gonadotropine, receptorul gluco-corticoid şi insulina. Plantele dispun de un complex de şase tioredoxine, prezente în diverse compartimente celulare. Împreună cu metionin-sulfoxid-reductaza, TRX reactivează proteinele în care au fost oxidate resturile de metionină. Inactivarea tioredoxinei (prin oxidarea grupărilor –SH din molecula ei) poate duce la creşterea concentraţiei calciului în celulă (ROS pot ataca unul din resturile de metionină de la capătul C-terminal al calmodulinei şi astfel să modifice pierderea capacităţii de activare a ATP-azei Ca2+

membranare). Or, dereglarea homeostaziei calciului în celulă poate determina activarea unor enzime (fosfolipaze, proteaze, transaminaze, endonucleaze etc), cu

37

consecinţele ce decurg de aici. TRX este implicată şi în reglarea unor molecule redox-sensibile, printre care NF-kB (factorul nuclear kappa-B), AP1 (activator protein-1) şi receptorul gluco-corticoid. Activarea NF-kB (asigurată prin fosforilarea subunităţii IkB din componenţa sa, la intervenţia unei tirozin-kinaze) determină migrarea lui în nucleu, unde se leagă de o secvenţă (kappa-B) a ADN-ului. În realizarea acestei legături (ADN-NF-kB) intervine TRX şi proteina Ref-1 (factorul redox 1), care asigură reducerea restului de cisteină din structura NF-kB. Translocarea în nucleu a NF-kB este facilitată de intervenţia agenţilor oxidanţi, iar legarea lui la ADN necesită agenţi antioxidanţi. O serie de argumente arată că activarea factorului NF-kB se află sub controlul statutului redox: activarea lui directă de către apa oxigenată şi peroxizii organici; activarea lui ca răspuns la acţiunea unor agenţi citotoxici (care poate fi blocată de antioxidanţi); inhibarea activării acestuia de către un număr mare de antioxidanţi etc. S-a constatat că însăşi funcţia proteinei p53 poate fi reglată de către antioxidanţi şi ioni metalici, (Moldoveanu şi Popescu, 1999). Faptul că tioredoxinele se pot deplasa dintr-o celulă în alta sugerează că ele ar putea fi implicate în fenomenul de comunicare la plante; - poli-(ADP-ribozil)-polimeraza (PARP) este o enzimă prezentă în nucleul celulelor, cu rol în procesele de excizie şi reparaţie ale ADN-ului. Enzima prezintă mai multe regiuni (domenii): un domeniu de legare la ADN, unul clivat de caspază, un altul de auto-modificare şi un domeniu catalitic. Ea se activează ca răspuns la rupturi monocatenare (RM) induse ADN-ului de factori metabolici, chimici sau fizici şi le semnalează sistemelor enzimatice implicate în reparaţia lor. În prezenţa unei astfel de leziuni ADN, domeniul de legare ADN al PARP se leagă la ADN şi determină sinteza unui lanţ de poly-(ADP)-riboză (PAR), acţiune de care este responsabil domeniul catalitic al enzimei. PAR reprezintă un semnal pentru intervenţia enzimelor de reparaţie a ADN-ului lezat. Domeniul de modificare al PARP asigură eliberarea proteinei PARP de ADN după cataliză. După reparaţia ADN, are loc şi degradarea lanţurilor PAR de către glicohidrolază. Această enzimă poate fi activată prin acţiunea ROS, care induc desfacerea helixului de ADN. Dacă ADN-ul nu poate fi reparat, intervine apopaina (caspaza-3) ce degradează PARP, iar degradarea PARP activează la rându-i endonucleaze specifice care vor determina apoptoza celulei; - prezenţa NO. S-a constatat că NO, care poate avea fie efect cito-toxic, fie cito-protector (funcţie, se pare, de tipul de celulă), poate induce în unele ţesuturi apoptoza, iar în altele s-o blocheze. NO poate inactiva unele enzime din mitocondrii, în special cele care conţin Fe, S şi grupări tiolice în moleculă. Or, inactivarea enzimelor cu Fe şi S poate conduce la eliberarea Fe, care poate participa la reacţia Fenton (care reprezintă cataliza de către Fe a peroxidului de hidrogen cu formarea de radicali liberi hidroxil; reacţie folosită practic în tratarea unor poluanţi acvatici precum fenolii, formaldehida, unele pesticide etc), din care rezultă radicali liberi oxidril. NO poate concura cu oxigenul în legarea la centrul activ al citocrom-oxidazei, ceea ce conduce la reducerea energiei în mitocondrii şi la eliberarea calciului (despre a cărei consecinţă am mai discutat). NO poate inhiba glicoliza şi metabolismul energetic din mitocondrii, ceea ce atrage moartea celulei datorită depleţiei ATP. NO poate inhiba şi sinteza ADN-ului (prin inhibarea ribonucleotid-reductazei) şi în acest fel contribuie la moartea celulară. Proteina Bcl-2 are calitatea de a proteja celula de apoptoza indusă de NO. De altfel, unii consideră că NO ar fi moleculă semnal pentru expresia proteinei Bcl-2. În investigaţii efectuate pe

38

culturi de hepatocite s-a arătat că NO ar bloca activarea caspazei-3 (şi astfel ar preveni apoptoza), fie prin S-nitrozilarea ei, fie prin intermediul guanozin-monofosfatului ciclic (GMPc), (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

Chimioterapicele. Este un fapt cert că apoptoza poate fi indusă de unele

substanţe anticanceroase cum ar fi tamoxifenul şi gluco-corticoizii, după cum este posibil ca şi alte substanţe precum metothrexatul, vinblastina, etopozida, cisplatina etc, care determină apoptoza in vitro, să aibă această calitate şi in vivo. Mecanismul prin care induc apoptoza aceste substanţe este neclar, dar se consideră că ele şi-ar exercita acest efect prin influenţarea genelor bcl-2 şi p53. S-a observat că stimularea sintezei de produşi specifici genei p53 creşte receptivitatea celulelor tumorale pentru substanţele citotoxice, după cum pierderea sau deficienţa funcţiei acestei gene sporeşte rezistenţa acestor celule la chimioterapice. Un rol asemănător ar avea şi gena bcl-2 prin produşii ei specifici. Se pare că genele care induc apoptoza sunt capabile pe de o parte să genereze cancerul, iar pe de altă parte să inducă rezistenţa la terapia anticanceroasă. Diminuarea în timp a eficienţei unor substanţe în terapia cancerului pare să fie legată de activarea unor gene anti-apoptotice (cum ar de exemplu bcl-2), după cum mutaţia genei p53 poate de asemenea să determine ineficienţa sau eficienţa parţială a unor chimioterapice, (Dănăilă et al., 1999).

Hormonii. Modul cum influenţează hormonii procesul de apoptoză este mai

puţin cunoscut. S-a observat că în cazul atrofiei unor glande precum prostata şi glandele suprarenale apoptoza are rolul ei. Gluco-corticoizii au capacitatea de a induce apoptoza în timocite şi în celulele limfoamelor maligne. Mecanismul de acţiune pare a fi legat tot de activitatea genei bcl-2.

Factorii de necroză a tumorilor (TNF) şi de creştere a nervilor (NGF) TNF este o citokină secretată de macrofagele active, care-şi exercită acţiunea

prin intermediul a doi receptori aflaţi pe suprafaţa celulelor, receptori care au greutate moleculară diferită (75 şi respectiv 55 kDa). Legarea TNF de aceşti receptori declanşează, în anumite condiţii, o serie de procese celulare care se pot finaliza cu intrarea în apoptoză a celulei. TNF are un rol important în distrugerea celulelor tumorale şi a altor tipuri de celule.

NGF este o citokină importantă pentru creşterea, menţinerea şi supravieţuirea unor neuroni ţintă. Receptorii lui sunt situaţi pe suprafaţa unor celule, inclusiv a celulelor nervoase. NGF este un factor critic pentru supravieţuirea şi întreţinerea neuronilor simpatici şi senzitivi, în lipsa acestui factor ei fiind supuşi apoptozei. Se consideră că şi NGF poate induce apoptoza, condiţiile şi mecanismul prin care realizează acest proces fiind încă insuficient cunoscute. NGF ar juca un anume rol în unele boli cardiovasculare (ateroscleroză, obezitate, diabetul de tip 2, sindromul metabolic), dar şi într-o serie de tulburări psihiatrice (demenţa, depresia, schizofrenia, autismul, anorexia nervoasă etc).

Anticorpii anti-antigenului Fas. Receptorul Fas (APO-1 sau CD95) face parte

dintr-o mare familie de proteine (în care intră şi TNF, NGF, unii receptori limfocitari

39

ca CD27, CD30, CD40), fiind o proteină trans-membranară receptor care poate induce apoptoza.

Retinoizii. Retinoizii sunt derivaţi ai vitaminei A, care au rol important în

creşterea, diferenţierea şi dezvoltarea unor ţesuturi, care pot manifesta însă activitate anticancerigenă şi declanşa apoptoza în diverse tipuri de celule canceroase, această acţiune fiind legată se pare de activitatea caspazelor.

Limfocitele citotoxice. În cercetări efectuate pe culturi celulare s-a constatat că

unele celule ca limfocitele T citotoxice, celulele NK (Natural Killer) şi celulele K (Killer) pot induce apoptoza în celulele ţintă. Un exemplu de acest gen îl reprezintă distrugerea de către limfocitele T citotoxice a celulelor infectate cu virusuri. S-a constatat de asemenea că substanţele care inhibă expresia genei bcl-2 nu inhibă apoptoza provocată de limfocitele T citotoxice.

Infecţiile virale. S-a observat că unele infecţii virale (în special infecţia cu HIV)

determină un nivel mai ridicat al apoptozei limfocitelor T neinfectate, reducerea numărului limfocitelor activate şi diminuarea reacţiei imune.

Matrixul extracelular. Contactul (adeziunea) cu matrixul extracelular are un rol

foarte important pentru evoluţia normală, pentru creşterea, supravieţuirea şi dezvoltarea a numeroase celule. Acest contact este asigurat de molecule speciale denumite integrine, prezente la suprafaţa acestor celule (blocarea acestor molecule cu ajutorul peptidelor determină pierderea aderenţei celulelor şi intrarea lor în apoptoză). Aceste integrine ar transmite totodată semnale specifice în interiorul celulei. Lipsa contactului unor celule la matrixul extracelular, poate determina blocarea ciclului de diviziune sau intrarea în apoptoză a celulelor în cauză. S-a constatat, de exemplu, că pierderea contactului cu matrixul extracelular face ca fibroblastele primare să aibă o sinteză redusă a proteinelor, iar ciclul lor celular să se blocheze în G1, după cum celulele endoteliale şi epiteliale primare aflate în această situaţie să intre rapid în apoptoză (degradarea matrixului extracelular face, de exemplu, ca în cursul involuţiei glandei mamare celulele epiteliului mamar să intre în apoptoză). O caracteristică a celulelor tumorale este aceea că ele nu intră în apoptoză în urma detaşării lor de matrixul extracelular. În acest caz, apoptoza s-ar realiza prin intermediul produşilor genelor p53 sau bcl-2, (Dănăilă et al., 1999).

5.2. Factori care inhibă apoptoza Potrivit datelor furnizate de Thompson (citat după Dănăilă et al., 1999) printre

inhibitorii apoptozei figurează: a) factori fiziologici: factori de creştere, matrixul extracelular, ligandul CD-40,

aminoacizi neutri, zincul, hormonii estrogeni şi androgeni; b) factori farmacologici: inhibitori ai cistein-proteazelor, inhibitori ai calpainei,

promotori tumorali; c) gene virale: E1B (de la adenovirusuri), p35 şi IAP (de la baculovirusuri),

CrmA (de la virusul variolei), LMW5-HL (de la virusul febrei suine africane) etc.

40

Un mecanism eficient de apărare a organismelor pluricelulare împotriva infecţiilor virale îl reprezintă apoptoza, proces care asigură odată cu moartea celulei şi moartea virusului, evitându-se astfel propagarea infecţiei. Cum se ştie, virusurile au capacitatea de a subordona procesele celulare pentru reproducerea lor, iar pentru supravieţuirea lor este necesară şi supravieţuirea celulelor infectate şi deci evitarea apoptozei de către acestea. Virusurile au dezvoltat diverse strategii pentru inhibarea morţii celulare şi a eliberării de citokine pro-inflamatorii de către celulele infectate înainte de a-şi realiza ciclul de replicare şi a fi astfel capabili de a infecta alte celule. În acest scop, unele virusuri au capacitatea de a sintetiza proteine care pot inhiba apoptoza celulelor infectate. Exemple de acest gen sunt reprezentate de: proteina virală FLICE, care împiedică transmiterea semnalului de transducţie către enzimele efectoare ale apoptozei; proteina E1B19K (de la adenovirusuri) care, pentru a bloca semnalul pro-apoptotic al proteinei celulare Bax, interacţionează cu aceasta; baculovirusurile (virusuri specifice insectelor) produc unele proteine cum sunt p35 şi IAP, care inhibă caspazele (enzime efectoare ale apoptozei). S-a observat de asemenea că unele polizaharide (LPS) produse de bacterii pot inhiba apoptoza (în culturile de monocite, de exemplu), (Dănăilă et al., 1999).

Schimbările provocate unor factori de transcripţie necesari apoptozei, prin mutaţia genelor specifice (cum ar fi gena myc sau NUR77), pot inhiba apoptoza. Sunt situaţii în care, prin stimularea receptorului TNF, nu are loc activarea caspazelor, ci activarea factorului de transcripţie Nf-kB. Există de asemenea unele peptide care pot bloca receptorii Fas şi TNF şi inhiba în acest fel apoptoza.

Proteinele p35 şi crmA. Proteina p35 este cunoscută pentru efectele ei anti-

apoptotice şi antioxidante (SAHDEV et al., 2010), fiind codificată de o genă specifică baculovirusului, AcMNPv. Această proteină este un inhibitor al MCP la diverse specii de animale (insecte, nematode, mamifere), ceea ce sugerează că interacţionează cu un component conservat evolutiv al maşinăriei morţii celulare, (Hay et al., 1994; Beidler et al., 1995; Xue şi Horvitz, 1995). Proteina p35 are efect inhibitor asupra apoptozei indusă prin Fas şi TNF şi blochează clivarea proteolitică (indusă pe calea Fas sau TNF) a proteinei PARP (de la forma ei nativă de 116 kDa, la forma specifică apoptozei de 85 kDa), (Beidler et al., 1995). Proteina este capabilă să se lege la caspaze, să le cliveze şi inactiveze, fiind un inhibitor eficient al caspazelor -1 la -8 (FAN et al. 2005), dar nu are efect inhibitor asupra granzimei B. Există preocupări de a utiliza capacitatea de reglare a apoptozei şi pe cea antioxidantă a proteinei p35 în scop terapeutic. În combinaţie cu unele medicamente anticancer, ea ar putea să reducă rezistenţa celulelor tumorale şi să prelungească acţiunea citotoxică a acestora, (Sahdev et al., 2010). Hisahara et al. (2000) au obţinut şoareci transgenici care exprimă proteina p35 în oligodendrocite şi au constatat că acestea sunt rezistente la apoptoza indusă prin TNFα, anticorpi anti-Fas şi interferon gamma, iar şoarecii respectivi s-au dovedit rezistenţi la encefalomielita autoimună indusă experimental cu mielin-glicoproteină.

Proteina crmA este o serpină (inhibitor de serin-proteaze), produs al virusului cowpox (CPV). Poxvirusurile sunt virusuri mari cu ADN dublucatenar, care se replică în citoplasma celulelor gazdă şi sintetizează proteine care deviază răspunsul imun al gazdei, (Nathaniel et al., 2004). Proteina crmA are efect inhibitor asupra inflamaţiei şi

41

a recrutării macrofagelor la locul infecţiilor. Exprimarea ei în exces inhibă apoptoza indusă de lipsa factorului de creştere, a CD95 sau TNF. Proteina crmA este un inhibitor puternic al caspazelor-1 şi -8 şi mai slab al caspazelor -3 şi -6. Proteinele p35 şi crmA sunt inhibitori competitivi. Odată clivate de o caspază, ele se vor lega la aceste enzime şi vor împiedica astfel degradarea de noi substraturi, (Ricci, 2002).

Proteinele FLIP, E8, MC159 şi MC60. Aşa cum, vom prezenta mai pe larg într-

un alt capitol, există o familie de receptori specializaţi în inducerea apoptozei – receptorii morţii (DR). Stimularea acestora duce la recrutarea de molecule adaptoare urmată de clivajul zimogenului caspazelor iniţiatoare (caspazele -8 şi -10) şi în final activarea caspazelor efectoare. Etapa de recrutare poate fi reglată de proteina FLIP (FLICE inhibitory protein) care conţine două domenii efectoare ale morţii celulare (DED – death efector domain), care-i permit să se lege la pro-domeniile caspazelor-8 sau -10 şi astfel împiedică recrutarea lor la receptorii morţii (în special Fas şi TNF-R1). Transcripturile FLIP au o mare varietate. Ele pot avea efect pro- sau anti-apoptotic funcţie de natura transcriptului (tipul de proteină FLIP), de tipul celular în cauză şi de nivelul de expresie a fiecărei izoforme (Ricci, 2002). În condiţii fiziologice, FLIP pare să funcţioneze ca inhibitor al pro-caspazei-8. Proteina E8 (provenită de la virusul herpetic ecvin de tip II), precum şi proteinele MC159 şi M160 (provenite de la virusul Molluscum contagiosum) au o strategie asemănătoare cu FLIP în a inhiba apoptoza, având două domenii DED, care asigură inhibarea recrutării pro-caspazelor -8 şi -10 la receptorii lor, (Ricci, 2002).

Proteinele din familia Bcl-2. Această mare familie de proteine omoloage,

despre care vom discuta în detaliu în alt capitol, joacă un rol major în reglarea apoptozei, mai cu seamă prin modularea activităţii unor caspaze, în special a caspazei-9. Aşa de exemplu, Bcl-2 şi Bcl-XL, împiedică eliberarea citocromului c din mitocondrii şi astfel inhibă formarea complexului proteic Apaf-1/cyt.c/caspaza-9 necesar inducerii apoptozei.

Genele/proteinele IAP

Proteinele IAP. Au fost identificate prima dată în celulele de insecte infectate de baculovirus. IAP (inhibitory of apoptosis protein) pot inhiba apoptoza în celulele gazdă infectate. Această familie de proteine include la mamifere mai mulţi membri şi anume: cIAP1, cIAP2, XIAP (X-linked mammalian inhibitory of apoptosis protein), NAIP (neuronal apoptosis inhibitory protein), survivina şi livina. Cu excepţia survivinei, proteinele IAP prezintă 3 domenii BIR (baculovirus IAP repeats) în porţiunea lor N-terminală şi un domeniu conservativ C-terminal, RING (really interesting new gene). Survivina conţine doar domeniile BIR, care sunt structuri zinc finger-like, care pot chela ionii de zinc. Aceste structuri se pot lega la caspaze, blocându-le activitatea. Nu toate proteinele care conţin BIR pot inhiba apoptoza. Survivina conţine numai un domeniu BIR şi pare mai degrabă a fi un regulator al mitozei decât al apoptozei. Domeniul RING are activitate de catalizare a ubiquitin- ligazei E3. Se consideră că el ar facilita degradarea caspazei care se leagă la IAP, (FAN et al., 2005). Unele din aceste proteine IAP ar fi capabile să inducă activarea factorului NF-kB, care ar contribui la efectul protector de inducere a apoptozei prin factorul TNFα. Este

42

interesant că proteina Smac/DIABLO (descoperită în 2000 de Verhagen et al., şi respectiv de Du et al., de aici şi cele două nume diferite), după ce se sintetizează este importată în mitocondrii. În timpul apoptozei această proteină este eliberată din spaţiul intermembranar mitocondrial şi se leagă de proteinele IAP, cărora le anulează efectul inhibitor asupra caspazelor. În acest fel caspazele din apoptosom se activează şi pot realiza apoptoza. Proteina Diablo/Smac este abundentă în inimă, ficat şi testicule şi în cantităţi mici în alte ţesuturi, (Ricci, 2002). Este posibil ca proteinele IAP să aibe şi alte funcţii decât inhibarea caspazelor. Vom reveni asupra proteinelor IAP în capitolul referitor la implicarea lor în reglarea apotozei.

Fosforilarea. O serie de cercetări au arătat că apoptoza poate fi reglată şi prin intervenţia

protein-kinazelor şi protein-fosfatazelor. În experienţe in vitro s-a evidenţiat faptul că fosforilarea caspazelor poate afecta activitatea lor enzimatică. S-a observat de asemenea că defosforilarea caspazelor s-a corelat cu o capacitate sporită a lor de a cliva PARP, ceea ce ar însemna că fosforilarea lor le-ar putea inhiba capacitatea de a cliva substraturi specifice. S-a observat de asemenea că kinaza Akt poate fosforila şi inactiva procaspaza-9 umană, dar s-a dovedit incapabilă să fosforileze caspazele 3, 6 şi 7. Nu este încă prea clară natura kinazelor responsbaile de fosforilare şi nici rolul fiziologic al fosforilării caspazelor, (Ricci, 2002).

Prin fosforilare pot fi reglate şi unele proteine din familia Bcl-2. Exemple de acest gen sunt proteinele Bcl-2 şi Bad, a căror reglare este investigată şi speculată în vederea dezvoltării de medicamente specifice. Pentru Bcl-2 există 3 locuri de fosforilare pentru reglarea ei: ser-17, ser-70 şi thr-56. Taxolul este unul din drogurile care induce fosforilarea Bcl-2 la mai multe resturi aminoacil, între care şi ser-17, şi inhibă funcţia anti-apoptotică a acesteia. În cazul Bad, care este o proteină pro-apoptotică, fosforilarea la resturile ser-112, ser-136 sau ser-155 inhibă funcţia acesteia. Ea este fosforilată la ser-136 de către Akt, iar la ser-112 de către PKC. Fosforilarea la ser-155 previne capacitatea Bad de a se lega la Bcl-xL şi Bcl-2. Căile de defosforilare a Bad intensifică activitatea ei şi promovează apoptoza, (Schimmer et al., 2005).

Apoptoza independentă de caspaze. Folosind inhibitori specifici pentru caspaze, s-a constatat că unele celule mor

prin mecanisme care nu implică aceste proteaze. Inhibitorul general al caspazelor zVAD-fmk s-a dovedit incapabil să împiedice moartea celulară indusă de proteinele Bax. S-a observat că o serie de stimuli cum ar fi privarea de ser, expresia în exces a oncogenelor myc şi E1A, a proteinelor Bak, leziunile ADN etc, pot provoca moartea celulară, care nu poate fi blocată de către inhibitori ai caspazelor. În aceste situaţii celulele mor printr-un proces ce seamănă cu necroza, fără a prezenta modificările nucleare specifice apoptozei, deşi înmugurirea membranei plasmatice a celulelor seamănă cu cea observată în apoptoză, (Ricci, 2002).

6. Fazele apoptozei

În cadrul ciclului celular, o celulă poate avea trei opţiuni: a) să rămână în stadiul G0, situaţie în care ea nici nu proliferează, dar nici nu

urmează apoptoza;

43

b) să prolifereze, parcurgând stadiile ciclului mitotic (G0 → G1 → S → G2 → Mitoza);

c) să intre în moarte celulară, fie programată (G0 → D1 → F → D2 → fragmentare celulară apoptotică), fie neprogramată (necroză), [D1 reprezintă perioada în care sunt activate gene a căror expresie asigură fragmentarea ADN; F = fragmentarea ADN; D2 reprezintă perioada în care celula însăşi se fragmentează în corpi apoptotici], (fig. 6.1).

Fig. 6.1 - Schemă privind desfăşurarea ciclului celular în care sunt ilustrate opţiunile unei celule aflată în faza G0, (după Petruşca et al.)

Declanşarea procesului de apoptoză are loc, aşa cum a reieşit din informaţiile

prezentate anterior, la intervenţia unor factori din mediul intern al celulei, din mediul extracelular şi din afara organismului, factori care se constituie în semnale pentru structurile efectoare ale apoptozei. În funcţie de modificările care se produc în celulele care intră în apoptoză, s-au delimitat mai multe faze ale acestui proces: faza de iniţiere, faza de decizie, faza de execuţie şi faza de eliminare, (fig. 6. 2).

Fig. 6. 2 - Desfăşurarea apoptozei pe faze (după Thompson, citat de Dănăilă et al., 1999)

Faza de iniţiere (de activare)

Iniţierea apoptozei se poate datora unor factori din mediul intern sau extern al celulei, care pot influenţa activitatea unor receptori specifici ca Fas, receptorul pentru TNF, receptorul purinergic P22. Dintre stimulii interni, cel mai important rol pare să-l aibă leziunile induse ADN de către unii agenţi externi, dar şi unele modificări accidentale produse la nivelul ADN în cursul diviziunii celulare. În cazul apoptozei,

44

decizia de a urma calea apoptotică sau de a relua ciclul mitotic (dacă reparaţia ADN-ului este compatibilă cu supravieţuirea celulară) revine celulei în cauză, în timp ce decizia de a intra în necroză nu mai depinde de celula în cauză, ci de distrugerile majore provocate celulei de factorii externi. Se pare că intrarea în apoptoză a celulelor depinde de prezenţa sau absenţa unor molecule represor pentru acest proces.

Faza de decizie

După iniţierea apoptozei apar semnale moleculare (mesageri) de transducţie către structuri ţintă din celulă, în special către nucleu şi citoschelet. În această categorie sunt incluse ceramidele, diacil-glicerolul, sau alţi compuşi alternativi cu rol de semnal de transducţie cum ar fi inositol-trifosfatul sau unele kinaze celulare. O altă modalitate ar fi constituită de activarea receptorului P22 (de pe membrane) care s-ar solda cu apariţia unui por membranar prin care sporeşte aportul de calciu. Pe toate aceste căi ar avea loc în final activarea endonucleazelor şi declanşarea apoptozei, (Dănăilă et al., 1999). Totodată, sub acţiunea radiaţiilor ionizante, a citostaticelor etc, se produce hidroliza unor proteine specifice membranei celulare (sfingomielina, fosfatidilcolina), cu obţinerea de ceramide şi diacil-glicerol, compuşi cu efect apoptotic cert.

Apoptoza se află totuşi sub controlul unor gene specifice. La viermele nematod Caenorhabditis elegans au fost descoperite 3 gene (ced-3, ced-4 şi ced-9) ale căror produşi controlează apoptoza: proteinele Ced-3 şi Ced-4 sunt implicate în iniţierea şi desfăşurarea apoptozei, iar proteina Ced-9 o blochează. La mamifere apoptoza este guvernată de două familii de gene: bcl-2 şi ICE. Produsul genei ced-9 este asemănător proteinelor din familia Bcl-2 (Bcl-2 şi Bcl-XL) de la mamifere (în absenţa proteinei Ced-9 la C. elegans, proteina Bcl-2 poate inhiba apoptoza). Proteina Ced-3 de la C. elegans este omoloagă enzimei de conversie a interleukinei 1β (interleukin 1β

converting enzyme sau ICE) de la mamifere (caspaza-1). Şi pentru gena ced-4 de la nematod s-a identificat la mamifere o genă omoloagă: Apaf-1 (apoptotic protease

activating factor 1), (Alberts et al., 1999; Moldoveanu şi Popescu, 1999; Dănăilă et al, 1999; Ricci, 2002), (fig. 6.3).

Fig. 6.3 - Conservarea unor familii mari de proteine implicate în apoptoză,

de la nematode până la vertebrate, (după Ricci, 2002) În controlul apoptozei la mamifere un rol deosebit joacă, cum s-a precizat deja,

şi familia de gene p53 (care controlează ciclul celular), mutaţia acestor gene fiind

45

frecvent întâlnită în diverse formaţiuni tumorale (genele p53 au activitate antitumorală). În urma unor anomalii survenite la nivelul ADN pot fi activate aceste gene, iar produşii lor pot stopa (direct sau indirect) ciclul celular în fazele G1 sau S (pentru refacerea leziunilor la nivelul ADN), iar în situaţia în care leziunile ADN nu pot fi reparate, celula este dirijată spre apoptoză. Nu se ştie precis dacă decizia celulei de a intra în apoptoză se ia la nivel biochimic sau genetic, dar mulţi autori înclină să considere că această decizie ar fi luată la nivelul genelor specifice, funcţie de semnalele primite. Decizia de a intra în apoptoză odată luată, devine ireversibilă.

Faza de execuţie

După luarea deciziei de intrare în apoptoză în funcţie de semnalele provenite din interiorul şi din exteriorul celulei, intervin enzime specifice din citoplasmă (cu evoluţie în cascadă) de degradare a organitelor celulare şi a macromoleculelor, care pregătesc celula pentru fagocitoză. Ea presupune activarea caspazelor de execuţie ale apoptozei (caspazele -3, -6 şi -7), care la rândul lor activează endonucleaze şi alte proteaze din celulă care determină degradarea proteinelor nucleare şi ale citoscheletului. Caspazele efectoare, şi în special caspaza-3, clivează diverse substraturi din celulă, cum ar fi PARP, citokeratinele, alfa-fodrina, proteina nucleară NuMA (proteină multifuncţională localizată în interfază în nucleu şi la polii aparatului mitotic în timpul mitozei), gelsolina (proteină de legare a actinei; fragmentele rezultate din clivarea gelsolinei clivează la rândul lor filamentele de actină) etc. Ea activează totodată CAD, prin clivarea ICAD, fapt ce determină degradarea ADN-ului cromosomal, (Elmore, 2007). De altfel, unul dintre evenimentele celulare foarte importante, care pare a fi principala cauză a morţii celulare, este clivarea ADN-ului nuclear în fragmente de 180-200 pb (sau multipli ai acestui număr), (fig. 6.4). Caspaza-3 ar fi responsabilă şi de reorganizarea citoscheletului şi formarea corpilor apoptotici.

Fig. 6.4 - Efecte nucleare ale apoptozei (după P. R. Dash, 2002) (www.sgul.ac.uk/dept/immunology-dash)

46

Faptul că fragmentarea nucleului este un factor determinant în execuţia apoptozei a fost demonstrat de experienţe în care prin enuclearea celulelor, sau prin transferul de citoplasmă din celule apoptotice în celule normale s-au produs evenimente specifice apoptozei, (Dănăilă et al., 1999).

Faza de eliminare (de distrugere)

După finalizarea procesului de apoptoză, cu moartea celulară şi formarea corpilor apoptotici, urmează ingestia acestora de către fagocite şi uneori de către celulele învecinate (cu această capacitate), ingestie care se produce fără a afecta celulele vecine, fără a perturba structura şi activitatea ţesutului respectiv şi fără a fi însoţită de un proces inflamator. Este vorba de o eliminare fără urme („curată”) a celulei afectate de apoptoză. Recunoaşterea corpilor apoptotici de către macrofage s-ar datora unor produşi de pe membranele lor (carbohidraţi şi alte molecule specifice). În procesul de recunoaştere a corpilor apoptotici sunt incriminate trombospondina, fosfatidilserina (PS), receptorul de suprafaţă de 75 kDa (recunoscut de anticorpul 61D3), nefiind excluse şi alte posibilităţi, încă necunoscute. Se pare că externalizarea PS (translocarea ei pe faţa externă a membranei plasmatice) ar fi evenimentul cel mai important, care ar facilita recunoaşterea celulelor apoptotice de către fagocitele non-inflamatorii şi ar asigura apoi ingestia corpilor apoptotici, (Elmore, 2007).

Fig. 6.5 – Căile principale care conduc la apoptoză (după Ricci, 2002) În final, cum arătam anterior, procesul de apoptoză duce nu numai la moartea

celulei, ci şi la dispariţia ei fără urme şi fără consecinţe pentru celulele din jur şi pentru ţesutul din care face parte. În figura 6.5 sunt prezentate schematic căile de inducţie şi fazele apoptozei, (după Ricci, 2002), despre care vom discuta în detaliu în capitolele următoare.

47

7. Mecanismele moleculare ale apoptozei

7.1. Semnale şi receptori în apoptoză Apoptoza este, cum a rezultat din cele expuse anterior, un proces care se petrece

în etape, un proces multifazic. Într-o primă fază, în celulă apare un semnal transmis fie din exteriorul ei, fie din compartimentele proprii, semnal care ajunge la receptori specifici, care este apoi analizat şi transmis prin diferiţi mesageri până la nivelul nucleului unde, fie sunt activate genele letale, fie sunt represate cele anti-letale. Una din căile apoptozei se realizează prin intermediul receptorilor celulari (Fas - FasL) sub acţiunea unor inductori fiziologici; o alta este calea mitocondrială a apoptozei (în care este implicată procaspaza-9); ar exista de asemenea şi o cale în care participă reticulul endoplasmatic (în care ar fi implicată procaspaza-12).

Semnale de supravieţuire

În experienţele de cultivare in vitro a celulelor animale şi umane s-a evidenţiat faptul că supravieţuirea lor în aceste condiţii necesită pe lângă factori de creştere şi alţi factori extracelulari (situaţi uneori la distanţă de celula influenţată), care sunt de fapt molecule mai mult sau mai puţin complexe, cu rol de semnal pentru desfăşurarea anumitor procese fiziologice şi biochimice în celulele ţintă. Activitatea unei celule depinde de mediul în care trăieşte, de semnalele recepţionate pe parcursul vieţii din mediul extracelular prin contact mecanic direct, prin mijlocirea citoscheletului, prin mesaje de natură chimică etc. Un exemplu bine cunoscut îl reprezintă acţiunea hormonilor secretaţi de glandele endocrine asupra unor celule ţintă situate uneori la mare distanţă de aceste glande în organismele animale.

Semnalele de supravieţuire, indispensabile pentru activitatea celulară normală şi specifică, provin cel mai adesea de la celulele învecinate cu celula ţintă, iar în absenţa lor celula este sortită dispariţiei, cel mai adesea prin apoptoză. Exemple de dependenţă faţă de semnalele provenite de la alte celule pot fi: dezvoltarea neuronilor la vertebrate funcţie de factorii neurotropici secretaţi de celulele pe care le inervează; dependenţa celulelor cortexului suprarenal de secreţia de ACTH; dependenţa culturilor de limfocite T (formele tinere) de interleukina 2 (IL-2) sau a celulelor endoteliale de factorul de creştere a limfoblastelor; dependenţa formării celulelor germinative la şoarece de produşii genelor Steel (SI) etc.

În general, factorii de supravieţuire sunt şi factori de creştere (de proliferare) celulară. Celulele canceroase au capacitatea de a produce în mod autonom factori de supravieţuire şi de proliferare, precum şi proteine ce protejează celula de apoptoză, codificate de genele bcl-2. Există de asemenea factori de supravieţuire cu specificitate de ţesut (factori „locali”), care asigură eliminarea unor celule „plasate greşit”, în alt ţesut decât cel specific. Astfel, în cazul rănirilor prin tăiere, unele celule epidermice pot să ajungă în hipoderm sau în derm, dar supravieţuirea lor aici (care ar afecta procesele de reparaţie a rănii) nu este posibilă, tocmai din cauza lipsei factorilor specifici de supravieţuire. Factorii locali de supravieţuire reglează de asemenea numărul de celule într-un ţesut. Există o competiţie a celulelor dintr-un ţesut pentru aceşti factori. Dacă numărul de celule creşte, iar nivelul factorilor de supravieţuire devine insuficient, unele celule vor fi private de aceşti factori şi vor intra în apoptoză.

Din cele prezentate rezultă că există factori de supravieţuire locali – care sunt produşi de celulele unui anumit ţesut, şi generali – care sunt produşi în afara acelui

48

ţesut. Celulele care primesc aceşti factori supravieţuiesc, în timp ce celulele private de ei, sau care-i primesc în cantităţi insuficiente, intră în apotoză. Se consideră însă că, deşi factorii de supravieţuire au un rol important în decizia celulei de a intra în apoptoză, ei nu sunt singurii implicaţi în această decizie, aşa cum vom vedea în cele ce urmează.

Semnalizarea apoptozei este asigurată prin activarea unor receptori de pe suprafaţa celulelor, denumiţi „receptorii morţii”, care după ce se leagă cu liganzi specifici, transmit celulelor semnale apoptotice. Aceşti receptori sunt codificaţi de o superfamilie de gene pentru receptorul factorului de necroză tumorală (TNFR), care includ TNF-R1, Fas/CD95, receptorii (TRAIL) DR-4 şi DR-5. Membrii acestei familii TNFR conţin subdomenii extracelulare bogate în cisteină, care le permite să recunoască liganzi specifici, fapt ce conduce la trimerizarea şi la activarea respectivului receptor al morţii. Semnalizarea este transmisă apoi prin porţiunea citoplasmatică a receptorului morţii ce conţine o secvenţă bine conservată, denumită domeniul morţii (DD), (Gewies, 2003).

Sistemul Fas/FasL

Sunt situaţii în care apoptoza unor celule este provocată prin intermediul unor molecule efectoare prezente pe suprafaţa unor celule specializate (celulele NK sau limfocitele T citotoxice) sau prin intermediul unor citokine, recunoscute de receptori de pe suprafaţa celulelor ţintă. Sistemul Fas/Fas-ligand este un sistem de inducere a apoptozei în celulele tumorale şi în celulele infectate cu virusuri. Receptorul Fas (denumit şi APO-1 sau CD95), a fost descoperit în 1989 şi este un membru al familiei de receptori TNF şi NGF, (Waring et Müllbacher, 1999). Fas este o proteină trans-membranară constituită din 325 de aminoacizi, având capătul amino-terminal în citoplasmă, iar capătul carboxi-terminal spre exterior, secvenţa semnal fiind situată extracelular, unde se cuplează cu ligandul specific Fas-L (care este o citokină ce aparţine familiei TNF). Acest receptor este codificat de o genă situată pe cromosomul 19 la şoarece şi pe cromosomul 10 la om (Dănăilă et al., 1999). S-a constatat că prin tratarea cu anticorpi umani (ce se cuplează cu Fas) a celulelor transformate ce prezintă pe suprafaţa lor proteine Fas, celulele au murit într-un interval de cca 5 ore, de unde s-a dedus că prin activarea acestui receptor este declanşată apoptoza. S-a observat că domeniul extracelular al Fas are o structură în aminoacizi asemănătoare în proporţie de 20-25% cu TNF (TNF-R1), în timp ce domeniile citoplasmatice ale celor doi receptori sunt aproape identice. În inducerea apoptozei, domeniul citoplasmatic al receptorului pare a avea rol esenţial şi de aceea el a fost denumit domeniul morţii (DD – death

domain) sau domeniul tanatogen (o regiune a receptorului de cca 80 de aminoacizi, bine conservată în cursul evoluţiei). Distribuţia receptorilor Fas este diferită pe diferite celule.

S-a descoperit apoi că Fas este receptorul unei proteine trans-membranare (a unei citokine) cu greutatea moleculară de 40 kDa, având capătul amino-terminal în citoplasmă şi capătul carboxi-terminal în afara citoplasmei (proteină extrem de toxică pentru celulele care exprimă receptorul Fas pe suprafaţa lor), denumită Fas-ligand (Fas-L). Această proteină s-a dovedit în proporţie de 76% identică la om şi şoarece în privinţa secvenţei de aminoacizi, fiind codificată de o genă situată pe cromosomul 1 al

49

acestor specii. Sistemul Fas/Fas-L este implicat în următoarele situaţii de apoptoză fiziologică:

a) apoptoza limfocitelor T activate la sfârşitului răspunsului imun (receptorul Fas se află pe numeroase tipuri celulare, iar Fas-L pe limfocitele T activate);

b) distrugerea celulelor infectate de virusuri, precum şi a celulelor tumorale (de către limfocitele T citotoxice şi celulele NK);

c) distrugerea celulelor inflamatorii din zone imunologic sensibile, precum ochiul, (Gomez et al.1997- citat de Dănăilă et al., 1999; Ashkenazi et al. 1998).

S-a găsit că receptorul Fas se exprimă pe suprafaţa limfocitelor B mature, astfel încât este posibil ca Fas-L de pe limfocitele T activate să se lege de limfocitele B şi să inducă apoptoza. S-au descoperit substanţe care inhibă exprimarea ligandului Fas pe suprafaţa limfocitelor T (herbimicina A, cyclosporina A, genisteina) şi substanţe care stimulează această expresie (ionomicina, para-metoxi-amfetamina sau PMA).

Fig. 7.1 - Schemă reprezentând faze ale activării căii Fas a apoptozei

Prin cuplarea Fas cu Fas-L se produc modificări de conformaţie a domeniilor tanatogene ale receptorului Fas, care permit legarea la acest domeniu a moleculelor adaptor. Principala moleculă adaptor pentru Fas este FADD (Fas-associated death

domain), proteină care conţine un domeniu efector al morţii – DED, ce se leagă de un domeniu analog - DED al proteinei FLICE (MACH), sau caspaza-8, (fig. 7.1). Prin cuplarea cu FADD a procaspazei-8, are loc clivarea şi activarea ei (caspaza-8). FADD reprezintă punctul de convergenţă al căilor de semnalizare induse de Fas sau TNF-R1. Prin intermediul DED, FADD poate recruta caspaza-8 sau capsaza-10 şi iniţia astfel

50

cascada apoptotică (Ricci, 2002). Domeniul tanatogen (DD) este asemănător cu domeniile DED (death effector domain) şi CARD (caspase recruitment domain).

Cu FADD se pot asocia şi alte proteine din citoplasmă, precum Daxx, situaţie

care conduce la activarea altor căi – prin mijlocirea kinazelor c-Jun, de exemplu, independente de calea FADD, (fig. 7.2). Au fost evidenţiate două tipuri de modificări ale receptorului Fas: una determină absenţa expresiei Fas, iar cealaltă reprezintă o mutaţie punctiformă a DD (ce constă în înlocuirea izoleucinei din poziţia 225 cu asparagina), care face receptorul Fas incapabil de a interacţiona cu FADD, (Ricci, 2002).

Fig. 7.2 – Transmiterea semnalului apoptotic prin sistemul Fas/Fas-L (după Dănăilă et al., 1999)

Semnalul apoptotic se transmite în principal prin cuplarea Fas-FasL. Dar Fas se

poate cupla la domeniul extracelular cu domeniul Fc al imunoglobulinelor umane, complexul format Fas-Fc blocând apoptoza. S-a constatat că Fas şi Fas-L pot exista şi sub formă solubilă în urma clivajului acestora de pe membranele celulare (proteoliză produsă de o familie de metalo-proteaze membranare). Aceste forme solubile ar putea avea un rol important în apoptoză. De regulă, Fas-L se exprimă pe suprafaţa unei celule efectoare ce se leagă de receptorul Fas aflat pe suprafaţa unei celule ţintă şi astfel activează caspazele şi induce apoptoza.

Sistemul receptor TNF/TNF-R1

Factorul de necroză a tumorilor (TNF) reprezintă o familie mare de citokine proinflamatorii implicate în fenomenele de semnalizare celulară, răspunsurile inflamator şi imun şi în diferenţierea celulară. TNF manifestă acţiune citotoxică asupra

51

celulelor tumorale, care nu se exercită însă şi asupra celulelor normale. TNF acţionează pe limfocitele T şi B, pe neutrofile, fibroblaste, celulele endoteliale şi ale măduvei hematogene, în care induce sinteza de factori necesari în răspunsul inflamator şi imun. Există două tipuri de TNF şi anume TNF-alfa şi TNF-beta, care au o omologie de 36% a secvenţei lor de aminoacizi şi o structură terţiară asemănătoare. TNF-alfa este secretat în special de macrofage, dar şi de limfocite, fibroblaste şi keratinocite, iar TNF-beta este secretat de celulele T-helper. Primul are efect citotoxic asupra celulelor tumorale, iar cel de al doilea are acţiune asemănătoare cu TNF-alfa şi intensifică activitatea macrofagelor şi neutrofilelor. Unele celule tumorale secretă ambele tipuri de TNF. În afara acţiunii lui antitumorale, TNF-alfa intervine şi în răspunsul imun la infecţii bacteriene, virale, invazii fungice şi cu paraziţi. Nivelurile scăzute de TNF-alfa determină remodelarea sau înlocuirea ţesuturilor lezate sau senescente prin stimularea creşterii fibroblastelor.

Fig. 7.3 - Activarea căii TNF în apoptoză (după P. R. Dash, 2002), (www.sgul.ac.uk/dept/immunology-dash)

Răspunsurile induse de TNF se produc prin intermediul a două tipuri de receptori pentru această citokină, prezenţi pe suprafaţa celulelor somatice: TNF-R1 (p55, sau CD120a) - care este o proteină de 55 kDa (p55) şi TNF-R2 (sau CD120b) - care este o proteină de 75 kDa (p75). La om, gena pentru TNF-R1 este localizată pe cromosomul 12, iar cea pentru TNF-R2 pe cromsomul 1. S-a constatat că apoptoza nu este automat indusă de cuplarea TNF la TNF-R1, ci că este nevoie în plus de o cuplare a domeniului intra-citoplasmatic al acestui receptor la unele proteine adaptor pentru activarea caspazelor (enzimele efectoare ale apoptozei), (fig. 7.3). TNF-R1 induce

52

cito-toxicitatea şi activarea factorului NF-kB, iar funcţia lui TNFR-2 (p75) nu este prea bine cunoscută. Unele experienţe în culturi celulare HeLa sugerează existenţa unui sinergism în acţiunea acestor receptori. TNF-R2 nu are un domeniu tanatogen citoplasmatic, dar are capacitatea de a se lega la proteinele adaptor TRAF-1 şi TRAF-2 şi prin aceasta ar modula activitatea TNF-R1.

Interacţiunea TNFα – TNF-R1 determină trimerizarea receptorului TNF-R1 şi asocierea domeniilor morţii ale acestora (situate în citoplasmă), fapt ce duce la recrutarea proteinei adaptor TRADD (TNFR associated death domain), (fig. 7.4). Formarea complexului TNF-TNFR1-TRADD induce activarea mai multor căi:

a) activarea factorului NF-kB care mediază transcripţia unor proteine cu rol în supravieţuirea şi proliferarea celulară, răspunsul inflamator, factori anti-apoptotici;

b) activarea căii MAPK-JNK, în general pro-apoptotică, implicată şi în proliferarea şi diferenţierea celulară;

c) semnalizarea apoptozei prin legarea la FADD şi recrutarea caspazei-8. De reţinut că această cale de inducere a morţii - TNF/TNFR1, este mai puţin eficientă decât calea Fas/FasL, (informaţii preluate după Moldoveanu şi Popescu, 1999; Dănăilă et al., 1999; Ricci, 2002; site-uri de profil de pe internet). TRADD este principala proteină adaptor pentru domeniul tanatogen al TNFR. Ea se asociază şi cu alte proteine cum ar fi TRAF-2 (TNFR associated factor-2) şi RIP (receptor interacting protein), din care doar RIP prezintă activitate enzimatică. TRAF-2 şi RIP pot activa kinazele inductoare ale NF-kB, (Dănăilă et al., 1999).

Fig. 7.4 - Schemă privind transmiterea semnalului apoptotic prin sistemul

TNF/TNFR-1 (după Dănăilă et al., 1999)

53

Familia de receptori TNF este una largă, cuprinzând şi receptorii pentru limfotoxina B, pentru NGF, CD40, CD27, CD30 etc, seria acestora crescând continuu, între timp fiind descoperiţi şi alţii, ca: DR, WSL-1, HVEM (herpes virus early

mediator), CAR-1 (cytophatic aviar leukosis-sarcoma virus receptor). Nu toţi aceşti receptori TNF induc apoptoza prin cuplarea cu ligandul specific, cei mai mulţi dintre ei transduc semnale de stimulare sau de activare a ei. S-a observat că domeniul tanatogen citoplasmatic este specific nu numai TNF-R1 şi Fas, ci şi altora dintre receptorii menţionaţi, cum ar fi DR4, DR5, WSL-1, CAR-1, ceea ce denotă că ei ar putea transmite semnalul apoptotic sau că (exceptând Fas) ar putea da semnalul pentru activarea NF-kB.

Sistemul DR4-DR5/TRAIL

Proteina TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand sau APO2L) este un membru al suprafamiliei TNF, este codificată de gena cu acelaşi nume situată la om pe cromosomul 3, este formată din 281 aminoacizi (32,5 kDa) şi reprezintă un inductor puternic al apoptozei într-un mare număr de celule tumorale şi transformate, dar nu şi în majoritatea celulelor normale (Lee et al., 2002; Wang et El-Deiry, 2003; Ren et al., 2004; Zhang et al., 2010), fiind considerată un agent de perspectivă în terapia cancerului. TRAIL este o proteină trans-mebranară omoloagă 28% cu FasL şi 23% cu TNF, care formează homo-trimeri (care leagă 3 molecule receptor) cu majoritatea membrilor familiei TNF. Pentru stabilitatea şi activitatea biologică optimă este esenţial un atom de Zn legat de cisteină la ligandul trimeric. Deşi funcţia principală a TRAIL pare să fie inducţia apoptozei, rolul fiziologic al acestui ligand este încă incomplet cunoscut, (Wang et El-Deiry, 2003).

Au fost identificaţi şi un număr de 5 receptori pentru această proteină: TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5/TRICK2 sau Killer), TRAIL-R3 (DcR1/TRID sau LIT), TRAIL-R4 (DcR2 sau TRUNDD) şi Opg (osteoprotegerina). Primii doi receptori au în structura lor domeniul morţii (DD) funcţional şi capacitatea de a induce apoptoza prin legarea la TRAIL, iar ceilalţi 3 servesc drept receptori „capcană” (ei se pot lega la TRAIL, dar nu induc apoptoza). Astfel, lui DcR1 îi lipseşte o porţiune (nu posedă domeniul citoplasmatic, coada) intracelulară necesară pentru inducerea MC; DcR2 conţine în structura lui un DD trunchiat (îi lipsesc 4 din cei 6 aminoacizi esenţiali în recrutarea proteinelor adaptor) – care nu poate semnaliza apoptoza, dar poate activa NF-kB (Merino et al., 2006); Opg este un receptor mai slab pentru TRAIL, în schimb poate lega Opg-ligand (OpgL) şi să activeze NF-kB. DR4 este o proteină formată din 468 de aminoacizi (aa); DR5 prezintă două forme, una mai lungă - care conţine 440 aa şi alta mai scurtă, de 410 aa. Aceşti doi receptori au în structura lor o secvenţă semnal, o regiune trans-membranară şi un domeniu DD. Receptorul DcR1 este format din 259 aa, iar DcR2 conţine 386 aa, (http://apresslp.gvpi.net/apocyto/lpext.dlll/.).

Proteina TRAIL ar avea efecte scăzute asupra celulelor normale din organism, deoarece receptorii DR4 şi DR5 sunt exprimaţi mai ales pe celulele tumorale, în timp ce receptorii ei „capcană” sunt exprimaţi pe celulele sănătoase. Prin legarea DR4 sau DR5 la TRAIL are loc trimerizarea receptorului, recrutarea proteinei FADD (probabil indirect, via GTP, DAP3 – death associated protein-3), formarea complexului DISC şi apoi legarea şi activarea caspazei-8 sau -10. Caspazele -8 şi -10 activate, clivează şi activează casapaza-3, care determină la rândul ei clivarea substraturilor morţii, (Wang

54

şi El-Deiry, 2003). Deşi TRAIL are o secvenţă omoloagă cu FasL şi TNF, ea induce apoptoza independent de Fas şi TNF-R1. Exprimarea în exces a receptorilor DR4 şi DR5, sau activarea lor de către TRAIL induce apoptoza într-o varietate de tumori, dar nu şi a majorităţii celulelor sănătoase studiate (Ashkenazi, 2002; http://apresslp.gvpi.net/ apocyto/lpext.dlll/). Schneider et al. (1997) arătau că DR4 şi DR5 se pot asocia, sugerând faptul că TRAIL ar putea semnaliza printr-un sistem heteroceptor. Ambii receptori ar lega FADD şi TRADD pentru a semnaliza moartea celulară şi ambele semnale ale morţii pot fi anulate de către FLIP şi o formă dominant negativă a FADD.

Ligandul TRAIL pare a avea rol important în supravegherea imună de către celulele sistemului imun înnăscut împotriva infecţiilor virale şi în transformarea malignă (Wang et El-Deiry, 2003). S-a constatat că ţesutul ocular etalează atât TRAIL cât şi FasL. Rezultatele cercetărilor lui Lee et al. (2002) arată că celulele tumorale din ochi sunt distruse via oricare din acest ligand, sugerând existenţa unui sistem compensatoriu între TRAIL şi FasL şi că TRAIL ar exercita un rol în supravegherea tumorală la acest nivel. Faptul că TRAIL prezintă o activitate tumoricidă certă şi evidentă asupra unei varietăţi de tumori, a stârnit interesul pentru folosirea acestui ligand în terapia cancerului uman, numai că proteina provoacă o moarte semnificativă a hepatocitelor umane normale. De aici preocupările unor autori de a reduce toxicitatea hepatică a proteinei TRAIL. Cercetări efectuate în acest sens de Zhang et al. (2010) au arătat că administrarea intra-tumorală sau intravenoasă de sTRAIL (TRAIL solubil) la şoareci, prin intermediul E. coli DH5α, a determinat o reducere evidentă a ratei de proliferare a tumorilor, o prelungire a duratei de viaţă a animalelor, fără a fi semnalată o toxicitate decelabilă în nici un organ.

Factorul de transcripţie NF-kB (nuclear-kappa B)

Factorul nuclear kappaB (NF-kB, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of

activated B cells) este o proteină complexă, care se găseşte în aproape toate tipurile de celule animale şi este implicat în răspunsurile celulare la stimuli ca stresul, citokinele, radicalii liberi, LDL oxidate, radiaţiile UV, antigenii bacterieni şi virali. NF-kB joacă rol cheie în controlul răspunsului imun la infecţii, iar reglarea incorectă a acestui factor a fost legată de cancer, de boli inflamatorii şi autoimune, de şocul septic, infecţia virală şi dezvoltarea imună deficientă. NF-kB pare a fi implicat şi în procesele de plasticitate sinaptică şi memorie, (cnf. Wikipedia). Proteinele din familia NF-kappaB prezintă la capătul N-terminal un domeniu de omologie Rel. Factorul NF-kB activat este un heterodimer format dintr-o subunitate p65 (sau RelA) şi o subunitate p50, (p65/p50). În unele procese celulare forma activată a Nf-kB poate fi constituită şi din asocieri de alte subunităţi: RelB, v-Rel, p52. Heterodimerii p65/p50 sau RelB/p50 ai NF-kB sunt activatori transcripţionali, iar homodimerul p50/p50 este dimpotrivă represor transcripţional (www.ganfyd.org/indexphp?title=Nuclear_factor-kappaB). Factorul NF-kB este activat, cum s-a precizat anterior, de numeroşi stimuli ca: citokine, toxine, virusuri, agenţi de oxidare, LPS bacteriene, radiaţii UV şi ionizante etc. Dimerii NF-kB sunt sechestraţi în citoplasmă sub formă inactivă de către proteine inhibitoare specifice care conţin repetiţii ankyrin, denumite inhibitori ai kB (IkB). Activarea NF-kB are loc la degradarea semnal-indusă a IkB de către kinaza IkB (IKK), fapt ce permite NF-kB să se elibereze (activeze) şi să pătrundă în nucleu, unde induce

55

transcripţia unor gene specifice. Activarea de către NF-kB a acestor gene poate genera un răspuns de supravieţuire, de proliferare celulară, un răspuns inflamator sau imun.

De activarea factorului NF-kB depinde transcripţia genelor IAP (inhibitor of

apoptosis), a genelor ce codifică proteinele TRAF-1 şi TRAF-2 (anti-apoptotice), precum şi a genelor implicate în răspunsul inflamator. Factorul NF-kB este activat prin intermediul familiei de receptori TNF şi astfel protejează celula de a intra în apoptoză. Între TNF şi NF-Kb ar exista un feed-back negativ, în sensul că factorul NF-kB inhibă apoptoza provocată de TNF. Prin cuplarea TNF-TNFR1 este indus un semnal apoptotic celulelor care posedă acest receptor şi în acelaşi timp un semnal anti-apoptotic, dependent de RelA. S-a observat că NF-kB poate salva semnalul apoptotic indus de TNFR-1, dar nu şi pe cel indus prin receptorul Fas, (Dănăilă et al., 1999).

Factorul NF-kB este un modulator important al programului de funcţionare a genelor. Diferite tipuri de tumori umane au NF-kB reglat greşit. Numeroase virusuri carcinogene şi oncogene induc activarea NF-kB şi evenimentele oncogenice ulterioare contribuie la creşterea progresivă a NF-kB constitutiv activ – o cale comună în cele mai multe forme de cancer, (Van Waes, 2007). NF-kB activ induce expresia genelor care menţin proliferarea celulară şi protejează celulele de apoptoză. În acelaşi timp, defectele NF-kB pot determina şi o stimulare a apoptozei celulare prin activitatea lui de reglare a genelor anti-apoptotice TRAF1 şi TRAF2. S-a constatat de asemenea că NF-kB poate fi activ cronic într-o serie de boli inflamatorii ca artrita, sepsia, gastrita, astmul, ateroscleroza, unel boli intestinale (cnf. Wikipedia). Rolul pe care Nf-kB îl are în desfăşurarea unor procese biologice importante a sugerat intervenţia asupra unor boli umane (în special cancerul şi bolile inflamatorii) prin controlul activităţii acestui factor. Inhibarea activării aberante a NF-kB ar putea fi o cale eficientă în prevenirea şi tratamentul cancerului, (Aggarwal, 2004). Există date care arată că gluco-corticoizii, aspirina (la doze înalte), IL-10, sărurile de aur, vitamina D etc, pot inhiba activarea NF-kB. S-a observat că resveratrolul şi curcumina pot inhiba semnalizarea NF-kB activată de TNFα în adipocite şi implicit reduc semnificativ expresia citokinelor, sugerând că cei doi produşi ar putea fi folosiţi în inflamaţiile cronice ale ţesutului adipos, (Gonzales şi Orlando, 2008). Se apreciază că agenţii care ţintesc proteasomul, IKK şi alte kinaze implicate în activarea NF-kB, au manifestat efect anticancerigen în studii clinice şi preclinice, (Van Waes, 2007).

Receptorul purinergic P2Z

Unele celule exprimă la suprafaţa externă a membranei lor receptori P2 pentru nucleotidele extracelulare. Stimularea acestor receptori creşte brusc concentraţia Ca2+ citosolic. Influxul de calciu poate avea loc fie din mediul extracelular pe calea canalelor cationice, fie din rezervele interne în urma activării cascadei de semnalizare a fosfolipazei C, (Garget et al., 1997). Aceşti receptori au fost clasificaţi în două mari familii: a) familia P2X, receptori formaţi din două domenii transmembranare conectate de o buclă extracelulară şi exprimaţi în principal pe neuroni şi muşchii netezi; b) familia P2Y, receptori care au şapte regiuni trans-membranare, se găsesc pe numeroase tipuri de ţesuturi şi sunt implicaţi în efecte multiple, care includ secreţia, dar şi relaxarea muşchilor. Pe baza profilelor farmacologice, aceste clase de receptori au fost împărţite în subclase (P2X1 – P2X6 şi P2Y1 – P2Y7). Receptorul P2Z aparţine la familia de receptori purinergici implicaţi în numeroase activităţi biologice: în

56

stimularea mitogenă, transmiţător de excitaţie, în secreţia de citokine şi moartea celulară (Ferrari et al., 1999); este exprimat de macrofage şi timocite şi ar avea rol în dezvoltarea imună şi în controlul infecţiilor microbiene (Coutinho-Silva et al., 1999). Proteina prezintă două domenii trans-membranare şi o buclă extracelulară mare, care îl plasează printre receptorii din familia P2X, dar spre deosebire de aceştia, P2Z are un domeniu carboxi-terminal foarte lung (necesar pentru acţiunile litice), fapt ce l-a diferenţiat de aceştia (având şi denumirea de P2X7), (Garget et al., 1997; Ferrari et al., 1997). Exprimarea lui pare a fi specifică liniei (filiaţiei) macrofagelor (celule dendritice, macrofage, microgliale). Receptorul P2Z ar fi responsabil de liza ATP-dependentă a macrofagelor. Activarea P2Z elicitează două tipuri de răspunsuri celulare: legarea ATP induce un flux cationic membranar trecător; depolarizarea membranei şi influxul de calciu liber în citosol determină deschiderea de pori membranari prin care trec molecule hidrofile cu masa moleculară de până la 900 kDa, (Di Virgilio, 1995; Suprenant et al., 1996; Ferrari et al., 1999). Activarea receptorului P2Z a indus rapid fragmentarea apoptotică ADN, însoţită de procesarea proteolitică a unor caspaze şi substraturi ale caspazelor în celulele mieloice. Rezultatele cercetărilor întreprinse de Ferrari et al., (1999) sugerează că activarea caspazelor de către P2Z este necesară pentru moartea celulară prin apoptoză, dar nu şi pentru schimbările necrotice induse de ATP.

7.2. Gene, proteine adaptor şi alte proteine implicate în apoptoză În fenomenul de inducere a apoptozei intervin o serie de proteine adaptor, care

se asociază cu domeniul intracelular al receptorilor de apoptoză (TNF şi Fas) în transmiterea semnalelor ce activează efectorii apoptozei. S-au descoperit două clase de proteine adaptor:

1) în prima clasă intră proteinele TRADD, FADD/MORT-1, RIP şi RAIDD; 2) în a doua clasă intră proteinele TRAF1, TRAF2, TRAF3. Proteina TRADD (TNFR1 associated protein with death domain) a fost identificată

de HSU et al. (1995), are o greutate moleculară de 34 kDa şi se cuplează cu domeniul tanatogen intracelular al TNFR-1 situat pe membrana celulară. Pentru transmiterea semnalelor prin receptorul TNFR-1 pare să fie obligatorie cuplarea domeniului tanatogen al acestuia cu proteina TRADD. Proteina TRADD la om are o secvenţă completă de 312 aminoacizi şi a fost identificată în toate ţesuturile. Aflată în exces, această proteină poate activa atât TNFR-1, cât şi factorul NF-kB. Proteina crmA poate inhiba moartea celulară mediată-TRADD, dar nu şi activarea de către TRADD a factorului NF-kB, ceea ce arată că cele două căi de semnalizare MC, indusă-TNF şi de activare a NF-kB, sunt distincte. Unii autori (Morgan et al., 2002; Bender et al., 2005) arată că TRADD conţine secvenţe de import şi export nuclear, care îi permit să naveteze între nucleu şi citoplasmă. Proteina prezintă un domeniu N-terminal de legare TRAF şi un domeniu al morţii C-terminal împreună cu secvenţe de import/export nuclear, care permit naveta între nucleu şi citoplasmă. TRADD citoplasmatică activează apoptoza pe calea FADD şi caspaza-8, blocată de inhibitorii de caspază sau de FADD dominant-negativă. Calea activată de TRADD nucleară ar necesita activitatea catalitică a caspazei-9. Această cale ar fi una alternativă prin care TRADD poate regla MC independent de FADD şi caspaza-8 şi s-ar produce mai degrabă din nucleu decât din citoplasmă, (Bender et al., 2005).

57

Proteina FADD (Fas-associated protein with death domain) sau MORT-1 este esenţială pentru apoptoza indusă prin receptorii morţii, mediind cuplarea şi activarea autocatalitică a caspazei-8. Potrivit informaţiilor lui Zhang et al. (2004), gena FADD la om este localizată pe cromosomul 11, iar mutaţiile la această genă par avea rol în fenomenele de tumorigeneză şi autoimunitate. Proteina FADD este formată din 208 aminoacizi şi se exprimă în numeroase ţesuturi, mai puţin în leucocitele mononucleare din sângele periferic; a fost însă identificată în toate ţesuturile embrionare la om şi şoarece. Se consideră de altfel că proteina are rol în dezvoltarea embrionară, întrucât şoarecii FADD-/- mor în uter. Proteina FADD conţine un domeniu al morţii (DD) C-terminal şi un domeniu efector al morţii (DED) N-terminal. Prin interacţiunea dintre domeniile DD ale Fas şi FADD se formează complexul de semnalizare şi inducere a morţii (DISC), (fig. 7.5). Prin intermediul domeniilor DED al FADD şi al caspazei-8 este recrutată procaspaza-8 la complexul DISC şi astfel este activată caspaza-8. Formarea DISC transduce un semnal cascadă în aval, din care rezultă moartea celulară. Dacă proteina FADD pierde domeniul tanatogen de legare la Fas, atunci semnalul apoptotic este blocat.

Fig. 7.5 - Calea de semnalizare Fas, (liniile săgeată gri reprezintă trepte multiple în semnalizarea JNK), (http://en.wikipedia.org/wiki/Fas_ligand)

Atât proteina FADD umană, cât şi cea de şoarece sunt fosforilate specific la un

rest de serină (la ser-191 la şoarece, echivalentă cu ser-194 la om). Prin fosforilarea ei, FADD se implică în activarea şi proliferarea limfocitelor, dar şi în apoptoza lor. În legătură cu localizarea celulară a proteinei FADD sunt controverse, cei mai mulţi autori considerând că ea este o proteină citoplasmatică, însă unele investigaţii arată că FADD ar fi localizată în nucleu şi că ar naveta între nucleu şi citoplasmă. Fosforilarea FADD i-ar conferi roluri suplimentare, cum ar fi activarea şi proliferarea limfocitelor,

58

dar şi apoptoza lor. Cum afirmă Zhang et al., (2004), FADD ar putea fi o moleculă pivot, care cuplează procese celulare opuse – proliferarea şi apoptoza.

Proteina RIP (receptor interacting protein) este o serin-treonin kinază cu masa moleculară de 74 kDa. S-a constatat că domeniile DD ale RIP, TRADD şi FADD interacţionează şi aceasta ar fi calea spre receptorii TNF şi Fas. DD al RIP a fost clivat de caspaza-8 în apoptoza indusă pe calea TNF, situl de clivare aflându-se la acidul aspartic din poziţia 324 al proteinei RIP. Clivarea RIP a blocat activarea NF-kB indusă de TNF. Mutanţii RIP rezistenţi la caspaza-8 au celulele protejate la apoptoza TNF-indusă, (Lin et al., 1999). Domeniul morţii al kinazei RIP pare a fi esenţial în semnalizarea TNF, în activarea IKK indusă-TRAIL şi în activarea JNK, (Lin et al., 2000). Expresia în exces a proteinei RIP induce atât activarea NF-kB cât şi apoptoza. Degradarea RIP sensibilizează celulele la apoptoza TNF-indusă. Şoarecii ko pentru proteina RIP sunt aparent normali la naştere, dar după naştere sunt supuşi unei apoptoze masive a celulelor din ţesuturile limfoid şi adipos şi mor după 1-3 zile de la naştere, (Kelliher et al., 1998); celulele provenite de la aceşti şoareci nu pot activa factorul NF-kB şi au sensibilitate înaltă la apoptoza indusă prin TNFα. Proteina RIP poate fi activată prin fosforilare, fapt ce duce şi la fosforilarea IkB, un inhibitor al NF-kB. Proteina RIP se poate cupla şi cu proteina RAIDD (RIP associated Ich-1/CED

homologous protein with death domain), denumită şi CRADD (caspase and RIP adapter

with death domain), proteină adaptor care se exprimă constitutiv în majoritatea ţesuturilor şi mai ales în inima adultă, testicule, ficat, muşchii scheletului şi rinichi. Gena umană pentru această proteină este situată pe cromosomul 12. Exprimarea în exces a acestei proteine în celulele de mamifere induce apoptoza. Ea conţine un domeniu DD carboxi-terminal - care se leagă la domeniul omolog al proteinei RIP, şi un domeniu CARD amino-terminal, care interacţionează cu caspaza-2. În prezenţa RIP şi TRADD, RAIDD recrutează caspaza-2 la complexul de semnalizare TNF-R1. Conducerea semnalului apoptotic prin intermediul proteinelor TRADD, FADD şi RIP este diferită, în sensul că apoptoza indusă prin TRADD şi RIP implică doar domeniile lor tanatogene, în timp ce apoptoza declanşată prin excesul de FADD nu depinde de domeniul tanatogen.

Semnalul de inducere a apoptozei poate fi transmis şi prin proteinele din clasa TRAF (factor asociat receptorului TNF), din care s-au identificat până acum un număr de 6 (TRAF 1 – TRAF 6), proteine având o greutate moleculară de 45 - 64 kDa. Aceste proteine au comun domeniul TRAF, format din 150 de aminoacizi, care asigură interacţiunea de tipul proteină-proteină, formând homo- şi hetero-dimeri. Dintre proteinele TRAF se deosebeşte TRAF-2, care în exces poate activa NF-kB, printr-un mecanism încă necunoscut.

Problema iniţierii semnalului apoptotic prin activarea proteinelor asociate cu receptorii este una complexă şi prezintă destule aspecte insuficient elucidate. Este însă cert, aşa cum s-a arătat deja, că proteina TRADD se cuplează cu domeniul tanatogen al receptorului TNF-R1 (aflat sub formă trimerică) şi dă naştere la două semnale diferite: unul poate induce apoptoza, iar celălalt poate activa factorul de transcripţie NF-kB. TRADD poate interacţiona şi cu TNF-R2 şi să activeze NF-kB. Se pare că asocierea TRADD-TNFR1 şi semnalul rezultat este mai puternic şi mai folosit decât asocierea cu TNFR2 în declanşarea apoptozei. Întrucât a fost depistată existenţa unui complex de tipul FADD-TRADD-TNFR1, se consideră că receptorul Fas se asociază cu proteina

59

FADD şi totodată că TRADD poate recruta FADD pentru asocierea indirectă cu TNF-R1. Prin urmare, FADD ar fi un component al căii tanatogene care poate fi activat atât de TNF-R1, cât şi de NF-kB. După cum arăta Dănăilă et al. (1999) este cert că TRADD se asociază cu TRAF2 şi FADD şi de asemenea că TNF-R1 le poate recruta pe acestea din urmă, ceea ce duce la concluzia că în unele situaţii TRAF2 şi FADD pot transmite semnalul apoptotic pe via TNFR1-TRADD.

În sinteză, cum preciza RICCI (2002), complexele moleculare asociate receptorilor morţii pot induce activarea caspazelor prin intermediul domeniilor DD, DED şi CARD, prin interacţiuni de tipul: FADD/caspaza -8 sau -10 (cazul Fas); TRADD/FADD/caspaza -8/-10, ori TRADD/RIP/RAID/caspaza-2 (cazul TNF-R1).

Proteina FLASH

FLASH este o proteină de dimensiuni mari, care conţine un motiv cu activitate de oligomerizare al cărui secvenţă este asemănătoare cu al proteinei Ced-4 de la C.

elegans şi un domeniu efector (DRD), care interacţionează cu un domeniu DED al caspazei-8 sau al proteinei adaptor. Se consideră că FLASH ar putea fi un component al complexului de semnalizare DISC, fiind necesar pentru activarea caspazei-8 în apoptoza mediată-Fas. Expresia transientă a FLASH activează caspaza-8, iar expresia în exces a unei forme trunchiate a proteinei (care conţine un DRD sau un domeniu CED-4-like) împiedică producerea apoptozei mediate-Fas, (Imai et al., 1999).

Rolul unor kinaze şi inhibitori ai kinazelor în apoptoză

Cum a reieşit dintr-un capitol anterior, un rol important în reglarea procesului de apoptoză pare să-l aibă proteinele cu activitate tirozin-kinazică (PTK). Antagoniştii PTK pot declanşa apoptoza şi inhiba activitatea unor factori de supravieţuire în celulele hematopoietice, (Moldoveanu şi Popescu, 1999). Erbstatina (un inhibitor al tirozin-kinazei), de exemplu, induce moartea celulară în culturile de celule prin inhibarea fosforilării intracelulare a tirozinei. Unele experienţe au arătat rolul important al activării tirozin-kinazelor în apoptoză, determinată de unele medicamente anticanceroase. În apoptoză ar fi implicate şi kinazele JUN. În această categorie intră şi kinaza JNK (kinază JUN-N terminal), activată de stres (SAPK), care reprezintă o parte a kinazelor MAPK (kinaze activate de factori mitogeni). TNF ar putea activa lanţul de kinaze JUN şi să determine astfel apoptoza, deşi s-a constatat în unele cercetări că activarea JUN-kinazelor de către TNF nu conduce întotdeauna la apoptoză, ci poate fi şi un factor de supravieţuire celulară. În anumite condiţii şi receptorul Fas poate contribui la activarea lanţului de kinaze JUN/SAPK prin medierea proteinei Daxx (proteină asociată domeniului tanatogen al receptorului Fas). Exprimarea în exces a proteinei Daxx duce la activarea lanţului de kinaze JUN/SAPK şi la apoptoză. Deşi nu se ştie exact rolul acestei proteine, se consideră că ar lega receptorii Fas şi TNF de lanţul de kinaze JUN, (Dănăilă et al., 1999).

Proteinele de stres şi apoptoza

Deşi nu fac parte dintre „actorii” principali ai apoptozei, totuşi unele proteine de stres (heat shock proteins = hsp) pot interveni în fenomenul de apoptoză. Cum se ştie, aceste proteine au funcţii importante în viaţa celulelor, dar şi în supravieţuirea lor în condiţii de stres (la temperaturi înalte în special, de unde şi denumirea lor), fiind înalt

60

conservate de-a lungul evoluţiei. Sunt clasificate funcţie de greutatea lor moleculară (care variază de la 1 milion Da în cazul hsp60, la 27 kDa în cazul hsp27). Unele dintre ele (hsp90, hsp70, hsp60, hsp27) acţionează ca proteine chaperon (proteine care asigură împachetarea tridimensională corectă a unor proteine după părăsirea ribozomului - la maturarea lor cu alte cuvinte, iau parte la transportul transmembranar al proteinelor, la degradarea unor proteine, la fenomenul de inhibare a agregării proteinelor, la reactivarea proteinelor denaturate, la reglarea răspunsului la şocul termic etc). Creşterea moderată a temperaturii asigură inducerea întregii familii de proteine hsp şi a unei stări denumite de „termo-toleranţă”, care permite celulei să reziste la un şoc termic, precum şi la alţi factori de stres, inclusiv la factori pro-apoptotici. Exprimarea în exces a proteinelor hsp, şi în special a hsp70 şi hsp27 determină atât instalarea stării de termo-toleranţă, cât şi inhibarea apoptozei indusă de stimuli diverşi ca: agenţi chimioterapici, Fas, oxidul de azot, lipsirea de ser, şocurile termice şi TNF, (RICCI, 2002). S-a constatat că unele din aceste proteine, cum ar fi hsp70 şi hsp27, pe lângă efectul lor protector în condiţii de stres, contribuie şi la diminuarea sensibilităţii celulelor la mesajele pro-apoptotice produse de diverşi stimuli, mecanismul de acţiune fiind încă neclar, dar care pare a fi independent de activitatea chaperon a acestor proteine. Se consideră că prevenirea apoptozei de către hsp70 şi hsp27 s-ar exercita prin acţiunea lor protectoare faţă de radicalii liberi de oxigen (RLO) şi prin interacţiunea acestora cu alte molecule, printre care şi caspazele. Unii autori arată că efectul anti-apoptotic al hsp70 ar fi datorat blocării semnalului ce determină activarea JNK. Potrivit informaţiilor furnizate de Ricci (2002), unele observaţii arată că efectul anti-apoptotic al hsp70 s-ar exercita după activarea caspazelor, în timp ce altele consideră că el s-ar datora inactivării caspazei-3. Deşi majoritatea datelor sunt în favoarea efectului anti-apoptotic al hsp70, nu lipsesc însă informaţiile care arată că în anumite condiţii hsp70 ar putea induce apoptoza. În ceea ce priveşte acţiunea anti-apoptotică a hsp27, se pare că aceasta s-ar exercita fie la nivelul apoptosomului, prin inhibarea activării de către cyit. c a procaspazei-9, fie prin capacitatea ei de a inhiba activarea caspazei-3. Sunt şi date care sugerează că efectul amintit s-ar datora inhibării de către proteinele hsp27 a kinazelor din familia Src, sau că ele ar interacţiona în condiţii de stres cu kinaza Akt (interacţiune ce ar asigura păstrarea acţiunii anti-apoptotice a acesteia), (Ricci, 2002).

Genele şi proteinele Ced Unele celule mor în mod ordonat, ca parte a programului de dezvoltare al

organismului. Un hermafrodit de Caenorhabditis elegans generează în cursul dezvoltării lui 1090 de celule somatice, din care 131 mor prin apoptoză. Moartea programată a celulelor pare a fi o trăsătură obişnuită în dezvoltarea animală şi este soarta unei fracţiuni substanţiale a celulelor produse la cele mai multe animale. Faptul că celulele animale au un program intrinsec al morţii vine din studiile genetice la C.

elegans, unde două gene denumite ced-3 şi ced-4 (ced provine de la Caenorhabditis

elegans death) sunt implicate în producerea morţii a 131 de celule. Dacă oricare dintre aceste gene este inactivată prin mutaţie, supravieţuiesc celule care în mod normal erau sortite să moară şi diferenţiază în alte tipuri celulare (în neuroni, de exemplu). Totodată, exprimarea în exces sau expresia greşită a genelor ced-3 şi ced-4 (rezultat al pierderii de funcţie prin mutaţie, care inactivează gena ced-9, care în mod normal represează programarea morţii) determină moartea multor celule, care în mod normal ar trebui să supravieţuiască. Mutanţi de C. elegans, care au în plus cele 131 de celule,

61

au o durată normală de viaţă, ceea ce arată că apoptoza în acest caz nu este esenţială pentru supravieţuirea sau procesul de îmbătrânire a nematodului. La animalele cu organizare mai complexă, mutaţiile care inhibă apoptoza fie sunt letale, fie antrenează tulburări importante în organismele afectate, (Jan et al., 2008).

De fapt numărul de gene ced la C. elegans ar fi de 11, din care trei (ced-3, ced-

4 şi ced-9) au rol cheie în controlul apoptozei în toate celulele somatice, altele 7 (ced-

1, ced-2, ced-5, ced-6, ced-7, ced-8 şi ced-10) controlează fagocitoza celulelor ce intră în apoptoză, iar nuc-1 controlează nucleaza implicată în hidroliza ADN. Gena ced-3 codifică o cistein-protează (caspază), iar ced-4 o kinază activată de calciu. Gena ced-3 poate induce apoptoza în absenţa genei ced-4, dar nu şi invers. O mutaţie care inactivează una din aceste două gene determină blocarea apoptozei în fiecare din cele 131 de celule somatice ale nematodului. Gena ced-9 are o funcţie antagonistă genelor ced-3 şi ced-4, în sensul că ea promovează supravieţuirea celulelor. Pierderea parţială a funcţiei ced-9 este letală (determină o moarte exagerată), în timp ce exprimarea ei în exces (dobândire de funcţie) duce la creşterea numărului de celule adulte la nematodul C. elegans, (RICCI, 2002). Aceste 3 gene de la C. elegans au omologi la mamifere. Astfel, gena ced-3 este omoloagă în proporţie de 28% cu genele ice (interleukine-1

converting enzyme) de la mamifere, care codifică tot caspaze (excesul de proteine codificate de genele ced-3 şi ice induce apoptoza la C. elegans şi respectiv mamifere). Gena ced-4 are corespondent la mamifere gene ce codifică tot kinaze dependente de calciu, proteina Apaf-1 (apoptotic protease activating factor). Proteina Ced-4 se consideră că acţionează în amonte de Ced-3. Proteina Ced-9 este 23% identică în secvenţa de aminoacizi cu proteina Bcl-2 (produsul proto-oncogenei bcl-2) de la mamifere care, ca şi Ced-9, acţionează în suprimarea morţii celulare programate la multe tipuri de celule specifice mamiferelor. Dacă gena bcl-2 umană este transferată la C. elegans, ea acţionează prin inhibarea morţii celulare normale la vierme şi este chiar capabilă să salveze mutanţii ced-9 care altfel mor timpuriu în dezvoltare. Toate aceste descoperiri arată că atât mecanismul morţii programate a celulelor, cât şi reglarea lui, au fost înalt conservate în evoluţie de la viermi până la om, capacitatea de a comite sinuciderea fiind deci o însuşire fundamentală a celulei animale, (Alberts et al., 1999).

La C. elegans procesul de moarte celulară ar fi controlat de interacţiunea a patru factori apoptotici: EGL-1, CED-9, CED-4 şi CED-3. Gena egl-1 codifică o proteină ce are în structura ei o regiune (constituită din 9 aminoacizi) similară cu domeniul BH3 al proteinelor Bcl-2 de la mamifere, dar nu conţine alte domenii BH, (Shen et al., 2009). Conradt şi Horvitz considerau în 1998 că proteina EGL-1 ar activa moartea celulară prin legarea ei la CED-9 şi inhibarea directă a activităţii acesteia, acţiune care ar avea la bază eliberarea activatorului morţii celulare CED-4 din complexul proteic format din CED-9/CED-4, aspect confirmat ulterior. Mai apoi are loc activarea caspazei CED-3 care execută apoptoza. Shen et al. (2009) au identificat în plus factorul WAN-1, un ortolog C. elegans al factorului ANT de la mamifere, cu rol de regulator al apoptozei la viermele nematod. WAN-1 se află în „inima” maşinăriei de moarte celulară, alături de cei 4 factori menţionaţi anterior (EGL-1, CED-9, CED-4 şi CED-3). Acest factor proteic este localizat în mitocondrii şi poate forma complexe proteice atât cu CED-4, cât şi cu CED-9. EGL-1 poate distruge legătura dintre CED-9 şi WAN-1.

Conform datelor furnizate de Ricci (2002), unele studii au arătat că Ced-4 ar putea interacţiona cu Ced-3 şi Ced-9, iar când se exprimă în celulele mamiferelor, se

62

localizează în membrana mitocondrială în prezenţa unei molecule Bcl-2. Mai mult, a fost posibil de izolat complexul Bcl-XL/Ced-4/caspază. S-a stabilit că localizarea acestui complex în membrana mitocondrială are efect anti-apoptotic, în timp ce eliberarea Ced-4 în citoplasmă determină activarea caspazelor şi moartea celulară. Zou et al. (1997) au reuşit să izoleze şi să caracterizeze omologul uman a lui Ced-4. În experienţe efectuate pe sisteme acelulare pentru studiul activării caspazelor, autorii au identificat un complex proteic care asigură maturarea proteolitică a acestei caspaze (activarea ei). Complexul este format din Apaf-1, citocromul c (Apaf-2) şi caspaza-9 (Apaf-3). Ca şi Ced-4, Apaf-1 s-a dovedit indispensabilă pentru activarea caspazei-9. Activitatea Apaf-1 reclamă prezenţa citocromului c şi a dATP, (Li et al., 1997). dATP asigură schimbarea conformaţiei Apaf-1 pentru a-i permite să se lege la cyt. c eliberat din mitocondrie. Pre-complexul format poate recruta apoi procaspaza-9 pentru activare. Acest complex multi-molecular a fost denumit apoptosom (Zou et al., 1999), (vezi figura 7.3).

Apaf-1 poate interacţiona şi cu alte proteine ca Bcl-XL şi caspazele -4 şi -8. Interacţiunea dintre Apaf-1 şi Bcl-XL se face în principal prin domeniul BH4 al Bcl-XL şi conduce la inhibarea asocierii Apaf-1/caspază-9 şi implicit la absenţa activării acestei caspaze. Apaf-1 este o proteină formată din trei domenii distincte: - un domeniu N-terminal (CARD), constituit din 85 aminoacizi, care prezintă omologii cu Ced-3 şi caspazele, care asigură interacţiunea cu caspazele; - un domeniu format din 320 de aminoacizi, care are asemănări cu Ced-4; - un domeniu C-terminal care conţine 12 repetiţii de motive WD-40 (implicate în interacţiunea proteină-proteină). Domeniul C-terminal pare a fi esenţial în reglarea negativă a Apaf-1, constatându-se că în absenţa lui, Apaf-1 poate activa caspaza-9 şi fără cofactorii săi (cyt. c şi ATP). Invalidarea genei pentru Apaf-1 asigură un fenotip asemănător cu cel determinat de invalidarea genelor pentru caspazele -3 şi -9. Şoarecii Apaf-1-/- prezintă o dezvoltare anormală a creierului şi mor în stadiul embrionar, (Ricci, 2002). S-a observat şi un decalaj în dispariţia membranei interdigitale care a fost eliminată târziu la şoarecii lipsiţi de caspazele -3 (casp. 3-/-) şi -9 (casp. 9-/-), rezultat care pare să indice faptul că Apaf-1 modulează activitatea altor caspaze.

Genele/proteinele din familia bcl-2/Bcl-2 Oncogena bcl-2 are activitate antiapoptotică şi antioxidantă şi poate fi

considerată „supresorul general al morţii celulare”. Proteina Bcl-2 a fost evidenţiată prima dată în celulele limfoamelor B umane (unde este produsă în cantităţi mari datorită unei translocaţii ce plasează gena bcl-2 sub controlul promotorului genei pentru lanţul greu al imunoglobulinei), iar ulterior a fost depistată şi în alte tipuri de cancer. Este o genă care se exprimă intens în ţesuturile embrionare. La mamifere există o întreagă familie a genei bcl-2: bcl-x, bax, bak, bad, bik, bid etc. La virusuri există gene omoloage acestora, ca: ASFV, LMV-5, BNRF-1, HVS, EBV etc, iar la nevertebrate – genele ced. Familia genelor bcl-2 codifică proteine având o greutate moleculară de 25-26 kDa, care au un capăt C-terminal de inserţie la diverse membrane intracelulare. Bcl-2 este deci o proteină de membrană. Specific proteinelor din această clasă este prezenţa unei zone hidrofobe la capătul terminal –COOH, care străbate stratul bilipidic, (Moldoveanu şi Popescu, 1999). Exceptând Bad şi Bid, toţi membrii familiei Bcl-2 prezintă un domeniu trans-membranar care le permite să se localizeze în

63

membrana mitocondrială, reticulul endoplasmatic, sau membrana nucleară externă, (Ricci, 2002). Potrivit cercetărilor întreprinse de Moldoveanu et. al (1998), Bcl-2 ar fi localizată în membrana mitocondrială internă. În structura proteinelor din această familie intră domenii de interacţiune cu alte proteine, din care au fost identificate patru (notate după N-terminal) şi anume: BH4, BH3, BH1 şi BH2, (fig. 7.6). Domeniile BH1 şi BH2 reprezintă secvenţe omoloage pentru interacţiunea proteină-proteină (în cadrul proteinelor din familia Bcl-2).

Fig. 7.6 – Familia de proteine Bcl-2. Regiunile notate cu 1-4 reprezintă domeniile BH1-BH4.

Zonele haşurate indică un domeniu transmembranar. Asteriscul arată că sunt prezentaţi doar ultimii 200 de aminoacizi (după O’Conor şi Strasser, 1999)

Domeniile BH1 şi BH2 sunt implicate probabil în formarea de canale, structura

lor tridimensională semănând cu cea a regiunii formatoare de pori a toxinei difterice. Aceste domenii diferă în secvenţa aminoacidică şi ca încărcare la cele două grupe de proteine Bcl-2 şi de aici probabil şi proprietăţile diferite ale porilor şi ale funcţiilor acestor proteine. Domeniul BH3, care este regiunea ce promovează moartea la toate proteinele Bcl-2, conţine un miez format din 8 aminoacizi, în care leucina din poziţia 1 şi acidul aspartic din poziţia 6 sunt esenţiali pentru heterodimerizare (mutaţiile în aceste poziţii împiedică heterodimerizarea şi anulează toxicitatea agoniştilor (agonist = substanţă care se leagă la un receptor al unei celule şi declanşează un răspuns al acelei celule) morţii. La proteinele Bcl-2 care inhibă apoptoza, domeniile BH3, BH2 şi BH1 formează un buzunar, care serveşte pe de o parte la afundarea domeniului BH3 (care nu-şi mai poate exercita funcţia de promotor al morţii), iar pe de altă parte constituie locul de reţinere (docking site) pentru domeniile BH3 ale agoniştilor morţii. Domeniul BH4 pare să fie implicat în interacţiunile (de tip proteină-proteină) cu proteine de reglare din afara familiei Bcl-2. Este un domeniu implicat în controlul desfăşurării ciclului celular şi pare să stabilizeze VDAC* (voltage-dependent anion channel; *factor implicat în

64

respiraţia mitocondrială şi controlul efluxului ATP din membrana mitocondrială externă; perturbările VDAC determină creşterea permebilităţii acestei membrane şi eliberarea cyt.c), (Schimmer et al., 2001).

Proteinele omoloage din familia Bcl-2 au fost clasificate în două grupe: - Grupa a I-a este formată din proteine anti-apoptotice, care includ proteinele A1/Bfl1, Bcl-2, Bcl-w, Bcl-xL, Boo/Diva, Mcl-1, NR-13 şi Nrf3 la mamifere, proteinele BHRF-1, E1B19K, Ks-Bcl-2, LMW5-HL şi ORF16 la bacterii şi proteinele Ced-9 la C. elegans. Cel mai evident mod de acţiune a lor ar fi legarea la proteinele pro-apoptotice, cărora le inhibă în acest fel funcţiile; - Grupa a II-a este formată din proteine pro-apoptotice, care includ proteinele Bad, Bak, Bax, Bcl-rambo, Bcl-xS, Bid, Bik, Bim, Blk, BNIP3, Bok/Mtd, Hrk şi Nip3 la mamifere şi proteinele Egl-1 la C. elegans, (FAN et al., 2005).

Proteinele anti-apoptotice (pro-supravieţuire) conţin toate cele 4 domenii BH: BH1, BH2, BH3 şi BH4. Proteinele pro-apoptotice se pot clasifica la rândul lor în două subgrupe: a) subfamilia Bax, formată din Bax, Bak şi Bok – care (toate) posedă domeniile BH1, BH2 şi BH3; b) subfamilia proteinelor care au doar BH3 (BH3-only), din care fac parte Bid, Bim, Bik, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma, Blk, Bnip3 si Spike. Acestea din urmă au doar un scurt motiv BH3, domeniu de interacţiune necesar şi suficient pentru acţiunea lor apoptotică, (Gewies, 2003).

Prezenţa în cadrul familiei de proteine Bcl-2 a unor domenii cu nivel ridicat de omologie (BH1, BH2, BH3) le permite formarea de homo- şi hetero-dimeri. Prin intermediul BH1 şi BH2, se formează homo-dimeri anti-apoptotici Bcl-2 sau Bcl-XL. Membrii pro-apoptotici ai Bcl-2, care conţin un domeniu BH3 (Bax, Bak), pot interacţiona cu Bcl-2 sau Bcl-XL fie prin intermediul domeniului BH3, fie cu ajutorul buzunarului hidrofob format de domeniile BH1, BH2 şi BH3 ale Bcl-2 şi Bcl-XL. Apare deci că echilibrul între moartea şi supravieţuirea celulară depinde de tipul şi proporţia de dimeri pro- şi anti-apoptotici formaţi. Dacă, de exemplu, se exprimă preferenţial Bax, se vor forma homodimeri Bax-Bax şi se va produce moartea celulară, iar dacă Bcl-2 se exprimă preferenţial atunci se vor forma dimeri Bcl-2/Bcl-2 şi celula va supravieţui, (deşi, se pare că astfel de dimeri Bcl-2 nu se formează, Bcl-2 având efect anti-apoptotic sub formă de monomer). Proteinele Bad şi Bid, care conţin doar domeniul BH3, nu pot forma homo-dimeri, iar rolul lor pro-apoptotic se exercită prin formarea de dimeri cu membrii anti-apoptotici, reducându-le astfel capacitatea de a genera homo-dimeri, (Ricci, 2002).

Şoarecii lipsiţi de gena bcl-2 sunt viabili, deşi majoritatea lor mor la câteva săptămâni după naştere. Ei dezvoltă o insuficienţă renală severă, datorată unui număr redus de nefroni. Se pare că proteina Bcl-2 joacă rol minor în diferenţierea celulelor T imature, dar este esenţială pentru supravieţuirea limfocitelor T mature. Alături de genele bcl-2, produşii genelor bcl-XL (genele bcl-2 şi bcl-XL sunt omoloage cu ced-9) sunt necesari în timpul dezvoltării embrionare şi au un efect anti-apoptotic puternic. Proteinele codificate de aceste gene au structură tridimensională (două helixuri hidrofobe înconjurate de alte cinci helixuri amfipatice). Şi în acest caz sunt importante domeniile BH1, BH2 şi BH3 pentru manifestarea efectului anti-apoptotic, mutaţiile produse la nivelul acestor domenii provocând pierderea efectului menţionat. Şoarecii

65

lipsiţi de gena Bcl-X mor în a 13-a zi de dezvoltare embrionară. Ei prezintă o apoptoză masivă la nivelul creierului, măduvei spinării şi timusului. Spre deosebire de Bcl-2, Bcl-X pare esenţială pentru supravieţuirea limfocitelor imature, (Ricci, 2002).

Genele bax (bcl-2 associated X protein) codifică proteine ce pot forma homo-dimeri între ele şi hetero-dimeri cu proteinele Bcl-2. Proteinele din familia Bax conţin, cum am arătat deja, domeniile BH1, BH2 şi BH3, care le asigură homo- sau hetero-dimerizarera. Dacă nivelul de homo-dimeri Bax-Bax creşte în detrimentul hetero-dimerilor de tipul Bax-Bcl2 celula se îndreaptă spre apoptoză, iar dacă creşte cantitatea de homo-dimeri Bcl2–Bcl2

în defavoarea hetero-dimerilor Bax-Bcl2, celula merge spre supravieţuire. Mutaţiile care au loc la nivelul domeniilor BH ale proteinei Bax o pun în incapacitatea de a forma homo- şi hetero-dimeri. Apoptoza indusă de radioterapie într-o serie de cancere (pulmonar, de col uterin) a fost asociată cu expresia sporită de proteine Bax, după cum în alte cancere (de colon, gastric, endometrial) s-au depistat mutaţii ale genelor bax. Şoarecii lipsiţi de gena bax (bax

-/-) sunt viabili, ceea ce arată că gena în discuţie nu este esenţială pentru dezvoltarea organismului; masculii lipsiţi de Bax sunt sterili. S-a constatat totodată că neuronii proveniţi de la şoarecii invalidaţi pentru Bax proliferează în abesnţa factorului de creştere, (Ricci, 2002). Această familie de proteine induce apoptoza acţionând la nivelul mitocondriilor. Ar exista 3 mecanisme de acţiune a lor: la nivelul membranei mitocondriale externe, prin care Bax accelerează deschiderea VDAC (Voltage Dependent Anion Channel) şi implicit eliberarea cyt. c; la nivelul membranei mitocondriale interne, unde ar interacţiona cu ANT şi ar intensifica permeabilitatea acesteia; exprimată la nivele ridicate, Bax poate forma pori în membrana mitocondrială şi induce eliberarea cyt. c, (Schimmer et al., 2005). Potrivit datelor experimentale obţinute de Shimizu et al. (2001), VDAC joacă un rol esenţial în eliberarea apoptogenă a cyt. c din mitocondrii şi în apoptoză la mamifere.

Genele bak (bcl-2 homologous antagonist/killer) Aceste gene au efect pro-apoptotic, sunt în număr de trei, sunt situate la om pe

cromosomii 6 (gena bak 1), 20 (gena bak 2), şi 11 (gena bak 3), iar expresia lor s-a identificat în muşchii scheletului, în ficat, ţesutul cardiac, pancreas, rinichi. Produşii acestor gene au o structură asemănătoare proteinelor Bcl-2 (domeniile BH1 şi BH2 ale celor două categorii de proteine au o secvenţă de aminoacizi seamănă în proporţie de 53%). Proteinele Bak au la capătul C-terminal un domeniu hidrofob, ceea ce sugerează că ele se pot integra în membrane. Modul de acţiune al proteinelor Bak este încă necunoscut. Ele ar avea capacitatea de a forma homo-dimeri şi ar interacţiona cu alte proteine şi în acest mod s-ar implica în procesele pro-apoptotice sau anti-apoptotice. S-a constatat că inactivarea genei bak la şoareci nu are nici un efect, iar inactivarea genei bax afectează uşor apoptoza, pe când la şoarecii knock-out pentru ambele aceste gene apoptoza este dramatic împiedicată pe parcursul dezvoltării, ceea ce conduce la acumularea de celule în exces în sistemul hematopoietic şi în creier. Se crede că oligomerii Bax şi Bak determină/sau contribuie la permeabilizarea membranei mitocondriale externe, (Gewies, 2003).

Genele bad. Proteinele BAD, care au doar domeniul BH3, sunt inhibitori ai Bcl-2 şi Bcl-xL şi prototipuri interesante de agenţi terapeutici. Domeniul BH3 este necesar pentru a se lega la Bcl-2 sau Bcl-xL. Ele pot deci dimeriza cu proteinele Bcl-2 şi Bcl-XL (având afinitate mult mai ridicată pentru proteinele Bcl-XL), dar nu şi cu proteinele

66

pro-apoptotice Bax sau Bak. Proteinelor BAD le lipseşte domeniul de ancorare de la capătul C-terminal (zona hidrofobă –COOH terminală), specific familiei de proteine Bcl-2, de unde concluzia că ele nu se pot integra în membrane, fiind localizate în citoplasmă. Se presupune că proteinele BAD ar avea rol reglator şi ar preveni formarea de hetero-dimeri Bcl-XL/Bax. În cazul în care proteinele Bax formează hetero-dimeri apoptoza este inhibată, iar când proteinele BAD dimerizează cu proteinele Bcl-XL, atunci proteinele Bax devin libere şi pot induce apoptoza celulară. BAD ar putea de asemenea inhiba capacitatea proteinelor Bcl-2 şi Bcl-xL de a forma canale în membrana mitocondrială, sau de a se lega şi a stabiliza VDAC. BAD este o proteină pro-apoptotică reglată prin fosforilare, proces care-i determină schimbări de conformaţie, (Schimmer et al., 2005).

Din familia genelor bcl-2 fac parte şi genele bik şi bim. Proteinele Bik ar conţine numai domeniul BH3 şi prezenţa lor în exces ar determina intrarea celulei în apoptoză. Proteinele Bim ar acţiona ca un ligand tanatogen, (Dănăilă et al., 1999).

Genele harakiri

Proteina harakiri (Hrk) are capacitatea de a interacţiona cu proteinele care împiedică apoptoza (Bcl-2, Bcl-XL), dar nu şi cu cele pro-apoptotice (Bax, Bak). Proteina Hrk este lipsită de domeniile BH1 şi BH2, dar prezintă o porţiune de 8 aminoacizi cu omologie ridicată cu domeniul BH3. Expresia Hrk induce moartea celulară, care este inhibată de expresia Bcl-2 şi Bcl-XL. Deleţia unei porţiuni de 16 aminoacizi din această proteină, porţiune care include şi domeniul omolog lui BH3, anulează capacitatea Hrk de a interacţiona cu Bcl-2 şi Bcl-XL în celulele de mamifere, (Inohara et al., 1997).

Genele BAR. În cadrul familiei de proteine Bcl-2 s-a descoperit un nou membru anti-apoptotic – proteina BAR, care are o structură aparte, fiind constituită din patru domenii: RING, SAM, DED şi un domeniu trans-membranar (Zhang et al., citat de Ricci, 2002). Domeniul SAM asigură interacţiunea proteinei BAR cu Bcl-2 şi Bcl-XL şi inhibă apoptoza indusă de Bax. Prin intermediul DED, ea interacţionează cu pro-caspazele şi anulează astfel moartea celulară indusă prin receptorul Fas. BAR poate forma un complex molecular între Bcl-2 şi pro-caspaza-8. Se consideră că BAR ar putea intra în competiţie cu proteine adaptoare (precum FADD) pentru legarea la pro-caspazele -8 şi -10.

Din cele prezentate rezultă că, în cadrul marii familii de proteine Bcl-2, intră atât proteine cu efect pro-apoptotic, cât şi cu efect anti-apoptotic. Activarea acestor proteine se poate realiza fie prin interacţiunea dintre ele, fie prin acţiunea lor asupra membranelor celulare, fie prin interacţiunea lor cu sistemele enzimatice celulare (care sunt, sau nu sunt, implicate în apoptoză). Prezenţa unor domenii omoloage la membrii acestei familii de proteine permite realizarea de interacţiuni de tipul proteină-proteină. Inducţia sau inhibiţia apoptozei depinde de nivelul de expresie şi de interacţiunile dintre aceste proteine la un moment dat. Un factor important în reglarea procesului de apoptoză este reprezentat de raportul dintre homo- şi hetero-dimeri. Se pare că interacţiunea între membrii diferiţi ai familii de proteine Bcl-2 (hetero-dimerizarea) duce la inactivarea lor (indiferent că au funcţie pro-, sau anti-apoptotică).

O altă cale de intervenţie în apoptoză a unor proteine Bcl-2 (moleculele anti-apoptotice Bcl XL şi Bcl-2 şi proteina pro-apoptotică Bax) ar fi capacitatea lor de a genera pori (canale ionice) în membranele celulare (asemănător unor toxine bacteriene

67

precum toxina difterică, colicinele). Diametrul porilor generaţi de proteinele Bcl-2 şi Bcl-XL, ca şi durata lor de deschidere, variază funcţie de condiţiile intracelulare, de interacţiunile cu alte proteine implicate în permeabilitatea membranei, de proprietăţile membranei la care sunt ataşate, de pH etc. Inserţia proteinelor Bcl-2 şi Bcl-XL pe faţa internă a unor membrane (nucleară, mitocondrială sau a reticulului endoplasmatic) din interiorul celulei determină formarea acestor canale prin care se produce transportul şi distribuţia unor ioni (în special a calciului) în interiorul unor compartimente celulare.

Semnificaţie aparte în procesul de apoptoză pare să aibă formarea acestor canale trans-membranare la nivelul mitocondriilor. Activitatea anti-apoptotică a proteinelor Bcl-2 şi Bcl-XL ar consta tocmai în inhibarea tranzitului prin aceste canale. Arătam anterior că, în timp ce producerea în exces de proteine Bcl-2 reduce permeabilitatea tranzitorie (PT) a membranei mitocondriale, producerea în exces de proteine Bax dimpotrivă duce la creşterea ei. Se pare că formarea acestor canale (şi permeabilizarea tranzitorie a membranelor) reprezintă fenomenul cheie, punctul nodal în desfăşurarea apoptozei, care ar mai putea fi controlat prin mecanismele anti-apoptotice. Porii de permeabilitate tranzitorie (porii PT) sunt canale oligo-proteice constituite la nivelul membranei externe de către porină (sau VDAC – Voltage

Dependent Anion Channel), iar la nivelul celei interne de către ANT (Adenine Nucleotide

Translocator) şi ciclofilina D (o proteină matricială), (Ricci, 2002). VDAC este o proteină specifică membranei mitocondriale externe, care generează un canal de transport pentru ioni, adenin-nucleotizi şi alţi metaboliţi în interiorul şi în afara mitocondriei (Eckardt, 2006). S-a constatat că Bax şi Bak intensifică activitatea VDAC şi implicit trecerea cyt. c prin canal, în timp ce Bcl-XL închide VDAC (Shimizu et al., 2001). ANT sau ADP/ATP translocator este o proteină care facilitează schimbul de ADP din citosol cu ATP mitocondrial, având rol central în reglarea capacităţii oxidative celulare (Portman, 2002). Ciclofilinele sunt proteine care se pot lega la ciclosporine. Ciclofilina D (Cyp-D) este un component al porului PT mitocondriale, afându-se în matrixul mitocondrial. Această proteină reglează deschiderea porului PT prin interacţiunea ei cu ciclosporina. Formarea canalelor ionice determină, direct sau indirect, hiper-polarizarea membranei mitocondriale, cu următoarele repercusiuni: intensificarea afluxului de Ca2+ către mitocondrii, diminuarea formării de radicali liberi, prevenirea ruperii membranei mitocondriale externe şi implicit împiedicarea eliberării în citosol a unor proteine (cyt. c) cu rol apoptogen, care pot activa caspazele, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

În procesele biochimice specifice apoptozei un rol important revine schimbărilor produse la nivelul mitocondriilor şi nucleului celular. În cursul apoptozei are loc eliberarea din mitocondrii a citocromului c (cyt. c), proteină cu implicaţii deosebite în procesele de oxido-reducere celulară. Această proteină se găseşte în ribozomi ca apo-citocrom c, formă sub care este transferată în mitocondrii, unde se asociază cu hemul, generând holo-citocromul c. Sub această formă este eliberat citocromul c din mitocondrie în citoplasmă în cursul apoptozei. Se consideră că acest proces nu este unul activ, nefiind certă calea de eliberare a cyt. c din mitocondrie, fie prin porii care asigură schimburile de ioni, fie prin porii formaţi de proteinele Bcl-2 şi Bcl-XL. În acelaşi timp cu cyt. c se mobilizează în citoplasmă şi un factor mitocondrial (o proteină având gr. mol. de 50 kDa), care realizează condensarea cromatinei şi fragmentarea nucleului, procese specifice apoptozei. Eliberarea cyt. c din mitocondrii

68

în citoplasmă duce la activarea caspazei-3 (printr-un mecanism încă neelucidat). În citosol, cyt. c se asociază cu Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1 – omolog al lui Ced-4 la mamifere), iar complexul format activează (în prezenţa ATP, sau dATP) caspaza-3. Proteinele Bcl-2 şi Bcl-XL au tocmai rolul de a bloca eliberarea cyt. c în citoplasmă şi implicit inhibarea activităţii caspazei-3. Ele ar asigura păstrarea homeostaziei mitocondriilor. Proteina Bcl-XL împiedică hiper-polarizarea membranei mitocondriilor, previne balonizarea lor şi ruperea membranei mitocondriale. Ea ar inhiba semnalele apoptotice spre structurile din mitocondrii. Se consideră, de altfel, că efectul anti-apoptotic al proteinelor Bcl-2 şi Bcl-XL se exercită tocmai prin acţiunea lor complexă asupra mitocondriilor, (Dănăilă et al., 1999).

Fiind ancorată de membranele intracelulare (cu orientare către citosol), proteina Bcl-2 poate acţiona ca „adaptor” sau „captator” pentru unele proteine din citosol (pe care le poate sechestra în membrană sau le poate asocia cu alte proteine membranare). Una dintre aceste proteine este Ced-4 (Apaf-1 la mamifere), implicată(e) în activarea caspazei-3. Această proteină este localizată în mod normal în citosol. Proteinele Bcl-2 cu activitate anti-apoptotică îndepărtează de membrană proteina Ced-4 (respectiv Apaf-1) în citosol, dar pot (prin asociere cu proteina Raf-1) s-o capteze prin intermediul domeniului ei BH4 (prezent la toate proteinele Bcl-2 cu activitate anti-apoptotică). Prin intermediul aceluiaşi domeniu BH4, proteina Bcl-2 se poate asocia cu calcineurina (o fosfatază Ca2+/calmodulin-dependentă). Aflată în exces, enzima induce apoptoza. Bcl-2 poate inhiba activitatea enzimei, şi implicit apoptoza, prin sechestrarea ei în membranele intracelulare. Totodată, prin capacitatea Bcl-2 de a forma canale proteice în membranele celulare, ea facilitează transportul de proteine prin membrane în ambele sensuri. Ea poate, de exemplu, lega proteina BP2 (asociată cu proteina p53), iar complexul format (p53-BP2) să-l transfere în nucleu. Cum am arătat anterior că proteinele Bcl-2 pot modifica permeabilitatea membranelor mitocondriale şi genera pori (canale) prin care sunt eliberaţi factori de activare a caspazelor (cyt. c şi factorul de inducere a apoptozei- AIF), (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

Ca şi când aspectele prezentate nu ar fi suficient de complicate, s-a constatat în plus că proteinele anti-apoptotice Bcl-2 şi Bcl-XL pot fi scindate de caspaza-3 activată, cu formarea unui fragment proteic de 23 kDa, care manifestă însuşiri pro-apoptotice certe. Prin urmare, unele proteine Bcl-2 anti-apoptotice pot avea, prin clivarea lor, şi acţiune pro-apoptotică. Acest efect pro- şi anti-apoptotic al proteinelor din familia Bcl-2 se poate exercita şi prin interacţiune cu kinazele dependente de ciclul celular (Cdk). Activarea Cdk determină apoptoza. Proteinele Bcl-2 şi Bax au calitatea de a modula activitatea Cdk2. Producerea în exces de Cdk2 accelerează apoptoza, în timp ce excesul de proteine Bcl-2 o întârzie. O altă kinază, Raf-1, poate forma hetero-dimeri cu proteinele Bcl-2 şi Bcl-XL şi astfel poate să blocheze acţiunea anti-apoptotică a acestora.

În apoptoză pot fi implicate şi speciile reactive de oxigen (ROS). Există o cale de activare a apoptozei ROS-dependentă (indusă prin TNFα sau prin eliminarea factorului de creştere) şi o cale ROS-independentă (indusă prin stimularea receptorilor Fas). Proteinele Bcl-2 ar avea capacitatea de a bloca transmiterea semnalelor apoptotice pe calea ROS-dependentă (în etapa de activare). Proteina Bcl-2 exercită în celulă şi acţiune antioxidantă. Localizarea ei în apropierea zonelor din celulă unde sunt

69

generaţi radicali liberi, pare un argument în acest sens. Ea poate proteja celula de apoptoza indusă de unii factori ca: radiaţiile, apa oxigenată, de inhibitorii glutation-sintetazei, de agenţii chimici ce provoacă stresul oxidativ (paraquat, menadionă, etoposid). Această activitate antioxidantă a proteinei Bcl-2 s-ar realiza prin: captarea radicalilor liberi, chelarea metalelor redox active, prevenirea peroxidării fosfolipidelor din membrane, blocarea translocării extracelulare a glutationului, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

Gena p53 (proteina p53)

Proteina p53 a fost evidenţiată datorită capacităţii ei de a co-precipita cu antigenul mare T de la virusul simian SV40. Ea a fost clonată la câteva specii şi suspectată iniţial a fi o oncogenă, întrucât exprimarea în exces a proteinei p53 s-a considerat că ar participa la transformarea tumorală a celulelor. S-a constatat ulterior că acţiunea ei oncogenă era determinată de unele forme mutant ale proteinei. În cancerul de colon, de exemplu, există o frecvenţă înaltă a mutaţiilor acestei gene. Se apreciază că, pierderea funcţiei p53 apare în cca 70% din cancerele colo-rectale, în 50% din cele pulmonare şi în 40% din cancerele de sân. De altfel, în cca 50% din cancerele umane apar proteine p53 mutant. Gena p53 de tip sălbatic face parte din categoria anti-oncogenelor, adică a genelor care suprimă dezvoltarea tumorală. Proteina p53 este un adevărat „gardian” celular, ea controlând ciclul celular. Cum se ştie, ciclul celular este reglat de complexele cicline/kinaze ciclin-dependente (cdk). Concentraţia şi activitatea acestor complexe cicline/cdk controlează ciclul celular. Prin blocarea formării lor poate fi stopat ciclul celular şi poate fi chiar indusă apoptoza (Van Cruchten şi Van Den Broek, 2002).

Studiul ADN-ului specific acestei proteine la diverse specii au relevat prezenţa a cinci regiuni conservate evolutiv, care au un anumit rol în activitatea proteinei. Patru dintre aceste regiuni sunt situate în inima domeniului central al p53, domeniu prin care p53 se leagă la genele ţintă, (Choisy-Rossi et al., 1999). Această genă este situată pe braţul scurt al cromosomului 17 la om. Proteina p53 specificată de această genă, conţine 393 de aminoacizi, are o durată scurtă de existenţă (cca 15 minute) şi este un regulator al creşterii celulare în numeroase tipuri de celule. Deficienţa celulelor în p53 le conferă o rezistenţă crescută la radiaţii sau la chioterapicele folosite în tratarea cancerului, (Somani et al., 2010).

Proteina p53 este localizată în nucleu, unde se poate afla sub formă fosforilată şi nefosforilată. Ea reprezintă în final o fosfo-proteină (de 53 kDa) modificată şi reglată prin fosforilare la multe situsuri. În condiţii normale de viaţă, p53 este o proteină foarte instabilă, având o durată medie de viaţă de 5 la 30 minute, cantitatea ei în celule fiind redusă, (Moll şi Petrenko, 2003). Nu are rol important în desfăşurarea normală a mitozei şi meiozei, dar intervine se pare în trecerea de la stadiul G0 la G1 al diviziunii. În condiţiile lezării ADN-ului celular de către radiaţii sau substanţe chimioterapice, proteina p53 produsă ulterior induce expresia genei p21, iar proteina p21 blochează complexele cicline/cdk şi astfel stopează ciclul celular. Creşterea cantităţii de proteină p53 în celulă ar determina şi sporirea nivelului transcripturilor bax, care ulterior induc apoptoza (Kamesaki, citat după Van Cruchten şi Van Den Broek, 2002). În stare nativă, proteina p53 se găseşte sub formă de tetrameri, iar domeniul de oligomerizare al p53 este situat la capătul C-terminal, mai exact la resturile de aminoacizi 323-355.

70

De altfel, C-terminal joacă un rol important în reglarea activităţii acestei proteine. Activitatea proteinei p53 poate fi totodată modificată de interacţiunea cu diverse proteine celulare sau virale, (Choisy-Rossi et al., 1999).

Transformarea malignă a celulelor presupune inactivarea genei p53 normale (de tip sălbatic). Două sunt funcţiile mai importante ale proteinei p53:

a) factor de transcripţie; b) inhibitor al replicării ADN.

În primul caz, proteina p53 stimulează transcripţia genelor care au la nivelul promotorului un situs de legare cu ea. Exemple de gene de acest tip sunt: gena Mdm2 (reglator negativ al proteinei p53), gena pentru creatinin-kinaza musculară, gena gadd-

45 (growth arrest DNA damage inducible), gena Waf-1 (wild type p53 activated fragment). Produşii acestor gene participă la repararea ADN-ului după diverse leziuni. Proteina p53 poate inhiba transcripţia unor gene precum: genele c-fas, c-jun şi Rb.

Realizarea celeilalte funcţii, de inhibitor al replicării ADN, este exercitată de proteina p53 prin interacţiunea cu unele proteine esenţiale în sinteza ADN, cum este proteina RPA (replicator protein A). Unele procese de transcripţie dependente-p53 şi căile de implicare a proteinei p53 în apoptoză sunt ilustrate în figura 7.7.

Fig. 7.7 - Procese de transcripţie p53-dependente şi modalităţi de intervenţie a proteinei p53 în reglarea activităţii caspazelor (după Moldoveanu şi Popescu, 1999)

Care este mecanismul de funcţionare al genei (proteinei) p53? În condiţiile

lezării ADN-ului celular de către factori de natură diversă, în situaţia în care celula nu este distrusă, ea îşi activează o cale de semnalizare (în care sunt implicate protein-kinazele) care duce la activarea (tetramerizarea) proteinei p53, fapt ce-i sporeşte

71

nivelul, stabilitatea şi durata de viaţă (gena p53 este deci activată în urma leziunilor pe care le suferă ADN-ul celular). Proteina p53 acţionează apoi asupra unor efectori specifici ca Waf-1 şi Gadd-45, care au rolul de a bloca trecerea din faza G1 în faza S a ciclului celular, (blocarea ciclului celular s-ar exercita, aşa cum s-a precizat anterior, prin intermediul proteinei p21). În acest fel se asigură un interval mai mare de timp pentru intervenţia sistemelor de reparaţie a leziunilor ADN, evitându-se mutaţiile (transmiterea ADN-ului lezat la celulele fiice, prevenind astfel multiplicarea genelor lezate). Prin urmare, proteina p53 stimulează procesele de reparaţie a ADN-ului, prin întârzierea sau chiar oprirea ciclului celular. Nivelul proteinei p53 în celulă revine la normal după repararea leziunilor ADN.

Proteina p53 este implicată în inhibarea proliferării tumorale, numai că în acest caz - al transformării tumorale a celulei, funcţia ei protectoare este depăşită, datorită unor dereglări multiple (nu numai din cauza lezării ADN-ului). Depăşirea funcţiei proteinei 53 poate duce însă la apoptoza celulară. Unele experienţe au arătat că există o legătură certă între prezenţa proteinei p53 şi apoptoză. S-a constatat, de exemplu, că timocitele lipsite de proteina p53 rezistau la doze mari de iradiere şi nu intrau în apoptoză, în timp ce în prezenţa proteinei p53, timocitele intrau în apoptoză la doze mici de iradiere, (Clarcke et al., citaţi după Choisy-Rossi et al., 1999). Se consideră că există o relaţie liniară între cantitatea de proteină p53 din celule şi probabilitatea intrării lor în apoptoză. Un nivel redus al acestei proteine (de tip sălbatic) determină blocarea creşterii, în timp ce la nivele înalte proteina p53 induce apoptoza, deşi lezarea ADN-ului celular ar favoriza răspunsul apoptotic fără alterarea nivelului de proteină p53 în celule, (Chen et al., citaţi după Choisy-Rossi et al., 1999).

Nu este prea clar mecanismul prin care proteina p53 se implică în inducerea apoptozei. S-a sugerat probabilitatea intervenţiei ei în activarea unor gene pro-apoptotice sau în inhibarea unor gene anti-apoptotice. Oricare ar fi acest mecanism, este cert faptul că pe măsura amplificării leziunilor (persistente) produse în ADN, creşte cantitatea de proteină p53 în celulă şi implicit probabilitatea ca celula să intre în apoptoză. Proteina p53 este privită ca un mecanism general de protecţie celulară, inclusiv antitumorală, care acţionează în condiţii diverse, iar fenomenul care o activează şi valorizează pare a fi alterarea ADN-ului celular. Dacă leziunile produse ADN-ului sunt reparabile, celula supravieţuieşte, iar dacă sunt ireparabile, atunci celula intră în apoptoză. Mutaţiile cu sens greşit (missense) produse în zona codificatoare a genei p53 pot provoca pierderea funcţiei de supresor tumoral al proteinei p53; mutaţiile produse în domeniul N-terminal determină pierderea capacităţii de activare a transcripţiei; mutaţiile care apar în regiunea bogată în resturi de prolină (resturile aminoacil 61-92) diminuează proprietatea proteinei p53 de a bloca ciclul celular şi de a media procesul de apoptoză (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

Stabilitatea proteinei p53 ar fi controlată de o fosfoproteină, Mdm2 (mouse

double minute 2). Mdm2 este o E3 ubiquitin-ligază şi principal antagonist al proteinei p53. Mdm2 reprezintă principalul antagonist celular al p53, ea asigurând menţinerea unor niveluri celulare scăzute ale proteinei p53 în absenţa stresului, este proteina care limitează funcţia de supresor tumoral al p53, (Moll şi Petrenko, 2003). Proteina umană Mdm2 (numită şi Hdm2) este formată din 491 resturi de aminoacizi şi prezintă la capătul N-terminal un domeniu de legare pentru proteina p53, interacţiunea dintre cele două proteine determinând blocarea activităţii proteinei p53. Cele două proteine sunt

72

legate între ele printr-un mecanism de tip feed-back (Moll şi Petrenko, 2003; Klein şi Vassilev, 2004). Proteina p53 induce transcripţia genei mdm2 (este o genă p53-inductibilă), asigurând sinteza unui produs (în prezenţa ubiquitinei) care determină propria ei degradare; o moleculă de proteină Mdm2 are capacitatea de a degrada mai multe molecule de proteină p53. În prezenţa unei proteine p53 mutant, transcripţia genei Mdm2 nu mai este posibilă şi în acest fel nu mai are loc nici degradarea proteinei p53, care se acumulează. Aşa s-ar explica stabilitatea ridicată a proteinelor p53 mutant într-o serie de tumori, cauzată de incapacitatea acestora de a induce transcripţia genei mdm2. Totodată, în multe tumori proteina Mdm2 este produsă în exces, proces care determină o restricţionare a funcţiei p53 (Klein şi Vassilev, 2004).

Factorul de inducere a apoptozei (AIF) Într-o lucrare de sinteză dedicată apoptozei, Somani et al., (2010) arată că AIF

este o flavoproteină situată pe membrana mitocondrială externă, care în momentul inducţiei apoptozei este translocată în nucleu şi în citosol, unde promovează o cale a apoptozei independentă de caspaze, prin condensarea periferică a cromatinei şi clivarea ADN-ului în fragmente de 50 Kpb. S-a constatat că AIF poate cataliza in vitro reducerea cyt. c în prezenţa NADH, ceea ce sugerează că cyt. c poate fi acceptor de electroni pentru AIF. Efectele AIF asupra cromatinei şi ADN-ului s-ar putea datora fie unei activităţi nucleazice criptice a AIF, fie creşterii susceptibilităţii ADN-ului la nucleazele latente în urma interacţiunii AIF-ADN, fie capacităţii AIF de a recruta nucleazele din aval şi a produce o cromatinoliză parţială. AIF ar putea fi în unele cazuri (atunci când activarea caspazelor are loc timpuriu) un efector al MC independentă de caspaze, eliberarea AIF din mitocondrii fiind un eveniment secundar activării caspazei-8, iar în alte cazuri să fie reclamat pentru activarea cascadei de caspaze cyt. c-dependentă. Se sugerează ideea că AIF şi caspazele ar acţiona împreună în procesele specifice apoptozei, contribuţia lor depinzând de stimulii de inducere a apoptozei şi probabil şi de tipul celular, (Somani et al., 2010).

Translocatorul adenin-nucleotid (ANT) ANT este o proteină a membranei interne mitocondriale, care aparţine

complexului multiproteic PTPC (permebility transition pore complex - complexul porului permeabilităţii de tranziţie) şi facilitează schimbul de ADP citosolic pentru ATP mitocondrial, (Belzacq et al., 2002; Portman, 2002). Complexul PTPC este localizat la locul de contact dintre membrana externă şi cea internă a mitocondriilor, fiind constituit (cel puţin) din receptorul benzodiazipen periferic (PBR) şi VDAC (în membrana externă), ANT şi ciclofilina D (în matrix) şi hexochinază (în citosol). ANT este o proteină bi-funcţională care, în funcţie de contextul celular, poate exercita rol vital sau letal. În condiţii fiziologice normale proteina catalizează schimbul ADP/ATP prin membrana internă a mitocondriilor, iar în apoptoză contribuie la moartea celulară programată prin formarea, în cooperare cu proteinele de tip Bax (Bax-like), a unui por letal. Faptul că proteina ANT este implicată în apoptoză s-a dedus dintr-o serie de experienţe efectuate in vivo şi in vitro, în care s-a constatat, printre altele, că inhibarea deschiderii porului PTPC cu o serie de substanţe (ANT-ligand, acidul bongkreik, ciclosporina A, ligandul ciclofilinei D etc) a protejat celulele de apoptoză; inhibitorii menţionaţi previn pierderea potenţialului mitocondrial trans-membranar (∆Ψm),

73

eveniment care precede apoptoza nucleară etc. Belzacq et al. (2002) au constatat că, după translocarea mitocondrială, Bax interacţionează cu ANT pentru a forma un por letal ne-specific, proces care a fost inhibat de către acidul bongkreik sau ciclosporina A, inhibitori ai PTPC. ANT poate declanşa MMP (permeabilizarea membranei mitocondriale) prin formarea unui por letal ne-specific, prin cooperare şi sub controlul proteinelor Bax/Bcl-2. Deschiderea porului ANT permite deplasarea apei şi ionilor prin membrana internă a mitocondriilor, pierderea ∆Ψm, umflarea matrixului, şi eliberarea proteinelor inter-membranare mitocondriale prin membrana externă, evenimente care activează căile de degradare din aval. La om există 3 izoforme ale ANT, codificate de gene distincte. Mutaţia genei ANT1 (substituţia alaninei cu prolina la codonul 114) determină o boală autosomală dominantă denumită oftalmoplegie progresivă, (Kaukonen et al., 2000, citaţi de Belzacq et al., 2002). Sunt preocupări de identificare a unor agenţi chimici care să moduleze funcţia porului ANT în perspectivă terapeutică, fără a-i afecta însă funcţia fiziologică de translocator ADP/ATP.

La nematodul C. elegans, controlul MCP este asigurat de cooperarea a 4 factori apoptotici şi anume: EGL-1, CED-9, CED-4 şi CED-3. SHEN et al. (2009) au identificat un factor, denumit WAN-1 (ortolog al ANT de mamifere), ca fiind un reglator al MC, inactivarea genei pentru acest factor inhibând moartea celulelor liniei somatice şi germinale la nematod. Proteina WAN-1 este localizată în mitocondrii şi poate complexa atât cu CED-4 cât şi cu CED-9. Iniţiatorul MC la nematod, EGL-1, poate să rupă interacţiunea CED-9/WAN-1. Autorii consideră că WAN-1 cooperează cu inima maşinăriei MC pentru a promova MCP la C. elegans.

Gena/proteina c-myc

Gena c-myc face parte dintr-o familie de proto-oncogene (alături de genele l-myc şi n-myc), este situată la om pe braţul lung al cromozomului 8 şi este implicată în controlul creşterii şi proliferării normale a celulelor. Proteina specificată de această genă este localizată în nucleu şi are rolul (singură sau în combinaţie cu alte proteine) de factor de transcripţie a unor gene pro-mitotice. Proteina c-Myc s-ar putea asocia cu proteina Rb - un factor de reglare a ciclului celular (produs al genei Rb - retinoblastoma

tumor suppresor gene). Dereglarea expresiei c-myc reprezită un factor important în dezvoltarea tumorală. Proteina c-Myc este exprimată în exces în numeroase forme de cancer: 80% în cancerele de sân, 70% în cancerele de colon, 90% în cancerele ginecologice, 50% în carcinoamele hepatocelulare etc, (Gardner et al., 2002). Proteina c-Myc este totodată şi un factor de inducere a apoptozei. S-a observat demult de către patologi că în limfomul Burkitt are loc atât un index mitotic înalt, cât şi o rată ridicată a apoptozei – ilustrată de abundenţa nucleilor picnotici. Totodată, fibroblastele care exprimă în exces c-myc sunt afectate de apoptoză în condiţiile unor factori de stres ca insuficienţa serului, hipoxie, cantitatea redusă de glucoză Nu se ştie exact cum acţionează genele c-myc în cazul proliferării celulelor (inclusiv tumorale) şi cum acţionează în cazul apoptozei, dar s-a constatat că regiunile Myc reclamate pentru apoptoză sunt aceleaşi cu cele solicitate pentru transformarea celulară, (Gardner et al., 2002). În condiţiile privării de factori de creştere ar avea loc apoptoza din cauza activării genei c-myc. Prin interacţiune cu proteinele Bcl-2, apoptoza indusă de proteinele c-Myc ar fi blocată, dar nu şi funcţia lor mitogenă (de proliferare celulară).

74

Totodată, proteinele c-Myc pot forma hetero-dimeri cu proteinele MAX, complexul MAX-Myc având activitate pro-apoptotică, (Dănăilă et al., 1999).

Genele ras

Proto-oncogenele ras au fost identificate prima dată ca oncogene responsabile de unele forme de cancer (conform Wikipedia) de către Scolnick et al. de la Institutul Naţional de Sănătate din SUA. Genele ras prezente la om sunt H-ras, N-ras şi K-ras

(K-ras4A şi K-ras4B), codifică proteine strâns înrudite, care au în molecula lor 188-189 aminoacizi. Sunt proteine care în mod normal controlează reţelele de semnalizare din celule. Produşii genelor ras sunt implicaţi în căile kinazice de semnalizare care controlează transcripţia genelor ce controlează creşterea şi diferenţierea celulară. Proteinele Ras controlează activitatea unor efectori din familia kinazelor RAF (protein-serin-threonin-kinase). Prin interacţiune cu unele kinaze RAF, proteinele Ras activează protein-kinaza MAPK (mitogen activated protein kinase), kinaza Mek-1, Mek-2, kinaza JUN-N terminal etc. Complexul RAF-MAPK poate fie să activeze, fie să inhibe apoptoza celulară. În culturi de fibroblaste şi de limfocite T s-a observat că genele ras induc apoptoza. Evitarea apoptozei s-ar realiza prin utilizarea unei căi alternative (la RAF-MAPK) şi anume a kinazelor PI3 şi PKB/ARK. Genele ras activează de asemenea transcripţia factorului NF-kB şi în acest fel evită apoptoza pe calea TNF. Se pare că activitatea pro- sau anti-apoptotică a genelor ras mediată de efectorii RAF depinde şi de tipul de celulă. Proto-oncogenele ras (H-ras, K-ras şi N-

ras) pot fi convertite în oncogene active prin mutaţii punctiforme care se produc în codonii 12, 13 şi 61, sau printr-o amplificare genică de la 5 la 50 de ori a genei de tip sălbatic. Nu s-a identificat o relaţie între prezenţa sau absenţa unei gene ras activate şi trăsăturile clinice sau biologice ale malignităţii, (Bos, 1988; Spandios et al., 2002). Se apreciază că mutaţii ale genelor ras se află la originea a 20-30% din tumorile umane, incidenţa lor variind semnificativ funcţie de tipul de cancer, cum ar fi: de pancreas (90%), colon (50%), plămân (30%), tiroidă (50%), vezică (6%), ovar (15%) etc, (cnf. www.cancerquest.org/ras-oncogene). Sunt absente sau mai rar prezente mutaţii ale acestor gene în cancerul de sân şi stomac. Cancerul de pancreas este o formă mai dificil de diagnosticat, astfel încât o metodă de identificare a mutaţiilor ras în ADN-ul celulelor pancreatice ar putea asigura specialiştilor discriminarea între pancreatitele cronice şi cancerul de pancreas.

Genele DCC şi SARP

Sunt gene ale căror implicare în desfăşurarea apoptozei este mai puţin cunoscută, deşi sunt unele date experimentale care par să susţină o astfel de ipoteză. Mutaţiile genelor DCC (deleted in colorectal cancer) au fost întâlnite în cancerul colo-rectal, dar şi în alte tipuri de tumori. Proteinele DCC sunt capabile să inducă apoptoza fără a avea loc asocierea ligandului Fas-L la receptorul Fas şi o blochează prin cuplarea cu molecula NETRIN-1 (moleculă de ghidare a axonului). Proteinele DCC s-ar constitui în substrat al caspazei-3. Proteinele DCC au capacitatea de a induce apoptoza în celulele care au blocată calea FAS-FASL.

Unele proteine din familia SARP (Secretor Apoptosis Related Proteins) ar avea capacitatea de a induce apoptoza, altele dimpotrivă ar avea rol anti-apoptotic. Au o însuşire specială, în sensul că sunt proteine secretate în afara celulei şi în acest fel ele

75

îşi pot extinde acţiunea şi asupra celulelor învecinate, constituindu-se în semnale fie pentru inducerea apoptozei, fie pentru supravieţuire, (Dănăilă et al., 1999).

7.3. Caspazele şi rolul lor în apoptoză

7.3.1. Structura şi clasificarea caspazelor Moleculele efectoare ale morţii celulare programate la animale sunt caspazele şi

granzimele (Jan et al., 2008). Arătam anterior că la nematodul Caenorhabditis elegans au fost identificate 3 gene (ced-3, ced-4 şi ced-9) ale căror produşi sunt implicaţi în moartea sau supravieţuirea celulară. Mutaţiile genelor ced-3 şi ced-4 determină supravieţuirea unor celule care în mod normal mor pe parcursul dezvoltării, în timp ce produsul genei ced-9 previne apoptoza. S-a constatat apoi că produsul genei ced-3 are un analog cu activitate proteazică la mamifere şi anume ICE (IL-1 beta converting

enzyme; enzima de conversie a interleukinei 1β), o cistein-protează (cistein-aspartază) care a fost denumită caspaza-1. Caspazele fac parte din clanul CD, familia C14 de cistein-proteaze. Denumirea de caspaze s-a stabilit astfel: „c” provine de la cisteina prezentă în centrul activ (QACRG, după alţii QACxG), iar „aspază” de la specificitatea lor strictă de a scinda legăturile peptidice ale substratului după un rest de acid aspartic (cysteinil-aspartate-cleaving-proteases). Doar granzima B, o serin-protează prezentă în limfocitele T citotoxice, nu are această specificitate de acţiune, (Cojocaru et al., 2007). Şi pentru gena (produsul) ced-4 s-a identificat un analog la mamifere – Apaf-1 (apoptosis protease activating factor 1), care are rol de activare a caspazelor. La mamifere, omologul proteinei Ced-9 este proteina anti-apoptotică Bcl-2. Au fost descoperite până în prezent un număr de 14 caspaze, din care 10 (tab. 7.1 şi 7.2) sunt mai bine cunoscute, caspazele -11 şi -12 fiind identificate doar la şoareci, (Gewies, 2003).

Tabel nr. 7.1. – Caspazele şi funcţiile lor (prelucrare după Moldoveanu şi

Popescu, 1999; Ricci, 2002)

Caspaza (denumire consacrată/alte

denumiri)

Funcţia Substratul (secvenţa

tetrapeptid*)

Localizarea genelor pe cromosomi

Caspaza-1 (ICE) Activarea IL- 1β WEHD 11q22 Caspaza-2 (ICH-IL; Nedd2) Execuţia apoptozei DEHD Caspaza- 3 (CPP32, YAMA/ Apopaina, prICE)

Execuţia apoptozei; clivează proteine celulare; activează alte caspaze

DEVD 4q34

Caspaza-4 (TX, ICH-2, ICE-rel II, Tx, Ich2)

Producerea limfokinelor; execuţia apoptozei

(W/L)EHD

11q22

Caspaza-5 (ICE-rel III; Ty) Producerea limfokinelor (W/L)EHD 11q22 Caspaza-6 (Mch-2) Execuţia apoptozei VEHD 4q25 Caspaza 7 (Mch3, ICE-Lap3, CMH-1)

Execuţia apoptozei: clivează proteine celulare

DEVD 10q25

Caspaza-8 (MACH, FLICE, Mch5)

Activarea caspazelor 3 şi 7 LETD 2q33

Caspaza-9 (ICE-Lap6, Mch-6) Activarea caspazei 3 LEHD 1q34

76

Caspaza-10 (Mch-4; FLICE-2) Activarea altor caspaze LEHD 2q33 * A – alanină (ala); C – cisteină (cys); D – acid aspartic (asp); E – acid glutamic (glu); F – fenilalanină (phe); G – glicină (gly); H – histidină (his); I – isoleucină (ile); K – lizină (lys); L – leucină (leu); M – Metionină (met); N – asparagină (asn); P – prolină (pro); Q – glutamină (gln); R – arginină (arg); S – serină (ser); T – treonină (thr); V – valină (val); W – triptofan (trp); Y – tirozină (tyr).

Prin intervenţia cu inhibitori peptidici ai acestor proteaze, în experienţe

realizate in vitro şi in vivo, s-a reuşit prevenirea morţii celulare, fapt ce a demonstrat fără dubii implicarea lor în procesul de apoptoză. Caspazele sunt enzime foarte selective. În general, caspazele sunt dimeri constituiţi din două subunităţi strâns asociate, de 10 şi 20 kDa. Ele prezintă un situs activ pentapeptidic conservat, format dintr-un rest cisteinic inclus într-o secvenţă peptidică de tipul QACRG (sau QACXG, în care X poate fi R, Q sau G), care le permite recunoaşterea substratului şi clivarea la nivelul reziduului aspartat din poziţia P1. Acest rest aspartat este dispus într-un buzunar (desemnat site-ul S1) şi este aliniat cu arg179, gln283, arg341 şi ser347 (numerotare ce corespunde caspazei-1), structură conservată la toate caspazele umane, cu excepţia caspazei-8 (la care ser347 este înlocuită cu thr). Aminoacizii implicaţi în cataliză sunt cys285 şi his237. Substratul caspazelor poate fi constituit din proteine citoplasmatice, nucleare, proteine ce iau parte la metabolismul şi reparaţia ADN-ului, protein-kinaze, proteine implicate în transducţia semnalului şi în exprimarea genelor, în reglarea ciclului celular şi a proliferării celulare etc, (tab. 7.2). S-a constatat totuşi că unele substraturi nu sunt scindate în toate tipurile de celule, (Ricci, 2002).

Tabel nr. 7.2 - Proteinele substrat ale caspazelor (după Ricci, 2002)

Polipeptidul Locul de

clivaj Caspaza implicată

Efectul presupus al clivajului

Proteine citoplasmatice

Gelsolina DQTD/G 3 Clivarea Ca2+ independentă a actinei Gas-2 SRVD/G ? Rearanjarea citoscheletului Fodrina DETD/S-

DSLD/S 3 Înmugurirea membranei plasmatice

β-Catenina ? 3 Diminuarea interacţiunilor celulă-celulă Citokeratina 18 VEVD/A 3, 6, 7 ? Proteine nucleare

SRF ? 3 Inactivarea factorului de transcripţie Lamina A VEID/N 6 Dezmembrarea lamininei nucleare Lamina B1 VEVD/S 6, 3 ? Dezmembrarea lamininei nucleare NuMA ? 3, 6 Schimbarea morfologiei nucleare Proteina de 70kDa a U1 snRNP

DGPD/G 3 Diminuarea procesării ARN

mdm2 DVPD/C 3, 6, 7 Necunoscut; se leagă întotdeauna la p53 Proteine implicate în metabolismul şi reparaţia ADN

PARP DEVD/G 3, 7, 9 Diminuarea sintezei poli-(ADP-ribozei) ADN-PKcs DEVD/N 3 Diminuarea activităţii Topo-izomeraza I DDVD/Y Necunoscut Protein-kinaze

PKCδ DMQD/M 3 Kinază constitutiv activă PKCτ DEVD/K 3 Kinază constitutiv activă PKC-legată de kinaza 2 3 3 Kinază constitutiv activă (?)

77

PKN LGTD/S 3 Kinază constitutiv activă Protein-kinaza Ca/Cam-dependentă

PAPD/A 3 Necunoscut

Pak2 SHVD/G 3, 8 Kinază constitutiv activă PITSLRE kinaza α2-1 YVDP/S 3, 8 Kinază constitutiv activă Kinaza Mst1 DEM/S ? Kinază constitutiv activă Kinaza Mst 2 DELD/S ? Kinază constitutiv activă FAK DQTD/S

VSWD/S 3, 7 6

Pierderea legăturii cu paxilina, translocaţia nucleară, diminuarea activităţii

Fyn EERD/G 3, 8 ? Activare nemodificată, desensibilizarea TCR

MEKK-1 DTVD/G 3 Diminuarea legăturii cu proteina 14-3-3; activarea constitutivă

Kinaza Weel ? 3, 7, 8 Inactivare probabilă, conduce la activarea Cdk

Alte proteine implicate în transducţia semnalului şi în expresia genelor Pro-interleukina 1β FEAD/G 1 Mediator cheie al inflamaţiei Pro-interleukina 16 SSTD/S 3 Chimiotactism al limfocitului T Pro-interleukina 18 LESD/N 1 Induce sinteza interferonului γ Protein-fosfataza 2A subunitatea Aα

DEQD/S 3 Creşterea activităţii

Fosfolipaza A2 citosolică DELD/A 3 Activare Stat 1 MELD/G 3 Diminuarea transcripţiei după acţiunea

interferonului α sau γ NF-kB p50, p65 ? 3 Diminuarea activităţii transcripţionale a

NF-kB IkB DRHD/S 3 Generarea de inhibitori constitutivi ai NF-

kB Calpastatina ALDD/S

LSSD/F ALAD/S

1, 3, 7 Diminuarea inhibării calpainelor

Proteine implicate în reglarea ciclului celular şi a proliferării

p21 DHVD/L 3, 7 Pierderea domeniului inhibitor N-terminal p27 DPSD/S 3, 7 Diminuarea p27 în complexele ciclin E-

cdk Proteina Rb DEAD/G 3 Lipsa opoziţiei la acţiunea E2F-1 Proteine implicate în maladii genetice umane

Hungtinton DSVD/L 3, 7 Posibil clivaj non-fiziologic Presenilina-1 ARQD/S ? Necunoscut Presenilina-2 DSYD/S 3 Generarea de fragmente anti-apoptotice Proteine de reglare a apoptozei

Bcl-2 DAGD/V ? Generarea de fragmente pro-apoptotice Bcl-XL HLAD/S 1, 3 Generarea de fragmente pro-apoptotice FLIP LEVD/G 3, 8, 10 Necunoscut Bid LQTD/G 8 Generarea de fragmente pro-apoptotice Bax FIQD/R ? Necunoscut ICAD DEPD/S 3 Eliberează endonucleaza CAD activă

Caspazele sunt sintetizate în celulă sub forma unui lanţ proteic unic, inactiv (zimogen sau pro-enzimă), ce constă din patru domenii: un prodomeniu NH2-terminal de lungime variabilă, o subunitate mare - p20 (cu greutatea moleculară de cca 20kDa),

78

o subunitate mică - p10 (de cca 10 kDa) şi o regiune linker ce conectează aceste subunităţi catalitice, (Ricci, 2002; Philchenkov et al., 2004). La unele pro-caspaze regiunea de legătură lipseşte. În urma clivării, pro-caspazelor este înlăturat domeniul „pro” de la capătul N-terminal şi sunt generate cele două subunităţi, cea mare (LS) de 17-21 kDa – ce conţine centrul activ (QACRG) şi cea mică (SS) de 10-14 kDa, subunităţi care se asociază intim şi formează hetero-dimerul LS-SS. Enzima activă este un heterotetramer (fig. 7.8) şi ia naştere prin asocierea a doi hetero-dimeri, [2(LS/SS) sau 2(p10/p20)]. Fiecare hetero-dimer din hetero-tetramerul activ are centrul lui catalitic, care funcţionează independent. Centrul catalitic este constituit din 6 lanţuri β, flancate de ambele părţi de α-helixuri. Centrul activ conţine 3 reziduuri de aminoacizi: unul de cisteină (cys285), unul de histidină (his237) şi unul de glicină (gli238), care sunt conservate la toate caspazele.

Fig. 7.8 - Procesul de activare a caspazelor (după Moldoveanu şi Popescu, 1999) Subunitatea mică are bine conservate două reziduuri de arginină şi serină, care

formează „buzunarul” în care pătrunde substratul. S-au identificat şi unele reziduuri de aminoacizi mai puţin conservate, despre care există părerea că ar fi implicate în specificitatea de substrat a diferitelor caspaze. Caspazele au specificitate strictă pentru o secvenţă de tetrapeptide (o secvenţă de cel puţin 4 aminoacizi - notaţi cu P1-P4), situată la stânga locului de clivare. Proteinele ţintă trebuie să conţină obligatoriu în poziţia P1 un reziduu aspartat, care va fi dispus într-un buzunar (denumit situl S1) şi va fi aliniat la secvenţa tetrapeptidică a caspazei, (Ricci, 2002; Cojocaru et al., 2007). Factorul determinant în desemnarea caspazei indicate pentru un anumit substrat (factorul de recunoaştere) este reprezentat de structura primară a substratului. În cazul unor proteine prezintă importanţă şi structura lor terţiară, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

Cei 14 membrii ai familiei caspazelor au fost clasificaţi în diverse moduri. Din punct de vedere filogenetic, caspazele -1, -4, -5, -11, -12 şi -14 aparţin subfamiliei de caspaze-1. Deşi caspaza-2 este foarte asemănătoare ca secvenţă cu caspaza-9, ea a fost grupată singură, iar caspazele -3, -6, -7, -8, -9 şi -10 aparţin subfamiliei de caspaze-3.

79

În funcţie de compoziţia în aminoacizi a tetrapeptidului din substrat (specificitatea de substrat), caspazele au fost împărţite de asemenea în 3 grupe (subfamilii) şi anume, caspazele-1 (ICE – Interleukine Converting Enzyme), caspazele-2 (ICH-1) şi caspazele-3 (CPP32): I. Din grupa a I-a fac parte în primul rând caspazele -1, -4 şi -5. Substratul lor are secvenţa optimă (tetrapetidul) trp-glu-his-asp (WEHD). Tipurile de substrat clivate includ pro-interleukina-1β şi factorul de inducere a interferonului-γ. Caspaza-1, de exemplu, clivează precursorul pro-IL-1β la forma sa matură. Caspaza-11 ar fi necesară pentru activarea caspazei-1. Caspazele -4, -5, -12, -13 şi -14(?) sunt implicate în procesarea citokinelor. Toate aceste caspaze intervin în maturarea citokinelor şi au funcţie pro-inflamatorie; II. Din grupa a II-a fac parte caspazele -2, -3, -7, precum şi proteina Ced-3. Substratul prezintă secvenţa asp-glu-X-asp (DEXD). Aceste caspaze intervin în etapa de execuţie a procesului de apoptoză. Ele scindează multe substraturi apoptotice (proteine structurale şi homeostatice); III. Din grupa a III-a fac parte caspazele -6, -8, -9 şi -10. Secvenţa optimă poate conţine în poziţia a 4-a mai mulţi aminoacizi, structura tetrapeptidului fiind de regulă (val/leu)-glu-X-asp [(V/L)EXD]. Sunt caspaze care funcţionează ca activatori ai caspazelor efectoare (sunt implicate în semnalizarea apoptozei).

Fig. 7.9 - Familia caspazelor la mamifere (cu excepţia caspazelor murine -11 şi -12), (după Fan et al., 2005)

Sunt prezentate 3 grupe majore de caspaze (pe baza funcţiei lor): I – caspaze inflamatorii; II – caspaze iniţiatoare de apoptoză; III – caspaze efectoare de apoptoză. Sunt indicate domeniile CARD, DED, subunităţile catalitice [mare (p20) şi mică (p10)].

Diferenţierea activităţii caspazelor funcţie de preferinţa pentru substraturi sintetice a adus o serie de informaţii importante privind mecanismele catalitice ale acestor enzime, dar nu poate fi un criteriu sigur de clasificare a caspazelor pentru că in

80

vivo preferinţa lor de substrat ar putea să nu fie aceeaşi cu cea identificată in vitro, (Pop şi Salvesen, 2009).

După alţi autori, clasificarea pe subfamilii a caspazelor arată astfel: I. caspaze activatoare ale apoptozei, din care fac parte caspazele -2, -8, -9 şi -10; II. caspaze de execuţie a apoptozei, din care fac parte caspazele -3, -6 şi -7; III. caspaze care mediază inflamaţia, din care fac parte caspazele -1, -4, -5, -11, -12, -13 şi -14 (Fan et al., 2005), (fig. 7.9).

Sunt şi autori care consideră că la animale se întâlnesc doar două grupe de caspaze: grupa I-a, formată din caspazele cu rol în inflamaţie, şi grupa II-a formată din caspazele cu rol în apoptoză (acestea fiind la rândul lor împărţite în caspaze iniţiatoare şi caspaze de execuţie a apoptozei), (Fink şi Gookson, 2005; Jan et al., 2008). Este aceasta o clasificare utilă într-un anume fel, dar oarecum relativă, deoarece multe dintre caspazele „apoptotice” (caspazele -2, -3, -6, -7, -8, -9 şi -10) au măcar un rol ne-apoptotic identificat, după cum unele caspaze tipic „ne-apoptotice” (caspazele -1, -4 şi -5) se consideră că induc „piroptoza” (o formă de moarte asociată cu activarea masivă a celulelor inflamatorii). Singura caspază cert ne-apoptotică ar fi caspaza-14, enzimă cu rol de mediator în diferenţierea keratinocitelor, (Pop şi Salvesen, 2009). Caspazele diferă între ele nu numai prin specificitatea de substrat, ci şi prin mărimea şi secvenţa în aminoacizi a pro-domeniului lor -NH2 terminal. Unele au pro-domenii lungi, altele scurte. Caspazele apoptotice sunt, aşa cum arătam anterior, de două categorii: caspaze iniţiatoare (apicale) şi caspaze de execuţie (efectoare sau din

aval). Ele au o organizare în cascadă, cele iniţiatoare fiind situate în amonte, iar cele de execuţie în aval. Caspazele din aval au pro-domenii mai mici şi devin active în urma clivajului proteolitic exercitat de către caspazele din amonte (Schimmer et al., 2001). Caspazele efectoare sunt deci activate de către caspazele iniţiatoare, care clivează pro-caspazele, formele inactive ale caspazelor efectoare. Pro-domeniile caspazelor efectoare (procaspazele -3, -6 şi -7) sunt scurte (maximum 30 de resturi amino-acil), în timp ce pro-domeniile caspazelor iniţiatoare (procaspazele -2, -8, -9, -10 şi -12) şi a caspazelor pro-inflamatorii (procaspazele -1, -4, -5, -11, -13 (care, cu unele excepţii, nu sunt implicate în apoptoză) au prodomenii lungi (peste 90 de resturi aminoacil), (Dănăilă et al., 1999; Philcenkov et al., 2004), (tab. 7.3). Nu se exclude însă ca unele caspaze (cum ar fi caspazele -1, -4 şi -5), care au structuri asemănătoare, pe lângă activitatea lor de bază în maturarea citokinelor pro-inflamatorii, să participe şi la iniţierea şi execuţia apoptozei celulare. Caspaza-14, cum s-a precizat anterior, nu este implicată nici în apoptoză, nici în inflamaţie, ci în diferenţierea celulelor epiteliale (FAN et al., 2005; POP şi SALVESEN, 2009).

Tabel nr. 7.3 - Particularităţi structurale şi funcţionale ale cistein-endopeptidazelor din familia caspazelor (după Philchenkov et al., 2004)

Enzima Dimensiune

precursor (kDa)

Tip prodomeniu Subunităţi active (kDa)

Adaptor de activare Secventa de recunoaştere substrat

Caspaze iniţiatoare de apoptoză

Caspaza-2 51 Lung, cu reg. CARD 19/12 RAIDD,PACAP,DEFCAP DEHD Caspaza-8 56 Lung, cu 2 reg. DED 18/11 FADD,DEDAF,ASC LETD Caspaza-9 45 Lung, cu reg. CARD 17/10 Apaf-1,Nod-1,PACAP LEHD Caspaza-10 55 Lung, cu 2 reg. DED 17/12 FADD,DEDAF Necunoscută

81

Caspaza-12 50 Lung, cu reg. CARD 20/10 TRAF-2 Caspaze efectoare de apoptoză

Caspaza-3 32 Scurt 17/12 Neaplicabil DEVD Caspaza-6 34 Scurt 18/11 Neaplicabil VEHD Caspaza-7 35 Scurt 20/12 Neaplicabil DEVD

Caspaze implicate în inflamaţie

Caspaza-1 45 Lung, cu reg. CARD 20/10 CARDIAK, ASC, CARD-8, Ipaf, Nod-1

WEHD

Caspaza-4 43 Lung, cu reg. CARD 20/10 Necunoscut (W/L) EHD Caspaza-5 48 Lung, cu reg. CARD 20/10 Necunoscut (W/L) EHD Caspaza-11 42 Lung, cu reg. CARD 20/10 Necunoscut (I/LV/P)EHD

Alte caspaze de mamifere

Caspaza-14 30 Scurt 20/10 Neaplicabil Necunoscută Caspaze de nevertebrate

Ced-3 56 Lung, cu reg. CARD 17/14 Ced-4 DEXD Dcp-1x 36 Scurt 22/13 Neaplicabil DEVD Droncx 50 Lung, cu reg. CARD 20/14 DARCxx V/DVAD xCaspaze de Drosophila; xxOmolog al Apaf-1 la Drosophila

Pe baza secvenţei oligopeptidice optime a substratului, activitatea caspazelor poate fi măsurată cu ajutorul unor peptide sintetice cuplate C-terminal la o jumătate fluorogenă, cum ar fi 7-amido-4-metilcumarina (AMC), o creştere a fluorescenţei după clivajul produs de caspaze fiind proporţională cu activitatea caspazică, (Verkammen et al., 2007). 7.3.2. Mecanismele de activare a caspazelor Caspazele cu prodomeniu scurt (de execuţie) se activează prin clivarea domeniului lor catalitic, în timp ce caspazele cu prodomeniu lung (caspazele apicale, inflamatorii şi caspaza-2) se activează prin dimerizare. Iniţial s-a considerat că toate caspazele devin active prin proteoliză. Caspazele din aval sunt într-adevăr activate prin proteoliză de către cele situate în amonte (iniţiatoare). Se pune însă problema mecanismului prin care sunt activate caspazele din amonte. Pentru a fi activate, caspazele iniţiatoare (aflate în celule sub formă de monomeri inerţi), necesită homo-dimerizarea. Dimerizarea este facilitată de recrutarea caspazelor la platformele specifice de activare în urma unui semnal apoptotic, (Pop şi Salvesen, 2009).

Pro-domeniile caspazelor par a fi implicate în interacţiunile de tip proteină-proteină. Pro-domeniul unor caspaze iniţiatoare, cum este cazul pro-caspazelor -8 şi -10 conţin domenii efectoare ale morţii celulare (DED), structuri ce permit legarea caspazei la molecule (proteine) adaptor – FADD sau TRADD. Pro-domeniul altor caspaze (pro-caspazele -1, -2, -4, -5, -9, -11 şi -12) prezintă un domeniu de recrutare a caspazelor (CARD), care joacă rol în interacţiunea dintre caspaze, (Ricci, 2002; Philchenkov et al., 2004). Legăturile de tip DED-DED asigură interacţiuni între proteinele hidrofobe, iar contactele de tip CARD-CARD interacţiuni electrostatice. Domeniile DED şi CARD asigură caspazelor capacitatea de a interacţiona cu alte molecule care le reglează activarea. Domeniul „pro” ar asigura dirijarea pro-enzimei inactive (pro-caspazei) spre „aparatul” de activare, prin interacţiuni de tipul proteină-proteină, determinate de un motiv

* (*secvenţă înalt conservată de aminoacizi din structura unei proteine care este asociată cu o anumită funcţie) specific, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

Recrutarea caspazelor iniţiatoare prin intermediul DED (caspazele -8 şi -10) sau CARD (caspazele -1, -2 şi -9) determină o creştere locală a concentraţiei lor şi le

82

asigură dimerizarea indusă de proximitate. Fiecare caspază apicală are o platformă proprie de activare: prin intermediul DISC sunt recrutate şi activate caspazele -8 şi -10; formarea apoptosomului activează caspaza-9, iar PIDD-osomul ar fi implicat în activarea caspazei-2. [PIDD-osomul (p53-induced protein with a death-domain) este un complex molecular generat în timpul apoptozei indusă de lezarea ADN şi este format din proteina PIDD, proteina adaptor RAIDD şi pro-caspaza-2, complex care asigură procesarea şi activarea caspazei-2, (Tinel şi Tschopp, 2004). S-a constatat apoi, în experienţe efectuate pe şoareci PIDD-deficienţi, că activarea caspazei-2 poate fi indusă în urma lezării ADN-ului şi în abesnţa PIDD-osomului, prin cel puţin un mecanism alternativ, independent de PIDD-osom, (Manzl et al., 2009)]. Probabil că şi caspazele inflamatoare se activează printr-un mecanism asemănător de dimerizare. Pentru acestea, platformele de activare multi-proteică sunt denumite inflamasomi. Nu este clar însă dacă activarea acestora are loc printr-o homo-dimerizare impusă, sau prin hetero-dimerizarea cu alţi componenţi ai inflamasomului, (Pop şi Salvesen, 2009). Activarea caspazelor se realizează deci prin autocataliză sau prin intermediul caspazelor iniţiatoare. Sub acest aspect, s-a impus noţiunea de cascadă de activare, ceea ce însemană că de îndată ce caspazele iniţiatoare sunt activate, ele vor putea cliva alte caspaze - aflate încă în stadiul de zimogen (în special caspazele de execuţie), care asigură probabil reglarea şi amplificarea semnalului, (Ricci, 2002). Caspazele de execuţie apar în celule ca dimeri inactivi, ele dimerizând rapid după ce sunt sintetizate. Sub formă de zimogeni, subunităţile mare şi mică ale domeniului catalitic al caspazelor efectoare sunt separate de o scurtă secvenţă linker. Procesarea proteolitică a linkerului de către caspazele iniţiatoare (caspazele -8, -9 şi -10) şi de granzima B asigură activarea caspazelor de execuţie. Deşi activatorul natural al caspazei-14 nu a fost identificat, experienţele in vitro au arătat că pentru activarea caspazei-14 este necesară atât clivarea cât şi dimerizarea ei. Activarea caspazelor este frecvent urmată de maturarea lor, care este un fenomen opţional şi care constă în clivajul (auto)proteolitic (Pop şi Salvesen, 2009). Maturarea presupune înlăturarea pro-domeniului sau a linkerului dintre subunităţi. De reţinut faptul că mecanismul de activare al multor proteaze, care constă în înlăturarea pro-domeniului lor, nu activează şi caspazele. Procesul de maturare a unor caspaze (cum ar fi maturarea caspazei-8 prin auto-clivare) ar asigura stabilizarea lor şi capacitatea de a se menţine un timp mai îndelungat în citosol (după eliberarea din complexul DISC, în cazul caspazei-8). Se consideră că maturarea caspazelor este un proces distinct de activare, care asigură stabilitatea caspazei în cauză şi poate reprezenta un semnal pentru evenimentele de reglare din aval, (Pop şi Salvesen, 2009).

Activarea caspazelor iniţiatoare este urmată de activarea proteolitică a caspazelor efectoare (-3, -6 şi -7), care scindează apoi numeroase proteine substrat specifice (din nucleu, citoplasmă şi citoschelet), inclusiv pro-caspaze. Scindarea diverselor proteine ţintă din celulă de către caspazele efectoare duce la dereglarea proceselor vitale celulare şi în final la moartea celulei. Caspazele de execuţie a apoptozei clivează selectiv un număr restrâns de proteine ţintă. Degradarea proteinelor ţintă antrenează unele din modificările morfologice şi biochimice celulare specifice apoptozei. Un marker important al morţii celulare prin apoptoză este generarea de laderi de ADN în urma clivării internucleosomale a cromatinei, cu formarea acelor fragmente de cca 180pb sau multiplu de 180pb. Procesul este realizat de CAD (caspase

83

-activated DN-ase; DN-aza activată de caspază) sau DFF-40, care este eliberată din legătura cu inhibitorul ei (ICAD sau DFF-45) prin clivajul produs de caspazele -3 şi -7. Caspazele de execuţie a apoptozei produc şi proteoliza altor substraturi, cum ar fi laminele (proteine de schelet ale anvelopei nucleare), a unor proteine din citoschelet (cum ar fi fodrina), a PAK2 (un membru al familiei kinazelor), induc probabil activarea gelsolinei (enzimă ce depolimerizează actina) etc, evenimente care, cum arătam anterior, contribuie la modificările morfologice specifice celulelor apoptotice, (Fink şi Gookson, 2005).

Uneori şi caspazele iniţiatoare pot funcţiona asemenea celor efectoare, în sensul că pot amplifica semnalul de auto-distrugere în celulele în care căile apoptozei sunt slab exprimate. Totodată, activarea caspazelor efectoare poate fi realizată nu numai de caspazele iniţiatoare, ci şi de către alte proteaze non-caspazice, cum ar fi catepsinele, calpainele şi granzimele, (Johnson, 2000).

Majoritatea caspazelor sunt proteine solubile localizate în citoplasmă. Excepţie fac doar două şi anume: caspaza-12, care este asociată membranei RE înspre citosol (şi mediază apoptoza indusă de stresul RE) şi caspaza-2, care este parţial localizată în nucleu şi mediază apoptoza indusă de lezarea ADN, (Nakagawa et al., 2000; Lassus et al., 2002). La animale, îndată ce caspazele au fost activate, ele induc o cascadă proteolitică în citosol, în care sunt activate şi alte enzime ce participă la degradarea componenţilor celulari şi la apoptoza celulei, (Sanmartin et al., 2005). Cum vom arăta în cadrul altui capitol, activarea caspazelor se poate produce pe mai multe căi, din care două sunt mai importante:

a) calea apoptotică mediată de receptorii morţii, în care receptorii din familia TNF activează caspaza-8 din amonte;

b) calea mitocondrială în care, în urma eliberării cyt. c din mitocondrii, este activată caspaza-9 din amonte. Aceste căi duc în final la activarea unei caspaze efectoare majore din aval, în principal a caspazei-3.

Există şi o altă cale, mai puţin importantă, de activare a caspazelor, prin intermediul granzimei B care, cu ajutorul perforinei, pătrunde în celulele ţintă unde clivează şi activează unele pro-caspaze, inclusiv pro-caspaza-3, (Schimmer et al., 2001).

Prezentăm sintetic în tabelul 7.4 unii dintre stimulatorii şi inhibitorii caspazelor (şi implicit ai apoptozei) şi modalitatea lor de acţiune.

Tabel nr. 7.4 - Proprietăţile unor activatori şi inhibitori endogeni ai capsazelor

(după Philchenkov et al., 2004) Proteina Mărime

(kDa) Localizarea

genei Reglarea apoptozei

Funcţia biologică

FADD 23 11q13.3 S/I* Recrutează caspaza-8 sau -10 la DISC; determină activarea procaspazelor-8 şi -10; se implică în controlul activării şi proliferării celulare

Apaf-1 130 12q23 S Facilitează auto-activarea procaspazei-9 prin oligomerizarea moleculei ei precursor

Citocrom c 12 7p15.2 S Co-factor al Apaf-1; component al lanţului respirator mitocondrial

Smac/DIABLO 27,1 12q24-1- q24.31

S Promovează MC prin prevenirea proteinelor IAP să se lege şi să inhibe caspazele

Omi/HtrA2 48,8 2p13.3 S Creşte apoptoza dependentă de caspaze prin blocarea IAP şi poate induce MC independentă de

84

blocarea IAP şi poate induce MC independentă de caspaze via activitatea ei serin-proteazică

ASC/TMS1 22 16p11.2-12 S/I Activează procaspaza-1; modulează calea de activare NF-kB

Bcl-2 26 18q21 I Reglează PMM; blochează eliberarea proteinelor apoptogene din spaţiul inter-membranar al mitocondriilor; inhibă activitatea caspazică prin legarea la Apaf-1

BCL-XL 26 20pter-p12.1

I Împiedică eliberarea în citosol a proteinelor apoptogene din mitocondrii prin legarea VDAC; formează hetero-dimeri cu Bak şi Bcl-2; inhibă asocierea Apaf-1 cu caspaza-9

Bax 21 19q13.3 - q13.4

S Leagă şi antagonizează cu proteina Bcl-2; promovează eliberarea proteinelor apoptogene din spaţiul inter-membranar mitocondrial, determinând activarea caspazelor

Bad 18,4 11q12.3 S Formează hetero-dimeri cu proteine antiapoptotice (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w) şi promovează eliberarea proteinelor din spaţiul inter-membranar mitoc., determinând activarea caspazelor

Bid 22 22q11.21 S Formează hetero-dimeri fie cu proteina pro-apoptotică Bax, fie cu proteina anti-apoptotică Bcl-2; contracarează efectul protector al Bcl-2; promovează eliberarea proteinelor din spaţiul inter-membranar mitocondrial, determinând activarea caspazelor

P53 53 17p13.1 S Induce apoptoza fie prin stimularea expresiei Fas, DR5, Apaf-1, procaspaza-6, Bax, Bid, Noxa şi Puma, fie prin Bcl-2 şi PTEN; induce permeabili-zarea membranei mitocondriale externe prin formarea de complexe cu Bcl-XL şi Bcl-2; participă la reglarea ciclului celular

c-IAP-1/MIHB/BIRC2

70 11q22-q23 I Inhibă activitatea caspazei-3 şi -7, interacţionează cu Smac/DIABLO şi inhibă activitatea ei anti-apoptotică; se leagă la TRAF-1 şi TRAF-2

c-IAP-1/MIHC/BIRC3

68 11q22-q23 I Inhibă activitatea caspazei-3 şi -7, interacţionează cu Smac/DIABLO şi inhibă activitateaei anti-apoptotică; se leagă la TRAF-1 şi TRAF-2

XIAP/MIHA/ BIRC4

57 Xq25 I Interacţionează cu, şi inhibă, caspazele-3, -7 şi -9; are activitate ubiquitin-ligază care promovează degradarea caspazei-3; interacţionează cu Smac/ DIABLO şi inhibă activitatea ei anti-apoptotică; participă la calea de semnalizare BMP/TGF

Survivina/ BIRC5

16,5 17q25 I Interferează cu activarea caspazelor-3 şi -7; interacţionează cu Smac/DIABLO; proteină pasager cromosomială care este reclamată în diviziunea celulară

Livina/ML-IAP/BIRC7

31 20q13.3 I Inhibă caspaza-3 şi activarea proteolitică a casp.-9; interacţionează cu caspazele-3, -7 şi -9

c-FLIP 56 2q33-q34 S/I Concurează cu procaspaza-8 în legarea la FADD şi astfel inhibă activarea caspazei-8; controlează activarea celulelor-T

ARC 30 16q21-q23 S/I Interacţionează cu caspazele-2 şi -8; inhibă caspaza-8; împiedică eliberarea cit. c; păstrează funcţia mitocondriilor

Iată în continuare unele detalii despre fiecare caspază.

85

Caspaza-1. Capasaza-1 (ICE) are capacitatea de a scinda citokina inactivă pro-IL-1β (de 31 kDa) la nivelul asp116 - ala117 şi a forma citokina activă IL-1β (de 17 kDa), care este un mediator cheie în procesele inflamatorii. Caspaza-1 umană este o proteină formată din 404 resturi de aminoacizi (codificată de gena CASP1, aflată pe cromosomul 11 la om). Proteina este localizată în citoplasmă şi este un heterotetramer cu greutatea moleculară de 45 kDa (p45), constituit din doi heterodimeri dispuşi antiparalel, fiecare având o subunitate de 20 kDa (p20) şi una de 10 kDa (p10). Cele două subunităţi se formează din proteina precursor printr-un mecanism autocatalitic. Proteina este exprimată în cantităţi mari în splină şi plămân, în monocite şi celulele epiteliale. A fost decelată şi în alte organe, ca ficat, inimă, intestin, timus, prostată, rinichi, testicule etc, dar nu se exprimă în creier, (www.uniprot.org/uniprot/P29466). S-a observat de asemenea un nivel înalt de caspază-1 în ţesuturile ischemice. Cele 4 situsuri de clivare ale proteinei p45 sunt localizate la nivelul legăturilor Asp – Xaa. Caspaza-1 conţine un reziduu de cisteină (cys285) în situsul activ al subunităţii p20. În privinţa specificităţii de substrat, caspaza-1 are preferinţă pentru reziduul acid aspartic adiacent situsului de clivare P1 (gly sau ala în P1) şi o secvenţă de 4 aminoacizi situată în stânga acestui situs. Forma activă a caspazei-1 este un tetramer format din 2 subunităţi p10 învăluite de 2 subunităţi p20. Stabilitatea moleculei este conferită de interacţiunile dintre capătul C-terminal al subunităţii p20 cu capătul N-terminal al subunităţii p10. Situsul catalitic este un pentapeptid (QARCG). S-au identificat 4 forme (izoforme) ale caspazei-1, care ar avea funcţii diferite în apoptoză.

Şoarecii knock-out pentru caspazele -1 şi -11 au o dezvoltare normală, prezintă deficienţe în producerea de IL-1α şi -β, de IL-18 şi de interferon-g, o rezistenţă crescută la şocul septic. Caspaza-1 pare a avea rol în reglarea sistemului imunitar şi ea ar fi activată printr-o interacţiune directă cu caspaza-11 de şoarece (care ar avea omologii cu caspazele umane -4 şi -5), (Ricci, 2002). S-a constatat că exprimarea în exces a genei ICE de la şoareci induce apoptoza în fibroblastele Rat-1. Acest proces este inhibat în cazul mutaţiilor punctiforme care afectează pentapeptidul din situsul catalitic. Gena crmA (care reglează răspunsul la citokine) codifică o proteină (serpina) care inhibă specific caspaza-1 şi astfel împiedică proteoliza IL-1β (şi implicit răspunsul la infecţiile virale). Este o modalitate prin care virusurile inhibă apoptoza în celulele infectate, care le asigură astfel capacitatea de infecţie a celulelor gazdă. O serie de experienţe in vivo (pe şoareci deficienţi în caspaza-1) şi in vitro (pe culturi de celule provenite de la aceşti şoareci) au arătat că enzima nu este implicată în multe forme de apoptoză, sau că funcţia ei ar putea fi substituită de o altă caspază la şoarecii deficienţi, (Dănăilă et al., 1999). Funcţia specifică a caspazei-1 este proteoliza pro-IL-1β, astfel încât decelarea de interleukină -1β matură este un indicator de activitate a caspazei-1. Secreţia de IL-1β în cazul apoptozei induse de TNFα în prezenţa cicloheximidei sau prin granzima B în celulele HeLa sugerează activarea caspazei-1, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

Sistemul imun dispune de receptori Nod-like (NLR, mamiferele având cca 20 astfel de receptori) care au rolul de a detecta patogenii intracelulari sau alte semnale „alarmă” şi participă la formarea complexului multiproteic – inflamasomul, (Saleh şi Green, 2007). Caspaza-1 este reglată în cadrul acestui complex, având ca molecule adaptor ASC, NLRC4 şi criopirina/Nalp3. Enzima acţionează apical în calea apoptotică neuronală indusă prin hipoxie şi ischemie. Ar fi implicată în apoptoza

86

mediată de p53 (într-o manieră specifică tipului de celule) şi ar sensibiliza celulele la moartea indusă prin Fas-ligand, produsă de radiaţii şi de cisplatin, (http:// atlasgeneticsoncology.org/Genes/casp1ID145ch11q22.html). Prin activarea caspazei-1 se poate declanşa piroptoza, (formă de moarte celulară care îmbină trăsăturile necrozei şi apoptozei). Unele cercetări recente acreditează ideia că efluxul de K+ ar fi implicat în activitatea caspazei-1. La niveluri mai scăzute ale efluxului de K+ caspaza-1 ar participa la repararea membranei plasmatice ca răspuns la toxinele bacteriene (care provoacă efluxul acestui cation) şi ar asigura supravieţuirea celulară, în timp ce la niveluri mai înalte ale efluxului de K+, caspaza-1 ar declanşa calea de suicid celular, (Saleh şi Green, 2007).

Caspaza-2 (ICH-1/Nedd2). Iniţial, această protează (Nedd2) a fost identificată

în creierul de şoarece, după care s-a descoperit şi varianta ei la om (Ich-1). Caspaza-2 umană (codificată de gena CASP2) este o proteină formată din 452 aminoacizi, fiind un heterotetramer ce constă în 2 heterodimeri dispuşi antiparalel, fiecare din ei format dintr-o subunitate p18 şi una p12. Niveluri mai înalte ale enzimei sunt exprimate în plămânul embrionar, ficat şi rinichi, iar la adulţi în placentă, plămâni, rinichi şi pancreas Nedd2 se exprimă la nivel ridicat în cursul dezvoltării embrionare în ţesutul nervos, în ficat, rinichi şi plămâni, (www.uniprot.org/uniprot/P42575). Ich-1 prezintă două izoforme: Ich-1L de 435 aminoacizi şi Ich-1S de 312 aminoacizi. Această proteină poate participa atât la apoptoză cât şi la supravieţuirea celulară. Exprimarea în exces a Ich-1L determină apoptoza celulară, iar exprimarea în exces a Ich-1S are efect anti-apoptotic. Situsurile de clivare ale caspazei-2 sunt dispuse în poziţia asp333-ala la capătul C-terminal al subunităţii mari şi în poziţia asp347 la capătul N-terminal al subunităţii mici. S-a constatat că această caspază poate fi activată de caspazele -1 şi -3 şi de granzima B. Ea poate fi de asemenea activată pe calea TNF-RAIDD-RIP, (Dănăilă et al., 1999).

Receptorii morţii activaţi pot recruta procaspaza-2 prin intermediul adaptorilor, proces care duce la activarea ei. Nu se cunosc prea bine substraturile din aval ale caspazei-2. Caspazele -2 şi -9 sunt asemănătoare cu Ced-3 de la C. elegans, toate trei având un domeniu CARD. Caspaza-2 se găseşte în majoritatea ţesuturilor şi tipurilor de celule, atât în nucleu cât şi în citoplasmă, dar mai ales în complexul Golgi, (Fan et al., 2005). S-a constatat că şoarecii knock-out pentru caspaza-2 au o dezvoltare normală până la vârsta adultă. Caspaza-2 pare a fi reclamată pentru moartea celulelor germinative femele. Şoarecii deficienţi în caspaza-2 prezintă la naştere un număr redus de neuroni motori faciali. În funcţie de tipul celular, această caspază ar putea avea fie rol de efector pozitiv al apoptozei, fie rolul de a întârzia moartea celulară, de unde şi ideea existenţei a două forme de caspază-2 (funcţie de modul de excizie a ARNm specific): casp2L (lungă) – care induce apoptoza şi forma casp2S (scurtă) care inhibă apoptoza (Wang et al., 1994). Caspaza-2 ar putea fi deci esenţială în apoptoza celulelor germinative femele, dar în acelaşi timp (şi în anumite situaţii), ar putea avea chiar rol protector împotriva apoptozei, (Ricci, 2002).

Guo et al. (2002) arătau că deşi caspaza-2 este una din primele caspaze descoperite, mecanismul ei de a induce apoptoza rămâne incert. Observaţia că Bcl-2 şi Bcl-XL pot bloca caspaza-2 şi moartea celulară indusă de CRADD (caspase and RIP

adaptor with death domain) i-au determinat pe autori să considere că această caspază ar

87

angaja calea apoptotică dependentă de mitocondrii (ar induce eliberarea cyt. c şi a altor factor apoptogeni din mitocondrii în citoplasmă), că ea ar fi un efector direct al căii apoptotice mitocondriale.

Caspaza-3 (CPP32; YAMA; Apopaina) este considerată enzima cheie în

execuţia apoptozei celulare. Caspaza-3 umană (codificată de gena CASP3) este constituită din 277 aminoacizi şi este localizată în citoplasmă. Prin clivarea acestei proteine (de 116 kDa) rezultă un fragment proteic (de 85 kDa) cu rol deosebit în inducerea morţii celulare (în cazul chimioterapiei). Este constituită din două subunităţi, de 17 kDa şi respectiv de 12 kDa. Se pot forma heterodimeri activi între subunitatea mare a caspazei-3 şi subunitatea mică a caspazei-7 şi vice-versa.Casapaza-3 asigură proteoliza unor substraturi care conţin secvenţa (motivul) Asp-Xaa-Xaa-Asp (DXXD). Capsaza-3 are unele asemănări cu caspaza-1, în sensul că solicită în P1 un reziduu Asp, acceptă unele substituţii în P2 şi P3, numai că faţă de caspaza-1 care preferă în P4 un rest Tyr, caspaza-3 preferă în P4 un reziduu Asp. Caspaza-3 poate fi clivată şi activată de granzima B, caspazele -6, -8 şi -10. Caspaza-3 este la rându-i implicată în activarea cascadei de caspaze care asigură execuţia apoptozei. Ea poate cliva şi activa caspazele -6, -7 şi -9. Caspaza-3 pare a fi necesară pentru apoptoza neutrofilelor şi limfocitelor T activate. Implicarea caspazei-3 ar depinde de tipul de stimul apoptotic, având totodată specificitate tisulară. Se consideră deci că enzima ar juca un rol diferit funcţie de tipul de celulă şi de stimulii în cauză. Şoarecii lipsiţi de caspaza-3 prezintă mari tulburări ale apoptozei, fiind mai mici decât cei de control şi mor în intervalul dintre prima şi a treia săptămână de la naştere. Cele mai evidente anomalii ale acestor şoareci par a fi localizate la nivelul sistemului nervos central, ei prezentând o hiperplazie cerebrală evidentă, (Ricci, 2002).

Caspaza-3 la om se eprimă la niveluri înalte în plămâni, splină, inimă, ficat şi rinichi şi la niveluri scăzute în testicule. Are o exprimare foarte ridicată în celulele sistemului imun. Caspaza-3 are capacitatea de a cliva multe proteine importante în apoptoză, printre care proteina nucleară PARP (la nivelul legăturii Asp216-Gly217), proteinele SREBP (sterol regulating element binding proteins). Ar fi implicată şi în scindarea hungtingtinei, (http://www.uniprot.org/uniprot/P42574).

Activarea caspazei-9 la apoptosom în cursul apoptozei duce la scindarea proteolitică şi activarea caspazelor -3 şi -7. În cursul apoptozei, caspaza-9 este clivată la rându-i de caspaza-3 la Asp330, proces ce determină accelerarea apoptozei. Denault et al. (2007) arată că prin clivajul la nivelul Asp330 al caspazei-9 ar fi înlăturat un motiv peptidic scurt care ar permite caspazei-9 să interacţioneze cu IAP şi să controleze astfel procesul de amplificare. Clivajul ar fi asigurat doar de caspaza-3 şi el nu activează caspaza-9 ci doar intensifică apoptoza prin reducerea inhibiţiei de către XIAP a caspazei apicale.

Caspaza-4 (ICErel II; TX; ICH-2) umană are o secvenţă formată din 377

aminoacizi şi poate cliva caspaza-1 (din a cărei subfamilie face parte). Subunităţile ei provin fie printr-o scindare autocatalitică a proenzimei, fie în urma intervenţiei caspazei-8. Face parte din categoria caspazelor inflamatoare. Nu are ortolog la şoarece, în schimb este omoloagă cu caspazele umane -1 şi -5 şi caspazele de şoarece -1, -11 şi -12. S-a constatat că LPS pot induce interacţiunea TRAF6-caspază-4, fapt ce

88

determină reglarea în amonte a NF-kB şi secreţia de citokine şi chemokine importante în semnalizarea imună înnăscută la nivelul monocitelor umane, (Lakshman şi Porter, 2007). Caspaza-4 este localizată în RE şi ar fi clivată în condiţii de stres provocat RE, clivaj care nu este afectat de exprimarea în exces a Bcl-2. Pare a fi de asemenea clivată prin administrarea de amiloid-beta (Abeta), iar apoptoza Abeta-indusă ar fi diminuată de către ARN mici (small interfering RNA)care interferă cu caspaza-4, (Hitomi et al., 2004). Prin urmare, caspaza-4 ar putea funcţiona ca o enzimă specifică stresului RE la om şi ar putea avea implicaţii în patogeneza bolii Alzheimer. Obeng şi Boise (2005) consideră însă că apoptoza indusă de stresul RE nu reclamă expresia caspazelor -12 şi -4 şi poate fi inhibată de expresia în exces a Bcl-XL sau a caspazei-9 dominant negative. Investigaţiile efectuate de Yamamuro et al. (2011) asupra implicării caspazei-4 în apoptoza indusă de stresul RE la linia celulară neuronală SH-SY5Y umană sugerează că această caspază ar activa direct caspaza-9 (prin procesarea procaspazei-9 la Asp315) şi în acest fel ar interveni în apoptoza indusă de stres RE. Studiul implicării funcţionale a caspazei-4 în celulele epteliale pigmentare ale retinei (hRPE) au evidenţiat rolul dual al aceasteia, atât în răspunsul proinflamatoriu cât şi pro-apoptotic, (Bian et al., 2009). Autorii consideră că apoptoza hRPE indusă de stresul RE este în parte dependentă şi independentă de caspaza-4.

Caspaza-4 este prezentă în numeroase ţesuturi, în care are o distribuţie asemănătoare cu caspaza-1. Se exprimă la cel mai înalt nivel în plămâni, moderat în inimă şi ficat, are expresie redusă în rinichi, testicule şi muşchii scheletului şi lipseşte în creier (http://www.uniprot.org/uniprot/P49662). Când este prezentă în cantităţi mari, caspaza-4 are capacitatea de a cliva PARP. Exprimarea în exces a caspazei-4, sau eliminarea pro-domeniilor ei duce către apoptoză.

Caspaza-5 (CErel III; TY) este codificată de gena CASP5. Face parte, ca şi caspaza-4, din prima grupă (sub-familie) de caspaze. Secvenţa ei numără 434 de aminoacizi. Secvenţa de clivaj preferată este Tyr-Val-Ala-Asp-I-, dar poate cliva şi la nivelul secvenţei Asp-Glu-Val-Asp-I-. Caspaza-5 este un heterotetramer format din 2 heterodimeri, care la rîndul lor sunt constituiţi dintr-o subunitate de 20 kDa (p20) şi alta de 10 kDa (p10), subunităţi ce derivă din secvenţa precursor printr-un proces autocatalitic. Caspaza-5 se exprimă la nivel scăzut în cele mai multe din ţesuturile umane, la nivel mai ridicat în plămâni, ficat şi muşchii scheletului, fiind absentă în creier, (http://www.uniprot.org/uniprot/P51878). Exprimarea în exces a caspazelor -4 şi -5 ar induce apoptoza, iar faptul că inhibitorul Ac-YVAD-CHO (specific caspazei-1) nu a inhibat apoptoza indusă de capsazele -4 şi -5, sugerează că ele au specificitate de substrat diferită de caspaza-1, (Kamada et al., 1997). Potrivit investigaţiilor lui Salskov-Iversen et al. (2011) caspaza-5 şi inflamasomul ar putea avea un rol important în răspunsul inflamator în psoriazis.

Caspaza-6 (Mch-2) este foarte asemănătoare cu caspaza-3 şi face parte din

grupa (sub-familia) Ced-3. Este o proteină localizată în citoplasmă, formată din 293 aminoacizi, de cca 34 kDa. Este clivată post-translaţional de caspazele -3, -8 şi -10. În stare activă este un heterotetramer format din 2 heterodimeri dispuşi antiparalel, fiecare din ei constituit dintr-o subunitate de de 18 kDA (p18) şi alta de 11 kDa (p11), (http://www.uniprot.org/uniprot/P55212). Exprimarea Mch-2 în celulele insectelor

89

determină apoptoza. Prin clivarea procaspazei-6 de către caspaza-3 are loc activarea caspazei-6, fapt ce arată că activarea celei din urmă presupune o caspază-3 deja activată. Unele cercetări sugerează posibilitatea activării reciproce a celor două caspaze. Caspaza-6 ar produce proteoliza laminelor (proteine structurale din membrana nucleară). În stadiul final al cascadei de capsaze, caspaza-6 catalizează activarea caspazelor -8 şi -10. Caspaza-6 poate fi activată de caspaza-3, dar nu şi de granzima B. La rândul ei caspaza-6 poate activa caspaza-3. Caspaza-6 are ca substraturi de acţiune PARP, laminina şi procaspaza-3, (FAN et al., 2005). Se pare că această caspază are un rol important în tulburările neorodegenerative, inclusiv în bolile Huntington şi Alzheimer. Este singura caspază capabilă să adopte o stare latentă, în care formează helixuri largi, blocând astfel accesul la situl activ, (Vaidya şi Hardy, 2011). Rezultatele cercetărilor întreprinse pe un model murin de către un grup condus de M. Hayden (2006) au arătat că prin blocarea acţiunii caspazei-6 a fost prevenit clivajul proteinei mutant huntigtina (htt), iar şoarecii nu au dezvoltat nici un simptom al bolii Huntington (HD). Aceste observaţii au fost confirmate de Graham et al (2006), care au constatat că şoarecii ce exprimă htt mutant rezistă la clivajul acesteia produs de caspaza-3, dar nu şi de către caspaza-6. Proteoliza htt reprezintă un fenomen important în medierea disfuncţiei neuronale şi a neuro-degenerării.

Caspaza-7 (Mch-3; ICE-LAP3; CMH-1) este o proteină localizată în

citoplasmă, codificată de gena CASP7. Este formată din 303 aminoacizi şi face parte din aceeaşi subfamilie cu Ced-3. Proteina activă este un heterotetramer constituit din 2 heterodimeri, fiecare la rândul lui format dintr-o subunitate de 20 kDa (p20) şi alta de 11 kDa (p11). Subunităţile active sunt generate de granzima B sau de caspaza-10. Se exprimă în numeroase ţesuturi fetale şi adulte. Caspaza-7 se exprimă la nivel ridicat în plămâni, ficat, rinichi, muşchii scheletului şi inimă, la nivel moderat în testicule şi nu se exprimă în creier. Are specificitate de substrat şi funcţii asemănătoare cu caspaza-3. Se apreciază că scindarea proteinei PARP în apoptoză ar fi efectul acţiunii combinate a celor două caspaze. Granzima B clivează procaspaza-7 în poziţiile asp-

198 şi asp-23 activând-o, astfel încât devine capabilă să scindeze proteina PARP (la fragmentul activ de 85 kDa). Caspazele -6 şi -7 au omologie ridicată cu caspaza -3. Substratul caspazei-7 include PARP, procaspaza-6, SREBP (sterol regulatory element

binding proteins) etc. Caspazele -3 şi -7 au acţiune diferită asupra unor proteine substrat ca Bid, XIAP, gelsolina, caspaza-6 şi proteina co-chaperon p23. Caspaza-3 ar fi mai heterogenă şi pare a fi caspaza de execuţie majoră în faza de execuţie a apoptozei, (Walsh et al., 2008). Soung et al. (2003) au arătat că mutaţiile genei CASP7 pot conduce la pierderea funcţiei ei apoptotice, fapt ce contribuie la patogeneza unor cancere solide la om. Autorii au depistat mutaţii ale acestei gene în 2% din carcinoamele de colon, în 2% din cancerele de esofag, în 3% din cele de gât etc.

Caspaza-8 (MACH; FLICE; Mch5) este codificată de gena CASP8. Proteaza

este localizată în citoplasmă şi este constituită din 479 de aminoacizi. Prezintă două capete N-terminale care conţin cca 70 de aminoacizi, omoloage cu domeniul N-terminal (DED – care conţine 117 reziduuri de aminoacizi în poziţie N-terminală) al proteinei FADD (MORT1), responsabil de apoptoză. Restul moleculei de caspază-8 este asemănător cu al subfamiliei Ced, situsul activ fiind însă pentapeptidul QACQG

90

(gln-ala-cys-gln-gly). Heterodimerul este format dintr-o subunitate de 18 kDa (p18) şi alta de 10 kDa (p10). Caspaza-8 ar avea forme diferite în diverse ţesuturi (izoforme), de unde şi capacitatea lor de a regla apoptoza. Aceste forme multiple exercită şi funcţii diferite în ţesuturi, unele ducând spre apoptoză, altele blocând apoptoza. Şi caspaza-8 poate fi activată de granzima B. Se consideră că în stare latentă, cele două domenii DED ale caspazei-8 sunt legate, ceea le face inactive. Activarea ei s-ar produce prin disocierea celor două domenii DED în urma cuplării proteinei FADD la domeniul DED. Caspaza-8 devine, prin oligomerizare, activă proteolitic în complexul DISC (Death Inducing Signaling Complex), complex format din Fas, FADD şi caspaza-8, iar prin clivare poate activa alte caspaze (caspazele -3, -6, -7). Când se leagă la DISC, moleculele de procaspază-8 ajung foarte aproape una de alta şi se pot activa prin auto-proteoliză, (Denault, citat după Gewies, 2003). Activarea căilor din aval ale caspazei-8 variază cu diferitele tipuri de celule. În figura 7.10 este ilustrată şi intervenţia în apoptoză a caspazei-10, care acţionează într-un mod asemănător cu caspaza-8, fiind implicată în principal în apoptoza celulelor limfoide.

Fig.7.10 - Calea de activare a apoptozei dependentă de caspaza-8/caspaza-10 (după Fan et al., 2005)

Caspaza-8 s-a dovedit capabilă să activeze in vitro zimogenii a şapte alte

caspaze, procaspazele -1, -2, -3, -6, -7, -9 şi -11, (Van De Craen et al., citaţi de Philchenkov et al., 2004). Embrionii de şoareci lipsiţi de caspaza-8 se dezvoltă normal în primele 11 zile de viaţă, apoi mor, datorită se pare unor malformaţii cardiace importante; inima acestor animale este hipotrofiată, ceea ce sugerează că enzima ar fi implicată în transmiterea mai degrabă a semnalelor de supravieţuire decât ale morţii, cel puţin la nivelul acestui organ. Totodată, aceşti embrioni produc prea puţini precursori mieloidici. Deşi rolul caspazei-8 nu este foarte clar, se pare că ea reprezintă

91

un element esenţial în apoptoza iniţiată de receptorii morţii, jucând de asemenea un rol foarte important în dezvoltarea cardiacă şi în hematopoieză, (Ricci, 2002). În afara auto-activării după recrutarea ei la receptorii morţii şi formarea complexului DISC, caspaza-8 poate fi activată şi pe calea apoptotică dependentă de cyt. c. În acest caz, este activată de caspaza-6 din citosol, iar această cale de activare a procaspazei-8 nu necesită nici interacţiunea cu FADD, nici formarea complexului DISC, (Fan et. al, 2005).

TNF-α poate induce apoptoza pe două căi distincte de activare a caspazei-8, reglate diferenţiat de către cIAP1/2 şi de către c-FLIP, (WANG et al., 2008). Într-o lucrare recentă, Oberst et al. (2011) arată că dezvoltarea şoarecilor deficienţi în caspaza-8 este salvată prin ablaţia RIPK3 (receptor interacting protein kinase-3). Caspaza-8 previne de asemenea necroza dependentă de RIPK3 fără inducerea apoptozei, funcţionând într-un complex proteolitic cu FLIPL [(FLICE(FADD-like

interleukin 1β-converting enzyme)- inhibitory protein long form)]. Într-o altă lucrare, autorii (Pop et al., 2011) arată că clivajul domeniului catalitic al caspazei-8 este crucial pentru activarea ei. S-a constatat că înaintea procesării, caspaza-8 în complex cu FLIPL nu generează o enzimă complet activă, ci una atenuată, care poate procesa doar substraturile naturale, rezultate care i-au determinat pe autori să propună un mecanism de activare a caspazei-8 prin dimerizare în prezenţa FLIPL şi a unui mecanism care să explice divergenţa ei funcţională.

Caspaza-9 (ICE-LAP6; Mch6) face parte din subfamilia Ced-3, este codificată de gena CASP9 localizată pe cromosomul 1 la om, conţine 416 aminoacizi, are o masă moleculară de 46 kDa, iar centrul ei catalitic este reprezentat de pentapeptidul QACGG (are gly în loc de arg). Heterodimerul este format dintr-o subunitate de 35 kDa (p35) şi alta de 10 kDa (p10). Clivajul la Asp315 produs de către granzima B şi la Asp330 de caspaza-3 generează subunităţile active ale enzimei. Este în principal o enzimă citosolică, dar atât enzima sub formă activă, cât şi sub formă de zimogen, au fost identificate şi în mitocondrii sau nucleu. Caspaza-9 este ubiquitară, cu exprimare ridicată în inimă, ovare şi testicule, expresie moderată în ficat, pancreas şi muşchii scheletului, nivel scăzut în alte ţesuturi, expresia ei variind şi în funcţie de stadiul de dezvoltare al organismului. În condiţii de stres celular (lezarea ADN, de exemplu) sunt activate proteinele pro-apoptotice din citosol. Acestea vor induce deschiderea porilor PT mitocondriali, ceea ce va determina eliberarea în citosol a cyt. c. În prezenţa dATP sau ATP din citosol, are loc oligomerizarea Apaf-1. Atât procaspaza-9 cât şi Apaf-1 au fiecare domenii CARD, prin intermediul cărora interacţionaează. Din interacţiunea Apaf-1, procaspazei-9 şi cyt.c citosolic, în prezenţa dATP, se formează un complex multimolecular denumit „apoptosom”, care duce la activarea caspazei-9, (fig. 7.11).

Caspaza-9 activată poate activa procaspazele -3 şi -7 (fig. 7.12), iar caspaza- 3 activată poate la rândul ei activa procaspaza-9 (o cale de activare de feed-back pozitiv). În cadrul apoptosomului, Apaf-1 este componentul central, fiind o moleculă formată din 3 domenii distincte, din care domeniul N-terminal CARD este responsabil de legarea la prodomeniul procaspazei-9, fiind important pentru recrutarea şi activarea acesteia, (asigură oligomerizarea Apaf-1 în prezenţa cit. c şi a dATP), (Fan et al, 2005).

92

Fig. 7.11 - Apoptosomul (după R.R. Dash, 2002; www.sgul.ac.uk/dept.immunology-dash)

Fig. 7.12 - Calea MCP mediată de mitocondrii şi dependentă de caspaze (după Fan et al., 2005)

Fenotipul şoarecilor lipsiţi de caspaza-9 seamănă cu al celor lipsiţi de caspaza-3, consecinţele fiind chiar mai grave; ei mor în ziua a 16-a de dezvoltare şi suferă de malformaţii cerebrale, prezentând un exces de celule la nivelul sistemului nervos central. Spre deosebire însă de creier, unele organe precum inima, plămânul, ficatul şi coloana vertebrală se dezvoltă normal. Faptul că şoarecii lipsiţi de caspaza-3, caspaza-9 sau Apaf-1 prezintă un fenotip foarte asemănător, sugerează că aceste molecule intervin probabil pe o cale comună în apoptoză, (Ricci, 2002). Caspaza-9 intervine în activarea, citocrom C-dependentă, a caspazelor -2, -3, -6, -7, -8 şi -10.

Caspaza-10 (Mch4, FLICE2, ICE-LAP4) este codificată de gena CASP10 şi este o proteină care la om conţine 521 de aminoacizi. Face parte din subfamilia Ced-3 şi are un situs activ de tipul QACQG (gln-ala-cys-gln-gly). Prezintă la capetele N-terminale două domenii DED (asemănătoare FADD). Enzima activă este un heterotetramer format din 2 heterodimeri, fiecare din aceştia constituit dintr-o subunitate mare de 23/17 kDa (p23/17) şi alta mică de 12 kDa (p12). A fost identificată în mai toate ţesuturile, aflându-se în cantităţi mai mari în ficat, inimă, splină şi în cantităţi mai scăzute în creier, rinichi, prostată, testicule şi colon. Pro-caspaza-10 poate fi clivată de granzima B, iar la rândul ei poate cliva toate caspazele. Întrucât caspazele -3 şi -7 nu sunt capabile de a scinda caspaza-10, se presupune că ea s-ar afla în apropierea vârfului cascadei proteazelor, (Fernandes-Alnemiri et al., 1996). Deşi acţionează asemănător cu caspaza-8, caspaza-10 poate funcţiona independent de aceasta în iniţierea apoptozei legată de receptorii FAS şi TNF. Chiar dacă ambele aceste caspaze interacţionează cu domeniul DED al FADD, ele ar putea avea

93

substraturi diferite ale apoptozei şi să funcţioneze cumva diferit în semnalizarea receptorilor morţii, (Fan et al., 2005). Caspaza-10 nu se poate substitui caspazei-8, iar deficienţele în inducerea apoptozei observate la celulele lipsite de caspaza-8 nu pot fi salvate de expresia în exces a caspazei-10, (Sprick et al., 2002). Defectele caspazei-10 stau la baza sindromului proliferativ autoimun de tip 2A (ALPS2A) la om, limfomului non-Hodgkin familial (NHL), a cancerului gastric etc (http://www. uniprot.org/uniprot/ Q92851).

Caspaza-11 este un membru al familiei de caspaze murine, fiind un activator

din amonte al caspazei-1 în reglarea maturării citokinelor. Situl optim de clivare al caspazei-11 este (I/L/V/P)EHD, (Kang et al., 2000). Enzima are rol crucial atât în inflamaţie cât şi în apoptoză. Ea activează atât caspaza-1 necesară în maturarea citokinelor proinflamatoare (ca IL-1β şi IL-18), cât şi în activarea caspazei-3 care conduce la apoptoză, (Hur et al., 2001). Caspaza-11 mediază răspunsul la şocul septic, şoarecii deficienţi în caspaza-11 fiind rezistenţi la şocul indus de LPS. Enzima poate activa caspazele -3/-7 independent de activarea caspazei-1, iar apoptoza mediată de caspaza-11 este independentă de Bid, (Kang et al., 2002). Autorii consideră că omologul uman al caspazei-11 ar putea fi o ţintă terapeutică pentru tratamentul şocului septic la om. Astrocitele (celule esenţiale în menţinerea integrităţii creierului) la şobolan se supun apoptozei după activarea inflamatorie. Mediatorul citotoxic major al acestui tip de apoptoză este oxidul de azot (NO) produs de astrocitele activate. Caspaza-11 pare a fi o moleculă esenţială în calea apoptotică independentă-NO a astrocitelor activate. Inactivarea caspazei-11 prin tratamente adecvate au redat astrocitelor rezistenţa parţială la apoptoza indusă de activarea inflamatorie, dar nu şi în cazul expunerii la donori de NO. Stimulii inflamatori induc atât producerea de NO citotoxic, cât şi iniţierea căii apoptotice NO-independente prin inducţia expresiei caspazei-11, (Suk et al., 2002). Această protează are un rol central în apoptoza microgliilor şi astrocitelor după activarea inflamatorie. Stimulii inflamatori produc apoptoza nevrogliilor prin caspazele -11, -1 şi -3, (Suk, 2005). Investigaţii întreprinse în scopul de a evidenţia dacă caspaza-11 este implicată în moartea astrocitelor dependentă de stresul RE în condiţii ischemice, au arătat că această protează este un mediator cheie al răspunsului la stresul RE, care acţionează în aval de CHOP (proteina omoloagă factorului de transcripţie C/EBP), (Fradejas et al., 2010).

Caspaza-12. Caspazele -1, -4, -5, -11 şi -12 au o omologie înaltă. La om,

caspaza-12 este situată pe cromosomul 11, nu are activitate proteazică, este codificată de gena CASP12 şi are o secvenţă formată din 341 aminoacizi. Gena pentru caspaza-12 umană este polimorfă şi poate conţine sau nu un codon stop care determină fie apariţia formei lungi (CASP12L) active (ancestrale), fie a formei scurte (CASP12S) inactive (derivate) a genei. Purtătorii genei inactive au o rezistenţă mai mare la sepsiile severe. Această formă inactivă ar fi apărut în Africa, a fost iniţial neutră sau aproape neutră, selecţia pozitivă contribuind cu timpul la fixarea ei datorită avantajului selectiv de rezistenţă la sepsie (sepsis), (Xue et al., 2006). Caspaza-12 a fost decelată în inimă, ficat, rinichi, plămâni, pancreas, splină, stomac, intestinul subţire, timus şi testicule, iar funcţia ei ar fi aceea de a diminua eliberarea de citokine ca răspuns la LPS bacteriene şi în cursul infecţiilor (http://www.uniprot.Q6UXS9). Unele cercetări efectuate pe

94

şoareci lipsiţi de caspaza-12 au arătat că enzima pare a nu fi esenţială pentru apoptoza indusă de Fas. Procaspaza-12 ar fi în principal localizată în reticulul endoplasmatic (RE) şi ar fi activată de către un stres provocat acestuia. Stresul pentru RE poate fi produs de acumularea în lumenul RE a unor proteine, în special a celor neîmpachetate sau împachetate eronat, sau de perturbarea homeostaziei ionilor de calciu. Acest stres poate fi indus şi de către tapsigargină, tunicamicină, ionoforii de calciu, brefildina-A şi cisplatină. În condiţii de stres RE, activarea caspazei-12 poate fi indusă şi de alte caspaze (de caspaza-7, de exemplu), (Fan et al., 2005).

Fig. 7.13 - Implicarea caspazei-12 în apoptoza declanşată de stresul reticulului endoplasmatic (ER), (după Fan et al., 2005)

O schemă care sugerează implicarea în apoptoză a caspazei-12 este redată în figura 7.13. S-a observat că neuronii şoarecilor lipsiţi de caspaza-12 sunt mai puţin sensibili la toxicitatea indusă de proteina amiloid-b (Ab); proteina Ab ar poseda receptori localizaţi în RE şi ar fi capabilă de a induce un proces apoptotic, mecanism ce ar juca un rol cheie în maladia Alzheimer. Caspaza-12 pare a fi esenţială în apoptoza indusă de un stres la nivelul RE sau de moartea neuronală indusă de proteina Ab, (Nakagawa et al., 2000; Ricci, 2002).

Caspaza-13 este codificată de gena CASP13, a fost iniţial raportată ca fiind caspază umană, dar s-a constatat ulterior că este specifică bovinelor. Are o secvenţă de 377 aminoacizi. Subunităţile heterodimerului provin fie prin clivaj autocatalitic, fie prin intervenţia caspazei-8. Se exprimă în principal limfocitele sângelui periferic, în splină şi placentă (http://www.uniprot.org/uniprot/O75601; Koenig et al., 2001).

Caspaza-14 umană este codificată de gena CASP14 aflată pe cromosomul 19 şi

are o lungime a secvenţei de 242 aminoacizi. Heterodimerul este format dintr-o

95

subunitate de 19 kDa (p19) şi alta de 10 kDa (p10). Este localizată în citoplasmă şi nucleu, se exprimă în keratinocite şi glandele sebacee, fiind slab exprimată în pielea cu psoriazis. Se consideră că este implicată în diferenţierea keratinocitelor şi în cornificare, (http://www.uniprot.org/uniprot/P31944). Investigaţiile efectuate de Pistritto et al. (2002) au arătat că enzima se exprimă nu numai în epiteliile complexe, ci şi în cele simple. Activarea caspazei-14 se corelează cu cornificarea, ceea ce arată că ea joacă rol în diferenţierea terminală a keratinocitelor, această activare având loc cel mai probabil la interfaţa dintre stratul granular şi cel cornos. Enzima nu este activată de o caspază, ci probabil de o serin-protează specifică epidermei, cu proprietăţi de tip elastază. Primul substrat descoperit pentru caspaza-14 este (pro)filaggrin, proteină a cărei degradare ar produce aminoacizi higroscopic liberi, fapt ce ar explica rolul ei în prevenirea pierderilor de apă prin epidermă. Caspaza-14 protejează de asemenea pielea de leziunile induse de UVB, mecanismul acestei acţiuni fiind încă obscur, (Denecker et al., 2008). Caspaza-14 murină are omologie de 83% cu cea umană. Se exprimă abundent în embrionii de şoarece. Caspaza-14 murină nu este clivată de granzima B şi caspazele -2, -3, -6, -7 sau -11, fiind slab procesată de către caspaza-8 de şoarece, (Van De Craen et al., 1998).

Prezentăm în figura 7.14 o schemă care ilustrează modul de interacţiune şi de activare a caspazelor.

Fig. 7.14 – Activarea şi interacţiunea caspazelor (după Dănăilă et al., 1999) Studiile efectuate pe şoareci lipsiţi de genele pentru unele caspaze (caspazele-1,

-2, -3, -8, -9, -11 şi -12) şi alte proteine implicate în apoptoză au arătat (tab. 7.5) că: - nici una din invalidările unor astfel de gene nu a inhibat total apoptoza pe parcursul dezvoltării. Cele mai severe fenotipuri (consecinţe) s-au observat la şoarecii lipsiţi de caspazaele -3 şi -9, care au manifestat anomalii cerebrale majore; - indiferent de caspaza în cauză, efectele asupra apoptozei au depins de tipul celular şi de stimulul folosit. Jocul caspazelor implicate diferă probabil funcţie de efector şi de ţesutul în cauză, (Ricci, 2002).

96

Tabel nr. 7.5 - Efectele invalidării genelor pentru unele caspaze şi proteine implicate în apoptoză la şoareci (Los et al., 1999 – adaptare după Ricci, 2002)

Proteina Dezvoltare, expresia citokinelor Apoptoza Referinţe

Caspaza-1 Lipsă efecte asupra dezvoltării; rezistenţă la şocuri septice induse de LPS; absenţa de IL-1β şi de IL-18; producere alterată de IL-1c, IL-6 şi IFN-γ

Sensibilitate normală la majoritatea agenţilor pro-apoptotici; apoptoza indusă prin CD95 este atenuată în timocite. Neuronii sunt rezistenţi la lipsa în factori de creştere

Kuida et. al., 1995; Li et al., 1995; Wang et al., 1998

Caspaza-2 Viabile, fără probleme majore; exces de celule germinative femele

Ovocite rezistente la moartea indusă de droguri; moartea indusă prin granzima B este defectuoasă în celulele B; limfocitele sunt sensibile la medicamente şi la anti-CD95

Bergeron et al., 1998; Wang et al., 1994

Caspaza-3 Talie mai mică. Moarte între prima şi a 3-a săptămână. Alterarea dezvoltării creierului, cu un exces de celule postmitotice

Lipsă înmugurire şi fragmentare a nucleului timocitelor şi hepatocitelor; scindarea substraturilor caspazelor absentă sau întârziată. Reducerea apoptozei în AICD (apoptoza indusă de antigen) şi în fibroblastele stimulate de droguri

Kuida et al., 1996; Woo et al., 1998

Caspaza-8 Letală in utero. Embrioni foarte mici; malformaţii cardiace; acumulare masivă de eritrocite şi hemoragie severă. Diminuarea celulelor suşă hematopoietice

Fibroblaste rezistente la apoptoza indusă prin TNF-RL, CD95 şi DR3, dar sensibile la majoritatea agenţilor pro-apoptotici; activare normală a NF-kB şi JNK

Varfolomeev et al., 1998

Caspaza-9 Letalitate perinatală; creier mai voluminos şi malformat datorită reducerii apoptozei în cursul dezvoltării creierului. Absenţa activării caspazei-3 în creierele embrionare

Celulele suşă embrionare şi fibroblastele sunt rezistente la numeroşi stimuli pro-apoptotici; timocitele sunt rezistente la apoptoza indusă prin iradiere gamma şi dexametazonă, dar sensibile la UV şi CD95. Splenocitele nu sunt protejate împotriva apoptozei induse de medicamanete

Hakem et al., 1998; Kuida et al., 1998

Caspaza-11 Lipsă deficienţe de dezvoltare. Producţia de IL-1α şi -β absentă, datorită blocării activării caspazei-1.

Celule rezistente la apoptoza indusă prin exprimarea în exces a caspazei-1

Wang et al., 1998

Caspaza-12 Lipsă defecte de dezvoltare Şoareci rezistenţi la apoptoza indusă de stresul reticulului endoplasmatic, dar sensibili la alţi stimuli pro-apoptotici; neuronii corticali prezintă o lipsă de sensibilitate la apoptoza indusă de proteina β-amiloid, dar nu şi la staurosporină sau la privarea de factori de creştere

Nakagawa et al., 2000

FADD Letală în cursul dezvoltării. Probleme cardiace majore şi o predispoziţie la hemoragii. Fenotip similar celui al şoarecilor casp. 8-/-. Expresie intactă a IL-2 de către timocite

Fibroblaste rezistente la receptorii morţii, dar nu şi la medicamente anticanceroase sau la expresia oncogenelor

Yeh et al., 1998; Smith et al., 1996; Newton et al., 1998; Zhang et al., 1998

Apaf-1 Letală pentru E16. Dezvoltare anormală a creierului. Deficienţe severe cranio-faciale şi de osificare, ca şi la nivelul cristalinului şi retinei. Persistenţa membranei interdigitale

Fibroblastele embrionare au un răspuns redus la numeroşi stimuli pro-apoptotici. Timocitele sunt sensibile la Fas, dar nu şi la apoptoza indusă de medicamente sau la iradieri.

Yoshida et al., 1998; Cecconi et al., 1998

Citocromul-c Letal in utero (spre E10,5). Activarea caspazei-3 redusă. Rezistenţă Li et al., 2000

97

Dezvoltare întârziată în raport cu şoarecii de control

la apoptoza indusă de UV, privarea de factori de creştere, staurosporină. Celulele cit. c-/- prezintă o sensibilitate crescută la moartea indusă prin TNFα

Bcl-2 Viabili la naştere. Şoarecii devin gri la vârsta de 5 sau 6 săptămâni

Insuficienţă renală severă datorită numărului redus de nefroni. Scăderea

progresivă a numărului de limfocite circulante în timpul dezvoltării. Apoptoza masivă a splinei şi timusului.

Veis et al., 1993; Nakayama et al., 1994; Kamada et al., 1995

Bcl-X Letală în E13 Apoptoză masivă la nivelul creierului, măduvei spinării şi timusului

Motoyama et al., 1995

Bax Viabili. Nu este esenţială pentru dezvoltarea organismului

Masculi sterili datorită unei apoptoze masive a a celulelor germinative. Neuroni izolaţi la aceşti şoareci proliferează în absenţa factorului de creştere

Knudson et al., 1995; Deckwerth et al., 1996

Bcl-w Viabili. Nu este esenţială pentru dezvoltarea organismului

Masculii sunt sterili. Femelele au funcţii de reproducere normale

Print et al., 1998

În cazul unor celule, denumite de tipul I, concentrarea locală (la nivelul DISC) a câtorva molecule de procaspază-8 determină, aşa cum s-a prezentat deja, activarea lor autocatalitică, iar caspaza-8 activă va provoca la rându-i în aval activarea unor caspaze efectoare, care vor scinda succesiv substraturi specifice, proces ce se va finaliza cu moartea celulei. În acest caz există un nivel important al caspazei-8 după stimularea receptorului Fas. La celulele de tipul II, semnalul produs de receptorul activat nu este suficient de puternic pentru semnalizarea cascadei de caspaze şi execuţia morţii celulare, semnal ce va trebui amplificat via calea apoptotică mediată de mitocondrii, proces asigurat de proteina Bid. Această proteină este clivată de caspaza-8, iar forma rezultată - tBid este translocată în mitocondrii unde, împreună cu proteinele Bax şi Bak (toate, membri ai familiei Bcl-2), determină eliberarea din mitocondrii în citosol a cyt.

c şi a altor factori pro-apoptotici. În citosol, cyt. c se leagă (cu consum de energie) la proteina monomerică Apaf-1, formează împreună cu procaspaza-9 apoptosomul, este activată caspaza-9 (iniţiatoare), care va activa cascada de caspaze efectoare din aval (caspaza-3, caspaza-7 şi caspaza-6), care în final vor determina moartea celulei, (Gewies, 2003). Acţiunea caspazelor are ca rezultat: - activarea (clivarea) pro-caspazelor, cu formarea caspazelor; - scindarea proteinelor anti-apoptotice din familia Bcl-2; - hidroliza proteinelor laminelor, care stabilizează membrana nucleară, cu condensarea cromatinei; - distrugerea proteinelor care participă la reglarea funcţiilor citoscheletului; - inactivarea şi dereglarea proteinelor care asigură repararea ADN-ului (ţinta caspazelor este PARP).

7.3.3. Substraturile din aval pe care acţionează caspazele Unele caspaze, precum caspazele -2, -8 şi -10, vor activa caspazele de execuţie

din aval. Caspaza-8 activată poate scinda proteina Bid, cu formarea tBid, care determină eliberarea cyt. c din mitocondrii, cu activarea căii apoptotice mitocondriale. Caspazele ce mediază procesele inflamatorii, cum ar fi caspazele -1, -4 şi -5, au ca substraturi în aval pro-IL-1β, pro-IL-18, IL-1F7b şi unii membri NOD-LRR

98

(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeat) ca Ipaf (interleukin-1β-

converting-enzime protease-activating factor), LRR pirin proteinele. Caspazele de execuţie au ca substart în aval proteine ca PARP, lamininele, fodrina şi Bcl-2, fapt ce determină modificări morfologice caracteristice, (Fan et al., 2005).

Între caspazele de execuţie, unele au o specificitate înaltă de substrat, altele pot cliva împreună acelaşi substrat. Aşa, de exemplu, caspaza-6, pare a fi singura capabilă să cliveze lamina, în timp ce caspazele -3 şi -7 sunt ambele capabile să scindeze PARP. Dintre caspaze, caspaza-3 pare să aibă cel mai variat spectru de acţiune, fiind găsită că poate cliva parţial sau total diverse substraturi ca: PARP, ribonucleoproteina U1-70 kDa, ribonucleoproteinele nucleare C1 şi C2, proteinele reglatoare de sterol, huntingtina, proteina Rb (din retinoblastom) etc. Aceste substraturi au ca motiv DXXD.

PARP. Dintre substraturile proteice menţionate anterior, PARP a fost cel mai studiat şi la numeroase sisteme. Proteina PARP de 116 kDa este scindată în două fragmente de 24 şi 89 kDa la secvenţa DEVD/G. Clivarea PARP este un indiciu clar al instalării apoptozei. Şi caspazele -2, -4, -6, -7, -8, -9, -10 par a fi capabile să cliveze in

vitro PARP, certă fiind deocamdată doar calitatea caspazelor -3 şi -7 de a scinda PARP.

ADN-PK (DNA-dependent protein kinase) este o enzimă (serin/treonin kinază) care serveşte drept sensor al lezării ADN. Ea este formată dintr-o subunitate catalitică de 460 kDa şi un ADN de legare Ku. Acest ADN este un hetero-dimer constituit din două subunităţi (de 70 şi 80 kDa). Rolul acestei enzime ar fi de: a proteja şi alinia capetele rupte ale ADN; de a ajuta localizarea proteinelor de reparaţie ADN la locul de lezare a lui; pare a avea rol şi în menţinerea stabilităţii telomerelor şi împiedicarea fuzionării cromosomilor prin capetele lor (www.uniprot.org/uniprot/P78527). Unele caspaze (în special caspaza-3) pot cliva componenta proteică a ADN-PK. În acest caz capacitatea de reparare a ADN de către ADN-PK se reduce, fiind favorizată degradarea ADN şi implicit apoptoza.

U1-70 kDa. Face parte din clasa U1 (o mică particulă ribonucleoproteică), care în celulele apoptotice este clivată specific, rezultând fragmentul de 40 kDa. Cinetica clivării coincide cu apariţia celulelor cu morfologie apoptotică, iar frecvenţa fragmentului de 40 kDa creşte în celulele apoptotice, (Casciola-Rosen et al., 1994). Proteina U1-70 kDa poate fi clivată de caspaza-3 la situsul DGPD/G.

CAD. Dezoxiribonucleaza activată de caspază (CAD) este o endonuclează dependentă de magneziu care joacă un rol important în degradarea ADN în apoptoza mamiferelor. Sediul ei este în nucleu, unde formează un complex cu inhibitorul ei specific ICAD (inhibitor of caspase-activated DN-ase), care este esenţial în împachetarea corectă a CAD şi în inhibarea activităţii ei nucleazice. În timpul apoptozei caspaza-9 lezează porii nucleari şi permite caspazei-3 să intre în nucleu şi să scindeze ICAD, fapt ce poate determina degradarea ADN-ului, (Fan et al., 2005; Kanouchi et al., 2005).

Laminele. Sunt, aşa cum arătam anterior, proteine de bază din structura membranei nucleare. Laminina reprezintă substrat pentru caspaza-6 şi posibil şi pentru alte caspaze. Clivarea se produce la un situs al domeniului alfa helical. Sunt distruse legăturile între laminine sau între laminine şi alte componente nucleare. În experineţe realizate pe celule HeLa tratate cu CD95 s-a observat că în apoptoza timpurie este

99

clivată mai întâi laminina B şi apoi lamininele A şi C sau ADN, de unde concluzia că lamininele A şi B sunt scindate de caspaze diferite, (Dănăilă et al., 1999).

Fodrina. Este o endoproteină globulară specifică citoscheletului. Împreună cu actina se situează abaxial la membrana plasmatică a celulelor secretorii şi este importantă în alinierea veziculelor secretorii la membrana plasmatică în timpul procesului secretor. Clivarea fodrinei în apoptoza indusă de CD95 şi TNF ar fi responsabilă de reducerea volumului celular şi încreţirea membranei plasmatice. Proteina ar avea mai multe situsuri de clivare, din care unele specifice caspazelor, (Dănăilă et al., 1999).

Fig. 7.15 - Substraturile din aval ale caspazelor de execuţie

(după Fan et al., 2005) Protein-kinaza C delta. Caspaza-3 are capacitatea de a cliva PKC delta în

apoptoză, din care rezultă un fragment catalitic activ. Prezenţa în exces a acestui fragment în celulă determină condensarea cromatinei, fragmentarea nucleară şi apoptoza.

Proteina Rb. Fosforilarea acestei proteine de kinazele ciclin-dependente (cdk) conduce celula spre mitoză. În cursul apotozei au fost identificaţi produşi de clivare a proteinei Rb. În unele cercetări s-a observat clivarea Rb la nivelul situsului DEAD/G, fapt ce a sugerat intervenţia caspazei-3.

În figura 7.15 sunt redate schematic substraturile din aval ale caspazelor de execuţie a apoptozei.

7.4. Căile de realizare a apoptozei

Deşi, din informaţiile ample prezentate anterior s-au dedus şi căile de semnalizare şi execuţie a apoptozei, în cele ce urmează ne propunem doar o sinteză a

100

lor. În literatura de profil, au fost identificate două căi ale apoptozei, şi anume a) calea extrinsecă (moartea idusă de semnale ale morţii, pe calea mediată de receptorii morţii şi b) calea intrinsecă (moartea indusă de stres, pe calea mediată de mitocondrii), (Saraste şi Pulkki, 2000; Fan et al., 2005), (fig. 7.16). La aceste două căi principale ale apoptozei, unii autori adaugă o a treia şi anume cea a citotoxicităţii mediată de celulele T - a morţii celulare care depinde de perforină/granzimă. Ar exista şi o cale apoptotică mediată de reticulul endoplasmatic (RE), în care ar fi implicată caspaza-12 (Nakagawa et al., 2000, citaţi de Van Cruchten şi Van Den Broek, 2002). Indiferent care ar fi calea urmată, apoptoza se finalizează cu faza de execuţie, care presupune activarea caspazei-3, fragmentarea ADN-ului, degradarea proteinelor nucleare şi ale citoscheletului, legarea în cruciş a proteinelor, formarea corpilor apoptotici, exprimarea liganzilor pentru receptorii celulelor fagocitare şi înghiţirea (ingestia) corpilor apoptotici de către fagocite. Şi granzima A este implicată în apoptoza CTL-indusă, activând căi ale MC independente de caspază, (Elmore, 2007).

Fig. 7.16 - Căile apoptotice care conduc la moartea celulei de mamifere,

(după Fan et al., 2005) Calea apoptotică extrinsecă (stânga) este indusă de un ligand receptor al morţii (TNF, TRAIL, FasL etc) şi determină recrutarea şi formarea complexului multiproteic DISC care include receptorul morţii, proteinele adaptor intracelulare (TRADD, FADD, RAIDD) şi caspazele iniţiatoare (procaspaza -8 sau -10). Complexul duce la procesarea autocatalitică şi activarea caspazei iniţiatoare. Calea apoptotică intrinsecă (dreapta) este iniţiată de majoritatea stimulilor apoptotici, care includ iradierea, medicamentele citotoxice, lezarea ADN etc. Pierderea potenţialului de membrană mitocondrială şi eliberarea proteinelor pro-apoptotice ale morţii celulare determină formarea unui alt complex multiproteic, apoptosomul, care include Apaf-1, citocromul c, ATP/dATP şi caspaza iniţiatoare, procaspaza-9. Complexul format duce la activarea autocatalitică a caspazei-9 şi ulterior a caspazelor efectoare. Omologii Bcl-2 pro- şi anti-apoptotici reglează eliberarea proteinelor mitocondriale pro-moarte celulară.

Calea extrinsecă (care în principiu înseamnă activarea caspazei-8) este mediată de activarea receptorilor morţii (death receptors) prezenţi la suprafaţa celulelor ce fac parte din familia TNFR (tumor necrosis factor receptor), care includ: TNFR1, Fas şi

101

receptorii DR-4 şi DR-5 ai TRAIL, (Ashkenazi, 2002; Wang şi El-Deiry, 2003; Păunescu, 2006). La rândul lor, celulele ce urmează calea extrinsecă a apoptozei pot fi, cum arătam anterior, de două categorii, de tipul I şi II. În cazul celulelor de tip I (timocitele, sau unele celule ale liniei limfoide, de exemplu), apoptoza este indusă direct, în principal pe calea semnalizării cascadei de caspaze. Prin cuplarea receptorilor familiei TNFR cu liganzii specifici celula primeşte semnalul pentru apoptoză. Cum ştim deja, receptorii morţii conţin în regiunea lor citoplasmatică domeniul morţii (DD). La rândul lor şi proteinele adaptor (FADD sau TRADD) conţin un domeniu omolog (DD), prin intermediul căruia pot fi recrutate de către receptorii morţii, formându-se astfel complexul de semnalizare şi inducere a morţii – DISC (death inducing signalling complex). Proteina FADD conţine în plus şi un domeniu efector al morţii (DED), prin intermediul căruia ineracţionează cu domeniul DED al procaspazei-8, pe care o recrutează (o sechestrează la platforma DISC). Concentrarea câtorva molecule de procaspază-8 la DISC determină clivarea ei prin autocataliză şi formarea caspazei-8 active. În acest caz, caspaza-8 este viguros activată şi la rândul ei va activa procaspazele efectoare din aval (de exemplu, procaspaza-3), care vor degrada substraturile specifice, ceea ce conduce în final la moartea celulară, (Gewies, 2003; Fan et al., 2005).

La celulele de tip II (hepatocitele, de exemplu), semnalul ce pleacă de la receptorul activat nu este suficient de puternic pentru a genera cascada de caspaze şi el trebuie amplificat prin intervenţia căilor apoptotice dependente de mitocondrii. În acest caz caz, caspaza-8 este slab activată şi incapabilă de a activa procaspaza-3, de exemplu. Ea poate totuşi activa calea mediată de mitocondrii prin activarea proteinei Bid, o proteină pro-apoptotică din citosol. Legătura dintre activarea cascadei de caspaze şi calea mitocondrială a apoptozei este asigurată deci de proteina Bid (BH3

interacting domain death agonist - un membru al familiei de proteine Bcl-2), care este clivată (tBid) de caspaza-8 şi apoi translocată în mitocondrii. Aici, tBid, în cooperare cu proteinele Bax şi Bak (alţi membri din familia Bcl-2) determină eliberarea din mitocondrii în citosol a cyt. c şi a altor factori pro-apoptotici. În citosol cyt. c se leagă la Apaf-1, în prezenţa ATP, iar Apaf-1 interacţionează cu procaspaza-9 prin intermediul CARD generând apoptosomul, fapt ce asigură activarea caspazei-9. Această caspază activează la rândul ei cascada de caspaze efectoare (caspazele -3, -7 şi -6), care în final determină moartea celulară, (Slee citat de Gewies, 2003; Wang şi El-Deiry, 2003).

Calea intrinsecă (care în principiu înseamnă activarea caspazei-9) a apoptozei are ca „actor” principal mitocondriile. Ele pot elibera, ca răspuns la anumiţi stimuli, factori care pot promova moartea celulară (factori apoptogeni), cum ar fi: citocromul c, Apaf-1, AIF, procaspaza-3, Ca2+ şi ROS. Eliberarea acestor factori din mitocondrii s-ar datora unor proteine pro-apoptotice precum Bax (care ar oligomeriza în membrana mitocondrială externă), sau a proteinei Bax în asociere cu VDAC (voltage-dependent

anion channel) sau cu tBid, care induc formarea de pori ce permit trecerea unor proteine solubile (Jan et al., 2008). Foarte mulţi dintre factorii care induc apoptoza provoacă lezarea potenţialului trans-membranar mitocondrial (Dy) şi a permeabilităţii de tranziţie (PT), ceea ce înseamnă creşterea bruscă a permeabilităţii membranei interne a mitocondriilor (la soluţii cu masa moleculară sub 1,5 kDa). Se produce astfel afluxul apei în matrix, care poate duce la ruperea membranei externe a mitocondriilor

102

şi la eliberarea în citoplasmă a proteinelor pro-apoptotice aflate în spaţiul inter-membranar mitocondrial, între care cyt. c, factorul de inducere a apoptozei (AIF), endonucleaza G, proteina Smac/DIABLO, serin-proteaza HtrA2/Omi (serin-protează mitocondrială, care interacţionează cu domeniile BIR2 sau BIR3 ale XIAP pentru anularea inhibiţiei de către proteinele IAP) etc, (Gewies, 2003). În spaţiul amintit se găsesc două grupe de proteine pro-apoptotice: una este formată din cyt. c, Smac/DIABLO şi HtrA2/Omi – care activează calea MPC mitocondrială dependentă de caspaze; cea de a doua grupă este formată din AIF, endonucleaza G şi CAD, acţionează într-o manieră independentă de caspaze şi odată eliberate din mitocondrii sunt translocate în nucleu unde produc clivarea cromatinei nucleare şi fragmentarea oligonucleosomală a ADN-ului, (Elmore, 2007).

În faza efectoare a apoptozei se deschid porii permeabilităţii de tranziţie (PPT), care sunt dependenţi de voltaj şi sensibili la ciclosporina A (CsA). Structura PPT nu este încă elucidată dar, potrivit informaţiilor sintetizate de Jan et al. (2008) sunt dovezi care sugerează că în componenţa lor ar intra: ciclofilina D din matrixul mitocondrial, VDAC din membrana externă, ANT (adenine nucleotide translocator) din membrana internă, receptorul periferic al benzodiazepin, Bcl-2, hexokinaza legată de VDAC şi creatin-kinaza inter-membranară. Din aceleaşi informaţii rezultă că hexokinaza este un component integral al VDAC, care prin legare la VDAC interferă cu deschiderea PPT, inhibând eliberarea cyt. c şi implicit apoptoza. Tranziţiile por deschis/por închis sunt reglate de numeroşi efectori, care pot fi de două tipuri: efectori ai matrixului şi efectori

ai membranei. Din prima categorie fac parte atât deschizători, cum ar fi Ca2+, fosfatul, agenţi oxidanţi, OH- etc, cât şi inhibitori, cum ar fi ciclosporina A, adenozin-difosfatul H+, agenţi reducători etc. Din categoria efectorilor de membrană fac parte potenţialul înalt de membrană - care asigură stabilizarea PPT în poziţia închis, în timp ce depolarizarea membranei induce deschiderea PPT. La reglarea PPT pot participa şi alţi factori precum chinonele, proteinele Bcl-2, nivelul de ATP intracelular etc., (Jan et al., 2008).

Prin urmare, canalele oligo-proteice generate la nivelul membranei mitocondriale externe de către porină sau VDAC, iar la nivelul celei interne de către ANT şi ciclofilina D, permit eliberarea unor molecule pro-apoptotice ca: cyt.c, factorul de inducere a apoptozei (AIF), caspazele -2, -3, şi -9. AIF este o moleculă situată în spaţiul intermembranar mitocondrial, care are funcţie dublă: de oxido-reductază şi de factor apoptogen. Calea AIF ar fi independentă de caspaze şi nu necesită un intermediar pentru a realiza apoptoza nucleară, (RICCI, 2002). Eliberarea cyt. c din mitocondrii în citosol, cum am arătat anterior, activează apoptosomul (formarea complexului molecular cyt.c/Apaf-1/procaspaza-9) şi induce cascada de caspaze, care duce la moartea celulară.

Proteinele din familia Bcl-2 au un rol major în reglarea apoptozei, tocmai prin modularea activităţii unor caspaze, şi în special a caspazei-9. Proteinele Bax şi Bim (pro-apoptotice) pot interacţiona cu VDAC şi induce eliberarea cyt. c din mitocondrii, în timp proteinele Bcl-2 şi Bcl-XL (anti-apoptotice) împiedică eliberarea cyt. c din mitocondrii şi implicit inhibă formarea apoptosomului necesar realizării apoptozei. Citocromul c are un rol esenţial în promovarea apoptozei, fapt demonstrat de invalidarea genei pentru această proteină. Celulele cyt. c

-/- nu pot activa caspaza-3 ca răspuns la stimulii pro-apoptotici. Se pare că nici o altă proteină în afara cyt. c nu poate

103

induce oligomerizarea Apaf-1 şi activarea caspazei-3 în urma unui stres celular sau a acţiunii unui agent care are drept ţintă mitocondria, (Li, citat de Ricci, 2002).

Se pune problema cum de au mitocondriile un rol atât de important în apoptoză? Dacă reflectăm un pic asupra originii lor, putem găsi un răspuns probabil. Este în prezent tot mai acceptată ipoteza endosimbiozei în serie, elaborată de Margulis şi Sagan (1968), cu privire la originea unor organite celulare ca plastidele şi mitocondriile. Dimensiunile acestor organite, prezenţa în ele a unui aparat genetic propriu (ADN, ARN, ribozomi) şi a unei proteosinteze autonome au sugerat ideia că ele provin din bacterii de dimensiuni mai mici (foste cândva organisme unicelulare libere) care au intrat în simbioză cu bacterii de dimensiuni mai mari, din care au derivat proto-eucariotele. Celulele eucariote sunt considerate comunităţi microbiene coevolutive (Ghiorghiţă, 2009). A fost un moment crucial în evoluţia viului, dar şi unul delicat: eucariotele primitive depindeau acum de energia furnizată de bacteriile „înghiţite”, iar acestea la rândul lor trebuiau să se adapteze noului mediu de viaţă. În ciuda acestei simbioze reuşite, „celulele eucariote trăiesc într-un echilibru între viaţă

şi moarte, deoarece mitocondriile păstrează încă repertoriul de molecule care poate

declanşa moartea” (cnf. Wikipedia). Procesul se produce însă doar atunci când este programat.

Fig. 7.17 - Schemă care relevă dispariţia (fagocitarea) celulelor apoptotice

(PS = fosfatidil-serină; LPC = liso-fosfatidil-colină; Anx 1 = anexina-1)

Pe una sau alta din căile apoptotice discutate mai sus sunt activate capsazele şi se produc modificările morfologice şi biochimice prezentate într-un capitol anterior:

- încetarea diviziunii celulare; - redistribuirea fosfatidil-serinei (PS) de pe faţa internă pe cea externă a

membranei plasmatice; - fragmentarea nucleului şi a citoscheletului şi formarea corpilor apoptotici, care

urmează a fi fagocitaţi de macrofage etc. Fosfatidil-serina (PS), fosfogliceridă care în mod normal se află pe membrana

plasmatică cu orientare spre citosol, în ultimul stadiu al apoptozei este redistribuită prin intermediul scramblazei (o proteină ipotetică, încă neidentificată) pe faţa externă a

104

membranei plasmatice şi transmite astfel din partea celulei în cauză semnale „eat me” (înghite-mă, distruge-mă!),(fig. 7.17).

Aceste semnale sunt receptate de către fagocite (de macrofage de exemplu), care vor elimina resturile celulare, prevenind astfel o reacţie inflamatorie. Pe macrofage se pot afla şi receptori pentru asialo-glicoproteine şi vitronectină. În procesul de fagocitare a corpilor apoptotici, macrofagele pot fi ajutate şi de factorul MFG-E8 (milk fat globule-EGF-factor 8), care se poate lega de fosfatidil-serina de pe membrana celulelor apoptotice, (conform Wikipedia).

7.5. Reglarea apoptozei Având în vedere efectele pe care le-ar putea avea activarea inoportună a

caspazelor asupra ţesuturilor şi organismelor, este de subînţeles faptul că atât activarea, producţia de caspaze, cât şi activitatea lor, se află sub control, iar acest control poate fi exercitat la mai multe niveluri. Proteoliza este un fenomen ireversibil şi de aceea activarea caspazelor în celule este strict reglată. Celulele folosesc unele strategii pentru prevenirea unor răspunsuri fiziologice nedorite: inhibarea caspazelor, degradarea caspazelor, captarea inhibitorilor, (Pop şi Salvesen, 2009).

Potrivit datelor furnizate de Ricci (2003), deşi ARNm pentru pro-caspaze a fost decelat în cele mai multe tipuri de celule, nivelul pro-caspazelor este diferit de la un tip de celulă la alta. Astfel, procaspaza-3 este bine exprimată în celulele limfoide şi mieloide mature, dar este slab exprimată în neuronii normali şi în epiteliul mamar. Nivelul de expresie al caspazei-3 nu este însă unul static, în sensul că, în condiţiile inducţiei apoptozei, în creierul de şoarece (in vivo), dar şi în neuroni (în condiţii in

vitro) creşte evident nivelul de ARNm pentru procaspaza-3. O mare influenţă asupra expresiei genelor ce codifică caspazele o are interferonul-g, mecanismul de acţiune al acestuia fiind însă necunoscut.

Pentru a inhiba proteazele o soluţie inventată de natură (selecţie) a fost aceea de a lua un avantaj în legarea substratului de clivat. Aşa cum arătam în capitolele anterioare, virusurile au dezvoltat strategii pentru evitarea morţii celulelor infectate înainte ca ele să se replice. Inhibitorii de caspaze reprezintă un mecanism de intervenţie a virusurilor pentru a contracara măsurile pe care le ia gazda pentru a controla infecţia. Proteinele p35/p49 sintetizate de baculovirus, spre exemplu, au capacitatea de a inhiba multe dintre caspaze, (nu şi granzima B). Exprimarea în exces a proteinei CrmA a virusului vaccinului inhibă apoptoza indusă prin CD95 sau TNF. CrmA inhibă activitatea proteolitică a caspazelor -1 şi -8, şi într-o oarecare măsură a caspazei-6. Baculoviruşii pot sintetiza şi o altă proteină care poate inhiba apoptoza. Este vorba de IAP care, cum am discutat anterior, exercită efect anti-apoptotic prin inhibarea activării şi implicit a activităţii unor caspaze. Dacă inhibarea activităţii unor caspaze prin proteinele menţionate pare una relativ neselectivă, regulatorul de caspază umană XIAP (X-linked IAP) foloseşte un mecanism mult mai selectiv; ele inhibă eficient şi selectiv caspaza-9 (prin intermediul domeniului BIR3) şi caspazele -3 şi -7 (via domeniul BIR2), (Pop şi Salvesen, 2009). Aceiaşi autori constatau într-o lucrare anterioară (Denault et al., 2007) că peptidul N-terminal al procaspazei-9 rezultat din clivajul la Asp330 nu se poate lega la XIAP, calitate pe care o are peptidul rezultat din clivajul la Asp315, sugerând că numai această formă este reglată de XIAP. Ei consideră că clivajul de către caspaza-3 nu activează caspaza-9, ci intensifică apoptoza

105

prin diminuarea inhibiţiei XIAP asupra caspazei apicale. Unii din factorii de reglare a apotozei sunt schematic prezentaţi în figura 7.18.

Fig. 7.18 - Caspazele şi principalii factori de reglare în apoptoză

(după Fan et al., 2005)

Alte proteine înrudite cu XIAP, şi anume cIAP-1 şi cIAP-2 au efect inhibitor asupra caspazelor -3, -7 şi -9, dar nu şi a caspazelor -1, -6 şi -8. Se pare că cIAP-1 şi cIAP-2 se pot cupla cu TRAF-1 şi TRAF-2 şi în acest fel ar exercita efectul lor inhibitor asupra activării caspazelor. Proteinele cIAP-1, cIAP-2 şi XIAP ar induce activarea factorului NF-kB, care are efect protector împotriva apoptozei indusă prin intermediul TNFα. Un rol interesant, în acest context, pare a-l exercita şi proteina Smac/DIABLO, care este un reglator negativ al proteinelor IAP. Această proteină este importată în mitocondrie, de unde este eliberată în momentul apoptozei, se cuplează cu proteinele IAP, cărora le anulează acţiunea anti-apoptotică, permiţând astfel activarea apoptosomului şi deci realizarea apoptozei. Proteinele mitocondriale Smac/DIABLO şi HtrA2/Omi neutralizează acţiunea inhibitorilor endogeni de caspaze şi facilitează activarea caspazelor, (Elmore, 2007). HtrA2/Omi are rol esenţial în reglarea homeostaziei mitocondriilor. Eliberată din mitocondrii în citosol, ea promovează moartea celulară într-un mod caspază-dependent (prin antagonizare cu IAP), şi ca protează - într-un mod caspază-independent. Aceste proteine blochează proteinele IAP prin motivul de legare-IAP de la capătul N-terminal. Smac/DIABLO şi HtrA2/Omi promovează indirect activarea caspazei-9 prin antagonizarea efectelor inhibitorii ale proteinelor IAP. În cazul în care leziunile mitocondriale sunt limitate, IAP pot bloca activarea caspazei indusă de o cantitate mică de cyt. c eliberat în citosol. În cazul lezării multiple a mitocondriilor capacitatea IAP de a contracara apoptoza este depăşită de concentraţia citosolică înaltă a antagoniştilor IAP, proteinele Smac/DIABLO şi HtrA2/Omi, (Fulda şi Debatin, 2006).

O altă strategie de control a apoptozei se exercită prin aşa-numiţii „prevenitori ai activării caspazelor”, adică prin proteine capcană înrudite structural cu pro-

106

domeniile caspazelor, care concurează cu ele pentru aceiaşi adaptori specifici platformelor de activare. Un astfel de exemplu îl reprezintă proteina FLIP, care este o pseudo-caspază-8, cu un domeniu catalitic nefuncţional, proteină capabilă să împiedice recrutarea caspazei-8 la DISC. La fel par a sta lucrurile şi cu unele proteine înrudite cu caspaza-1, cum ar fi COP-1, INCA şi ICEBERG, care prin intermediul interacţiunilor de tip CARD-CARD se leagă de pro-domeniul caspazei-1 şi împiedică recrutarea ei la inflamasomi, (Pop şi Salvesen, 2009). Transcripturile proteinei FLIP pot fi diferite, existând o formă lungă a ei (care conţine pe lângă cele două domenii DED şi echivalentul unui domeniu inactiv al caspazei) şi o formă scurtă (care conţine doar domeniile DED). În funcţie de natura transcriptului acestei proteine şi de tipul de celulă în cauză, FLIP poate inhiba sau induce apoptoza, poate avea deci efect anti- sau pro-apoptotic. Într-un fel asemănător cu proteina FLIP, par să acţioneze şi proteinele E8 (specifică virusului herpetic de tip II), MC159 şi MC160 (specifice virusului Molluscum contagiosum).

Un rol major în reglarea apoptozei revine, cum am arătat într-un capitol anterior, proteinelor omoloage din familia Bcl-2. Există două modele privind controlul apoptozei de către aceste proteine: unul din ele consideră că proteinele Bcl-2 ar putea controla direct activarea caspazelor, în timp ce altul consideră că ele acţionează prin apărarea integrităţii mitocondriilor. Se pare că funcţia de bază a membrilor familiei Bcl-2 la mamifere este de a păstra integritatea mitocondriilor şi de a controla eliberarea proteinelor mitocondriale în citoplasmă (Cory, citat de Gewies, 2003). Proteinele Bcl-2 care conţin numai domeniul BH3 (BH3-only) ar interfera în echilibrul fin al homo- sau hetero-oligomerizării între membrii Bcl-2 pro-apoptotici (cu mai multe domenii) Bax/Bak şi membrii anti-apoptotici Bcl-2/Bcl-XL. Proteinele Bcl-2 şi Bcl-XL îşi exercită efectul anti-apoptotic prin modularea activităţii caspazei-9, în principal, împiedicând eliberarea cyt. c din mitocondrii, fapt ce inhibă formarea apoptosomului necesar realizării apoptozei. Modul de reglare a apoptozei de către membrii familiei de proteine Bcl-2, ar putea fi descris pe scurt astfel: semnale de stres specifice apoptozei provoacă activarea unora din proteinele Bcl-2 de tipul BH3-only, care vor interacţiona cu membrii anti-apoptotici de pe membrana externă a mitocondriilor (dar şi a nucleului sau reticulului endoplasmatic), determinând eliberarea factorilor pro-apoptotici de tipul Bax (Bax-like). Aceşti factori suportă modificări conformaţionale (asigurate probabil de aceleaşi proteine Bcl-2, BH3-only), se inserează în membrana mitocondrială externă, căreia-i provoacă permeabilizarea tranzitorie şi eliberarea factorilor apoptogeni, (Borner, citat de Gewies, 2003).

Puma şi Noxa sunt alţi membrii ai familiei de proteine Bcl-2, implicate în apoptoza mediată-p53. Expresia în exces a proteinei Puma ar determina o expresie crescută a proteinei Bax, o schimbare conformaţională a acesteia şi translocarea ei în mitocondrii, reducerea potenţialului membranar mitocondrial şi eliberarea cyt. c din mitocondrii, (Liu et al., 2003 – citaţi de Elmore, 2007). Proteina Noxa s-ar localiza în mitocondrii, ar interacţiona cu membrii anti-apoptotici ai familiei Bcl-2, determinând activarea caspazei-9 (Oda et al., 2000 - citaţi de Elmore, 2007).

Un alt mecanism de reglare a caspazelor, şi implicit a apoptozei, îl reprezintă degradarea caspazelor via proteasom. Faţă de zimogenii lor, caspazele activate sunt specii efemere în interiorul celulelor. Există părerea că proteinele responsabile de înlăturarea rapidă a caspazelor activate din celule ar fi proteinele IAP, care ar realiza

107

acest proces înainte ca ele (caspazele) să atingă pragul apoptotic, (Pop şi Salvesen, 2009).

O proteină care poate interveni în reglarea apoptozei unor celule este gena/proteina Toso, (Hitoshi et al., 1998; Song et Jacob, 2005; Nguyen et al., 2011). Toso este o moleculă de suprafaţă celulară, specifică imunităţii, prezintă funcţie anti-apoptotică, a fost identificată de Hitoshi et al. (1998) şi acţionează ca reglator al apoptozei mediată-Fas. Exprimarea ei s-ar limita la celulele limfoide. Toso se exprimă la nivel ridicat în nodulii limfatici, plămân, rinichi, splină, leucocitele sângelui periferic, timus. În urma rezultatelor obţinute în experienţe efectuate pe şoarece, Song şi Jacob (2005) sugerează că proteina Toso ar interveni în reglarea apoptozei prin împiedicarea formării complexului DISC. Funcţia anti-apoptotică a Toso ar depinde de ubiquitinarea RIP1 şi ar implica recrutarea FADD la complexul proteic Toso/RIP1. Ca răspuns la CD95L şi TNFα, Toso determină activarea căii de semnalizare MAPK şi NF-kB. Funcţia anti-apoptotică a proteinei Toso ar putea fi blocată de un anticorp monoclonal specific-Toso, fapt ce ar deschide perspective în tratarea unor tulburări de imunitate şi a malignităţii hematologice, (Nguyen et al., 2011).

Apoptoza poate fi reglată, se pare, şi prin fosforilarea caspazelor, la intervenţia protein-kinazelor şi fosfatazelor. Cel puţin in vitro s-a observat că fosforilarea caspazelor poate să le afecteze activitatea enzimatică. Totodată, un studiu realizat de Martins et al. (citaţi după Ricci, 2002) au arătat că defosforilarea caspazelor s-a corelat cu capacitatea acestora de a cliva PARP, ceea ce sugerează că fosforilarea lor ar putea inhiba scindarea unor substraturi specifice acestor proteaze. S-a observat de asemenea că kinaza AKT este incapabilă să fosforileze caspazele -3, -6 şi -7, dar poate fosforila şi implicit inhiba activitatea caspazei-9 la om, (Cardone et al., 1998).

8. Inducerea apoptozei în procesele fiziologice normale Apoptoza şi dezvoltarea embrionară

În cursul dezvoltării embrionare organismele pluricelulare generează un mare număr de celule, din care unele dispar prin apoptoză, astfel încât fiecare ţesut sau organ conţine în final un număr specific de celule, ambele procese (de moarte celulară şi respectiv de supravieţuire celulară) desfăşurându-se după un program genetic prestabilit. Am arătat anterior că, la nematodul C. elegans din cele 1090 de celule somatice prezente la embrion, 131 de celule dispar în cursul de dezvoltării viermelui, adultul fiind constituit din 959 de celule somatice. Tot astfel, în cursul embriogenezei puilor de găină peste 50% din neuronii motori şi senzitivi sunt distruşi înainte de eclozare. De altfel, apoptoza care însoţeşte dezvoltarea embrionară a ţesutului nervos a beneficiat de studii numeroase. Se pare că în acest sens există o strategie a organismelor de a produce un număr mai mare de neuroni decât cel necesar pentru realizarea unei anumite funcţii. Celulele care reuşesc să interacţioneze cu ţinta, care reuşesc să-şi îndeplinească optim funcţia specifică, primesc semnale prin factori trofici sau de supravieţuire care le certifică apartenenţa la grupul de celule ce vor supravieţui, în timp ce celulele care nu recepţionează astfel de semnale vor dispare rapid şi fără urmă, prin fenomenul de apoptoză. În acest fel, programul genetic de inducere sau de inhibare a apoptozei se realizează prin intermediul acestor semnale extracelulare (provenite de la alte celule). S-a constatat, de exemplu, că soarta neuronilor simpatici depinde de factorul de creştere a nervilor (NGF). Prin

108

administrarea de NGF în cursul dezvoltării embrionare, apoptoza nervilor simpatici este anulată, în timp ce prin administrarea de anticorpi monoclonali anti-NGF are loc intrarea în apoptoză a tuturor acestor neuroni.

Semnalele de supravieţuire sunt constituite din peptide şi proteine cu moleculă mică care pot avea acţiune locală (cum ar fi NGF) sau generală (cum ar fi proteinele retinei embrionare sau ale scheletului osos). Acestea din urmă induc apoptoza atât la nivelul celulelor crestei neurale, cât şi a celulelor interdigitale (asigurând astfel formarea degetelor). Un exemplu de semnal de supravieţuire care acţionează la distanţă este hormonul tiroidian la batracieni, al cărui nivel crescut în sânge induce apoptoza celulelor ce generează coada şi resorbţia cozii. Sunt opinii conform cărora în primele stadii ale dezvoltării embrionare, apoptoza/supravieţuirea ar fi determinată(e) de absenţa/prezenţa semnalelor de supravieţuire, iar în fazele mai târzii ale embriogenezei ar acţiona sistemele specifice ale apoptozei (Fas/Fas-L, TNF/TNFR). Potrivit altor opinii, pe parcursul dezvoltării embrionare moartea celulară programată ar varia funcţie de organ, în sensul că în unele organe sunt produse celule în exces – iar prin apoptoză se ajunge la numărul normal, în timp ce în alte organe numărul de celule produse este mai apropiat de cel optim, astfel încât fenomenul de apoptoză este în acest caz mai redus.

Prin apoptoză, în timpul dezvoltării embrionare, se pot atinge câteva obiective importante: modelarea tisulară, eliminarea unor structuri nefuncţionale, monitorizarea numărului de celule, eliminarea unor celule anormale, nefuncţionale sau greşit plasate, producerea de celule diferenţiate lipsite de organite celulare, (Dănăilă et al., 1999). Observaţiile asupra dezvoltării embrionare la vertebrate au arătat că proliferarea celulară selectivă, în relaţie cu apoptoza selectivă, sculptează ţesuturile organismelor. Exemple de modelare tisulară prin apoptoză în embriogeneza vertebratelor sunt: formarea degetelor prin dispariţia membranei interdigitale, formarea orificiilor inimii, formarea palatului bucal la mamiferele superioare, formarea tubului neural (prin invaginarea foiţei epiteliale) etc. Apoptoza asigură şi eliminarea unor structuri care amintesc de organe ce au existat pe parcursul evoluţiei unor specii, dar care fie nu mai sunt funcţionale, fie au funcţii tranzitorii, fie au importanţă doar pe parcursul dezvoltării embrionare. În această situaţie se află unii neuroni, care au o funcţionalitate provizorie în timpul dezvoltării embrionare, dar care dispar înaintea naşterii organismului, sau unele structuri specifice unui sex la mamifere (la masculi dispare prin apoptoză canalul Müller care este specific femelelor, iar la femele dispare canalul Wolf, care este specific masculilor). Apoptoza reglează în cursul dezvoltării embrionare, aşa cum precizam mai sus, numărul optim de celule, specific pentru un ţesut sau un organ al adultului. Apoptoza ar fi implicată şi în formarea unor celule speciale (lipsite de organite), cum ar fi keratinocitele, hematiile, celulele epiteliale din cristalin. În cursul dezvoltării embrionare ar fi eliminate prin apoptoză şi unele celule nediferenţiate care apar în primele stadii ale embriogenezei în partea internă a maselor embrionare după formarea foiţelor embrionare (celule în exces care pierd în competiţia pentru factorii de creştere şi supravieţuire).

Inducerea apoptozei şi modificările morfologice antrenate de aceasta se desfăşoară după un program genetic, în care genele din familia bcl-2 au un rol important. Pentru iniţierea şi desfăşurarea apoptozei esenţial pare a fi raportul dintre proteinele pro-apoptotice Bax şi cele anti-apoptotice Bcl-2. S-a găsit că în ţesuturile

109

fetale umane proteina Bcl-2 are un nivel ridicat în trofoblast, fiind de asemenea prezentă în ţesutul dermato-limfoid, în structurile ce derivă din tubul neural, în ţesutul endocrin, în epiteliile pluristratificate etc. Această proteină este mai bine exprimată în ţesuturile fetale decât în cele adulte. Prin urmare, familia de gene bcl-2 prezintă un rol major în supravieţuirea celulelor şi a organismului.

Hematopoieza

Se ştie că celulele sanguine umane mature au o durată de viaţă limitată, ele fiind înlocuite prin hematopoieză din celule precursoare, care în urma unor diviziuni repetate ating maturitatea şi sunt eliberate în circuitul sanguin. La baza tuturor acestor celule precursoare ar sta un singur tip celular – celula stem pluripotentă (CFS – S, de la capacitatea ei de a forma colonii splenice). Acest tip celular diferenţiază în mai multe tipuri celulare care devin la rândul lor precursorii unor linii celulare distincte din care derivă celulele sanguine mature: eritrocitele, monocitele, mastocitele, limfocitele şi megacariocitele. Hematopoieza începe pe parcursul dezvoltării embrionare la nivelul sacului vitelin, apoi – prin migrarea celulelor stem, se desfăşoară în ficat şi splină şi în final sediul acestui proces devine măduva osoasă, timusul şi ganglionii limfatici, pentru ca la adult hematopoieza să aibă loc în măduva osoasă - pentru eritrocite, granulocite şi plachetele sanguine, iar ganglionii limfatici - pentru celulele limfatice. Desfăşurarea hematopoiezei în condiţii normale sau patologice se află sub controlul citokinelor {IL4, IL6, IL7, GM-CSF (stem cell factor) etc}, care adaptează procesul la nevoile organismului. Celulele hematopoietice imature au pe suprafaţa lor antigenul CD34, iar majoritatea acestor celule, ca şi cele diferenţiate din ele, exprimă şi proteinele familiei Bcl-2, care par avea rol important atât în proliferarea cât şi în diferenţierea celulelor hematopoietice. În hematopoieza embrionară un rol deosebit ar avea proteinele Bcl-XL, care ar proteja celulele hematopoietice şi celulele sistemului nervos de apoptoză. Investigaţiile care au urmărit funcţionalitatea sistemului Fas-FasL pe suprafaţa celulelor hematopoietice au arătat că celulele imature (definite de prezenţa pe suprafaţa lor a antigenului CD34) nu exprimă antigenul Fas, în timp ce celulele stem şi descendenţii lor (aflate în culturi şi sub influenţa factorilor de creştere) exprimă acest antigen, dar în cantităţi reduse. Receptorul Fas s-ar exprima ca parte a programului de diferenţiere a celulelor hematopoietice, sistemul Fas-FasL având rolul probabil de a elimina celulele anormale şi de a exercita un prim control numeric asupra celulelor sanguine, (Dănăilă et al., 1999).

Unele citokine ca IL3, IL10, GM-CSF, eritropoietina ar acţiona ca factori de reglare a apoptozei în diverse momente ale hematopoiezei. IL3 şi GM-CSF par avea rol important în exprimarea genelor bcl-2 în limfocite şi ar transmite un semnal puternic de inhibare a apoptozei celulelor hematopoietice. Totodată, IL10 ar avea rolul de moleculă de reglare, care ar determina o sinteză crescută a proteinelor Bcl-2, mai ales în primele faze ale hematopoiezei. Ea ar contribui la menţinerea unui echilibru între supravieţuirea şi moartea celulară a celulelor hematopoietice. În reglarea hematopoiezei pare a fi implicată şi citokina IFN-alfa, care în experienţe efectuate în culturi de celule a manifestat fie efect pro-apoptotic, fie anti-apoptotic, funcţie de linia celulară utilizată. Apoptoza pare să aibă un rol foarte important în menţinerea homeostaziei procesului de hematopoieză, ea contrabalansând procesul de

110

proliferare prin cel de eliminare a celulelor hematopoietice aflate în diverse stadii de dezvoltare şi diferenţiere, a celor nefuncţionale etc.

Răspunsul imun

Sistemul imun reprezintă un mecanism prin care organismele au capacitatea de a recunoaşte şi de a reacţiona faţă de corpi şi substanţe improprii (antigeni, non-self) şi de a tolera substanţele proprii (self). Reacţia, sau răspunsul imun, la aceşti antigeni este complex şi constă între altele în recunoaşterea şi memorarea lor, proliferarea şi diferenţierea unor celule specializate în neutralizarea lor, producerea unor enzime necesare eliminării acestora. Apoptoza ar îndeplini un rol major în funcţionarea şi reglarea sistemului imun. Prin acest proces sunt eliminate celulele imunitare care recunosc antigenele specifice organismului, sau care produc anticorpi anti-self, celulele ale căror răspuns imun devine ineficient etc. În realizarea reacţiei imune limfocitele au rol esenţial, având specificitate de antigen, fiind capabile să recunoască antigenii prin receptorii de pe suprafaţa lor. În cursul diferenţierii din progenii lor, celulele imune suportă o serie de rearanjări (recombinări) genice care asigură diversitatea receptorilor de antigeni de pe suprafaţa lor. Rearanjamentele genice pentru imunoglobuline nu depind de prezenţa antigenilor. Unele din aceste rearanjări dau naştere la proteine funcţionale, altele nu. Celulele care nu primesc semnale de supravieţuire vor urma calea apoptotică. Se apreciază că majoritatea limfocitelor B şi T mor prin apoptoză pe parcursul dezvoltării lor.

În timus, apoptoza are menirea pe de o parte de a elimina limfocitele T ale căror receptori nu pot interacţiona cu peptidele complexului major de histo-compatibilitate (CMH) – selecţie pozitivă, şi pe de altă parte, de a le elimina pe cele care au afinitate ridicată pentru antigenele proprii – selecţie negativă. Apoptoza are un rol deosebit în diferenţierea, selecţia şi proliferarea limfocitelor T în timus. Rearanjările care nu asigură exprimarea TCR (TCR-T cell receptor) conduc la apoptoză. Stimularea TCR determină exprimarea receptorilor TNF (FasL, TNF, CD40L, CD30L şi CD30) pe limfocitele activate. CD30 şi CD40 sunt implicate în selecţia negativă a limfocitelor T periferice, iar FAS şi TNF în apoptoza lor, (Dănăilă et al., 1999).

Citotoxicitatea mediată de granule proteice

Limfocitele T citotoxice (CTL) reprezintă un mecanism major de apărare a corpului de celulele infectate viral, de celulele tumorale şi par a avea rol şi în bolile autoimune sau în reacţiile de respingere în cazul transplantului de organe. CTL acţionează prin două mecanisme: unul ar consta în recunoaşterea şi distrugerea celulelor ţintă pe baza unor granule, iar celălalt ar fi mediat de prezenţa de receptori pe celulele ţintă pentru care CTL exprimă liganzi.

Recunoaşterea de către CTL a celulelor ţintă constă în generarea de semnale intracelulare pentru CTL, inclusiv eliberarea de calciu intracelular şi fosforilarea proteinelor, care în final duce la transcripţia unor gene. Mulţi din produşii proteici ai acestor gene sunt stocaţi în granule electron dense ce apar apoi în citoplasma CTL. Numeroase dovezi arată că „lovitura letală” aplicată de aceste celule asupra ţintelor lor implică conţinutul de astfel de granule. Granula litică este un „lisosom secretor” care are atât însuşirile granulelor secretorii reglate, cât şi ale lisosomilor. Dacă în majoritatea celulelor componenţii lisosomali şi ai granulelor secretorii sunt separaţi în organite distincte, în CTL proteinele lisosomale şi secretorii se găsesc în acelaşi

111

organit. Astfel, aceste granule conţin atât proteine cu funcţii apropiate cum ar fi granzimele şi perforina, cât şi enzime lisosomale precum β-glucuronidaza. Ca şi lisosomii, granulele litice sunt vezicule acide cu un pH intern de 5,5 (aciditate menţinută de prezenţa unei pompe protonice în membranele granulei). Aciditatea granulei este o însuşire importantă implicit pentru protecţia CTL de liză. După recunoaşterea celulei ţintă de către CTL, granulele, centrii de organizare a microtubulilor şi aparatul Golgi se re-orientează către punctul de contact cu celula ţintă, fapt ce asigură ca granulele exocitate să-şi elibereze conţinutul în spaţiul intercelular (între efector şi ţintă), iar perforina facilitează intrarea granzimelor în celula ţintă şi declanşează apoptoza acesteia, (Darmon et al., 1999; Dănăilă et al. 1999). În figura 8.1 prezentăm distrugerea celulelor ţintă de către CTL şi apoptoza lor prin sistemul Fas/Fas-L.

Fig. 8.1 - Citotoxicitatea limfocitelor T şi apoptoza lor (după HETTS, 1998-modificată de Dănăilă et al., 1999)

1. Receptorul T se cuplează cu peptide prezentate de MHC; 2. Transcripţia şi exprimarea Fas-L; 3. Cuplarea Fas-L cu receptorul Fas de pe alte celule T; 4. Inducerea apoptozei pe calea Fas/Fas-L

În figura 8.1 prezentăm distrugerea celulelor ţintă de către CTL şi apoptoza lor prin sistemul Fas/Fas-L. Proteinele prezente în aceste granule sunt numeroase, dar rolul lor pentru granulă sau pentru citotoxicitatea mediată de CTL este puţin cunoscut.

112

Unele dintre ele sunt proteine lisosomale (şi deci nu par a avea rol în citotoxicitatea mediată CTL), altele au rol cert în uciderea celulelor ţintă.

Perforina (care mai este cunoscută şi sub numele de citolizină, sau proteina care formează pori, sau proteina înrudită cu C9), este o proteină responsabilă de activitatea litică a CTL calciu-dependentă. Această proteină a fost iniţial identificată în granulele litice din celulele NK (natural killer) şi CTL. Ulterior s-a observat că poate provoca liza celulelor ţintă în prezenţa calciului. Ea se află în granulele litice în asociere cu proteoglicanii şi calreticulina. Prin exocitoză granulară, perforina este eliberată în spaţiul extracelular, unde este expusă la pH neutru şi calciu. pH-ul neutru eliberează perforina din asocierea cu proteoglicanii, iar monomerii de perforină se leagă de celula ţintă, se inserează în stratul bilipidic al acesteia (într-o manieră calciu-dependentă) şi creează pori (canale) în membrană. S-a observat că perforina însăşi este capabilă să inducă liza unor tipuri de celule, de unde ipoteza că doar ea contează în citoliza produsă de CTL (fapt de altfel demonstrat în experienţe de citotoxicitate efectuate la şoareci perforină „knockout”). Totuşi, perforina nu poate provoca fragmentarea ADN-ului celular, proces care precede lezarea membranei în timpul atacului CTL, ceea ce sugerează că şi alte proteine din granulele litice (alături de perforină) sunt implicate în citotoxicitatea mediată-CTL. De altfel, se crede că rolul perforinei nu este atât citoliza, cât acela de a permite accesul în celula ţintă a altor mediatori citotoxici pentru realizarea loviturii letale, (Darmon et al., 1999).

Granzimele, sunt o familie de serin-proteaze specifice CTL, prezente alături de perforină în granulele citolitice. Ele sunt sintetizate ca precursori inactivi, care prezintă un dipeptid la capătul N-terminal, prin a cărui eliminare se realizează activarea enzimei. În prezent se cunosc mai multe granzime, notate cu litere de la A la G. Primele granzime identificate au fost granzima A şi granzima B. Dacă iniţial s-a considerat că aceste două granzime şi probabil C ar fi mediatori ai citotoxicităţii CTL, ulterior s-a acceptat că doar granzima B ar fi un efector direct în procesul de liză celulară. Granzima A există ca homodimer, în timp ce granzima B este monomeră. Se pare că ele au substraturi celulare diferite. Ambele granzime sunt considerate a avea rol în inducerea fragmentării ADN-ului celulelor ţintă, într-o manieră perforin-dependentă. Ambele granzime în combinaţie cu perforina s-au dovedit capabile de a produce atât liza celulelor ţintă, cât şi fragmentarea ADN-ului lor. Unii consideră că deşi şi alte granzime sunt capabile să determine fragmentarea ADN-ului, granzima B ar fi totuşi cea care induce rapid acest proces, iar faptul că ea se localizează în nucleul celulei ţintă apare ca un argument în plus în favoarea rolului ei mai important în inducţia morţii celulelor ţintă. În afara rolului lor de a elimina celulele infectate de virusuri şi celulele tumorale, granzimele ar media totodată şi funcţii imuno-modulatorii prin interacţiunea lor cu receptorii de suprafaţă ai celulelor.

O serie de date arată că subunităţi ale perforinei (în număr de 4 sau 5) se asamblează în complexe biologic active de poli-perforină care formează canale suficient de mari în membrana celulelor ţintă, prin care pătrund moleculele citolitice efectoare. Nu sunt dubii în privinţa faptului că la concentraţii înalte de perforină celulele sunt lizate rapid. Se consideră că una din moleculele efectoare cheie care trece prin canalele generate de perforină este granzima B. Citotoxicitatea mediată de granulele proteice ar depinde atât de perforină, cât şi de granzima B. După degranulare, aceasta din urmă ar fi internalizată (prin endocitoză mediată de receptori)

113

în endosomi (pentru a nu avea acces la substraturi) şi ar trece apoi în celulă printr-un transport retrograd. După aceea ar interveni perforina, care ar elibera granzima din veziculele intracelulare printr-un mecanism încă neclar. Cert este faptul că rezultatul final este eliberarea granzimei în citoplasmă, unde poate cliva substraturile, inclusiv caspazele, şi astfel să iniţieze apoptoza. Este posibil ca granzima B să activeze mai multe caspaze, să declanşeze o adevărată cascadă catalitică prin activarea unor proteaze cheie care hidrolizează „substraturile” apoptotice. În plus, granzima poate fi translocată rapid în nucleu, unde poate media alte efecte asupra celulelor ţintă. (Darmon et al., 1999).

Alte granule proteice

În granulele citolitice a fost identificată şi dipeptidil-peptidaza I (DPPI sau catepsina C), o cistein-protează cu specificitate de clivare a dipeptidelor de la capătul N-terminal al proteinelor. Unele cercetări au arătat că DPPI activează atât granzima A cât şi B din formele lor zimogene. La pH-ul acid din granulele litice atât perforina, cât şi granzimele sunt legate la condroitin-sulfat şi menţinute în stare inactivă (fapt ce asigură protecţia CTL de acţiunea acestor proteine). După exocitoza granulelor, aceste complexe sunt expuse la pH neutru, fapt ce determină eliberarea proteinelor litice de condroitin-sulfat, permiţându-le să acţioneze asupra celulelor ţintă.

S-a constatat că granulele litice conţin o proteină de legare a calciului – calreticulina, a cărei exprimare este indusă după activarea celulelor T. Se consideră că calreticulina ar „escorta” perforina din reticulul endoplasmatic spre granule. Complexul perforină-calreticulină ar fi împachetat în granule şi ar fi desfăcut prin exocitoză şi expunerea la nivele înalte de calciu. Calreticulina ar servi şi la sechestrarea calciului în granulă în afara perforinei şi a o menţine în stare de monomer. Când calreticulina pătrunde în celulele ţintă, poate contribui la fluxul de calciu în celulele ţintă după atacul CTL.

Limfocitele B şi apoptoza

În selecţia limfocitelor B antigen-specifice implicate în răspunsul imun umoral şi limitarea transformării, reglarea morţii lor joacă un rol deosebit. Maturarea limfocitelor B se realizează în două stadii, din care unul se petrece în măduvă. Acesta este antigen-independent, constă într-o rearanjare genetică, iar precursorii care nu reuşesc să-şi armonizeze această rearanjare cu exprimarea imunoglobulinelor M pe suprafaţa lor, intră în apoptoză. Pe de altă parte, celulele B imature, care prezintă receptori ce se leagă la propriile antigene (self), fie devin silenţioase, fie suferă apoptoza, (Dănăilă et al., 1999). Pentru dezvoltarea limfocitului B un rol important îl are achiziţia receptorului CD40. De altfel, pentru formarea centrului germinativ (CG) al limfocitului B un loc special ocupă interacţiunea CD40/CD40L (care este o proteină de suprafaţă de pe limfocitele CD4+, ce transmite semnale pentru creşterea şi diferenţierea celulelor B). De fapt această interacţiune poate avea două efecte opuse: în fazele iniţiale ale răspunsului imun, contactul cu antigenul protejează limfocitul B de apoptoză; mai târziu însă, această interacţiune reglează pozitiv Fas, creând ţinte pentru distrugerea Fas-L mediată de limfocitele T activate. S-a constatat de asemenea că dintre citokine, IL-4 asigură supravieţuirea, proliferarea şi diferenţierea limfocitelor B imature, lipsa acestei citokine determinând apoptoza lor. La fel de importantă ar fi prezenţa receptorului pentru IL-2 (care primeşte semnale de la alte citokine ca IL2, IL-4, IL-7 şi IL-5), absenţa lui antrenând de asemenea apoptoza. Testele care au urmărit

114

dezvoltarea limfocitelor B au arătat că centrii germinativi reprezintă sediul selecţiei pozitive şi negative a celulelor B. În stadiul pro-B, când au loc rearanjările genetice ale imunoglobulinelor, majoritatea celulelor mor, aceeaşi soartă având şi limfocitele B mature în timpul generării răspunsului imun secundar. Apoptoza pare a avea un rol important în diversele faze de maturare a limfocitelor B şi T, aşa cum au demonstrat multe experienţe in vitro, numai că in vivo semnificaţia reglării pozitive şi negative a acestui proces în diverse stadii de maturare a limfocitelor nu este prea bine cunoscut, (Dănăilă et al., 1999).

Celulele NK şi apoptoza

Celulele NK (Natural Killer) sunt celule ale sistemului imun care au capacitatea de a ataca direct structuri şi antigene non-self. Ele acţionează „independent”, adică nu au nevoie să fie activate. Sunt celule înrudite cu limfocitele T, având unii markeri membranari comuni. Ele au viaţă scurtă, şi o imunitate înăscută împotriva unor celule tumorale, a celulelor infectate de virusuri, dar şi a bacteriilor şi paraziţilor. Se consideră că NK reprezintă un mecanism major de activitate antivirală, supraveghere tumorală şi de respingere a transplantelor. Ele provoacă apoptoza fie prin exocitoza granulelor proteice citotoxice ce le conţin (care acţionează în spaţiul intracelular al ţintei), fie prin intermediul sistemelor Fas-FasL şi TNF-TNFR. Celulele NK recunosc molecule CMH (complexul major de histocompatibilitate) şi se activează când receptorii lor nu întâlnesc pe suprafaţa celulelor ţintă molecule CMH. Ca şi granulele limfocitelor T, granulele NK conţin perforine şi granzime, granzimele B iniţiind cascada de evenimente specifice morţii celulare prin activarea unor caspaze. Celulele NK acţionează împotriva virusurilor fie prin cito-toxicitate directă, fie prin secreţia de factori solubili (interferon gamma, TNF). Funcţia antibacteriană a NK s-ar exercita prin cito-toxicitatea directă (prin mecanismul perforinei), fie prin cea mediată Fas, sau prin producerea de IFN gamma. În cazul paraziţilor, NK ar acţiona prin IFN gamma sau prin mecanismul perforinei. În rejectarea grefelor, NK ar interveni prin mecanismul cito-toxicităţii mediată de Fas-FasL şi perforină şi prin intermediul citokinelor (IFN gamma, TNF alfa, IL-12). Proliferarea celulelor NK ar necesita stimularea IL (IL-2, IL-5) şi co-stimularea (prin contactul cu limfocitele T sau B). S-a constatat că, atât în proliferarea cât şi în apoptoza celulelor NK, sunt implicaţi aceeaşi receptori, între cele două procese stabilindu-se un echilibru ce ar depinde de afinitatea receptorilor pentru liganzii lor şi efectul co-stimulării, (Dănăilă et al., 1999). În cadrul răspunsului imun împotriva virusurilor şi bacteriilor celulele NK au iniţial un rol decisiv, după care intervine reacţia antigen specifică a limfocitelor T, ceea ce determină reducerea activităţii celulelor NK şi intrarea lor în apoptoză. Celulele NK ar ucide celulele tumorale sau pe cele infectate de virusuri fie direct (cum s-a arătat deja), fie prin intermediul anticorpilor ADCC (antibody dependant cellular citotoxicity), deşi acest din urmă mecanism este controversat.

Un aspect important în apoptoză este şi cel al recunoaşterii de către fagocite a celulelor apoptotice şi ingestia lor, fapt ce asigură protecţia celulelor şi ţesuturilor vecine de consecinţele expunerii la componenţii rezultaţi din descompunerea acestora. Unele experienţe au arătat că această recunoaştere s-ar datora unor modificări specifice ale carbohidraţilor de pe suprafaţa celulelor apoptotice. Glicoproteinele de suprafaţă ar pierde resturi de acid sialic, astfel încât ar deveni disponibile să interacţioneze cu lectinele de pe macrofage. În acest mecanism ar fi implicate şi unele aminozaharuri şi

115

aminoacizi. Expunerea macrofagelor la GM-CSF (stem cell factor) a intensificat procesul de recunoaştere a neutrofilelor apoptotice. Inclusiv unele citokine ar avea rol reglator în supravieţuirea sau recrutarea de către macrofage a unor celule apoptotice.

Monocitele/macrofagele au rol major în iniţierea, desfăşurarea şi rezultatul răspunsului imun. Reglarea macrofagelor ar fi sub controlul citokinelor de tip 1 (IFN gamma) şi de tip 2 (IL-4). În experienţe efectuate pe culturi de monocite umane s-a observat că IL-2 intervine în supravieţuirea şi diferenţierea acestora, în timp ce IL-10 (citokină Th2) inhibă diferenţierea lor în macrofage şi facilitează apoptoza. Citokinele de tip 1 induc diferenţierea monocitelor în macrofage şi sporesc rezistenţa macrofagelor la apoptoza indusă de diverşi stimuli, iar citokinele de tip 2 intensifică moartea prin apoptoză a macrofagelor. Se pare că apoptoza reprezintă un factor important în controlul sistemului imun, dereglarea ei putând antrena deficienţe ale acestuia (boli autoimune, deficitul imun, inducerea cancerului). La pacienţii cu boli autoimune, comparativ cu indivizii sănătoşi, s-a evidenţiat o frecvenţă mai mare a numărului de celule apoptotice şi creşterea expresiei Fas/APO-1 pe limfocitele T. Bolile autoimune constituie însă şi un subiect care poate contribui la elucidarea evenimentelor proteolitice asociate cu apoptoza.

Celulele dendritice şi apoptoza

Celulele dendritice au o morfologie ce aminteşte de dendritele unui neuron (cu care nu au însă nimic în comun), fiind caracterizate de prezenţa unor prelungiri foarte lungi ale citoplasmei comparativ cu corpul celular. Celulele dendritice au pe suprafaţa lor molecule CMH şi au rolul de a captura antigenul şi a-l prezenta limfocitelor T, fapt ce determină activarea acestora. Ele sunt prezente în organele limfoide (celulele dendritice din ariile T ale splinei şi foliculilor limfatici, din zonele foliculare ale ganglionilor limfatici) şi nelimfoide (celulele Langerhans din piele, celulele dendritice interstiţiale din ficat, rinichi, cord, plămâni), în sânge şi în limfă. În privinţa apoptozei, se pare că principala funcţie a celulelor dendritice ar fi aceea de a prezenta antigenii derivaţi din corpii apoptotici limfocitelor CD8+ (CTL). Ligandul ce ar media contactul celulă macrofagă – celulă apoptotică ar fi trombospondina (TSP), substanţă secretată de macrofage. La recunoaşterea neutrofilelor, eozinofilelor şi limfocitelor apoptotice participă şi receptorul CD36 (un monomer transmembranar care se poate asocia cu tirozinkinazele din familia src şi amplifică recunoaşterea prin mecanismul TSP). Recunoaşterea de către fagocite a celulelor apoptotice ar fi facilitată şi de prezenţa pe acestea a fosfatidil-serinei (PS), un adevărat marker pentru fagocite.

Senescenţa la animale şi la om

S-a observat că celulele de mamifere cultivate in vitro, în condiţii de creştere normale, se divid de un anumit număr de ori, că au deci un număr limitat de cicluri celulare, după care ele încetează să se mai dividă şi mor. În culturile de celule umane acest număr de cicluri este de cca 50. Ar exista, de altfel, o relaţie între lungimea telomerelor cromosomilor şi durata de viaţă a celulelor. Telomerele au o structură specifică. Lungimea acestora depinde de activitatea unei enzime specifice – telomeraza, enzimă care după naştere îşi încetează activitatea (devine inactivă). Cu fiecare ciclu celular scurs, lungimea telomerelor se micşorează. În anumite condiţii însă, telomeraza se poate reactiva, situaţie în care lungimea telomerelor nu mai este afectată, ceea ce poate duce la proliferarea celulară necontrolată.

116

S-au izolat linii (clone) de celule cu diviziune multiplă, capabile să se dividă nelimitat, depăşind chiar durata de viaţă a organismului, linii provenite din celule care au suferit mutaţii somatice. Şi aceste linii însă pot intra în apoptoză dacă din mediul celular lipsesc factori de creştere şi molecule semnal pentru supravieţuire. În reglarea procesului de senescenţă la animale un rol deosebit pare să-l aibă proteina p53. Aşa de exemplu, liniile celulare de şoarece evită senescenţa dacă sunt deficiente în proteina p53, (care ar exercita un control asupra duplicării centrozomului şi asupra trecerii celulelor de la stadiul G2 la M, prevenind reintrarea în faza de sinteză S).

Procesul de senescenţă la organismele animale pluricelulare este unul complex, care ţine de numeroşi factori şi evenimente intra- şi extracelulare, care pot determina reducerea funcţiilor unui ţesut/organ, până la încetarea lor, fapt ce duce în final la moartea organismului. Deşi nu se ştie exact care este legătura dintre senescenţa celulară şi cea a organismului, pare neîndoielnic faptul că reducerea numărului şi a funcţiilor metabolice ale celulelor unui ţesut contribuie implicit la senescenţa organismului. În timpul senescenţei pot fi eliminate prin apoptoză atât unele celule lezate sau nefuncţionale (fibroblaste, hepatocite), cât şi celule (neuroni, miocite cardiace) care nu mai pot fi înlocuite ulterior, (Dănăilă et al., 1999).

S-a observat că pe măsura înaintării în vârstă a organismului, fibroblastele nu răspund la semnalele inductoare de apoptoză (nu-şi reduc expresia genelor bcl-2), ceea ce vine în contradicţie cu procesul de senescenţă. Deşi, această acumulare cu vârsta a fibroblastelor rezistente la apoptoză nu a primit o explicaţie plauzibilă, se apreciază că fenomenul ar duce la dezvoltarea unor boli specifice bătrâneţii. În cursul senescenţei creşte capacitatea de exprimare a receptorului Fas de pe suprafaţa membranelor odată cu vârsta. În cazul limfocitelor T şi B, intrarea în apoptoză poate fi împiedicată tocmai de o exprimare mai redusă a acestui receptor pe suprafaţa lor. Limfocitele T provenite atât de la tineri, cât şi de la vârstnici, îşi pierd în mod progresiv capacitatea de reducere a numărului de receptori Fas de pe suprafaţa lor, fapt mai pronunţat la vârstnici. În consecinţă, la vârstnici se produce o acumulare de limfocite ce prezintă pe suprafaţa lor receptori Fas, ceea ce determină intrarea lor mai rapidă în apoptoză şi implicit reducerea numărului de limocite T cu vârsta. În cazul limfocitelor B s-a evidenţiat odată cu înaintarea în vârstă un nivel crescut de exprimare a genelor bcl-2 (datorită unei translocaţii cromosomiale), dar nu este clară legătura dintre cele două procese.

Se consideră de asemenea că în procesul de senescenţă la animale şi om ar fi implicate şi unele leziuni produse la nivelul mitocondriilor: perturbări în cuplarea şi decuplarea proceselor din lanţul respirator, perturbări privind formarea microporilor mitocondriali, eventuale leziuni provocate ADNmt de speciile reactive de oxigen. Odată cu înaintarea în vârsta au loc deficienţe ale procesului de apoptoză celulară, fapt ce favorizează inducerea cancerului, (un exemplu de acest fel fiind cancerul de prostată la om, a cărui incidenţă creşte cu vârsta). Deşi legătura dintre apoptoză şi senescenţă nu este foarte clară, observaţiile mai sus prezentate par să susţină o astfel de asociere, (Dănăilă et al., 1999).

9. Apoptoza în procesele patologice

9.1. Apoptoza în infecţiile virale şi bacteriene În cazul infecţiilor virale, apoptoza reprezintă un mecanism de eliminare a

celulelor invadate de virusuri şi în acest fel reduce riscul multiplicării şi răspândirii

117

acestora şi la alte celule. Multe virusuri şi-au dezvoltat însă mecanisme care să le permită blocarea apoptozei celulelor infectate şi astfel să le faciliteze replicarea şi multiplicarea şi implicit creşterea patogenităţii lor, sau a capacităţii oncogene în cazul unora dintre ele, cum ar fi: a) legarea de receptor; b) activarea protein-kinazei R (PKR); c) interacţiunea cu p53; d) exprimarea de proteine virale cuplate cu proteinele MHC de pe suprafaţa celulei infectate, care permite recunoaşterea de către celulele sistemului imun. Se pare că, cele mai multe virusuri codifică proteine ce pot inhiba apoptoza. Un exemplu de acest gen este reprezentat de sinteza de proteine care inhibă activitatea caspazelor (efectorii apoptozei), cum ar fi cazul proteinei CrmA la virusul variolei, a proteinelor p35 şi IAP la baculovirusurile ce infectează insectele. În alte situaţii virusurile produc proteine omoloage Bcl-2 (cum se întâmplă cu unele virusuri din clasa celor herpetice ca virusul Epstein Barr, virusul asociat sarcomului Kaposi - tip 8, virusul Saimiri etc), inhibitori ai căilor FAS/TNF, antagonişti ai proteinei p53, inhibitori ai PKR etc. Unele din proteinele virale cu efect antiapoptotic sunt redate în tabelul 9.1.

Tabel nr. 9.1 - Proteine virale cu acţiune antiapoptotică (după Everett şi Mc Fadden, 1999)

Mecanism Virus Proteina virală Omolog al proteinei BCL-2 Adenovirusuri

Virusul febrei suine africane Virusul Epstein Barr Virusul herpetic Saimiri Virusul herpetic 8

E1B19K A1 79L/5-HL BHRF-1 ORF 16 KShel-2

Inhibitor de caspaze Virusul febrei suine africane Baculovirusuri Pox virusuri

A224L/4CL P35, IAP CrmA/SPI-2

Inhibitor al căilor FAS/TNF Adenovirusuri Virusul Epstein Barr Virusul herpetic Equin 2 Virusul herpetic Saimiri Virusul herpetic 8 Virusul ce produce moluscum contagiosum

RID/E3-14.7K LMP-1 E8 ORF 71 K 13 MC 159L

Antagonişti ai p53 Adenovirusuri Virusul papilomatozei umane Virusul simian 40

E1B-55K E6 Antigenul T

Funcţii antioxidante Virusul ce produce moluscum contagiosum MCO 66L Acţiune asupra reticulului endoplasmatic

Mixoma virusuri M-Th

Inhibitori ai PKR HIV-1 Virusuri gripale Virusul vaccinal

Tot NS-1 E3L, K3L

Baculovirusurile lipsite de proteina p35 produc o apoptoză rapidă a celulelor

infectate şi totodată îşi reduc capacitatea de replicare. Proteina p35 reprezintă substratul unor caspaze. Prin scindarea acestei proteine se formează un complex caspază/proteină p35 clivată, care inhibă acţiunea caspazelor. La baculovirusuri sunt prezente şi proteinele IAP, care prin intermediul unei secvenţe specifice BIR (o secvenţă terminală de 65 de aminoacizi) pot interacţiona cu unele caspaze (caspazele -3 şi -7, de exemplu) pe care le inactivează şi în acest mod pot bloca apoptoza celulelor

118

infectate. Se consideră că genele iap de la baculovirusuri ar putea proveni din celulele infectate, de unde ar fi fost înglobate în genomul viral pe parcursul evoluţiei, tocmai pentru a împiedica apoptoza celulelor invadate şi a asigura astfel înmulţirea virusurilor.

Un alt mecanism folosit de virusuri în blocarea apoptozei celulelor îl constituie, cum s-a afirmat anterior, sinteza de proteine cu funcţii asemănătoare (omoloage) cu ale proteinei Bcl-2. S-a constatat că proteina virală Bcl-2 diferă prin dimensiunile ei faţă de cea celulară, fiind mai scurtă, este lipsită de domeniul BH4, iar domeniul BH3 prezintă de asemenea diferenţe faţă de proteina Bcl-2 celulară. De altfel, tocmai structura diferită a domeniului BH3 reprezintă modalitatea prin care virusul evită activarea caspazelor şi apoptoza. La virusul Epstein Barr, de exemplu, în momentul replicării lui se sintetizează o serie de proteine virale, printre care şi BHRF-1 care, ca şi proteinele Bcl-2 (cu care seamănă în proporţie de cca 25%), manifestă acţiune antiapoptotică. Virusul herpetic Saimiri (HVS) are capacitatea de a sintetiza secvenţe de aminoacizi ORF 16 (open reading frame) asemănătoare cu domeniile BH1 şi BH2 ale proteinelor Bcl-2, care pot forma dimeri şi heterodimeri cu proteinele Bcl-2, Bax şi Bak, dar nu şi cu proteinele Bcl-XL sau Bcl-XS. Se pare că ORF 16 previne apoptoza prin inhibarea eliberării cyt. c din mitocondrii în citoplasmă, prin inhibiţia clivării caspazei-3 şi PARP şi a exprimării fosfatidil-serinei pe suprafaţa celulei. Virusul herpetic asociat sarcomului Kaposi (virusul herpetic de tip 8; KSHV) produce de asemenea o proteină, KS Bcl-2, care seamănă cu proteinele Bcl-2 sub aspectul domeniilor BH1 şi BH2 şi mai puţin în privinţa domeniul BH3, proteină care nu formează heterodimeri cu proteinele Bax şi Bak şi astfel evită reglajul negativ exercitat de acestea, (Dănăilă et al., 1999).

Strategia altor virusuri de a evita apoptoza celulară constă în capacitatea lor de a sintetiza proteine (proteine virale FLIP 8) ce inhibă proteinele FLICE. Proteinele virale FLIP conţin două domenii efectoare tanatogene care se pot cupla cu domeniile efectoare tanatogene ale proteinelor FADD şi FLICE şi în acest fel pot bloca formarea complexului (DISC) de inducere a semnalului tanatogen. Proteinele virale FLIP protejează celulele infectate de virusuri (ca: virusul herpetic asociat sarcomului Kaposi, virusul herpetic equin 2, virusul herpetic bovin 4, virusul ce produce moluscum contagiosum) de apoptoza indusă pe calea FAS şi TNF şi în acest fel asigură prelungirea duratei de viaţă a acestor celule şi implicit multiplicarea (replicarea) virusurilor. Sunt şi virusuri care pentru a bloca apoptoza celulelor infectate recurg la sinteza de proteine ce mimează receptorii celulari pentru citokine sau proteinele adaptor pentru transmiterea semnalului tanatogen. O proteină de acest gen este proteina dimerică M-T2, produsă de mixoma virusuri, care se poate lega de TNF alfa şi în acest fel poate bloca apoptoza indusă pe calea receptorului TNF. Unele virusuri codifică proteine care prezintă doar similitudine cu domeniul tanatogen efector de pe componente celulare implicate în transmiterea semnalului apoptotic pe calea FAS/TNF-R1. În această situaţie se află virusul equin de tip 2 EB - care codifică proteina 2E8, şi virusul ce produce moluscum contagiosum – care codifică proteina MC 159, proteine conţinând secvenţe similare ale domeniului tanatogen cu FADD şi caspaza-8 din celule.

În experienţe efectuate în culturi in vitro cu celule umane infectate cu adenovirusuri s-a constatat că două proteine, E1A şi E1B, sunt implicate în procesele

119

de apoptoză şi transformare malignă a celulelor. E1A poate induce apoptoza în absenţa proteinei E1B, proces realizat prin medierea proteinei p53 (mutantele p53 fiind lipsite de această proprietate). Proteinele E1B19K şi E1B55K codificate de regiunea E1B a genomului viral pot interacţiona cu E1A în proliferarea şi transformarea celulară şi pot inhiba apoptoza indusă de aceasta. Există unele asemănări structurale ale proteinei E1B19K cu proteinele Bcl-2, în special între regiunea 19K a proteinei virale E1B19K şi regiunea BH1 a proteinei celulare Bcl-2. Se pare totuşi că aceste asemănări structurale nu sunt atât de evidente şi că E1B19K ar fi mai degrabă funcţional un omolog viral al proteinei Bcl-2. Experimental s-a dovedit că aceste două proteine se pot substitui una cu alta, transferul de proteine Bcl-2 în celule infectate care produc o proteină virală E1B19K nefuncţională (mutant) restabilindu-i funcţia antiapoptotică.

Şi alte virusuri, cum ar fi SV40 sau papiloma virusurile, au ca strategie sinteza de proteine cu rol în blocarea sau chiar degradarea proteinei p53, asigurându-şi astfel supravieţuirea celulelor infectate (inhibarea apoptozei acestora) şi creşterea capacităţii lor de transformare celulară.

Unele virusuri ca virusul herpetic de tip 1, şi probabil virusul variolei şi baculovirusurile dispun de mecanisme de inhibare a apoptozei induse de limfocitele T citotoxice (CTL). De altfel, apoptoza pare să joace un rol important în dezvoltarea sistemului imun, în evoluţia proceselor neoplazice ce pot apărea prin proliferarea necontrolată a limfocitelor T şi B. Apoptoza asigură eliminarea celulelor precursoare ale limfocitelor care manifestă modificări de structură şi funcţie, dar şi clonelor autoreactive, a limfocitelor activate de un antigen atunci când activitatea lor nu mai este necesară, (Dănăilă et al., 1999).

De o atenţie specială s-a „bucurat” în ultimele decenii, atât în lumea specialiştilor cât şi a opiniei publice, infecţia cu virusul imunodeficienţei dobândite la om (HIV). Acest virus infectează limfocitele T helper (CD4+), dar şi alte celule ce exprimă receptorul CD4, provocând tulburări majore răspunsului imun. Infecţia cu HIV duce la reducerea treptată a limfocitelor T helper şi concomitent la progresia bolii de la stadiul lipsit de simptome la cel cu manifestări clinice evidente – la SIDA, (în ultimele faze ale bolii limfocitele CD4+ suportă o reducere masivă). Fenomenul care ar sta la baza acestei reduceri drastice ar fi apoptoza. S-a observat că la indivizii HIV pozitivi există un procent mai mare de celule T care exprimă pe membrana lor receptorul Fas decât la indivizii sănătoşi şi că odată cu progresia bolii creşte şi numărul de celule care exprimă acest receptor. În cercetări efectuate pe culturi de limfocite, de la indivizi HIV pozitivi şi sănătoşi, s-a constatat că apoptoza este mult mai frecventă printre celulele provenite de la indivizii afectaţi. Totodată, observaţiile asupra apoptozei în celule ale ganglionilor limfatici au arătat că şi celule vecine cu cele infectate de virus prezintă semne ale apoptozei, că deci celulele infectate HIV produc moartea unor celule din proximitate. Westendrop et al. (citaţi după Dănăilă et al, 1999) arată că FasL ar putea induce atât apoptoza celulelor pe care se exprimă, cât şi a altor celule T cu care se află în contact, fie direct, fie printr-un mecanism paracrin. Modalităţile prin care se realizează apoptoza celulelor T-helper au fost sintetizate astfel în Wikipedia:

a) Enzimele HIV dezactivează proteina Bcl-2 antiapoptotică. Totodată, ele activează pro-caspaza-8 (pro-apoptotică), care la rându-i activează procesele mitocondriale ale apoptozei;

120

b) HIV poate determina creşterea nivelului proteinelor celulare care dirijează spre apoptoza mediată Fas;

c) Proteinele HIV pot reduce cantitatea de glicoproteină CD4 marker de pe membrana celulară;

d) Atât particulele virale eliberate cât şi proteinele din fluidul extracelular au capacitatea de a induce apoptoza în celulele T-helper din vecinătate;

e) HIV poate inhiba producţia de molecule ce marchează celulele supuse apoptozei şi în acest fel acordă timp virusului pentru replicare şi producerea de agenţi apoptotici ;

f) Celulele CD4+ infectate pot totodată recepţiona semnalul apoptotic de la o celulă T citotoxică. Unele virusuri pot inhiba apoptoza, dar o şi pot induce. Este o strategie care le

asigură multiplicarea. În primele faze ale infecţiei virale este inhibată apoptoza, pentru ca după replicarea virusurilor apoptoza să fie stimulată. Un astfel de exemplu îl reprezintă proteina Tat a virusului HIV care poate bloca apoptoza prin stimularea expresiei genelor bcl-2, dar poate să o şi inducă pe calea receptorului Fas, activarea uneia sau alteia din aceste căi depinzând se pare de ciclul de replicare a virusului. Tot astfel, proteina Vpr produsă de HIV poate induce apoptoza limfocitelor T în lipsa activării celulare, dar poate şi inhiba apoptoza celulelor activate (ţintă a virusului HIV) prin inactivarea factorului NF-kB.

Dacă în infecţiile cu virusuri supravieţuirea celulelor gazdă este necesară pentru însăşi supravieţuirea şi multiplicarea lor, fapt pentru care virususrile au dezvoltat mecanisme antiapoptotice, în cazul infecţiilor bacteriene sau cu protozoare intracelulare, celulele gazdă nu mai pun la dispoziţia acestora structuri sau funcţii cu o astfel de menire. Celulele infectate (epiteliale, macrofage) cu bacteria Chlamydia

psittaci intră în apoptoză şi mor după o zi de la infecţie. Alături de celule infectate cu această bacterie mor şi celule neinfectate, efect ce sugerează faptul că celulele infectate sintetizează factori pro-apoptotici ce provoacă şi apoptoza unor celule neinfectate. Celulele care intră în apoptoză, datorită infecţiei cu unele bacterii (cum ar fi Chlamydia psittaci), secretă citokine proinflamatorii care declanşează răspunsul inflamator. Unele produse de sinteză ale bacteriilor au calitatea de a modula apoptoza celulelor infectate. Astfel, enterotoxina stafilococică D acţionează asupra limfocitelor B care prezintă receptorul VH4 ca un superantigen, salvându-le de la apoptoză printr-un mecanism încă puţin cunoscut. Un produs bacterian care modulează apoptoza celulelor sanguine este LPS (lipopolizaharid), care poate activa monocitele (prin stimularea exprimării pe acestea a receptorului CD14) şi în acest fel asigură supravieţuirea lor, în timp ce citokinele (IL-4, de exemplu) reduc exprimarea receptorului CD14 pe monocite, dirijându-le spre apoptoză. Între virusuri şi bacterii există deci diferenţe clare în modularea apoptozei. În timp ce la virusuri aceste procese se realizează la nivelul celulei infectate de virus, la bacterii intervin în plus şi mecanisme ce depind de ţesut şi chiar de întregul organism. Este poate şi motivul că în infecţiile cu bacterii declanşarea apoptozei este însoţită şi de un răspuns inflamator (prin intermediul citokinelor), în timp ce în infecţiile cu virusuri acest tip de răspuns se întâlneşte mai rar. În sfârşit, s-a constatat că în cazul unor infecţii cu paraziţi intracelulari, cum este Toxoplasma gondii - de exemplu, celulele parazitate sunt

121

rezistente la apoptoza indusă prin iradierea gamma sau cu UV, pe calea Fas sau pe căi independente de aceasta, prin citotoxicitatea mediată de CTL etc.

9.2. Apoptoza şi cancerul

Dacă până nu demult procesul de cancerizare era privit doar ca un efect al proliferării necontrolate a unor celule, care dereglează homeostazia tisulară, descoperirea apoptozei a făcut ca transformarea tumorală să fie privită şi ca o consecinţă posibilă a dereglării procesului de apoptoză, care asigură eliminarea celulelor cu mutaţii, cu leziuni ireparabile ale ADN-ului, a celulelor implantate incorect etc. S-a constatat, de altfel, că perturbarea apoptozei poate influenţa starea de sănătate a unui organism: pierderea capacităţii unor celule de a intra în apoptoză poate conduce la cancer, boli autoimune etc, după cum stimularea apoptozei poate duce la boli neurodegenerative, osteoporoză etc (Moldoveanu şi Popescu, 1999). Este în prezent acceptat de către specialişti că celulele tumorale se caracterizează printr-o mare instabilitate genetică, care poate creşte cu fiecare generaţie celulară. S-a observat că atunci când se clonează o celulă tumorală, descendenţii ei pot avea mărime, formă şi particularităţi genetice diferite faţă de celula clonată. Instabilitatea genetică constă în mutaţii genomice, restructurări cromosomiale, mutaţii genice şi odată cu instalarea ei celula este predispusă spre cancerizare dacă nu este capabilă să le înlăture sau să intre în apoptoză. Acest fapt este o certitudine în cazul unor boli ca ataxia telangiectazică, xeroderma pigmentosum, sindromul Li-Fraumeni, boli care pot degenera în cancere cutanate sau alte tumori, (Dănăilă et al., 1999).

Modificările morfologice ce însoţesc apoptoza celulară au permis evidenţierea în cadrul diverselor tipuri de tumori a indicelui apoptotic (raportul dintre numărul de celule în apoptoză şi numărul total de celule tumorale non-apoptotice x 100). Valorile indicelui apoptotic (apoptotic index – AI) ar oscila între 1 şi 7 şi ar reflecta nivelul proliferării celulare, în sensul că o proliferare crescută ar fi însoţită şi de o apoptoză mai intensă. Unele observaţii au arătat însă că AI ar reflecta mai degrabă nivelul de instabilitate genetică în ţesuturile normale şi tumorale decât raportul dintre apoptoză şi proliferarea celulară. S-au făcut de asemenea corelaţii între valorile AI şi MI (mitotic index) şi s-a constatat bunăoară că raportul dintre AI şi MI este de 10:0 în cazul epiteliomului bazo-celular (cancer neinvaziv) şi de 1:3 în cazul melanomului malign (cancer puternic invaziv). Capacitatea scăzută de invazie a epiteliomului bazo-celular s-ar putea datora unui proces intens de apoptoză (Moorey et al., 1995).

Genele care controlează procesele de homeostazie tisulară, apoptoză şi dezvoltare tumorală aparţin la 4 clase:

a) oncogene – gene care induc proliferarea celulară (c-myc, src, ras şi altele); b) gene care inhibă proliferarea tumorală (p53, Rb); c) gene care determină moartea celulară (cum sunt ced-3 şi ced-4 de la C.

elegans); d) gene care asigură supravieţuirea celulară (cum este ced-9 la C. elegans şi bcl-

2 la mamifere), (Dănăilă et al., 1999). Despre majoritatea acestor gene am discutat în detaliu într-un capitol anterior.

Genele c-myc şi proteinele codificate de ele au atât capacitatea de a promova proliferarea tumorală cât şi apoptoza. C-myc este o proto-oncogenă care codifică o proteină factor de transcripţie ce promovează proliferarea celulară prin modularea unor

122

gene ţintă. S-a constatat că în numeroase tumori are loc exprimarea în exces a genelor c-myc sau se produc mutaţii ale lor, ceea ce a dus la aprecierea că perturbările intervenite la nivelul acestor gene ar putea reprezenta un prim semnal în determinarea proliferării celulare şi a transformării tumorale. Proteina c-Myc ar induce apoptoza prin activarea caspazei-3 şi probabil, şi a altor proteaze, proces asociat cu clivarea PARP. Se pare că pentru inducerea apoptozei de către gena c-myc trebuie să fie activă gena p53.

S-a constatat că în cazul unor tumori pulmonare, ale bronhiilor sau de prostată îşi pierde funcţia gena şi respectiv proteina Rb. Fosfoproteina codificată de această genă intervine în ciclul mitotic celular, blocând unii factori de transcripţie (E2F), care inhibă trecerea de la G0 la S şi în acest fel se produc perturbări în proliferarea celulelor normale şi a celor cu ADN lezat, ceea ce facilitează transformarea tumorală a unor celule. Proteina Rb este totodată un reglator negativ al proteinei p53. În experienţe efectuate pe animale Rb knock-out s-a observat că apoptoza indusă este dependentă de proteina p53.

Şi bcl-2 este o oncogenă, bine reprezentată în toate celulele hematopoietice şi limfoide, în multe celule epiteliale şi neuroni. Prin interacţiunea ei cu alte gene sau direct (probabil, în unele cazuri), poate promova dezvoltarea tumorală. Principala acţiune a bcl-2 este însă inhibarea apoptozei, fără blocarea ciclului mitotic, fapt ce facilitează supravieţuirea unor celule ce acumulează mutaţii incompatibile cu dezvoltarea normală, ceea ce poate favoriza proliferarea malignă. Exprimarea în exces a acestei gene (printr-un mecanism încă necunoscut) în unele forme de cancer este asociată cu un prognostic negativ asupra evoluţiei bolii. S-au evidenţiat nivele ridicate ale proteinei Bcl-2 în unele forme de cancer ca: limfoamele foliculare de celule B, adenocarcinomul colorectal, adenocarcinomul de prostată, cancerul pulmonar cu celule mici etc. Se apreciază că exprimarea în exces a genei bcl-2 s-ar datora pierderii funcţiei proteinei p53. Se pare de asemenea că, în unele forme de cancer, proteina Bcl-2 poate fi substituită de proteina Bcl-XL. Mai mult, Bcl-2 şi Bcl-XL imprimă rezistenţă la agenţii chimioterapici ce distrug celulele tumorale, (Păunescu, 2006). Totodată, concentraţiile crescute de Bcl-2 protejează celulele de apoptoza indusă de c-myc.

Gena p53, prin proteina codificată de aceasta, exercită un puternic efect inhibitor asupra proliferării tumorale însă, în multe forme de cancer, au fost semnalate mutaţii ale acestei gene. Proteina p53, cum am mai consemnat anterior, are capacitatea de a recunoaşte leziunile produse ADN şi de a activa gene şi respectiv proteine care intervin în înlăturarea acestora. Prin intermediul proteinei p53 se blochează ciclul mitotic în G1 (înaintea sintezei replicative a ADN), asigurându-se astfel posibilitatea intervenţiei mecanismelor de reparaţie a ADN prezente în celule, iar în cazul în care refacerea ADN-ului nu este posibilă, celula este dirijată spre apoptoză. De altfel, mulţi agenţi carcinogeni produc rupturi ale ADN, sau interferă cu enzimele implicate în replicarea corectă a ADN. La acest tip de alterări, celula în cauză poate răspunde fie prin întârzierea diviziunii până la repararea leziunii, fie să intre în apoptoză, fie să progreseze fără întrerupere în ciclul de creştere celulară, (Stoian, 2006). Evident că, urmarea uneia sau alteia din căile prezentate determină consecinţe diferite.

Sunt date potrivit cărora ar exista forme diferite ale proteinei p53, forme care ar putea avea şi efecte diferite. Se pare că rolul proteinelor p53 în carcinogeneză este unul complex şi că pe lângă capacitatea lor de a induce apoptoza, ar putea acţiona şi ca

123

factori de transcripţie pentru alte gene. Mutaţiile acestei gene, depistate într-o serie de tumori umane, se produc de regulă la unii codoni (hot spots) ca: 175, 245, 248, 249, 273, 282 (între resturile aminoacil 120 şi 292), iar aceste mutaţii alterează capacitatea proteinei p53 de a funcţiona ca activator sau inhibitor al transcripţiei unor gene ce intervin în controlul ciclului mitotic. În multe tipuri de cancer, în care s-au depistat forme mutant ale proteinei p53, s-au dovedit nefuncţionale şi alte gene. S-a constatat că în 70% din cancerele colorectale, în 50% din cele pulmonare şi în 40% din cancerele de sân se pierde funcţia genei p53. Se apreciază că în cca 50% din formele de cancer uman apar proteine p53 mutant. Totodată, celulele ce conţin forme mutant ale proteinei p53 devin incapabile de apoptoză şi aceasta ar explica rezistenţa celulelor respective la chimio- şi radioterapie, (Moldoveanu şi Popescu, 1999). Din cele prezentate rezultă că proteina p53 reprezintă o componentă esenţială a unor căi de semnalizare celulară, iar modificările ei pot antrena malignizarea şi că, în timp ce gena p53 este una pro-apoptotică şi anti-tumorală, gena bcl-2 este dimpotrivă una anti-apoptotică şi pro-tumorală.

Şi perturbările produse genei Fas (Apo-1), care este una inhibitoare a procesului tumoral, pot s-o facă nefuncţională şi implicit incapabilă de a mai induce apoptoza, fapt ce poate favoriza oncogeneza. S-a observat că tumorile care exprimă proteina Fas sunt mai sensibile la apoptoză şi răspund mai bine la terapia cu anticorpi anti-Fas. Totodată, există posibilitatea unor perturbări ale proteinei FasL (care se leagă de receptorul Fas) pentru a transmite semnalul apoptotic şi în acest mod unele tumori să scape de sub controlul sistemului imun. Un alt factor incriminat în dezvoltarea tumorală este absenţa sau inactivarea DAP-kinazei (Death Associated Protein, o kinază Ca2+/calmodulin dependentă) - fenomen frecvent în carcinoamele umane şi leucemia cu celule B, care ar inhiba apoptoza, ar determina rezistenţa la unii stimuli apoptotici. Controlul apoptozei de către această enzimă s-ar exercita în primele faze ale metastazării. Există şi posibilitatea ca promovarea procesului de oncogeneză să aibă loc prin inhibarea activităţii caspazelor, efectorii apoptozei. Astfel, excesul de proteină FLIP poate bloca transmiterea semnalului apoptotic de la receptorii Fas sau TNFR, după cum excesul de survivină (proteină din familia IAP) poate inhiba caspazele iniţiatoare, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

Apoptoza pare a fi un fenomen frecvent în blocarea proliferării tumorale, iar eficienţa unor tratamente împotriva cancerului ar depinde de capacitatea lor de a induce apoptoza celulelor tumorale. Este interesant că atât dezvoltarea tumorală, cât şi apoptoza se pot declanşa, aşa cum s-a mai arătat, ca urmare a restructurării sau lezării ireversibile a materialului genetic într-o subpopulaţie celulară, procese care au însă sensuri contrare. Apoptoza depinde în special de stimuli care vin pe calea receptorilor Fas şi TNF, iar în carcinogeneză ea depinde de stimuli ce apar în urma leziunilor produse ADN-ului celular, proces în care un rol important par să-l joace proteinele p53 şi cele din familia Bcl-2. Este posibil ca unele celule cu leziuni minore (spontane sau induse de diverşi factori materialului lor genetic), să evite apoptoza, să acumuleze mutaţii în generaţiile celulare succesive şi să prolifereze malign. Apoptoza are loc însă şi după constituirea formaţiunilor tumorale, iar factorii care o declanşează sunt diverşi. În tumori, apoptoza ar putea fi determinată de citokinele eliberate în special de macrofage (care ar activa calea receptorilor Fas şi TNF), prin acţiunea limfocitelor T citotoxice, sau ar putea chiar să apară ca un proces specific celulelor tumorale.

124

Apoptoza poate avea loc şi în metastaze, doar că frecvenţa ei la acest nivel este mai scăzută decât în tumora primară. S-a constatat totodată că apoptoza are o frecvenţă mai mică în tumorile cu capacitate mare de metastazare decât în cele unde această capacitate este mai redusă, (Dănăilă et al., 1999).

Referitor la relaţia apoptoză - unele forme de cancer s-a constatat că, în cazul adenocarcinomului de prostată de exemplu, cancer cu proliferare relativ lentă, tumora este reprezentată de o populaţie heterogenă de celule, a cărei evoluţie depinde de androgeni. Prin ablaţia androgenică, celulele tumorale dependente de androgeni intră rapid în apoptoză, iar cele independente nu, astfel încât tumora se poate reface pe seama acestora din urmă în cazul ablaţiei androgene. S-a observat că indicele apoptotic la nivelul epiteliului transformat este semnificativ mai ridicat decât în epiteliul normal. Ar exista o relaţie directă între indicele apoptotic şi evoluţia cancerului de prostată. Se apreciază că nivelul mai ridicat al apoptozei în adenomul primar de prostată este asociată cu un potenţial de malignitate mai înalt.

Acumularea de alterări genetice în celulele epiteliale ale mucoasei din colon şi rect pot declanşa cancerul colorectal. Cancerul colorectal ocupă locul al doilea între neoplazii şi reprezintă a patra cauză de deces la om. Este o formă de cancer în care se pot produce două tipuri de instabilitate genetică: una cromosomială (chromsomal

instability pathway – CIP) şi una datorată schimbării nucleotidelor din componenţa ADN (microsatellite instability pathway – MIS). Instabilitatea cromosomială ar sta la baza a cca 60-80% din cancerele colorectale. S-au observat frecvent mutaţii ale genelor k-ras şi ale altor gene, precum şi inactivarea genelor p53, (s-a demonstrat experimental că transferul genei p53 intacte în celule de cancer de colon, deficitare în gena p53, le-a indus apoptoza), (Păunescu, 2006). Observaţii efectuate pe pacienţi cu cancer colorectal au arătat că cei care au prezentat un indice al apoptozei redus au înregistrat şi un procent mai redus de supravieţuire, ceea ce sugerează că un indice apoptotic scăzut poate indica un proces de progresie a bolii, de malignitate mai ridicată. În cancerul de colon la om, activarea protein-kinazei G (PKG) inhibă creşterea şi migraţia celulelor şi induce apoptoza. Tumorile în care apoptoza decurge normal sunt mai sensibile la chimioterapie şi au un prognostic mai bun.

În unele forme ale cancerului de stomac s-a evidenţiat exprimarea în exces a genelor p53 şi H-ras, iar printre substanţele care pot influenţa apoptoza în acest caz este posibil să se numere şi unele provenite din alimente. Studiul apoptozei în tumori benigne şi maligne ale glandelor salivare a arătat că indicele apoptotic este mai ridicat în tumorile maligne. Totodată proteina Bcl-2 a fost mult mai slab exprimată în tumorile maligne decât în cele benigne, situaţie pusă pe seama unei frecvenţe mai înalte a apoptozei.

În investigaţii privind carcinogeneza hepatică la şoareci s-a observat că în fazele iniţiale ale bolii nivelul apoptozei în celulele predispuse la transformare tumorală este mai mare decât în ţesutul sănătos. Există, se pare, o relaţie directă între exprimarea receptorului Fas pe celulele tumorale şi apoptoză, în sensul că nivelul acesteia este mai înalt în cazul exprimării Fas. Interferonul gamma eliberat de limfocitele T activate poate stimula hepatocitele să exprime receptorul Fas, iar limfocitele T citotoxice să exprime FasL, fapt ce ar induce apoptoza în celulele tumorale. S-a demonstrat în experienţe pe linii celulare de carcinom hepatocelular, că

125

există posibilitatea pierderii totale sau parţiale a activităţii receptorului Fas în ţesutul tumoral, asociată cu perturbări ale apoptozei.

Investigaţii efectuate de Pezzella (citat după Dănăilă et al., 1999) pe un lot de bolnavi de cancer pulmonar au evidenţiat prezenţa în tumori a proteinelor Bcl-2 la 25% dintre bolnavii cu carcinom spinocelular şi la 12% la cei cu adenocarcinom, în timp ce în limfocitele acestora proteinele Bcl-2 erau absente sau în cantităţi mici şi că supravieţuirea după 5 ani era mai mare printre aceşti pacienţi. Deficienţe ale apoptozei au fost observate în cazul cancerului pulmonar denumit NCl-H460, în care proteina X-linkată (XIAP) inhibitoare a apoptozei se exprimă în exces în celulele liniei celulare H460. Exprimarea în exces a aceastei proteine determină reducerea cantităţii de agonişti pro-apoptotici (XIAP se leagă la forma procesată a caspazei-9 şi inhibă activitatea cyt. c – activator apoptotic) astfel încât se modifică echilibrul dintre efectorii pro- şi anti-apoptotici în favoarea celor din urmă. Ca urmare, în loc ca celula lezată să fie dirijată spre apoptoză, ea continuă să se replice.

Unele observaţii au arătat că în cazul cancerului de sân nu există o corelaţie între nivelul apoptozei şi al proteinei Bcl-2, pacienţii cu nivel ridicat de exprimare al proteinei Bcl-2 având o supravieţuire mai îndelungată. Deşi, o frecvenţă ridicată a apoptozei ar trebui să însemne o progresie tumorală mai scăzută şi un pronostic mai bun, s-a constatat că în tumorile primare de sân apoptoza crescută s-a asociat cu o proliferare tumorală mai mare şi un pronostic nefavorabil. Se apreciază de altfel că o apoptoză intensă poate să indice o tumoră puţin diferenţiată, sau perturbări ale oncogenelor care controlează apoptoza.

În cazul cancerului tiroidian, care prezintă o mare varietate de forme, ar exista o relaţie între frecvenţa apoptozei şi nivelul de exprimare al proteinelor Bcl-2, dar nu şi între aceasta şi prezenţa sau lipsa proteinei p53, iar prezenţa acesteia din urmă pare a fi asociată cu un grad ridicat de agresivitate tumorală. În carcinomul papilar al tiroidei, indicele apoptotic s-a corelat direct cu proteina p53 şi invers cu Bcl-2. Într-un studiu în care s-a testat sensibilitatea liniilor celulare de carcinom tiroidian la apoptoza indusă prin Fas şi TRAIL, s-a constatat că Fas s-a exprimat la cele 12 linii celulare care au inclus linii celulare papilare, foliculare, medulare, slab diferenţiate şi anaplastice. TRAIL recombinant a indus apoptoza la 10 din liniile testate şi a activat caspaza-10 la nivelul receptorului, declanşând cascada de caspaze a apoptozei. Linia celulară de carcinom medular a fost însă rezistentă la apoptoza indusă Fas şi TRAIL, chiar şi în prezenţa cicloheximidei. TRAIL induce apoptoza mediată de caspaze în carcinoamele ce provin din epiteliul folicular al glandei tiroide, fapt ce procură un remediu terapeutic potenţial în cancerul de tiroidă. Se consideră că Bcl-2, Fas şi FasL pot fi folosiţi ca markeri de diferenţiere a carcinoamelor de tiroidă şi ca factori de prognostic, (Lin, 2001).

Şi tumorile cerebrale au o mare diversitate de forme, funcţie de tipul celulei care proliferează malign, frecvente fiind: astrocitomul, glioblastomul, oligo-dendrogliomul, tumorile mixte neuronale şi gliale, tumorile embrionare (neuroblastomul, medulo-blastomul), tumorile meningei, tumorile nervilor spinali şi cranieni etc. Într-un număr mare de astfel de tumori cerebrale a fost evidenţiată apoptoza, iar dintre factorii inductori ai acesteia au fost semnalaţi: ischemia, activarea receptorilor Fas şi TNF, acţiunea factorilor de creştere. Într-un studiu efectuat de Dănăilă et al. (1998) pe un lot de 16 bolnavi de glioblastom s-a observat că pacienţii la

126

care frecvenţa apoptozei a fost mare au avut o evoluţie clinică mai bună şi de durată mai lungă, iar la cei care au exprimat genele bcl-2 evoluţia clinică şi pronosticul au fost nefavorabile. La concluzii asemănătoare au ajuns autorii şi în studiul unor cazuri de astrocitom. Unele observaţii efectuate pe glioame au evidenţiat o relaţie pozitivă între prezenţa transglutaminazei şi apoptoză, pentru ca apoi să se constate prezenţa enzimei şi în zonele de necroză celulară. Deşi s-a observat că pierderea activităţii genei p53 s-a dovedit a contribui la promovarea dezvoltării tumorale a astrocitelor şi că în numeroase tipuri de tumori cerebrale sunt exprimate genele bcl-2, relaţia dintre apoptoză şi aceste evenimente nu este suficient de clară.

În cazul melanomului, care pare să provină dintr-o singură clonă de celule tumorale, având cel mai adesea ca punct de iniţiere pielea, celulele bolnave pot scăpa de apoptoza indusă prin receptorul Fas. De altfel, se consideră că melanocitele ar fi „experte” în dezvoltarea de mecanisme de sustragere de la supravegherea imunologică anti-tumorală, iar evoluţia melanomului malign este asociată cu un pronostic extrem de nefavorabil. Nu s-au putut stabili relaţii clare între prezenţa apoptozei şi evoluţia sau prognosticul bolii. Studiile care au urmărit stabilirea unei relaţii între indicele apoptotic, indicele mitotic, expresia genelor c-myc şi bcl-2, pe de o parte, şi evoluţia şi prognosticul bolii, pe de altă parte, au arătat că doar mărimea tumorii şi indicele mitotic sunt parametri care pot da informaţii de acest gen. Se pare că genele c-myc şi bcl-2 cooperează în a asigura supravieţuirea celulelor de melanom, (Dănăilă et al., 1999). În melanoamele maligne s-a observat exprimarea în exces a proteinei FLIP (inhibitor de caspaze), prin care se blochează transmiterea semnalelor apoptotice de la receptorii Fas şi TNFR.

În toate formele de cancer renal (tumori parenchimatoase epiteliale sau pielocaliciale) a fost frecvent semnalat un nivel mai ridicat al proteinei Bcl-2 decât în ţesutul renal normal. Deşi nu există o relaţie certă, s-a observat totuşi că în unele cazuri de cancer renal se întâlnesc forme mutant ale proteinei p53. Nu s-a putut de asemenea stabili o legătură clară nici între apariţia de metastaze şi raportul apoptoză/proliferare celulară. De altfel, se apreciază că prezenţa proteinei Bcl-2, a proteinei p53 normale sau mutant şi a apoptozei nu se constituie în factori importanţi de prognostic în cancerul renal. Există, se pare, o exprimare crescută a FasL în celulele tumorale renale, fapt relevat şi în alte forme de cancer (adenocarcinom, melanom, cancer hepatic).

Leucemiile sunt neoplazii ale ţesutului sanguin datorate mutaţiilor unor clone celulare din ţesutul hematopoietic, care le asigură o proliferare mai înaltă, un grad de diferenţiere mai scăzut, sau o prelungire a duratei de viaţă. Un rol important în patogeneza leucemiilor ar avea chiar acest ultim aspect, care ar putea fi asociat cu un răspuns schimbat al celulelor în cauză la factorii de supravieţuire celulară. Leucemia acută se caracterizează prin acumularea rapidă de celule hematopoietice primitive şi, în funcţie de originea celulelor maligne, ea poate fi mieloidă (AML) sau limfoidă (ALL). ALL este o boală care afectează mai ales copiii (75% din pacienţi având vârsta sub 15 ani), în timp ce AML este mai comună printre adulţi şi frecvenţa ei creşte cu vârsta. În leucemia acută are loc o rezistenţă la apoptoză, care este datorată frecvent expresiei greşite (aberante) a unor gene. Expresia eronată a unor gene în leucemia acută poate fi consecinţa unor translocaţii cromosomiale, (Schimmer et al., 2001). Unele limfoame foliculare se produc ca urmare a unei translocaţii între cromoaomii 14

127

şi 18, fapt ce determină exprimarea în exces a genelor bcl-2 şi implicit reducerea frecvenţei apoptozei. S-a constatat că în majoritatea cazurilor de leucemie mieloidă acută se exprimă genele bcl-2, existând totodată o corelaţie pozitivă între expresia acestora şi factorii de creştere G-CSF (factorul ce stimulează coloniile de granulocite) şi GM-CSF (factorul ce stimulează coloniile de granulocite şi monocite). În cazul leucemiei mieloide cronice (CML), boală în care are loc o acumulare progresivă de granulocite în măduva hematogenă şi sângele periferic, la peste 90% din pacienţi s-a evidenţiat cromozomul Philadelphia - o translocaţie reciprocă între cromosomii 9 şi 22, t(9;22). Translocaţia determină fuziunea genelor bcr/abl şi sinteza unei proteine de fuziune BCR-ABL, care dereglează activitatea ABL tirozin-kinazei. Dereglările acestei enzime conduc la activarea unor căi de semnalizare celulară ca Ras, kinaza- AKT/PI3, factorul NF-kB etc, (Schimmer et al., 2001). Proteina de fuziune BCR/ABL inhibă apoptoza. În stadiile timpurii ale bolii are loc o reducere a apoptozei, fapt ce determină acumularea de neutrofile şi creşterea duratei lor de viaţă. În faza agresivă a bolii (în care pot apărea şi alte anomalii genice, în special la nivelul genei p53, dar şi a genelor myc şi ras), apoptoza este mai intensă în neutrofilele periferice, dar se reduce în neutrofilele din măduvă (asigurând acumularea de elemente tinere în sângele periferic). Şi în leucemia limfatică cronică, în care are loc acumularea masivă de limfocite în măduvă şi sângele periferic, s-au semnalat anomalii citogenetice la nivelul limfocitelor şi o exprimare mai înaltă a proteinei Bcl-2. O cauză primară a acestei boli ar fi alterarea fenomenului de apoptoză, prin care poate fi contracarată proliferarea celulară. Nivele crescute ale proteinei Bcl-2 şi o durată de viaţă mai mare a celulelor s-a observat şi în leucemia limfatică acută, (Dănăilă et al., 1999).

Întrucât procesul de transformare neoplazică şi/sau progreseia tumorilor ar putea avea ca mecanism inhibiţia caspazelor, şi în consecinţă, o apoptoză deficitară, se consideră de perspectivă terapia genică a cancerelor pe baza caspazelor, eliberate selectiv la nivelul unor ţesuturi tumorale, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).

9.3. Boli determinate de dereglarea apoptozei

Dereglarea procesului de apoptoză poate avea un rol principal sau secundar în în diverse boli. Aşa cum s-a arătat deja, o apoptoză deficitară poate conduce la cancer, autoimunitate (incapacitatea de a elimina limfocitele autoreactive), infecţii persistente (incapacitatea de a eradica celulele infectate) etc, în timp ce apoptoza excesivă poate contribui la boli neuro-degenerative (bolile Alzheimer, Parkinson, Huntington, scleroza laterală amiotrofică), la autoimunitate (inducerea apoptozei necontrolate în organe specifice), la SIDA (depleţia limfocitelor T) şi ischemie (atac de cord, infarct miocardic), (REED, citat de Gewies, 2003). Despre relaţia apoptoză deficitară/ excesivă şi unele boli am discutat în capitolele anterioare şi nu vom insista asupra acestui subiect.

Apoptoza deficientă poate fi implicată în formarea şi progresia tumorilor, în procesul de metastazare, ca şi în apariţia rezistenţei la terapia medicamentoasă anticancer. Este tot mai evident faptul că tumorigeneza nu reprezintă doar rezultatul unei proliferări excesive a celulelor ca urmare a activării oncogenelor, ci depinde într-o anumită măsură şi de alterarea punctelor de control ale apoptozei. Se pare că procesul de tumorigeneză se dezvoltă pe baza acelor celule oncogene care supravieţuiesc şi devin maligne şi care în plus sunt protejate de moarte celulară

128

datorită unor deficienţe ale căilor apoptotice, (Vousden, 2002). Această protecţie împotriva apoptozei poate fi asigurată celulei transformate de o exprimare sau activare neadecvată a proteinelor anti-apoptotice, sau de inactivarea unor factori pro-apoptotici. Este cazul proteinei Bcl-2 exprimată în exces în diverse forme de cancer, proteină care asigură supravieţuirea celulei canceroase prin inhibarea apoptozei. În alte cazuri de cancer apar mutaţii sau dereglări ale proteinelor Bax şi Bak. În procesul transformării canceroase pot fi exprimate în exces sau activate inadecvat NF-kB şi Mdm2. În apărarea împotriva transformării maligne un rol foarte important are proteina p53, supresoare a tumorilor. Se apreciază că în peste 50% din cancerele umane are loc inactivarea acestei proteine. Proteina p53 este activată, ca factor de transcripţie, ca răspuns la factori precum activarea oncogenelor, hipoxie şi în special lezarea ADN-ului. Activarea p53 (care în celulele normale se află în citosol, în concentraţii mici şi inactivată) determină oprirea creşterii sau/şi apoptoza prin stimularea exprimării unor gene ţintă pentru p53, ca: p21, Bax, Puma, Noxa, Apaf-1, Fas şi Dr5 (Vousden, 2002). În reglarea p53, un rol foarte important are oncogena Mdm2 (care codifică o ubiquitin-ligază), care se leagă de p53 şi o inhibă. Ca răspuns la stresul celular (cum ar fi lezarea ADN), proteina p53 este fosforilată la anumite resturi serină/treonină, ceea ce previne interacţiunea Mdm2-p53 şi în acest fel p53 este stabilizată şi activată (Schon, citat de Gewies, 2003). Căile apoptozei p53-mediate pot fi inhibate de semnale de supravieţuire, cum ar fi legarea factorilor de creştere la receptorii lor înrudiţi, fapt ce determină activarea kinazei Akt care, se ştie, mediază o serie de mecanisme anti-apoptotice. Cunoscând mai bine mecanismele apoptozei, dar şi leziunile prin care componenţii maşinăriei apoptotice determină stări patologice se vor putea dezvolta mijloace terapeutice adecvate, mai eficiente şi mai bine tolerate de către organism. Printre acestea ar putea figura, în cazul cancerului, activarea supresorilor tumorali sau blocarea oncogenelor anti-apoptotice, iar în cazul morţii celulare premature (care stă la baza proceselor neuro-degenerative, de exemplu) inhibarea componenţilor pro-apoptotici cheie (cum ar fi caspazele), (Reed, citat de Gewies, 2003).

9.4. Apoptoza şi bolile autoimune Apoptoza poate contribui în două modalităţi la promovarea bolii autoimune: pe

de o parte apoptoza contribuie la selecţia şi educarea celulelor T normale (perturbarea sau întreruperea procesului făcând posibilă generarea de celule autoreactive), iar pe de altă parte, apoptoza poate constitui un mecanism de distrugere a organelor şi ţesuturilor independent de limfocite. Deşi bolile autoimune au manifestări distincte, bazele lor genetice sunt asemănătoare, cele mai multe dintre ele fiind asociate cu regiunea HLA (antigenul leucocitar uman, cunoscut şi ca MHC – complexul major de histocompatibilitate uman) sau cu locii non-HLA din apropiere (Becker et al., citaţi de Hayashi şi Faustman, 2003). Una din trăsăturile distinctive ale autoimunităţii este eşecul celulelor autoreactive de a se supune selecţiei negative şi morţii, fie pe parcursul dezvoltării lor, fie ulterior.

Boala autoimună apare atunci când sistemul imun al unei persoane nu mai distinge între propriu (self) şi străin (non-self), când atacă deci nu numai corpurile străine (invadatoare) din organism, ci şi componente specifice lui (propriile celule şi ţesuturi). Prin urmare, în bolile autoimune se produc anticorpi împotriva propriilor constituienţi celulari, care nu sunt recunoscuţi ca antigeni la indivizii sănătoşi. Bolile

129

autoimune duc la debilitarea organismului afactat şi chiar la moartea lui. Un mecanism care asigură protecţia în faţa unei astfel de perspective este apoptoza. După realizarea misiunii lor, celulele sistemului imun primesc semnale pentru moartea lor (Sorelle, 2006). Celulele dendritice sunt componenţi critici ai sistemului imun, care „prezintă” proteinele străine (antigenii specifici virusurilor, bacteriilor) limfocitelor, iar acestea declanşează atacul împotriva lor. Wang (citat de Sorelle, 2006) consideră că apoptoza deficientă a celulelor dendritice ar putea fi un component critic al bolii autoimune. Autorul apreciază că autoimunitatea, în general, ar fi provocată de situaţia în care „celulele dendritice nu sunt stopate (controlate) fie de către MCP, fie de superactivare”.

Într-un raport publicat în „American autoimmune”, MacKay et al. (2007) discută pe marginea relaţiei existente între boala autoimună, pe de o parte, şi inflamaţie, infecţie, apoptoză, factorii genetici şi expunerea la factori de mediu, pe de altă parte. Autorii consideră că rolul apoptozei în iniţierea bolii autoimune rămâne încă neclar şi controversat şi că sunt necesare noi dovezi pentru stabilirea aportului apoptozei în dezvoltarea autoimunităţii, în special când vine vorba de bolile autoimune specifice organelor.

Faptul că unii constituienţi proprii organismului nu sunt recunoscuţi ca atare s-ar putea datora unor modificări neobişnuite pe care le suportă aceştia în timpul procesării lor şi de aici incapacitatea sistemului imun de a-i recunoaşte ca non-străini, sau a faptului că sistemul imun devine incapabil de a elimina limfocitele care dezvoltă reactivitate împotriva auto-antigenilor. Însăşi apoptoza este considerată un proces care ar putea produce astfel de schimbări neobişnuite ale componenţilor celulari, (Clemens et al., 2000). Apoptoza intervine în reglarea populaţiilor de celule T, în sensul că celulele T activate care şi-au îndeplinit rolul funcţional sunt rapid eliminate prin „activarea indusă a morţii celulare” (AICD). Activarea prelungită a celulelor T, ca urmare a unui nivel ridicat de citokină IL-2 (care reglează în amonte expresia proteinei anti-apoptotice Bcl-2 în celulele ţintă), de exemplu, ar determina rezistenţa acestor celule la apoptoză, ceea ce ar conduce la incapacitatea eliminării celulelor T self-reactive şi implicit la boala autoimună. Susceptibilitatea mai scăzută a celulelor T la stimulii apoptotici ar putea fi şi consecinţa unor mutaţii la componenţii sistemului Fas (CD-95). Dereglarea apoptozei poate conduce deci la autoimunitate. Dacă ratele apoptozei în unele ţesuturi devin anormal de înalte, atunci ar avea loc prezentarea unor nivele ridicate de auto-antigeni sau de antigeni noi către sistemul imun.

În unele boli autoimune, cum este cazul sindromului limfoproliferativ autoimun (ALPS - autoimmune lymphoproliferative syndrome), s-au descoperit deficienţe ale metabolismului CD-95. ALPS presupune o apoptoză disfuncţională sau nefuncţională a limfocitelor (Rao şi Straus, 2006). Perturbarea apoptozei în ALPS permite acumularea şi persistenţa limfocitelor activate. Majoritatea cazurilor de ALPS provin din mutaţia genei pentru proteina Fas. Mai mult, pacienţii cu mutaţii ale porţiunii intracelulare a Fas (domeniul morţii) sunt „candidaţi” siguri în a manifesta simptomele ALPS. Dacă la indivizii normali, celulele T şi B efector sunt distruse prin apoptoză după ce antigenul a fost „neutralizat” (eliminat din corp), la indivizii ALPS (la care primele semne ale bolii apar timpuriu – la vârsta de două luni a copiilor), aceste celule, aşa cum se preciza anterior, persistă şi se acumulează în organele limfoide periferice (în nodulii limfatici şi splină) şi pot atinge nivele foarte înalte, (Strauss et al., 1999).

130

Un alt factor incriminat în declanşarea bolilor autoimune ar fi incapacitatea fagocitelor de a elimina celulele apoptotice ce exprimă auto-antigeni multipli (din cauza deficienţei complementului, de exemplu). Se consideră că puţini auto-antigeni reprezintă substraturi de scindare pentru caspaze în timpul apoptozei şi că unii produşi „anormali” de scindare proteolitică, potenţial antigenici, ar putea rezulta în timpul necrozei sau după expunerea la granzima B. De altfel, Rosen (citat de Clemens et al., 2000) arăta că granzima B clivează o fracţie mult mai mare de proteine auto-antigenice decât caspazele, dând naştere la produşi de scindare diverşi, dintre care unele peptide, potenţial nou-antigenice.

În condiţiile în care sistemul Fas/FasL funcţionează defectuos au loc tulburări limfo-proliferative, care conduc la declanşarea bolilor autoimune. La şoareci, mutaţiile genelor lpr (limfoproliferare) şi gld (boală limfoproliferativă generalizată) determină pierderea funcţiei sistemului Fas/FasL, ceea ce are drept consecinţă acumularea de limfocite T şi B activate şi producerea de boli autoimune. Mutaţiile lpr (lpr/lpr) afectează receptorul Fas, iar mutaţiile gld (gld/gld) afectează FasL, (Dănăilă et. al., 1999; Hayashi şi Faustman, 2003). Şoarecii cu mutaţii ale genelor pentru Fas sau Fas ligand (FasL), în funcţie de fondul lor genetic, prezintă limfadenopatie, splenomegalie, formarea de auto-anticorpi, inflamaţia articulaţiilor şi glomerulonefrită. La om s-au descris puţine cazuri cu mutaţii ale genelor ce codifică Fas/FasL. Ei manifestă un sindrom limfo-proliferativ autoimun (sindromul Canale-Smith sau ALPS), ce se caracterizează prin limfadenopatie, splenomegalie şi auto-anticorpi împotriva unor componenţi sanguini ca eritrocitele şi plachetele, dar nu dezvoltă boli de articulaţie sau renale, (Stuart şi Hughes, 2002). Potrivit informaţiilor furnizate de Dănălă et al. (1999), deficienţele sistemului Fas/FasL, determinate de mutaţiile genelor specifice, ar avea drept consecinţă inhibarea apoptozei limfocitelor activate sau autoreactive şi de aici apariţia de boli autoimune, cum ar fi lupusul eritematos sistemic (SLE), artrita reumatoidă, psoriazisul, diabetul zaharat autoimun.

Faptul că majoritatea populaţiei nu dezvoltă patologia autoimună, deşi celulele apoptotice pot exprima pe suprafaţa lor auto-antigeni potenţiali, înseamnă că apoptoza nu este în sine suficientă pentru a induce boala autoimună. Se pare că autoimunitatea apare mai degrabă ca urmare a unei deficienţe în eliminarea celulelor apoptotice. Expunerea la un număr mare de celule apoptotice, care depăşeşte capacitatea fagocitară a sistemului reticulo-endotelial, ar determina un răspuns auto-anticorp, (Stuart şi Hughes, 2002).

Lupusul eritematos sistemic (SLE) reprezintă o boală autoimună complexă (multisistemică) ce constă în producerea unui titru înalt de auto-anticorpi împotriva auto-antigenilor exprimaţi ubiquitar. În cazul SLE deci, are loc prăbuşirea toleranţei la antigenii proprii şi drept consecinţă producerea de auto-anticorpi reactivi la numeroase proteine proprii., (Eguchi, 2001; White şi Rosen, 2003). Pacienţii cu lupus eritematos sistemic au un nivel mai ridicat de Fas solubil. Formele solubile de Fas ar interacţiona competitiv cu FasL de pe unele celule, inclusiv de pe limfocite, şi astfel ar bloca apoptoza pe calea Fas. Nivelul de Fas solubil în ser ar fi deosebit de important pentru dezvoltarea limfocitelor. În serul unor pacienţi cu SLE s-au descoperit auto-anticorpi anti-FasL, care ar putea fi consideraţi auto-anticorpi anti-limfocitari. Auto-anticorpii anti-FasL ar fi implicaţi în inhibarea apoptozei mediată de sistemul Fas/FasL. Se pare, de altfel, că formele solubile de Fas şi FasL ar bloca activitatea unor anticorpi

131

specifici, responsabili de moartea prin apoptoză a unor linii celulare tumorale, (Dănăilă et al., 1999).

La majoritatea pacienţilor cu SLE s-au decelat auto-anticorpi anti-nucleari (ANA), care pot prezenta mai multe subtipuri: a) anticorpi anti-dsADN (anticorpi anti-ADN dublu catenar). Unii din aceşti anticorpi ar recunoaşte specific alfa-actina, o proteină din rinichi, suspectată a se produce şi în alte ţesuturi afectate de SLE (piele, articulaţii, creier); b) anticorpi anti-Sm, identificaţi în special la pacienţii cu lupus de origine africană; c) auto-anticorpii anti-Ro (SSA) şi anti-La (SSB), implicaţi în eczemele sensibile la soare ale pacienţilor SLE, dar au fost asociaţi şi cu sindromul neonatal de lupus (în care anticorpi de la mamă pătrund în făt provocându-i inflamaţii la nivelul pielii şi inimii); d) anticorpii antifosfolipidici, care atacă proteinele de reglare a cheagului sanguin, cresc riscul de formare a cheagurilor sanguine şi pot fi responsabili de neregularităţile şi îngustarea vaselor de sânge.

Un factor imun important în SLE este sistemul complement, implicat în apărarea şi reglarea răspunsului imun şi format din peste 30 de proteine. Deficienţele înregistrate ale unora din componenţii complementului (C1q, C1r, C1s, C4 şi C2) au fost asociate cu lupusul eritematos sistemic (SLE). Complementul poate asigura normalizarea apoptozei şi în acest fel proteja împotriva bolii autoimune. Auto-anticorpii naturali (specifici omului sănătos) pot de asemenea contribui la reglarea apoptozei prin activarea complementului şi distrugerea rapidă a celulelor auto-distructive (apoptotice), astfel încât auto-antigenii periculoşi să nu fie eliberaţi în fluxul sanguin pentru prea mult timp, să se prevină deci expunerea persistentă (îndelungată) a sistemului imun la auto-antigeni. Componenţii complementului servesc totodată şi la eliminarea resturilor (deşeurilor) moleculare, a aşa numitelor complexe imune, care sunt de fapt produşii finali ai activităţii imune şi care altfel s-ar acumula şi depozita în rinichi, vasele de sânge, articulaţii etc, unde ar incita în continuare sistemul imun. Există, se pare, consens asupra faptului că anomaliile în generarea şi eliminarea materialului apoptotic poate reprezenta o sursă importantă de antigeni în bolile autoimune sistemice, (White şi Rosen, 2003). Deficienţa în C1q este puternic asociată cu SLE, şoarecii lipsiţi de gena specifică acestui factor dezvoltând spontan auto-anticorpi şi glomerulonefrită. Inflamaţia glomerulară la şoarecii C1q - knockout se caracterizează prin acumularea de celule apoptotice în glomeruli, ceea ce sugerează că perturbarea procesului de eliminare a acestor celule este un factor etiologic în dezvoltarea bolii, (Stuart şi Hughes, 2002).

Potrivit unor estimări, ar exista între 20 şi 100 de factori genetici implicaţi în tulburările sistemului imun, factori de risc pentru SLE, între care deficienţe ale genelor ce reglează apoptoza, o deficienţă genetică ce constă în producţia crescută de oxid nitric, un set de gene reunite sub numele de interferon care sunt activate de interferon, anomalii ale genei pentru HLA (human leucocite antigen) cunoscute ca HLA-DR2, -DR3, -A1, -B8 şi DMA0104, care au fost asociate cu lupusul. Printre factorii externi care ar declanşa răspunsul autoimun în SLE s-ar număra unele virusuri, frigul, oboseala, stresul, contraceptivele orale, unele medicamente şi substanţe, lumina solară (radiaţiile UV) etc.

Tulburările autoimune ale tiroidei. În tiroidita Hashimoto procentul de celule apoptotice creşte, în timp ce în boala lui Graves acest procent scade. În boala Hashimoto are loc pierderea celulelor epiteliale ale tiroidei, care sunt înlocuite treptat

132

de celule mononucleare. Eguchi (2001) consideră că în tiroiditele Hashimoto, apoptoza Fas-mediată a tirocitelor se realizează prin două mecanisme şi anume, prin infiltrarea celulelor T activate şi de către tirocitele FasL pozitive într-o manieră fratricidă sau suicidă. Deşi nu există o dovadă directă a implicării celulelor T citotoxice în distrugerea tirocitelor, unele date arată că celulele T au rolul lor în iniţierea şi amplificarea răspunsului autoimun împotriva celulelor tiroidei. Limfocitele T care se infiltrează exprimă nivele înalte ale Fas şi CD69 (Lin, 2001). Faptul că, spre deosebire de tirocite, limfocitele T nu exprimă cantităţi însemnate de FasL, sugerează că acestea nu sunt implicate direct în distrugerea tirocitelor. Studii in vivo efectuate pe şobolani BioBreeding/Worcester au arătat că în tiroidita limfocitară creşte semnificativ expresia genelor Fas şi FasL. Administrarea plasmidei ADN care codifică FasL în celulele foliculare tiroidiene a inhibat dezvoltarea infiltrării limfocitare a tiroidei şi a indus moartea celulelor T infiltrante, sugerând că în tiroidita animală autoimună se produce suprimarea totală a răspunsului tiroglobulin specific al celulelor T citotoxice.

În patogeneza bolii lui Graves pare a avea un rol important Fas solubil, fapt reieşit din unele observaţii şi experimente. La pacienţii cu boala Graves, Fas solubil joacă un rol cheie în inhibarea sistemului Fas - FasL. Concentraţia de Fas solubil în serul pacienţilor netrataţi de boală este mult mai ridicat decât la subiecţii de control şi ea scade după 6-8 săptămâni de la administrarea de medicamente anti-tiroidice. Concentraţia de Fas solubil s-a corelat cu anticorpii receptor anti-TSH, dar nu şi cu factori ca triiodtironina liberă, tiroxina liberă, hormonul de stimualre a tiroidei, anticorpul antimicrosomal (AMA) şi anticorpul antitiroglobulină (ATA). Fas solubil s-a decelat şi în supernatantul tirocitelor cultivate de la bolnavii cu boala Graves, iar producerea lui a putut fi indusă de către interleukina 1β şi TNF-α, (Lin, 2001). Într-un studiu al genelor legate de apoptoză la pacienţi cu boala lui Graves şi guşă multinodulară (grup de control), Waheed et al. (2002) au constatat că în ambele situaţii TNFR2 s-a exprimat puternic. În boala lui Graves s-au înregistrat nivele crescute ale caspazei-14, MCL-1, RIP, TRAF1 şi Bak, în timp ce caspazele-8 şi -9 nu s-au exprimat clar. Rezultatele obţinute i-au determinat pe autori să considere că în această boală ar putea exista o cale neconvenţională de activare a apoptozei.

Diabetul autoimun. Aşa cum a rezultat din cele prezentate anterior, autoimunitatea cuprinde un grup de boli ce sunt definite clinic de organul sau ţesutul ţintă distrus. Bunăoară diabetul de tip 1 (cunoscut şi ca diabetul dependent de insulină sau diabetul de atac juvenil) rezultă din atacul celulelor T asupra celulelor β din pancreas, secretoare de insulină. La şoarecii diabetici non-obezi (NOD), limfocitele sunt mai sensibile la apoptoza indusă prin TNF-α decât limfocitele animalelor de control, datorită unei deficienţe în activarea factorului NF-kB (factor de transcripţie ce protejează de moartea celulară indusă prin TNF- α). NF-kB contribuie însă la moartea celulară mediată de Fas, iar activarea NF-kB ca răspuns la TNF-α poate determina expresia FasL. Iată de ce deficienţele rezultate din inter-jocul acestor căi apoptotice (suprapuse parţial), pot explica formarea de fenotipuri de selecţie intensificată sau diminuată a celulelor T, asociate cu boala autoimună. În diabetul uman de tip 1 şi în două modele ale bolii specifice rozătoarelor (NOD la şoarece şi BB la şobolan) sunt distruse selectiv celulele pancreatice β ca rezultat al reacţiei autoimune cronice, (Hayashi şi Faustman, 2003). Distrugerea celulelor beta-pancreatice s-ar datora limfocitelor T citotoxice activate de limfokinele produse de limfocitele T-helper

133

(Dănăilă et al., 1999). La şoarecii NOD şi oamenii cu diabet autoimun s-au decelat anomalii în expresia markerilor de maturare (expresie redusă a antigenului de maturare CD45) sau în prezentarea de antigeni (o abundenţă scăzută a moleculelor din clasa I-a MHC şi auto-peptidelor de pe suprafaţa celulară). Genele candidat din regiunea MHC a genomului la om şi rozătoare, responsabile de deficienţele în prezentarea antigenilor, asociate cu bolile autoimune, includ pe cele pentru transportorii de peptide TAP şi subunităţile LMP ale proteasomului. Şoarecii knockout pentru genele TAP sau LMP manifestă selecţie anormală a celulelor T şi autoreactivitate pentru transplantul de ţesut normal singenic, (după Hayashi şi Faustman, 2003). Şoarecii NOD reprezintă un model pentru studiul diabetului uman de tip 1. S-a constatat că aceşti şoareci prezintă în limfocite un proteasom defect, ce rezultă din reglarea în aval a subunităţii LMP2 a proteasomului, deficienţă care împiedică procesarea proteolitică necesară pentru producerea şi activarea NF-kB. Proteasomul mediază deci procesarea şi activarea factorului de transcripţie NF-kB. Hayashi şi Faustman (2003) şi-au propus să elucideze care este motivul că în diabetul uman de tip 1 celulele T tratează celulele beta-pancreatice ca străine şi cum se defectează procesul de educare a celulelor T la antigenii proprii în cazul indivizilor cu acest tip de diabet. Procesul de educare a celulelor T se realizează de către celulele prezentatoare de antigeni (APC) „profesionale”, ca macrofagele, celulele dendritice şi celulele B. S-a crezut iniţial că autoimunitatea rezultă din activarea nespecifică a celulelor T de către antigeni străini (cum ar fi, de exemplu, proteinele virale), care ar genera reactivitate încrucişată cu antigenii proprii, situaţie considerată a fi datorată unei deficienţe a MHC din clasa a II-a. Autorii au adus dovezi că la baza dezvoltării bolii autoimune la şoarecii NOD şi oamenii cu diabet de tip 1 stă întreruperea prezentării de antigeni proprii de către moleculele din clasa I-a MHC. Ei au demonstrat existenţa unei deficienţe evidente în funcţionarea proteasomului în limfocitele şoarecilor NOD predispuşi la diabet autoimun, care rezultă dintr-un defect al subunităţii LMP2 a acestuia (gena responsabilă fiind situată în regiunea MHC a genomului). Această deficienţă determină atât o procesare deteriorată a peptidelor proprii pentru prezentare de către moleculele din clasa I-a MHC, cât şi incapacitatea de a activa NF-kB.

În artrita reumatoidă are loc o hiperplazie a ţesutului sinovial, infiltrarea celulară şi osteoporoza peri-articulară. Citokinele inflamatorii şi/sau factorii de creştere duc la exprimarea intensă a Bcl-2 şi translocarea nucleară a factorului NF-kB în celulele sinoviale. Aceste celule devin rezistente la apoptoza indusă de diverşi stimuli. Celulele infiltrate, deficiente în activarea indusă a morţii celulare asigură supravieţuirea celulelor T şi B autoreactive, provocând astfel autoimunitatea, (Eguchi, 2001). În serul pacienţilor cu boli autoimune ca SLE, artrita reumatoidă, boala inflamatorie de intestin au fost identificaţi autoanticorpi pentru anexina V. Anexinele sunt proteine înrudite structural, care în prezenţa Ca2+ se leagă reversibil la fosfolipidele încărcate negativ din membrane. Anexina V este specifică pentru fosfatidil-serină şi se leagă la suprafaţa celulelor apoptotice. Autoanticorpii ar interfera cu funcţiile anexinei V, incluzând legarea la colagenul de tip II, inhibarea activităţii fosfolipazei A2 şi activarea receptorului Fc, (Vannier, 2002).

134

10. Moartea celulară programată (MCP) la plante La plante, ca şi la animale, moartea celulară este un fenomen esenţial în ciclul lor de viaţă. Moartea celulară programată este un proces activ, aflat sub control genetic, care aşa cum am arătat deja, duce la eliminarea selectivă a unor celule nedorite sau lezate la eucariote. Moartea şi proliferarea celulară, creşterea şi diferenţierea, sunt procese bine coordonate, astfel asigurându-se menţinerea homeostaziei ţesuturilor şi organelor, (Gadjev et al., 2008).

La plante, au fost descrise mai multe tipuri de moarte celulară. Deşi MCP la plante are unele asemănări cu apoptoza de la animale, ea prezintă totuşi diferenţe importante, întrucât plantele nu au un sistem imun şi nu conţin fagocite, iar peretele celular specific plantelor împiedică formarea de corpi apoptotici. Se consideră de altfel că la plante corpii apoptotici ar fi irelevanţi funcţional, întrucât nu ar fi posibilă fagocitoza lor de către celulele adiacente în prezenţa pereţilor celulari. La plante în schimb sunt prezente autofagia şi/sau autoliza. Autofagia presupune înghiţirea şi degradarea nucleului şi unor organite celulare de către provacuole, vacuole şi alte organite autofagice ce derivă din leucoplaste (Filonova et al., 2000), iar autoliza contribuie la degradarea organitelor şi componenţilor celulari solubili, ea având calitatea de a continua şi după moartea celulelor, aşa cum se întâmplă în cursul diferenţierii elementelor traheale. Adeseori, cele două mecanisme cooperează pentru a realiza dezasamblarea celulară, (Jan et al., 2008; Nanda et al., 2010). Celulele vegetale supuse MCP sintetizează substanţe de autodistrugere, care sunt plasate în vacuolă, iar ruperea vacuolei determină moartea celulei. Se pare că şi la plante mitocondriile au un rol esenţial în promovarea şi execuţia MCP.

Potrivit informaţiilor sintetizate de Courtois-Moreau, (2008), MCP la plante a fost clasificată în 3 tipuri pe baza caracteristicilor morfologice exprimate de celulele afectate:

1) moartea celulară asemănătoare cu apoptoza (apoptosis-like, AL) care implică degradarea rapidă a nucleului şi pierderea organizării celulare, fenomen întâlnit pe parcursul dezvoltării plantelor sau în condiţii de expunere la factori de stres. Această formă de MC este frecvent indusă prin semnalizare - via mitocondrii, este însoţită de micşorarea nucleului, condensarea cromatinei şi ADN-laddering;

2) MC specifică senescenţei plantelor, proces lent, asociat cu recuperarea conţinutului celular şi relocarea nutrienţilor. După degradarea completă a plastidelor, la sfârşitul procesului de MC, se produce colapsul nucleului şi al vacuolei;

3) MCP indusă prin colapsul vacuolei, proces foarte bine ilustrat de diferenţierea elementelor traheale (ET), care are o viteză intermediară între cele două forme prezentate anterior, şi care presupune acţiunea proteazelor localizate în vacuolă, a căror eliberare în citosol determină degradarea conţinutului celular.

Prezentăm în continuare, pe scurt, unele din opiniile mai recente cu privire la moartea celulară programată (MCP) la plante şi unele din asemănările şi deosebirile existente sub acest aspect între apoptoză la animale şi MCP la plante, asupra cărora vom reveni într-un alt subcapitol.

MCP la plante este implicată într-o serie de procese specifice acestora, cum ar fi: formarea embrionului, degenerarea stratului de aleuronă în timpul germinării seminţelor la monocotiledonate, formarea aerenchimului în rădăcini şi a unor tipuri de trichomi epidermali, formarea elementelor traheale ale xilemului, ablaţia organelor

135

florale, eliminarea celulelor primordiilor de stamine la florile femele ale speciilor monoice, degenerarea celulelor tapet ale anterei, auto-incompatibilitatea polenului, formarea lobilor şi perforaţiilor foliare, dehiscenţa fructelor sau spargerea păstăilor etc, (Pennell et Lamb, 1997; Vercammen et al., 2007; Gadjev et al., 2008). În plus, moartea celulară poate fi un răspuns la stresul biotic şi abiotic. MCP însoţeşte dezvoltarea plantelor de la începutul şi până la sfârşitul ciclului lor de viaţă. Pentru plante, ca şi pentru animale, moartea celulară este la fel de importantă ca şi diviziunea celulară, (Reape et al., 2007). Ca şi în cazul animalelor, MCP la plante este implicată în răspunsul la patogeni (răspunsul hipersensibil) sau la factori de stres (formarea aerenchimului, de exemplu).

Unul din semnalele biochimice importante ale apoptozei este fragmentarea ADN-ului şi formarea de ladderi ADN. Citând o serie de date prezente în literatura de profil, Jan et al., (2008) arată că fenomenul de formare a ladderilor ADN a fost raportat şi la plante pe parcursul dezvoltării lor, în cursul morţii stratului de aleuronă la monocotiledonate, senescenţei petalelor, ţesutului carpelelor şi frunzelor, în cursul dezvoltării anterelor, a stresului provocat de unii agenţi ca frigul, înfometarea cu nutrienţi, stresul salin sau cu D-manoză, stresul indus de UV, patogeni sau toxine ale acestora. În legătură cu fragmentarea ADN, spre deosebire de animale, unde aceste fragmente oligonucleosomale numără 180 pb sau multiplu al acestui număr, la plante fragmentele de ADN datorate MCP numără în unele cazuri 50 kb, iar în altele 140 pb. Se consideră că mărimea diferită a acestor fragmente s-ar datora activării într-o primă etapă a unui set de endonucleaze ce produc fragmente de 50 kb (care ar duce la eliberarea spirelor de cromatină), urmată apoi de activarea altui set de endonucleaze care ar asigura formarea fragmentelor oligonucleosomale (Pandey et al., citaţi de Jan et al., 2008).

În privinţa enzimelor care participă la dezmembrarea nucleului în timpul MCP lucrurile nu sunt încă foarte clare. În frunzele de ovăz tratate cu victorină s-a evidenţiat inducţia activităţii endonucleazei de 28 kDa (p28), fenomen precedat de ADN- laddering şi condensarea heterocromatinei. În lizatele celulare de ovăz s-au decelat şi patru nucleaze constitutive de 22 kDa (p22), de 31 kDa (p31), de 33 kDa (p33) şi de 35 kDa (p35), (Tada et al. - 2001 şi Kusaka et al. – 2004, citaţi de Nanda et al., 2010). La Arabidopsis s-a identificat în spaţiul intermembranar al mitocondriilor o activitate nucleolitică dependentă de Mg2+, care genera fragmente de ADN de 30 kb, în timp ce la Zinnia s-a evidenţiat o endonuclează (ZEN1) dependentă de Zn2+, implicată în degradarea ADN nuclear din elementele traheale. Conform informaţiilor lui Courtois-Moreau (2008), în cursul MCP a ET la Zinnia s-a evidenţiat o activitate crescută a nucleazelor, şase din ele fiind induse specific în timpul diferenţierii ET în culturile de celule la această specie. Dintre ele ZEN1 – o nuclează de tip S1 de 43 kDa, apare ca DN-aza cheie în degradarea ADN nuclear în cursul MCP a elementelor traheale. Familia de gene pentru nucleazele de tip S1 este reprezentată de 5 gene la Arabidopsis, două la orz şi trei la Zinnia, dintre care doar BEN1 de la Arabidopsis şi ZEN1 de la Zinnia codifică DN-aze.

Această nuclează nu produce însă ADN-laddering aşa cum se întâmplă cu nucleazele implicate în apoptoză la animale, de unde concluzia că animalele şi plantele dispun de sisteme independente de degradare a ADN-ului în timpul morţii celulare, (după Jan et al., 2008). În nucleul celulelor de aleuronă la grâu supuse MCP s-a

136

identificat, înainte de ADN-laddering, o endonuclează dependentă de Ca2+ şi Mg2+. Toate aceste informaţii arată că în MCP la animale şi plante participă mai multe nucleaze. Revenind la problemele discutate anterior, cercetări recente întreprinse pe culturi de celule vegetale au arătat că diferenţa dintre apoptoză şi necroză este dată uneori de nivelul lezării, de severitatea (intensitatea) stresului. Celulele supuse la un stres de nivel scăzut vor supravieţui în marea lor majoritate, în cazul unui stres de nivel moderat majoritatea celulelor vor fi supuse MCP, în timp ce la un stres de nivel ridicat, majoritatea celulelor vor fi supuse necrozei. Citând o serie de autori, Reape et al. (2007) arată că celulele de morcov supuse temperaturii de 550C au suferit moartea celulară, care morfologic a constat în retragerea protoplastului celulei de peretele celular. Dacă nivelul stresului termic a fost mai înalt (750C), celulele au murit fără să se mai observe condensarea citoplasmatică, ceea ce demonstrează că fenomenul de retragere a fost mai degrabă un rezultat al MCP decât un semnal al colapsului celular. Deşi la plante nu s-a observat formarea de corpi apoptotici şi nici prezenţa enzimelor specifice apoptozei la animale – caspazele, în genomul de Arabidopsis, de exemplu, s-au descoperit molecule asemănătoare caspazelor şi substraturi specifice acestor enzime care sunt clivate în timpul MCP. Mai mult, ar exista gene implicate în MCP şi în clivarea ADN-ului. Deşi la unele plante moartea celulară pare să aibă uneori aspecte ce seamănă cu apoptoza, diferenţele morfologice existente au sugerat totuşi pentru plante termenul de moarte celulară programată asemănătoare apoptozei, sau de tip apoptotic (Apoptotic-like Programmed Cell Death; MCP-AL), (Danon et al., citat de Reape et al, 2007). Deşi acest tip de moarte celulară este mai înceată (mai lentă) decât apoptoza la animale, ea este totuşi un proces relativ rapid, fiind iniţiat şi finalizat într-un interval de cca 6 ore.

Culturile de celule apar ca un sistem model important pentru studiul mecanismului MCP la plante, datorită uniformităţii culturilor, accesibilităţii lor, complexităţii lor reduse. McCABE et al. (citaţi de Reape et al, 2007) au dezvoltat la Arabidopsis un model de inducere a morţii celulare prin tratament termic, în care puteau distinge celulele vii, de cele supuse necrozei, sau MCP-AL. Starea celulelor a fost urmărită cu ajutorul fluorescein-diacetat (FDA). Prezenţa fluorescenţei în celule arăta faptul că ele sunt vii, iar absenţa fenomenului indica moartea celulei. Dacă fluorescenţa lipsea şi condensarea citoplasmei era prezentă, însemna că celula a fost supusă MCP, iar în cazul că lipsea atât fluorescenţa cât şi retragerea citoplasmei, însemna că celula a murit prin necroză (fără activarea MCP). Clivarea ADN reprezenta de asemenea un marker al MCP-AL. Un stres termic moderat a determinat moartea celor mai multe celule prin MCP-AL, în timp ce la temperaturi mai ridicate celulele au murit prin necroză. Celulele de morcov supuse unui şoc termic la 550C (10 minute) nu au prezentat imediat fenomenul de fragmentare a ADN, ci după cca 3-5 ore, interval de timp necesar probabil pentru activarea nucleazelor implicate în clivarea ADN. Şocul termic la temperaturi mai mari a determinat necroza şi degradarea imediată a ADN-ului. Această metodă de a distinge între diversele categorii de moarte celulară la plante a fost folosită cu succes la celulele de morcov, Arabidopsis şi tutun. Se pare că asemănarea dintre apoptoză la animale (calea extrinsecă) şi MCP-AL la plante apare şi sub alt aspect. S-a constatat că şi în MCP-AL are loc eliberarea cyt. c din mitocondrii. Stresul termic al cotiledoanelor de castraveţi a determinat eliberarea

137

cyt. c din mitocondrii imediat (cca 1h) după şocul termic (Balc et al, citat de Reape et al., 2007). Aşa cum arată Jan et al. (2008), citând o serie de autori, eliberarea cyt. c din mitocondrii precede apariţia simptomelor MCP în celulele de A. thaliana tratate cu manoză, efect asociat şi cu activarea endonucleazelor, aşa cum a fost şi cazul celulelor de porumb infectate cu Agrobacterium sp. Mai mult, MCP-AL pare a fi asociată cu o activitate de tip caspazic, implicit în răspunsul hipersensibil al plantelor. Harpina, un elicitor proteic bacterian, care induce HR în celulele de tutun, a indus schimbări ale funcţiilor mitocondriale, (Xie et Chen, citaţi de Jan et al., 2008). Moartea celulară ce însoţeşte procesul de dezvoltare normală la plante determină, în unele cazuri, modificări morfologice celulare care sunt mai degrabă specifice MCP-CL decât autofagiei (formarea unei vacuole mari ale cărei rupere eliberează enzimele hidrolitice care degradează conţinutul celular). S-a observat, de exemplu, că în cazul celulelor tapet de la angiosperme are loc condensarea celulei şi nucleului, condensarea cromatinei la periferia membranei interne a nucleului. La floarea soarelui Bulk şi Leaver (citaţi după Reape et al., 2007) au arătat că în timpul morţii premature a celulelor din ţesuturile anterei, specifice androsterilităţii citoplasmatice, celulele şi nucleii s-au condensat, ADN-ul nuclear s-a fragmentat în unităţi oligonucleosomale, în timp ce mitocondriile s-au păstrat până târziu în procesul de moarte celulară. S-a observat de asemenea că degenerarea suspensorului la Phaseolus coccineus implică eliberarea cyt. c din mitocondrii şi activarea unor proteaze asemănătoare caspazelor. Mitocondriile au un rol major în reglarea şi integrarea semnalelor de stres şi/or MCP atât la plante cât şi la animale. Chiar dacă la plante nu s-au descoperit caspaze, sunt dovezi că şi la plante se formează pori ai permeabilităţii de tranziţie (PT) în membrana mitocondriilor, care ar explica în acest caz trecerea bruscă de la MCP la necroză. Permeabilizarea mitocondriilor în cazul unui stres moderat suportat de celulele plantelor ar putea explica eliberarea cyt. c din mitocondrii în timpul MCP, dar nu sunt dovezi certe că acest proces este activatorul direct al MCP la plante. Potrivit unor observaţii, în funcţionarea VDAC la animale şi plante poate interveni şi hexokinaza I (HK-I). Prin legarea ei la VDAC ar induce închiderea canalului mitocondrial generat de VDAC, împiedicând astfel eliberarea cyt.c din mitocondrii şi apoptoza. Eckardt (2006) consideră că este posibil ca hexokinaza asociată mitocondriilor să influenţeze potenţialul de membrană mitocondrial şi MCP prin legarea la proteina VDAC, proteină care are un rol important atât în MCP la animale cât şi la plante. În ciuda diferenţelor evidente existente între celulele animale şi vegetale, constatăm că unele fenomene ce însoţesc MCP în celulele celor două regnuri sunt asemănătoare, dovada descinderii lor dintr-un ancestral comun. Pe măsură ce vom pătrunde mai adânc tainele MCP, vom asista cu siguranţă la noi argumente privind existenţa unor mecanisme unice în lumea vie pentru realizarea anumitor procese şi funcţii. Într-un scurt capitol dedicat evoluţiei MCP, Pennell şi Lamb (1997) apreciau că procese similare MCP au fost descrise la procariote şi la eucariotele inferioare. Astfel, unele tulpini de Escherichia coli găzduiesc plasmide cu gene care declanşează proteoliza şi moartea celulară după infecţia cu bacteriofagi. Activarea căii AMP în celulele nediferenţiate de Dictyostelium discoides induce un proces ce seamănă cu MCP. Prezenţa MCP a fost evidenţiată şi la alga Volvox sau la feriga Marsilea. Originea comună a speciei Dictyostelium, algelor verzi, ferigilor, plantelor şi

138

animalelor sugerează că mecanismele MCP au fost conservate, într-un anume grad, la toate eucariotele. O dovadă moleculară este prezenţa la plante şi animale de omologi ai genei Ost2 de la drojdii (gena pentru oligosaccharyltransferaza-2). Un omolog al acestei gene de la C. elegans poate suprima MCP la o linie celulară de hamster, iar omologii genei Ost2 de la orez şi Arabidopsis pot de asemenea funcţiona ca supresori ai MCP, (Pennell şi Lamb,1997; Gadjev et al., 2008).

Alte dovezi moleculare de acest gen nu existau acum mai bine de un deceniu. În ciuda progreselor înregistrate în ultimul timp în domeniul MCP, la plante nu s-au găsit omologi înrudiţi cu caspazele, dar s-a identificat o familie de proteaze ancestrale implicate în MCP – metacaspazele, al căror substraturi naturale sunt încă insuficient cunoscute, enzime ale căror particularităţi şi funcţii le vom discuta într-un capitol separat. Recent însă (octombrie 2009), un grup de cercetători aparţinând mai multor universităţi din lume, conduşi de P. Bozhkov (www.sciencedaily.com; www.slu.se/ Bozhkov), de la Universitatea de Ştiinţe Agricole din Upsala (Suedia) au constatat că o proteină bine conservată evolutiv, TSN (Tudor Staphylococcal Nuclease) - care are funcţie anti-apoptotică, este degradată în timpul MCP de proteaze specifice: de caspaze în cazul celulelor animale şi de metacaspaze în cazul celulelor plantelor. Sundström et al. (2009) au arătat că metacaspaza mcII-Pa clivează TSN atât în MCP din timpul dezvoltării plantelor, cât şi în MCP indusă de stres. TSN umană (care este cunoscută şi ca p100 sau SND1) – un reglator multifuncţional al expresiei genice, este clivată de caspaza-3 în timpul apoptozei, clivare care inhibă activitatea ei ribonucleazică, importantă în execuţia apoptozei. Rezultatele obţinute de Sundström et al. (2009) stabilesc TSN ca fiind primul substrat biologic al metacaspazelor. Se demonstrează astfel, pentru prima dată, că o proteină (TSN) este degradată (fapt ce-i anulează funcţia anti-apoptotică, pro-supravieţuire) atât la animale cât şi la plante, de enzime asemănătoare, caspazele şi respectiv meta-caspazele. Celulele cărora le lipseşte proteina TSN, suferă frecvent MCP prematură. Ar fi această descoperire o dovadă că MCP a apărut timpuriu în evoluţie, că în ciuda divergenţei plantelor şi animalelor de la ancestorul comun - produsă acum cca 1 miliard de ani, şi a unor căi distincte MCP, plantele şi animalele au conservat un mecanism asemănător de clivare a unui substrat comun – proteina Tudor-SN. De altfel, unii autori consideră că MCP ar fi la fel de veche ca şi celula primordială (Ameisen, citat de Jan et al., 2008), MCP fiind observată şi la unele procariote şi eucariote unicelulare. Ulterior, pe parcursul evoluţiei organismelor pluricelulare, MCP ar fi fost „fin acordată” pentru a îndeplini unele roluri, cum ar fi controlul social al membrilor celulari într-un organism, (Gray, citat de Jan et al., 2008).

Potrivit afirmaţiilor lui Jones (2001), starea vacuolei pare să caracterizeze MCP în cazul răspunsului hipersensibil, finalizării diferenţierii sau senescenţei la plante. Întrucât plantele nu posedă macrofage şi neutrofile, procesarea celulelor moarte se face prin autoliză. S-a constatat că în cele trei situaţii enumerate, schimbările care se produc în vacuolă sunt dramatice. Colapsul vacuolei şi încetarea curenţilor citoplasmatici marchează autoliza în timpul diferenţierii elementelor traheale (ET). Acest colaps este reglat de celula în cauză şi nu apare în cazul necrozei celulare. „E ca

şi cum celula ar avea un fel de ac molecular care „sparge” vacuola pentru a elibera

hidrolazele sechestrate, acţionând ca o bombă sinucigaşă detonată de fluxul de

calciu”, consideră Jones. Colapsul vacuolei, urmat de degradarea cromatinei, sunt

139

markeri importanţi ai MCP în situaţiile prezentate. Procesarea celulei moarte (a „cadavrului” celular) în cele trei situaţii de MCP prezintă şi asemănări şi diferenţe. Colapsul vacuolei marchează începutul degradării celulei moarte, modul de degradare a ei depinzând de tipurile de hidrolaze din vacuolă. Astfel, în cazul elementelor traheale este autolizată citoplasma dar nu şi pereţii celulari secundari, în cazul formării aerenchimului lizigen întregul corp celular este înlăturat, iar celulele moarte în urma răspunsului hipersensibil sunt distruse (înăbuşite) de ţesuturile în expansiune. În cazul senescenţei la plante, celula în cauză manifestă toate aceste trăsături (numai că în celulele senescente apar semnale ale dezasamblării celulare înaintea colapsului vacuolei), (Jones, 2001). Profilul hidrolazelor din vacuolă diferă funcţie de modul în care va fi procesată celula moartă. De exemplu, în celulele ce vor constitui elementele traheale, auxinele şi citokininele induc sinteza de novo a nucleazelor şi proteazelor, dar nu şi a hidrolazelor pentru eliminarea pereţilor celulari; când vine vorba de formarea aerenchimului însă (indusă de etilenă) vacuola conţine şi hidrolaze pentru peretele celular (cum ar fi celulaza, de exemplu) pentru a degrada nu numai citoplasma, ci şi matrixul extracelular; în cazul răspunsului hipersensibil, semnalele provenite de la patogen induc producerea de fitoalexine, polifenoli şi chitinaze, compuşi toxici pentru patogen, care sunt eliberaţi în momentul colapsului vacuolar. Eliberarea conţinutului vacuolar marchează de fapt începerea evenimentelor celulare post-mortem.

Din cele prezentate mai sus, rezultă rolul important pe care îl joacă vacuola la plante în moartea celulară. Se ştie că vacuola reprezintă sediul factorilor care mediază liza celulară, locul de depozitare pentru diverşi metaboliţi, este implicată în reciclarea unor componenţi celulari etc. Vacuolele la plante şi lisosomii la animale au rol deosebit în autofagie, mecanism prezent la toate eucariotele, care asigură degradarea proteinelor lezate şi a substanţelor toxice, a componenţilor celulari, reciclarea nutrienţilor etc. Autofagia la plante are rol în refolosirea nutrienţilor în cazul lipsei zaharurilor şi azotului (înfometării), a senescenţei frunzei, intervine în degradarea proteinelor oxidate în timpul stresului oxidativ şi posibil chiar în înlăturarea organitelor sau proteinelor lezate în condiţii obişnuite de creştere, (Bassham, 2007). Colapsul tonoplastului duce la eliberarea proteazelor şi nucleazelor prezente în vacuolă şi la fenomenele de liză prezente în toate formele de MCP la plante. Tonoplastul se invaginează şi formează vezicule în interiorul vacuolei, apoi se produc schimbări în cromatină (condensarea ei şi fragmentarea ADN-ului). Hatsugai et al. (2004) au arătat că în cazul răspunsului hipersensibil (HR) indus prin infecţia cu VMT, o protează localizată în vacuolă – enzima de procesare vacuolară (VPE) este un mediator esenţial pentru MCP. Din cele 4 gene VPE prezente în genomul de Arabidopsis, trei (αvpe, γvpe şi δvpe) par să determine diferite tipuri de MCP la plante. În vacuole se acumulează de asemenea enzime ca nucleaza ZEN1 (de la Zinnia endonucleaza-1), care ar fi factorul major ce participă la degradarea ADN-ului nuclear asociată morţii celulare în procesul de xilogeneză.

În ciuda unor elemente comune ale morţii celulare în lumea eucariotelor, despre care am discutat la un moment dat, la plante MCP are trăsături specifice datorită peretelui celular, în special. Unicitatea unor trăsături ale MCP la plante rezultă şi din prezenţa altor structuri specifice celulei vegetale, precum cloroplastele (se pare că unele semnale ale morţii celulare pot proveni de la aceste organite) şi vacuola. În cele mai multe situaţii de MCP la plante, peretele celular se păstrează după degradarea

140

protoplastului şi reutilizarea componenţilor acestuia. În cazul răspunsului hipersensibil, MCP este însoţită de distrugerea organitelor, colapsul membranei plasmatice şi separarea ei de peretele celular – care rămâne deformat după scurgerea conţinutului protoplastului în apoplast (Gadjev et al., 2008).

10.1. MCP în cursul creşterii vegetative a plantelor MCP însoţeşte creşterea şi dezvoltarea plantelor din momentul germinării

seminţelor şi până la maturarea şi senescenţa plantelor. Eliminarea programată a celulelor are rol esenţial în sculptarea (modelarea) corpului plantei, a formei şi arhitecturii frunzelor, întocmai cum apoptoza la animale asigură formarea degetelor prin înlăturarea ţesutului interdigital la vertebrate. Dacă la multe specii, forma penată sau palmat-sectată a frunzelor se realizează prin stimularea sau inhibarea creşterii în timpul morfogenezei foliare timpurii, formele complexe ale frunzelor unor specii sunt rodul morţii celulare localizate în cursul stadiilor timpurii din dezvoltarea frunzelor, (Gadjev et al., 2008). Moartea câtorva celule în timpul dezvoltării primordiilor foliare la specii de Monstera asigură formarea acelor găuri din frunzele mature ale acestor specii; odată cu creşterea frunzelor se lărgesc şi găurile formate, dând în final aspectul perforat al limbului foliar. Asemănător stau lucrurile şi cu frunzele speciei Aponogeton

madagascariensis. Germinarea seminţelor unor specii de plante este însoţită de MCP.

Endospermul la cereale este constituit dintr-un strat interior ce conţine amidon şi de unul exterior ce conţine aleuronă. Celulele endospermului amidonos mor la maturarea seminţelor, păstrându-şi însă conţinutul şi mumificându-se, pe când celulele stratului de aleuronă rămân vii. În momentul germinării seminţelor embrionul produce acid giberelic, fapt ce determină celulele de aleuronă să elibereze alfa-amilaza, enzimă care hidrolizează amidonul (din stratul amidonos), procurând astfel energia necesară embrionului. Celulele stratului aleuronic sunt supuse MCP după finalizarea germinării. În stratul aleuronic de grâu, MCP este precedată de creşterea nivelului de calciu citosolic. Moartea celulară în acest caz implică se pare vacuolele autofagice. Întrucât tratamentul cu acid okadaic a prevenit moartea celulelor din stratul aleuronic al endospermului de grâu, s-a tras concluzia că în acest proces este implicată activitatea protein-fosfatazei, (Beers, 1997). Se pare că acidul giberelic şi ROS au un rol major în controlul şi execuţia MCP a stratului aleuronic, (Gadjev et al., 2008).

MCP este cea care contribuie şi la diferenţierea vaselor lemnoase (a traheidelor) la plante, compuse dintr-o serie de celule moarte, goale. La plante, unele tipuri celulare devin funcţionale după moartea celulară, iar funcţionarea lor este facilitată de păstrarea peretelui celular (care poate suporta o serie de schimbări morfologice, de structură şi chimice, în concordanţă cu funcţia pe care o îndeplinesc), cum este şi cazul elementelor traheale (ET), (Krishnamurthy et al., 2000; Cao et al., 2003).

Dezvoltarea ET şi a fibrelor de sclereide se încheie cu formarea unui perete celular îngroşat (de regulă lignificat). După formarea pereţilor secundari, ET pierd conţinutul lor celular, se leagă cap la cap sub forma unor tuburi lungi, continue, formând un ţesut ce conduce apa în plante - xilemul. Studii ultrastructurale în timpul diferenţierii traheidelor au arătat că celule autonome sunt supuse degradării rapide şi progresive a organitelor (nucleu, vacuole, plastide, mitocondrii, reticul endoplasmatic), iar la maturitate pierd şi membrana plasmatică, precum şi părţi din pereţii celulari.

141

Colapsul vacuolei determină degradarea rapidă a nucleului acestor celule, ca şi a nucleoidului din cloroplaste, iar curenţii citoplasmatici din celulă încetează imediat, (Palavan-Unsal et al., 2005). Are loc autoliza celulei, citoplasma este complet hidrolizată, astfel încât rezultă un corp celular scobit (o cavitate) delimitat de peretele celular secundar. Din legarea cap la cap a acestor cavităţi rezultă vasele (ţesutul) de conducere a apei în plantă (xilemul). În figura 10.1 este redată schematic dezvoltarea ET ca urmare a MCP. Lignificarea secundară a pereţilor celulari are loc înainte de ruperea ireversibilă a tonoplastului.

Fig.10.1 - Formarea elementelor traheale prin MCP (după Obara şi Fukuda, 2003 – modificată de Palavan-Unsal et. al., 2005)

S-a constatat că înaintea iniţierii MCP în celulele ce formează traheidele este

activată calea de biosinteză a brassinosteroizilor, compuşi care induc atât MCP, cât şi îngroşarea secundară a pereţilor celulari, (Yamamoto et al., 2001). Groover (www.bio.unc.edu/faculty/jones/lab/pcd) arată că elementele traheale comit suicidul în urma declanşării unui flux masiv de ioni prin membrana plasmatică, proces care duce la colapsul vacuolei. Autorul consideră că triggerul primar al acestui flux ionic ar putea fi o serin-protează activată odată cu sinteza precursorilor peretelui celular secundar. Nu orice tratament (nociv) care determină moartea celulară provoacă şi colapsul vacuolei. Bunăoară, tratamentele cu azidă de sodiu (o toxină ce inhibă respiraţia celulară) au indus modificări dramatice în celule, inclusiv oprirea curenţilor citoplasmatici, dar nu au produs şi colapsul vacuolei. Faptul că moartea provocată cu diverşi agenţi toxici nu a dus la prăbuşirea vacuolei, sau la degradarea ADN-ului nuclear, demonstrează că formarea elementelor traheale are la bază MCP.

Diferenţierea elementelor traheale poate fi studiată pe modelul (sistemul) Zinnia. În acest sistem, celule de mezofil izolate de la frunze tinere de Z. elegans pot fi cultivate in vitro şi supuse unui proces de trans-diferenţiere în ET prin intervenţii în compoziţia mediului de cultură. Agenţii de modelare implicaţi în diferenţierea xilemului par afi auxinele, în special IAA, (Cao et al., 2003). S-a constatat că tratamentul cu actinomicină D sau cu cicloheximidă a celulelor (care diferenţiază) de

142

Zinnia, blochează moartea celulară, ceea ce sugerează că MCP în formarea ET reclamă sinteza de proteine, probabil a nucleazelor şi proteazelor necesare dezasamblării celulare, (Pennell şi Lamb, 1997). În cursul MCP a ET de Zinnia s-a evidenţiat, aşa cum arătam anterior, o activitate crescută a nucleazelor, şase din ele fiind induse specific în timpul diferenţierii ET în culturile de celule la această specie. Dintre ele ZEN1 – o nuclează de tip S1 dependentă-Zn2+, apare ca DN-aza cheie în degradarea ADN nuclear în cursul MCP a elementelor traheale.

Deşi în procesul de diferenţiere a ET prin MCP s-a observat o condensare a cromatinei în zona membranei nucleare, lipsesc totuşi fenomenele de micşorare a celulei şi nucleului, de fragmentare a nucleului şi de formare a corpilor apoptotici, aşa cum se întâmplă în apoptoză la animale. Nu este totodată clar dacă ruperea tonoplastului şi eliberarea enzimelor hidrolitice reprezintă cauza primară sau un efect secundar al MCP. Nu s-au descoperit gene sau proteine care controlează iniţierea autolizei în timpul formării traheidelor, dar s-a observat o creştere evidentă a activităţii enzimelor hidrolitice în faza tardivă de diferenţiere a lor. Degradarea rapidă a nucleului după ruperea vacuolei denotă o activitate nucleazică ridicată. S-a observat de asemenea creşterea activităţii cistein- şi serin-proteazelor (de 145 kDa şi 60 kDa). O dovadă a intervenţiei acestor enzime în diferenţierea ET este aceea că inhibitorii cistein-proteazelor inhibă şi procesul de formare a traheidelor, dacă sunt aplicaţi înaintea îngroşării pereţilor celulari, (Beers, 1997). În cercetări efectuate la Eucommia

ulmoides, Cao et al., (2003) aratau că deşi nu au găsit vreo dovadă morfologică că MCP în formarea xilemului secundar ar avea loc printr-un mecanism apoptotic, procesul a manifestat totuşi unele trăsături specifice apoptozei, cum ar fi: activarea unui mecanism de degradare a ADN (formarea de ladderi ADN), clivarea unor proteaze de tip caspază (CLP) şi a PARP. Autorii consideră că, deşi nu se cunoaşte exact rolul acestor proteaze în diferenţierea xilemului secundar la această specie, nu este exclus ca ele să aibe un rol în reglarea sau execuţia MCP.

Procesul de autoliză însoţeşte şi formarea elementelor ciuruite (EC) ale floemului. De data aceasta asistăm la o autoliză selectivă, care asigură degradarea nucleului, tonoplastului, ribozomilor, dictiosomilor şi microtubulilor, EC mature păstrându-şi însă protoplastul. Se conservă de asemenea reticulul endoplasmatic (RE), iar cloroplastele şi mitocondriile sunt adeseori modificate. În timpul diferenţierii EC la Ephedra, Mimosa şi la grâu s-a observat degenerarea picnotică a nucleului. La grâu morfologia nucleului şi picnoza cromatinei din EC seamănă cu cele din nucleii apoptotici, inclusiv lobarea şi fragmentarea lor. Învelişul nucleului în dezmembrare este strâns legat de cisternele RE. Este posibil ca RE să furnizeze fosfataza acidă implicată în autoliză. Lipsesc informaţiile privind prezenţa altor sisteme proteolitice în timpul diferenţierii EC. În investigaţii pe culturi de ţesuturi la specia Streptanthus

tortuosus, care au urmărit evidenţierea unor proteine în EC diferenţiate, s-a identificat prezenţa β-amilazei, (Wang, citat de Beers, 1997).

Celulele din vârful rădăcinii, care provin din celule iniţiale ale meristemului deplasate la periferie de celulele nou formate, protejează meristemul apical în timpul germinării seminţei şi creşterii plăntuţei. Aceste celule periferice mor după câteva zile, iar această moarte este parte a dezvoltării normale a plantei şi nu consecinţa frecării de sol în timpul penetrării ei. Celulele care mor din vârful rădăcinii se micşorează şi capătă profile diferite. Deşi unele din trăsăturile lor morfologice fac să se creadă că

143

sunt supuse MCP, lipsesc însă datele de ordin biochimic care să confirme o astfel de ipoteză, (Pennell şi Lamb, 1997).

Fig. 10.2 - Exemple de MCP în timpul dezvoltării plantelor şi ca răspuns la fluctuaţiile mediului (după Gadjev et al., 2008)

MCP are loc în embriogeneză (eliminarea suspensorului), degenerarea tapetumului, auto-incompatibilitatea polenului, senescenţa organelor (petale, sepale, frunze), dantelarea frunzelor, MC a sinergidelor şi antipodelor la gametofitul femel, diferenţierea ET, unele tipuri de maturare a trichomilor, MC a stratului aleuronic la monocotiledonate în timpul germinării seminţelor, formarea aerenchimului în lipsa oxigenului (anoxie), MC a celulelor din vârful rădăcinii, MC în interacţiunile alelolopatice plantă-plantă şi în atacul plantelor de către patogeni necrotrofici sau care declanşează răspunsul hipersensibil (HR)

144

Pe parcursul creşterii vegetative a plantelor şi alte structuri sau procese sunt însoţite sau provin prin MCP. O schemă care sugerează intervenţia MCP în timpul dezvoltării vegetative şi reproductive a plantelor este redată în figura 10.2.

Celulele sclerenchimului sunt moarte, iar pereţii celulari sunt îngroşaţi pentru a îndeplini funcţie mecanică. Scoarţa este formată din celule specifice cu perete celular suberificat, pentru a proteja ţesuturile interne de deshidratare. Protoplastul acestor celule este eliminat. Şi creşterea tulpinii este însoţită de moartea celulară, diviziunea celulelor din cambiu determinând moartea celulelor în stratul de scoarţă, (Palavan-Unsal, 2005). Prin moartea unor celule sub-epidermale de la suprafaţa fructelor de citrice se formează cavităţi în care se depozitează uleiurile esenţiale. Mecanismul prin care are loc diferenţierea canalelor secretoare şi a cavităţilor în care se strâng uleiurile volatile, întâlnite la numeroase specii de plante, se numeşte lizigenie.

Dezvoltarea trichomilor la plante urmează trecerea (comutarea) de la mitoză la endo-reduplicare, expansiune celulară şi apoi, după diferenţierea lor completă, devin structuri moarte la multe specii de plante. Moartea celulară este precedată de creşterea bruscă a cantităţii de apă oxigenată (Hulskamp, citat de Gadjev et al., 2008).

Fig.10.3 - MCP în culturi embriogene în suspensie de morcov (după Pennell şi Lamb, 1997)

A.Micrografie electronică a unei celule vii; B. Micrografie elctronică a unei celule moarte; membrana plasmatică (pm) este separată de peretele celular (cw) şi protoplastul este micşorat şi condensat; bara = 2,5 µm

S-a observat că plantele knock out pentru semialdehid-dehidrogenaza succinică, enzimă cheie în calea metabolică a γ-aminobutiratului, au nivele ridicate de peroxid de hidrogen în trichomii lor. Aceste plante sunt mult mai sensibile la stresul termic şi cu UV şi trichomii lor mor rapid în condiţiile unei intensităţi ridicate de radiaţii UV. Un exemplu extrem îl reprezintă cactuşii, la care tulpina devine organ fotosintetic, iar frunzele se transformă în spini. Mulţi peri, ţepi, spini de pe suprafaţa frunzelor sau tulpinii cactuşilor mor la maturitate, ei exercitând rol protector.

MCP a fost observată şi în culturile embriogene în suspensie la unele specii de plante. Celulele totipotente se divid asimetric şi formează perechi de celule, din care una se dezvoltă într-un embrion somatic, în timp ce în cealaltă are loc sistarea sintezei ADN şi moartea ei (Nomura şi Komamine, citaţi de Pennell şi Lamb, 1997). În

145

celulele embriogene în suspensie de morcov care mor observaţiile la microscopul electronic au arătat că citoplasma lor este condensată şi micşorată, (fig.10.3) comparativ cu celulele normale.

Observaţii de acest gen au efectuat şi Filonova et al., (2000), care au încercat să afle dacă MCP este implicată în eliminarea unor celule în cursul embriogenezei somatice la Picea abies. Autorii au constatat că embriogeneza somatică la această specie are loc în două faze: în prima fază are loc proliferarea maselor celulare pro-embriogene, iar în cea de a doua dezvoltarea embrionilor din aceste mase – fază în care ei trec prin aceleaşi stadii ca şi embrionii zigotici. Autorii au evidenţiat două unde succesive ale MCP care au loc în tranziţia de la masele pro-embrionice la embrionii somatici: prima undă determină degradarea maselor pro-embrionice după formarea embrionilor somatici, iar a doua asigură eliminarea celulele embrio-suspensor în timpul embriogenezei timpurii. Autorii folosesc termenul de „suspensor” sau „embryo-suspensor” pentru a marca structura ce se formează în cursul embriogenezei zigotice şi somatice a gimnospermelor, care în embriologia clasică este considerat suspensor secundar.

10.2. MCP în cursul dezvoltării reproductive a plantelor

MCP însoţeşte şi o serie de procese specifice dezvoltării reproductive a plantelor, cum sunt determinarea sexului, formarea gameţilor, fertilizarea şi embriogeneza. MCP are loc în diverse ţesuturi şi organe reproductive şi uneori chiar unele astfel de organe sunt supuse dispariţiei, (Beers, 1997; Gadjev et al, 2008).

În stadiile timpurii de dezvoltare a florii la plantele unisexuate, floarea conţine atât primordii pentru organele sexuale mascule cât şi pentru cele femele. Ulterior, fie organele mascule, fie cele femele sunt eliminate prin MCP. Avortarea staminelor sau primordiilor de carpele este un tip de MCP care asigură formarea florilor unisexuate. La porumb de exemplu, plantă monoică, inflorescenţa masculă este separată spaţial de inflorescenţa femelă. Florile tinere din panicul conţin atât primordii ale staminelor, cât şi ale gineceului, acestea din urmă încetându-şi însă dezvoltarea, (are loc o vacuolizare crescută a celulelor şi pierderea organitelor, iar ruperea tonoplastului pare să fie evenimentul final în procesul de avortare a organelor sexuale). Avortarea primordiilor de stamine din florile femele începe din apexul primordiului şi se propagă bazipetal. La Asparagus, dezvoltarea vasculară este incompletă în organele sexuale femele ale florilor mascule şi în organele sexuale mascule ale florilor femele (nu se ştie dacă lipsa dezvoltării vasculare este cauza MCP, sau dacă nu reprezintă un efect secundar al MCP). Descoperirea unor gene implicate în avortul organelor sexuale femele, cum este Ts2 la porumb şi Gsf1 la Tripsacum încep să facă lumină şi în acest caz. La mutanta de porumb ts2, de exemplu, apar flori femele în panicul, ceea ce demonstrează că gena ts2 este necesară pentru moartea organelor femele din panicul. Produsul codificat de genele ts2 şi gsf1 este asemănător hidroxisteroid-dehidrogenazelor şi ar cataliza conversia unui precursor de tip GA într-un promotor al MCP, (care ar avea fie efect citotoxic direct, fie ar acţiona indirect – prin reglarea activităţii unor gene încă necunoscute), (DeLong et. al., citat de Beers, 1997).

MCP intervine şi în ruperea (dehiscenţa) anterelor, care asigură eliberarea polenului din sacii polinici. Desfacerea anterei are loc la nivelul stomiumului şi ea se produce prin degenerarea ţesutului aflat între stomium şi ţesutul conectiv al sacilor

146

polinici. În realizarea acestui proces sunt implicate mai multe tipuri de celule, fiind asociat cu creşterea activităţii unei cistein-proteaze. La anterele de tomate, alături de moartea grupului de celule de sub stomium, are loc şi degenerarea protoplastului celulelor tapet, a celulelor epidermice adiacente stomiumului, endoteciului şi ţesutului conectiv. Unele cercetări au arătat că în MCP ce însoţeşte deschiderea anterelor sunt implicate şi o serie de enzime hidrolitice. Chiar înaintea degenerării unor tipuri celulare specifice din antere sunt activate atât tiol-proteaze cât şi conjugate-ubiquitin, ceea ce sugerează că în cursul morţii celulare de la nivelul staminelor sunt antrenate şi anumite sisteme proteolitice, (Beers, 1997).

După eliberarea din antere grăunciorii de polen în contact cu stigmatul se hidratează, germinează şi formează un tub polinic, care traversează stilul îndreptându-se spre ovar. Stigmatul şi stilul au şi rolul de a distinge între polenul adecvat şi inadecvat pentru fertilizare, de a preveni creşterea polenului străin şi uneori chiar a polenului propriu la unele specii de plante. Auto-incompatibilitatea la unele specii din familia Solanaceae, Rosaceae şi Scrophulariceae este controlată genetic de locusul-S polimorfic. La Solanaceae, locusul-S prezintă o serie alelică ce codifică ribonucleaze stilare (specifice stilului), denumite S-RNaze, enzime implicate în manifestarea auto-incompatibilităţii. S-au propus două modele în care ar acţiona acestea: fie aceste S-RNaze sunt excluse din tubul polinic, iar produsul locusului S din polen recunoaşte S-RNazele din matrixul extracelular al ţesutului stilar şi permite pătrunderea tubului polinic incompatibil; fie S-RNazele sunt prezente în tuburile polinice, dar sunt inactivate sau sechestrate de către substrat în cazul tuburilor polinice compatibile (produsul locusului S la tuburile polinice incompatibile ar preveni inactivarea sau sechestrarea S-RNazei corespunzătoare), (Beers, 1997). Conform unor informaţii prezentate de Gadjev et al. (2008), la Papaver fenomenul de auto-incompatibilitate se asociază cu activarea de către Ca2+ a cascadei de semnalizare, care determină eliberarea în citosol a cyt. c din mitocondrii şi o activitate enzimatică asmănătoare caspazei-3. Procesul ar fi mediat de activitatea cascadei de semnalizare MAPK.

Dezvoltarea gametofitului femel se produce în ţesuturile diploide ale ovulului, fie ca o structură închisă în ovar (cazul plantelor cu flori), fie ca una deschisă, neinclusă în carpele (ca la gimnosperme). Megasporocitul din ovulele imature este supus meiozei, rezultând patru celule haploide (megaspori), din care trei degenerează (se pare că prin MCP), iar una supravieţuieşte şi prin diviziuni mitotice succesive dă naştere sacului embrionar. La cele mai multe plante cu flori sacul embrionar este format din şapte celule, din care una prezintă doi nuclei. Cum se ştie, în zona micropilului, trei dintre celule diferenţiază în celula ou şi două sinergide, în zona şalazei alte trei celule devin celulele antipode, iar în zona centrală sacul embrionar conţine o celulă mare binucleată. Sinergidele produc semnale care asigură creşterea tubului polinic, sau eventuala lui degenerare. Moartea sinergidelor are loc la unele plante după finalizarea mega-gametogenezei, iar la altele după polenizare. Tubul polinic pătrunde prin micropil, prin una din sinergide (care apoi degenerează), moment în care creşterea tubului polinic încetează şi eliberează cele două celule (nuclei) spermatice (cei doi gameţi masculi), din care una se uneşte cu celula ou şi formează zigotul, iar cealaltă cu celula centrală binucleată a sacului embrionar, formând endospermul triploid. Unele investigaţii arată că înaintea şi în timpul degenerării sinergidelor se produc schimbări în distribuţia calciului. La tutun, de exemplu, în

147

stadiul final de maturare a sacului embrionar are loc acumularea de calciu în ţesutul nucelar ce înconjoară canalul micropilar. Influxul de calciu ar fi un efector al morţii sinergidelor, pe via activării proteazelor, endonucleazelor etc. Celulele antipode la unele plante (cum ar fi Arabidopsis) mor chiar înaintea fertilizării, în timp ce la altele (cum ar fi porumbul) se multiplică în peste 100 de celule în sacul embrionar matur (Yadegari şi Drews, citaţi după Gadjev et al., 2008).

În stadiile tardive de dezvoltare a gametofitului mascul, degenerează şi celulele tapet, pentru a permite eliberarea polenului din antere. Se consideră că procesul are loc prin MCP, deoarece este însoţit de pierderea integrităţii membranei mitocondriale, vacuolizare, umflături (înmuguriri) ale nucleului, fragmentarea ADN-ului, (Rogers, 2006).

Zigotul format după fertilizare se divide, formând două celule, una bazală şi una apicală, moment considerat esenţial în morfogeneza plantelor, pentru că determină modelul polar de dezvoltare a plantei. Din celula apicală se va forma embrionul, în timp ce, din celula bazală, prin câteva diviziuni, va fi generat suspensorul, care are rolul de a dirija factorii de creştere spre embrion, formaţiune care în cele din urmă va fi supus MCP prin autoliză. Autoliza celulelor suspensorului la Phaseolus şi Tropaeolum, începe din partea lui bazală şi progresează spre embrion. În timpul autolizei creşte activitatea fosfatazei acide şi β-glucozidazei în celulele suspensorului, iar produşii rezultaţi din autoliză sunt folosiţi de către embrion, (NAGL, citat de Beers, 1997). S-a observat că prin distrugerea embrionului sau prin oprirea creşterii lui, are loc o creştere anormală a suspensorului, de unde rezultă că MCP a celulelor suspensorului este promovată probabil de semnale provenite din embrionul în dezvoltare.

10.3. MCP în interacţiunea dintre plante şi mediul abiotic şi biotic

10.3.1. MCP ca răspuns la stresul abiotic Expunerea plantelor la diverşi factori de stres cum ar fi hipoxia, deficitul hidric,

radiaţiile UV, salinitatea, temperaturile extreme, poluanţii, toxinele, metalele grele etc, poate induce un stres oxidativ şi poate fi urmată de MCP. Plantele şi-au dezvoltat mecanisme pentru a contracara sau tolera condiţiile de mediu adverse până la o anumită limită care, depăşită fiind, poate antrena moartea unei părţi a plantei sau moartea ei în întregime. Moartea celulară la plante în condiţiile stresului abiotic poate fi însă şi un proces reglat, menit să le asigura supravieţuirea. Spre exemplu, adaptarea plantelor la secetă sau iluminare intensă este însoţită frecvent de acoperirea suprafeţei lor cu un strat protector de peri unicelulari morţi, care provin prin MCP, (Palavan-Unsal et al., 2005). În rădăcinile de porumb şi floarea soarelui, dar şi în tulpinile a numeroase plante ierboase, fenomenul de hipoxie determină formarea aerenchimului (care asigură difuzia oxigenului din ţesuturile normal oxigenate în cele hipoxice). Aerenchimul este un ţesut ce conţine spaţii aerifere şi este frecvent întâlnit în rădăcinile plantelor din zonele umede. Stresul hipoxic este deci factorul implicat în formarea lui, proces realizat prin MCP. Peretele celular şi protoplastul sunt îndepartate din celulele rădăcinilor mature, formându-se în acest fel canale prin care aerul poate trece din tulpină în rădăcină. Aerenchimul poate fi de două tipuri: lizigen şi schizogen. În cazul aerenchimului lizigen - întâlnit la orez, grâu, orz, porumb etc, mor celule formate anterior în ţesut pentru a crea spaţii prin care circulă aerul, (Evans, citat de

148

Palavan-Unsal et al., 2005). Spaţiile aerifere formate în aerenchimul schizogen nu sunt consecinţa MCP, ci a creşterii diferenţiate a celulelor adiacente. În condiţii de hipoxie în ţesut se acumulează etilenă. Etilena reprezintă semnalul de transducţie pentru calea ce duce la formarea aerenchimului. De fapt existenţa acestei căi sugerează că moartea celulară ce însoţeşte hipoxia este una de tip MCP. Formarea aerenchimului în condiţii de hipoxie la Arabidopsis, a fost asociată cu producerea de etilenă şi apă oxigenată, (Muhlenbock et al., citaţi de Gadjev et al., 2008). La unele specii, formarea aerenchimului este indusă de etilena produsă endogen. S-a constatat că la porumb, primele semne ale MCP în celulele tratate cu etilenă sau în cele supuse hipoxiei, sunt: invaginarea membranei plasmatice, o citoplasmă mai densă la electroni şi retragerea membranei plasmatice de peretele celular. În timpul formării aerenchimului în rădăcinile de porumb, s-a observat că primele simptome ale instalării MCP sunt fosforilarea proteinelor, influxul de Ca2+, distrugerea curenţilor citoplasmatici, ruperea tonoplastului şi eliberarea enzimelor litice din vacuolă. Aceste procese sunt urmate de condensarea cromatinei, fragmentarea ADN-ului nuclear, degradarea organitelor celulare şi a peretelui celular (Gunawardena et al., citaţi de Gadjev et al., 2008)

Într-o sinteză dedicată MCP la plante, Gadjev et al. (2008), citând o serie de autori care au abordat cercetări de acest gen, arătau că un poluant important şi un component al smogului fotochimic din zonele urbane poate fi ozonul (O3), gaz care poate pătrunde în apoplastul plantelor, determinând formarea de ROS şi în special de apă oxigenată. Moartea celulară indusă de ozon este însoţită de intensificarea fluxului de ioni prin membrane, micşorarea nucleului, condensarea cromatinei, fragmentarea ADN-ului nuclear, inducţia genelor legate de patogeneză şi consolidarea peretelui celular.

Metalele grele pot de asemenea iniţia moartea celulară prin intermediul H2O2. Cadmiul s-a dovedit capabil să inducă în celulele de tutun un adevărat şoc oxidativ, exprimat mai ales în apoplast şi mitocondrii. Are loc peroxidarea membranelor şi producerea de radicali superoxid în mitocondrii, procese care duc la moartea celulară. Ca răspuns la stresul indus de cadmiu sau cupru sunt activate kinaze MAPK. Şi alte metale grele, cum ar fi aluminiul şi mercurul, pot perturba homeostazia redox şi induce moartea celulară ROS-dependentă la plante. MCP poate fi activată şi de lumina foarte intensă sau de expunerea la doze mari de radiaţii UV. Expunerea în exces la UV-C determină o explozie de ROS, urmată de pierderea potenţialului de membrană a mitocondriilor şi de moartea celulară. He et al. (citaţi de Gadjev et al, 2008) arată că în moartea celulară mediată de UV-C şi indusă de ROS are loc explozia (burst) radicalilor peroxid şi superoxid, urmată de activarea metacaspazei-8.

La unele specii de plante, şocul de căldură poate determina o explozie de H2O2 în celule, care antrenează eliberarea cyt. c din mitocondrii, activarea proteazelor (cu acţiune asemănătoare caspazei-3) şi a proteasomului şi în final MCP. S-a constatat că inhibitorii specifici caspazei-3, precum şi catalaza şi SOD, enzime care înlătură ROS, pot bloca activităţile de tip caspază-3 şi inhiba MCP, (Vacca et al., citaţi după Gadjev et al., 2008). Şi expunerea la temperaturi scăzute poate induce moartea celulară la plante. În cazul celulelor BY-2 de tutun apar semne tipice ale MCP, cum ar fi condensarea cromatinei şi desfacerea ADN, (DNA laddering).

Investigaţii care au avut ca scop evidenţierea MC ca urmare a stresului hidric provocat de deficitul de apă în rădăcinile de Arabidopsis au arătat că deficitul hidric

149

înalt determină MC în celulele meristemului apical şi rădăcinile primare. Observaţiile la microscopul electronic de transmisie au evidenţiat că celulele supuse morţii au avut trăsăturile morfologice specifice morţii celulare autofagice, constând în creşterea dimensiunilor vacuolei, degradarea organitelor celulare, colapsul tonoplastului şi al membranei plasmatice. Deficitul hidric sever ar induce deci MCP de tip autofagic. S-a decelat totodată o acumulare semnificativă de ROS în vârfurile rădăcinilor, creşterea expresiei Bax inhibitor-1 (AtBI1), (Duan et al., 2010). La protoplaştii de orez supuşi şocului termic, s-a observat că expresia în exces a proteinei mitocondriale 70 a şocului termic (mtHsp70) a inhibat MCP indusă de căldură, precum şi cantitatea de H2O2, fapt reflectat într-o viabilitate celulară mai mare, reducerea ADN-laddering şi a condensării cromatinei. Expresia în exces a mtHsp70 a contribuit la menţinerea unui potenţial mitocondrial de membrană (∆Ψm) mai înalt decât în celulele martor şi a inhibat parţial eliberarea cyt. c din mitocondrii şi a prevenit semnificativ generarea ROS. Se apreciază că mtHsp70 poate inhiba MCP în protoplaştii de orez supuşi şocului termic prin menţinerea ∆Ψm mitocondrial şi inhibarea generării de ROS, (Qi et al., 2009).

Tabel nr. 10.1 - Modificări de ultrastructură celulară induse de factori de stres abiotic

(Evans, 2004) Factorul de stres Modificările ultrastructurale

Hipoxia-lizigenă Condensarea cromatinei şi fragmentarea ADN Formarea aerenchimului Organite înconjurate de membrane

Invaginarea membranei plasmatice şi degradarea tonoplastului Degradarea peretelui celular

Radiaţia luminoasă Fragmentarea oligonucleosomală a ADN Migrarea conţinutului nuclear spre periferia celulei

Stresul mecanic Material TUNEL-pozitiv în jurul marginii nucleului Fragmentarea oligonucleosomală a ADN în nucleu şi cloroplaste

Stresul provocat de frig Umflarea cloroplastelor, deformarea şi umflarea tilacoidelor, tilacoizi granari nesuprapuşi şi liza cloroplastelor, umflarea nucleului, fragmentarea cromatinei, umflarea RE şi cisternelor Golgi, condensarea citoplasmei

Stresul salin poate de asemenea provoca MCP la unele specii de plante. MCP

indusă de stresul salin în celulele din vârful rădăcinii de orez şi la protoplaştii de tutun a fost însoţită de perturbarea echilibrului ionilor de Ca2+, K+ şi H+, de creşterea nivelului de peroxid de hidrogen (Huh et al, citaţi de Gadjev et al., 2008). În tabelul 10.1 sunt prezentate unele din modificările ultrastructurale în cazul MCP indusă de condiţii de stress, aşa cum au fost ele rezumate de Evans (2004).

Despre speciile reactive de oxigen (ROS) şi despre unele implicaţii ale lor în apoptoză am discutat şi în prima parte a acestei lucrări. În organismele aerobe, deci şi în plante, ROS sunt produse în procese metabolice normale, sunt înalt reactive şi pot provoca leziuni structurilor şi moleculelor biologice. Plantele şi-au dezvoltat un sistem de protecţie împotriva ROS, care constă într-o serie de molecule şi enzime antioxidante ce controlează producerea în exces a acestora. În cadrul acestui sistem antioxidant, ROS poate avea rolul de molecule de semnalizare în reglarea unor procese de creştere, dezvoltare, adaptare la stres, moarte celulară. Răspunsul biologic la schimbarea nivelului ROS depinde de tipul acestora, de intensitatea semnalului, de

150

locul de producere a ROS, de interacţiunea ROS cu alţi factori etc, (Gadjev et al., 2008). ROS şi RNS (speciile reactive de nitrogen) sunt produse în diverse procese celulare în toate compartimentele celulei, (fig. 10.4). Cloroplastele reprezintă principalul organit de generare ROS.

Fig. 10.4 - Producerea şi soarta metabolică a ROS (H2O2, O2●-, 1O2) în diferite

compartimente celulare (după Gadjev et al., 2008) ROS-specii reactive de oxigen; PSI-fotosistem I; PSII-fotosistem II; ETC-lanţul de transport electronic; SOD-superoxid dismutayă; CAT-catalază; AsA/GSH-acid ascorbic/glutation Dintre speciile reactive de oxigen, cele mai importante sunt: radicalii superoxid

(O2●-) şi hidroxil (HO●), apa oxigenată (H2O2) şi oxigenul singlet (1O2). Apa oxigenată

pare a fi cea mai importantă dintre acestea, datorită mobilităţii ei, unei relative stabilităţi şi a duratei medii de viaţă (1 ms), mult mai mari decât a celorlalte ROS enumerate. H2O2 este generată în reacţii mediate de enzime ca: glicolat-oxidază, în timpul fotorespiraţiei; de acil-CoA-oxidază în timpul β-oxidării; de oxalat-oxidază, care transformă oxalaţii şi oxigenul la H2O2 şi CO2; de NADPH-oxidază, care transferă electronii de la NADPH la oxigenul molecular, cu producerea de radicali superoxid, convertiţi ulterior la H2O2, (Desikan et al., citaţi de Iakimova et al., 2005). Apa oxigenată este produsă în special în cloroplaste, peroxizomi şi glioxizomi, dar şi în citosol, nucleu, mitocondrii, apoplast, sistemul de membrane celulare interne, (Gechev et al., 2006). Peroxidul de hidrogen poate migra din locul de producere în zonele învecinate şi chiar în celulele din jur, unde poate inactiva unele enzime prin oxidarea grupărilor lor tiolice. Apa oxigenată este degradată de catalaze atunci când concentraţia ei este mare şi de peroxidaze când nivelul ei este mai scăzut. Radicalul hidroxil are capacitatea de a reacţiona cu oricare biomoleculă pe care o întâlneşte în

151

cale, iar radicalul superoxid poate inactiva enzime ce conţin Fe-S (forma lui protonică HO2

● poate traversa membranele biologice şi iniţia oxidarea lipidelor). Radicalii superoxid sunt degradaţi doar de superoxid-dismutaze.

Efectele distructive ale radicalului superoxid şi apei oxigenate sunt şi mai importante când interacţionează, în prezenţa ionilor metalici, şi formează radicalul hidroxil (HO●), care este înalt reactiv (iar celulele nu posedă enzime de neutralizare a lui, ci doar mecanisme de a preveni formarea lui). Radicalii superoxid pot reacţiona însă nu numai cu peroxidul de hidrogen şi forma radicali hidroxil, ci şi cu oxidul de azot (NO●), situaţie în care formează peroxinitriţi (ONOO-), care pot fi rapid convertiţi în acid peroxinitric (un agent oxidant extrem de puternic). NO● poate controla procesele de creştere şi dezvoltare într-o manieră complexă, prin modularea activităţii unor protein-kinaze dependente de Ca2+. El poate să interacţioneze cu H2O2 şi cu O2

●- şi să regleze moartea celulară în timpul răspunsului hipersensibil la plante. Se consideră de altfel că ROS ar fi mediatorii cheie în canalizarea NO● pe căile metabolice ce duc la moartea celulară, (Gechev et al., 2004).

Oxigenul singlet poate să-şi transfere energia la alte molecule şi să le producă leziuni, cum ar fi peroxidarea acizilor graşi polinesaturaţi. În funcţie de nivelul de acumulare endogenă, oxigenul singlet poate exercita efecte citotoxice sau de semnalizare. În tabelul 10.2 prezentăm unele din proprietăţile biochimice ale speciilor reactive de oxigen (ROS) şi ale speciilor reactive de nitrogen (RNS), precum şi unii compuşi care le inactivează.

Tabel nr. 10.2 - Proprietăţile ROS/RNS şi ale inactivanţilor (scavengers) lor

(după Gadjev et al., 2008)

Tipul de ROS Durata medie de viaţă şi mobilitatea

Modul de acţiune Principalii scavengers

Radicalul superoxid (O2

●-)

1µs, 30 nm Reacţionează cu compuşi ce conţin duble legături, clusteri Fe-S ai proteinelor; reacţionează cu NO● pentru a forma ONOO-

Superoxid dismutaze (SOD)

Peroxidul de hidrogen (H2O2)

1 ms, 1 µm Oxidează proteine (resturi de cisteină); reacţionează cu O2

●- într-o reacţie Fe-catalizată, pentru a forma HO●

Catalaze, diverse peroxidaze, peroxiredoxine, flavonoide

Radicalul hidroxil (HO●)

1 ns, 1 nm Extrem de reactiv cu proteinele, ADN-ul, lipidele şi alte biomolecule

Flavonoide, prevenirea formării HO● prin sechestrarea Fe

Oxigenul singlet (1O2)

1µs, 30 nm Oxidează direct proteine, acizi graşi polinesaturaţi, ADN

Carotenoide, α-tocoferol

Oxidul de azot (NO●)

Limitată datorită reactivităţii

Nitrozilează proteine, via S-nitrozo-tioli

Hemoglobine, glutation

Peroxinitritul (ONOO-)

Nedeterminată Foarte reactiv cu lipidele, ADN-ul şi proteinele

În mod normal, conţinutul ROS în ţesuturile sănătoase ale plantelor, se menţine

la un anumit nivel prin sistemele de producere şi de neutralizare a lor. Acest echilibru

152

este necesar pentru îndeplinirea funcţiei lor de semnalizare celulară, dar şi pentru prevenirea toxicităţii lor. În condiţii de stres însă nivelul ROS poate creşte fie trecător, fie persistent. Plantele prezintă atât enzime ce produc ROS, dar au dezvoltat şi sisteme de antioxidanţi (care constau în enzime şi compuşi cu efect antioxidant), care asigură homeostazia ROS în compartimentele celulare, astfel încât nivelul acestora să fie conform cu nevoile de moment ale celulei. Antioxidanţii ne-enzimatici care contribuie la menţinerea echilibrului ROS în celulă includ acidul ascorbic, glutationul, tocoferolul şi carotenoizii, ca fiind compuşii mai abundenţi, solubili în apă sau lipide, (Gadjev et al., 2008). Prezenţa acestor sisteme antioxidant (enzimatice sau non-enzimatice) asigură înlăturarea ROS chiar la locul formării lor în celulă. Dacă nivelul ROS în unele compartimente celulare devine la un moment dat foarte ridicat, datorită condiţiilor de stres sau unei activităţi reduse a enzimelor antioxidante, apa oxigenată şi alţi compuşi oxidanţi în exces sunt dirijaţi spre vacuole, organite bogate în flavonoide (compuşi cu efect antioxidant puternic), dar şi în acid ascorbic, glutation şi peroxidaze (localizate pe faţa internă a tonoplastului), care pot contribui la neutralizarea lor.

Surprinzător sau nu, apa oxigenată este cel mai important semnal celular ROS. Ea intervine în desfăşurarea normală a unor procese biologice din plante, participând la reglarea unor funcţii importante, cum ar fi repausul seminal, creşterea şi alungirea tubului polinic sau a perilor radiculari, răspunsul la stresul provocat de factori diverşi, abiotici şi biotici (temperaturi extreme, uscăciune, UV, lumină puternică, poluanţi, patogeni etc). Ea poate însă induce şi MCP, şi sub acest aspect este implicată în realizarea multora din evenimentele discutate anterior, unele dintre ele fiind ilustrate în figura 10.2. MCP la plante poate fi iniţiată şi de oxigenul singlet sau de radicalii superoxid. Peroxidarea lipidelor iniţiată de radicalul HO● procură o sursă de lipide oxidate care ele-însele, sau în combinaţie cu alte specii reactive de oxigen, pot induce MCP la plante. Rezultatul final al semnalizării celulare asigurată prin ROS depinde, aşa cum am arătat anterior, de numeroşi factori, printre care figurează: tipul de ROS, locul producerii lor, intensitatea semnalului produs de aceştia, stadiul de dezvoltare a plantei, interacţiunea ROS cu alte molecule de semnalizare (fitohormoni, mesageri lipidici, NO) etc, (Gadjev et al., 2008). Creşterea nivelului H2O2 în celulă determină perturbarea fluxului ionilor de sodiu, potasiu şi calciu. Variaţiile induse Ca2+ de factori de stres pot antrena schimbări în activitatea unor proteine care interacţionează cu acesta, cum ar fi calmodulina sau protein-kinazele dependente de calciu, inclusiv MAPK-kinazele. Cascada MAPK- kinazelor mediază MCP declanşată de patogeni sau de apa oxigenată provenită din cloroplaste. Aceste kinaze (în special MEKK1) sunt reglate de condiţii diverse de stress şi de H2O2 într-o manieră dependentă de proteasom. În cercetări efectuate la A. thaliana s-a constatat că un component important în reţeaua de semnalizare H2O2 este serin-treonin kinaza Oxi1 (oxidative

signal-induced-1), enzimă care poate fi indusă de factori de stres şi de către peroxidul de hidrogen. Mutanţii Oxi1 au o creştere anormală a perilor radiculari şi o sensibilitate ridicată la infecţiile cu patogeni, fapt ce subliniază încă odată importanţa ROS în dezvoltarea plantelor şi răspunsul lor la stres (Rentel et al, citaţi de Gadjev et al., 2008). Un alt component al reţelei de semnalizare amintite este şi nucleotid-difosfat-kinaza2 (NDK2), enzimă care de asemenea poate fi indusă de H2O2, a cărei exprimare în exces la A. thaliana reduce acumularea de apă oxigenată în celule şi creşte toleranţa la frig, salinitate şi stresul oxidativ. S-a observat că H2O2 poate activa la A. thaliana

153

şi fosfolipaza D, iar acidul fosfatidic eliberat poate inhiba moartea celulară indusă de H2O2, plantele care au perturbări ale activităţii acestei enzime fiind incapabile să elibereze acidul fosfatidic şi în consecinţă devin mai susceptibile la moartea celulară H2O2-indusă.

Răspunsul plantelor la stres şi moartea celulară H2O2-indusă pot fi influenţate şi de fitohormoni, H2O2 având interacţiuni complexe cu unii din aceştia în reglarea MCP Etilena şi acidul salicilic (SA) sunt regulatori pozitivi ale unor forme de moarte celulară H2O2-indusă, inclusiv în MCP care asigură formarea aerenchimului lizigen sau în timpul răspunsului hipersensibil la plante, (Muhlenbock et al, 2007; Wang et al, 2002). ROS şi etilena sunt regulatori pozitivi ai senescenţei frunzelor, iar acidul jasmonic este un regulator negativ al acestui proces fiziologic la plante.

Stresul provocat RE la plantulele de Arabidopsis thaliana prin tratarea lor cu tunicamicină (TM) a evidenţiat rolul de modulator al Bax Inhibitor-1 (AtBI1) în MCP indusă de stresul RE. Tratamentul TM a determinat o inhibare puternică a creşterii rădăcinii şi reducerea supravieţuirii, însoţite de indicii certe ale MCP, cum ar fi: acumularea de H2O2, condensarea cromatinei şi fragmentarea oligonucleosomală a ADN-ului nuclear. Aceste efecte au fost diminuate prin co-tratamentul cu unele substanţe chaperon. S-a constatat că expresia AtBI1 a crescut dramatic înaintea iniţierii MC indusă de TM. Expresia în exces a AtBI1 a redus evident sensibilitatea plantelor de Arabidopsis la TM, ceea ce evidenţiază rolul major al AtBI1 (ca factor înalt conservat) în cursul stresului provocat RE la plante, (Watanabe et al., 2008).

10.3.2. MCP ca răspuns la agenţii patogeni În momentul când o plantă este infectată de un agent patogen, ea dezvoltă un

răspuns de apărare pentru a inhiba creşterea sau dezvoltarea acestuia. Pentru a limita creşterea/dezvoltarea bolii trebuie întrunite două condiţii: patogenul să posede gena de avirulenţă – avr, iar planta gazdă să prezinte în genom o genă pentru rezistenţă – R (care asigură recunoaşterea avr a patogenului). Fenomenul a fost denumit rezistenţă gene-for-gene („genă-pentru-genă”), (Greenberg, 1997). Mecanismul prin care sunt recunoscute funcţiile genei avr nu sunt prea bine înţelese. S-a constatat că în unele situaţii produşii acestei gene sunt proteine (secretate fie în apoplast, fie direct în celulele plantelor), în alte situaţii sunt c-glicozil-lipide etc. Interesant, dar nu surprinzător, este faptul că genele R au o structură asemănătoare, chiar dacă sunt specifice unor agenţi patogeni diferiţi ca mecanism de patogenitate (de la virusurile intracelulare, la bacteriile extracelulare şi fungii intra- şi extra-celulari). Unele gene R au fost clonate şi s-a găsit că ele prezintă repetiţii bogate în leucină. Alte gene de rezistenţă la plante codifică molecule semnal de transducţie (cum ar fi Pto-kinasele şi Pti-kinasele la tomate). În timpul răspunsului de rezistenţă este indusă sinteza de novo a multor transcripturi-ARNm şi proteine (numite proteine legate de apărare). Aceste proteine implicate în apărare şi fitoalexinele sunt considerate a fi importante în limitarea creşterii patogenului. Pentru a fi sintetizate în timpul răspunsului de rezistenţă, unele proteine de acest gen reclamă prezenţa unei molecule semnal de acid salicilic (cum e cazul răspunsului de rezistenţă al tutunului faţă de VMT).

În cursul răspunsului de rezistenţă se pot produce şi modificări ale pereţilor celulari: legarea în cruciş a unor proteine prin punţi de di-tirozină (proces ce ar depinde de prezenţa H2O2), sau a unor compuşi fenolici din pereţii celulari (care devin

154

lignificaţi) etc, modificări care protejează celula de a fi digerată de patogeni. Printre modificările celulare semnalate în cursul răspunsului de rezistenţă se numără şi acumularea trecătoare de Ca++ în celule, activarea schimbului de H+/K+. În cele din urmă, cele mai multe răspunsuri de rezistenţă duc la moartea rapidă (în decurs de ore) a celulelor infectate şi limitarea extinderii infecţiei la celulele vecine, moarte celulară denumită răspuns hipersensibil (HR). Plantele care au suportat, în una sau mai multe frunze, un răspuns de rezistenţă ce include şi HR, dezvoltă un soi de imunitate şi la alţi patogeni ai frunzelor, la care nu au fost expuse anterior, denumită rezistenţă sistemică

dobândită (care pentru inducere necesită semnalul acid salicilic; SA), rezistenţă care se manifestă la organe situate la distanţă, (Greenberg, 1997). Acest tip de rezistenţă este însoţit de activarea unor gene legate de patogeneză, de sinteza de metaboliţi secundari cu funcţii protectoare, de consolidarea pereţilor celulari (Dangl şi Jones, 2001). Cascada de schimbări morfo-biochimice celulare produse în cursul răspunsului de rezistenţă a plantelor este, se pare, rezultatul stimulului iniţial indus de patogen şi nu a unui schimb permanent de informaţii între patogen şi gazdă. MCP provocată în urma atacului unui agent patogen trebuie restricţionată la locul infecţiei, pentru ca HR să joace rol de protecţie. În urmă cu câţiva ani, Liu et. al., (2005) arătau că produsul genei BECLIN1 (ortolog al genei autofagiei ATG6/PS30/beclin1, de la drojdii şi mamifere) restricţionează moartea celulară programată de tip HR la locul infecţiei. La plantele deficiente în această genă iniţierea HR-MCP are loc, dar nu se limitează la locul infecţiei ci se extinde şi la ţesuturile sănătoase adiacente şi chiar pe frunzele situate distal de frunza infectată (are loc MCP nerestricţionată). În limitarea HR-MCP par a fi implicate şi alte gene ortoloage legate de autofagie, cum ar fi P13KIVPS34, ATG3 şi ATG7, încât calea de autofagie, conservată evolutiv, ar regla negativ MCP, jucând un rol esenţial în răspunsul imun înnăscut.

În urma atacului unui agent patogen nevirulent se produce un HR localizat, care determină colapsul rapid al ţesutului de la locul infecţiei şi din imediata lui vecinătate, cu formarea unei leziuni uscate, clar delimitată de ţesutul sănătos din jur, (Pennell şi Lamb, 1997; Gadjev et al., 2008). Spre deosebire de această reacţie, infecţia cu un agent patogen virulent, care nu declanşează răspunsul hipersensibil (HR), duce la contractarea bolii. Faptul că celulele moarte în timpul HR se colorează, ne permite să observăm că multe din ele sunt situate în apropierea nervurilor foliare, sugerând că celulele din teaca fasciculară care înconjoară nervurile sunt mai sensibile la semnalele inductoare ale morţii decât celulele din mezofil. În acest fel este împiedicată pătrunderea patogenului în sistemul vascular şi răspândirea lui sistemică în plantă. De fapt, MCP datorată unor patogeni, este indusă de o serie de toxine specifice acestora, cum ar fi: harpinele în cazul bacteriilor Pseudomonas syringae şi Erwinia amylovora, toxine fungice ca victorina şi xilanaza de la Trichoderma viridae, toxina AAL de la Alternaria alternata, fumonizina B1 de la Fusarium moniliforme, proteine virale precum cea specifică VMT etc, (Iakimova et al., 2005).

Existenţa unor mutanţi la Arabidopsis, porumb şi tomate la care moartea celulară specifică HR apare spontan, fără intervenţia unui agent patogen, demonstrează că fenomenul de moarte celulară asociată HR este unul determinat (controlat) genetic (Lamb şi Dixon, 1997; Overmayer et al, citaţi de Gadjev et al., 2008). Unii din aceşti mutanţi manifestă leziuni locale asemănătoare celor prezente în HR, în timp ce la alţii se produce o „propagare” masivă a morţii celulare, fapt ce sugerează că la baza acestor

155

evenimente stau mecanisme genetice diferite. MCP promovată în cazul răspunsului hipersensibil are unele asemănări cu apoptoza: începe cu fluxuri rapide de ioni prin membrana plasmatică şi eliberarea unor cantităţi mari de ROS (radicali de superoxid şi H2O2) care determină creşterea nivelului de Ca++ în citosol, activarea cascadei de protein-kinaze, reprogramarea transcripţională şi moartea celulară rapidă, (GADJEV et al., 2008). Potrivit informaţiilor prezentate de Iakimova et al. (2005), principalii factori implicaţi în activarea HR, sunt: ROS, oxidul nitric (NO), pompele de calciu şi protoni, protein-kinazele mitogen-activate (MAPK), acidul salicilic şi etilena. Se pare că ROS reprezintă inductorul general al MCP la plante.

În cursul HR are loc clivarea ADN-ului, reorganizarea citoscheletului şi dezorganizarea organitelor celulare. Etapele critice în răspunsul hipersensibil ar fi, după Palavan-Unsal et al. (2005), următoarele: - interacţiunea genei avr cu genele de rezistenţă; - convergenţa dintre semnalele genelor R şi calea HR; - activarea NADPH-oxidazei, care induce MCP.

În afară de ROS, cum arătam anterior, moartea celulară asociată HR este modulată şi de unii fitohormoni. S-a constatat că acidul salicilic (SA) poate stimula sau inhiba MCP în unele sisteme HR. Controlul de tip feed-back între nivelul ROS şi SA, precum şi echilibrul dintre nivelul intracelular de NO şi H2O2 au de asemenea un rol important în moartea celulară asociată-HR. Conform datelor furnizate de Delaney et al. (1994), acidul salicilic (SA) este o moleculă de semnalizare critică în căile de rezistenţă la boli, implicit a MCP, în rezistenţa locală şi sistemică, conţinutul acestuia în zona lezată de patogen crescând de peste 100 de ori. S-a constatat că prin administrarea din afară a SA sunt activate o serie de gene de apărare, fitoalexine, este indusă generarea de ROS şi MCP, (Shirasu et al., citat de Palavan-Unsal et al., 2005. Mutanţii care au sistemul de percepţie şi de semnalizare SA perturbat, prezintă cel mai adesea şi o rezistenţă alterată la boli. Efectele SA ar fi legate de activarea unor MAP-kinaze, sau a unor promotori ai genelor de apărare. Alături de SA şi alţi fitohormoni ca etilena, acidul jasmonic şi acidul abscisic ar modula semnalele de transducţie HR.

Iakimova et al., (2005) considerau că una din reacţiile timpurii după recunoaşterea patogenului la plante este deschiderea canalelor ionice şi formarea de H2O2 şi superoxizi. Peroxidul de hidrogen determină, cum s-a prezentat anterior, legarea în cruciş a proteinelor structurale din pereţii celulari şi s-ar constitui într-un fel de declanşator local al MCP în celulele atacate de patogeni. Autorii au constatat că MCP indusă de camptotecină (CPT, un alcaloid din Camptoteca acuminata, inhibitor al topoizomerazei-1, folosit ca medicament împotriva cancerului) în culturile de celule la tomate a fost însoţită de eliberarea ROS în mediul nutritiv, precum şi faptul că MCP indusă CPT a fost inhibată de catalază şi de o serie de antioxidanţi, fapt ce sugerează că H2O2 este responsabilă de inducţia şi execuţia MCP. La semnalul de transducţie a MCP la plante un rol important pare să aibă şi etilena. Intervenţia etilenei în acest proces a fost evaluată pe mutanţi-NR de tomate care nu se maturează niciodată (never-

ripe, NR), mutanţi insensibili la etilenă, la care infecţia s-a soldat cu o moarte celulară mult mai scăzută. În cercetările lor pe suspensii celulare de tomate, Iakimova et al (2005) au arătat că etilena potenţează explozia oxidativă indusă de camptotecină, aplicarea ei simultană cu CPT intensificând evident MCP, un efect probabil al creşterii producţiei de H2O2.

156

Referitor la reglarea şi execuţia morţii celulare asociate HR, Greenberg (1997) arăta că HR este însoţit de unele evenimente, despre care am discutat deja, ca: explozia oxidativă, lezarea membranei, fluxurile ionice, activarea endonucleazelor, clivarea ADN şi exprimarea unor gene. Este posibil ca unele din aceste evenimente să fie legate doar de răspunsul de rezistenţă al plantelor. Eliberarea masivă de ROS (superoxizi şi H2O2) pare să determine declanşarea HR. Levine et al. (1994) considerau că peroxidul de hidrogen, în cazul stresului oxidativ, orchestrează răspunsul hipersensibil al plantelor la boli. Autorii au constatat că dacă, în timpul HR produs de bacterii nevirulente, era inhibată activitatea catalazei, fapt ce determina intensificarea producerii de H2O2, avea loc o creştere masivă a morţii celulare. În schimb, blocarea exploziei oxidative, prin inhibarea NADPH-oxidazei sau a activităţii kinazelor, a condus la o reducere de cca două ori a morţii celulare indusă de bacteria avirulentă Pseudomonas. Cu toate acestea, Levine et al. (1994) sunt de părere că, probabil, nu este suficientă doar producerea de H2O2 pentru toate celulele care mor în timpul HR. Este posibil ca în cazul unor concentraţii înalte de H2O2 să nu fie necesare semnale suplimentare ale morţii celulare. Şi superoxizii pot avea rolul lor în inducerea morţii celulare asociate HR. S-a observat, de exemplu, că infiltrarea de superoxid-dismutază (SOD) în frunzele de tutun infectate cu VMT a inhibat dezvoltarea HR, (Doke şi Ohashi, citaţi de Greenberg, 1997).

Alte posibile semnale pentru inducerea HR ar putea fi fluxul şi schimbul de ioni. Astfel, în primele faze ale răspunsului de rezistenţă are loc o scurgere de K+. Fluxurile de Ca2+ au rolul lor în execuţia HR. Prin blocarea canalelor ionice pentru Ca2+, s-a redus moartea celulară în suspensiile de celule de soia, ca răspuns la bacterii nevirulente sau la H2O2, iar prin tratamentul acestor suspensii cu ionofori de Ca2+ s-a indus MCP. Întrucât prezenţa Ca2+ a fost necesară şi pentru activarea endonucleazelor asociată HR, se consideră că este posibil ca în procesul de MCP clivarea ADN-ului să fie un pas necesar. Cum răspunsul de rezistenţă determină şi schimbări în proprietăţile membranei, se consideră că unele semnale de reglare HR ar putea fi de natură lipidică, produşi ai activităţii lipoxigenazei sau fosfolipazei D, (Croft et al., Young et al., citaţi de Greenberg, 1997). Implicarea canalelor ionice în semnalizarea morţii celulare la plante pare să fie o certitudine. De altfel, într-o sinteză publicată în 2005, Iakimova et al. arătau că HR se caracterizează printr-o serie de perturbări ionice, cum ar fi influxul de ioni (de Ca2+ şi K+) şi efluxul de ioni de Cl- prin membrana plasmatică, schimbări ale pH şi depolarizarea membranei. La3+, care este un inhibitor al canalelor de calciu, a inhibat moartea celulară indusă de camptotecină în suspensiile celulare de tomate, ceea ce constituie o dovadă că ionul de Ca2+ este implicat în MCP indusă de CPT.

Deşi în reglarea HR intervin fosforilarea şi defosforilarea, activarea unor proteaze, în multe situaţii nu sunt cunoscute moleculele care participă la acţiunile legate de acest proces. Greenberg considera, în urmă cu mai bine de un deceniu, că multe întrebări referitoare la reglarea şi execuţia HR rămân deschise: dacă H2O2 şi O2

- sunt semnale obligatorii în inducerea HR, în cazul că există şi altele, care sunt acelea?; dacă aceste semnale ar putea fi peroxizii lipidici?; care este rolul clivării ADN în acest proces?; dacă există proteaze specifice HR?; care sunt ţintele fosforilate, defosforilate sau proteolizate? etc. Deşi, între timp, s-a progresat în înţelegerea evenimentelor legate de MCP în HR, suntem departe de a avea răspunsuri adecvate la toate întrebările de mai sus.

157

La Arabidopsis, HR determină condensarea şi micşorarea celulei, care în final arată cumva asemănător corpilor apoptotici. În timpul răspunsului hipersensibil intervin enzimele de procesare vacuolară (VPE), proteaze de tip caspazic (caspase-

like), implicate în execuţia morţii celulare. Aceste enzime se află în celule sub formă de precursor inactiv şi după procesare sunt activate şi transferate în vacuolă. Conform informaţiilor oferite de Gadjev et al. (2008), s-a descoperit că procese ce seamănă cu autofagia la animale par să existe şi la plante, şi ar fi implicate în reglarea negativă a morţii celulare asociată-HR (prin împiedicarea promovării semnalului de moarte celulară şi inhibarea amplificării extinderii leziunilor la ţesutul sănătos). Modelul propus pentru explicarea acestui fenomen consideră că în urma recunoaşterii patogenului, genele asociate autofagiei ar fi reglate în amonte şi ar conduce la formarea de autofagosomi în celulele sănătoase adiacente celor supuse MCP-HR, care ar sechestra proteinele VPE şi le-ar degrada după fuziunea cu vacuola, împiedicând astfel dezorganizarea ei şi implicit promovarea MCP.

10.4. Metacaspazele şi paracaspazele Existenţa unor asemănări între evenimentele care se petrec în timpul MCP la

animale şi la plante, a încurajat eforturile de cercetare şi de identificare a unor eventuali omologi ai caspazelor („actorii” majori ai apoptozei în regnul animal) şi în regnul plantelor, enzime care să îndeplinească un rol asemănător. În acest scop s-au folosit substraturi sintetice potrivite pentru cele trei tipuri de caspaze (care procesează citokinele, care iniţiază apoptoza şi care execută apoptoza), caspaze ce preferă în poziţia P4 a substratului, după caz, fie un reziduu hidrofob, fie unul alifatic, fie un rest de acid aspartic. Gene pentru caspaze la plante nu s-au identificat, iar secvenţierea genomului la Arabidopsis şi apoi la orez a confirmat absenţa la plante a unor secvenţe ortoloage caspazelor, (Bonneau et al., 2008). Din acest motiv, activităţile enzimatice la plante, ce seamănă cu unele din cele efectuate de caspaze la animale, au fost denumite activităţi de tip-caspazic, sau asemănătoare caspazelor (caspase-like; CL). În 1998, Del Pozo şi Lam (citaţi de Bonneau et al., 2008) raportau pentru prima dată existenţa unor activităţi de tip caspazic (CL) la plante. La sfârşitul secolului trecut, Uren et al. (2000) identificau prin analiza in silico a genomului unor eucariote două noi familii de enzime - metacaspazele şi paracaspazele, rude îndepărtate ale caspazelor.

Paracaspazele sunt implicate în dezvoltarea limfomului MALT, dar nu şi în execuţia morţii celulare. Ele au în structura lor un prodomeniu (ce conţine un domeniu DD) şi unul sau două domenii Ig şi au fost identificate atât la eucariotele cărora le sunt proprii caspazele, cât şi la cele lipsite de caspaze.

Metacaspazele sunt specifice doar eucariotelor lipsite de caspaze şi execută activităţi CL, fiind implicate în MC, deşi nu pot cliva substraturile caspazelor. Paracaspazele şi metacaspazele conţin o diadă catalitică His/Cys conservată şi o structură secundară CL (caspase-like). Pe baza similitudinilor de secvenţă şi de structură, metacaspazele au fost clasificate în două categorii (tipuri): Tipul I - au în molecula lor o extensie N-terminală ce aminteşte de pro-domeniul caspazelor inflamatorii şi iniţiatoare; Tipul II – la care lipseşte acest pro-domeniu, dar prezintă o regiune linker între subunităţile mari şi mici, (după Vercammen et al., 2007).

S-a constatat, cum deja am amintit, că paracaspazele şi caspazele sunt prezente la eucariote doar în regnul Animalia, în timp ce metacaspazele au fost identificate în

158

regnurile Protozoa, Fungi, Plantae şi Chromista. În acelaşi timp meta-/para-caspazele au fost identificate şi la arhebacteii (Archaea) şi eubacterii (Eubacteria). Proteaze de tipul meta-/paracaspază au fost întâlnite la toate grupele de bacterii, inclusiv la cianobacterii, ancestralii cloroplastelor la plante. În privinţa filogeniei lor, originea caspazelor şi paracaspazelor este încă neclară. Metacaspazele ar proveni din transferul pe orizontală al genelor între endosimbionţii mitocondriali, α-protobacterii şi eucariotele timpurii (Koonin şi Aravind, citaţi de Vercammen et al., 2007). Este de asemenea interesant că tipul I de metacaspaze este prezent la Protozoa, Fungi şi Chromista, la plante fiind prezente ambele tipuri de metacaspaze. O altă ipoteză privitoare la originea acestor familii de enzime sugerează că paracaspazele, caspazele şi metacaspazele de tipul I ar proveni dintr-un prim transfer al genelor pe orizontală între endosimbionţi mitocondriali şi celule gazdă eucariote, iar metacasapazele de tipul II ar deriva dintr-un al doilea transfer pe orizontală al genelor în cursul instituirii plastidelor din cianobacteriile simbiotice. Un element surprinzător în această dispută filogenetică îl reprezintă paracaspaza de Dictyostelium discoideum (specie aparţinând regnului Protozoa), la care lipsesc domeniile Ig şi domeniul morţii din pro-domeniu – tipice pentru paracaspazele animale, aspecte care pun sub semnul întrebării apartenenţa acestei proteaze la grupul paracaspazelor, (Vercammen, 2007).

La Arabidopsis thaliana s-au descoperit 3 gene pentru metacaspaze de tipul I [notate astfel: AtMC1 (prescurtare de la A. thaliana metacaspase 1) - AtMC3] şi 6 gene pentru metcaspaze de tipul II (notate AtMC4 – AtMC9); notarea acestor gene poate fi întâlnită şi sub forma AtMCP1a-1c pentru metacaspazele de tip I şi AtMCP2a-2f pentru metcaspazele de tip II, (Sanmartin et al., 2005). S-a constatat că prin producerea în exces de metacaspaze de tipul II la E. coli, are loc autoprocesarea lor şi etalarea unei activităţi proteolitice Cys-dependentă a substraturilor sintetice P1-Arg. AtMC9 ar cliva, chiar dacă eficienţa este scăzută, şi substraturi P1-Lys. În cazul caspazelor, buzunarul S1 bazic - format din resturile Arg179, Gln283 şi Arg341 (conform numerotării acestor reziduuri la caspaza-1), se leagă optim la P1-Asp acid din substraturile lor. Metacaspazele au în structura lor un buzunar S1 înalt acid, care determină o specificitate bazică pentru arginină şi lizină în poziţia P1, în timp ce caspazele au specificitate de substrat pentru acidul aspartic în P1, (Meslin et al., 2011). Alinierea secvenţelor omoloage ale metacaspazelor/paracaspazelor cu cele ale caspazelor a arătat că Gln283 este înlocuită cu Asp, iar Arg341 este înlocuită cu Asp sau Glu, atât la para- cât şi la metacaspaze, iar Arg179 a caspazelor se aliniază la Leu. Resturile de aminoacizi care formează buzunarul S1 sunt astfel poziţionate încât îi conferă acestuia un caracter puternic acid şi sunt înalt conservate în toate secvenţele cunoscute ale para- şi meta-caspazelor, (Vercammen, 2007). Cys-proteazele AtMCP2d şi AtMCP2f nu au activitate caspazică in vitro, dar clivează în schimb substraturi după reziduurile P1 Arg/Lys. Proteaza AtMC9 prezintă un Cys primar (Cys147) necesar procesării autocatalitice şi activării AtMC9 şi un Cys catalitic secundar (Cys29), de care ar depinde activitatea proteolitică, înlocuirea acestui reziduu cu Ala reducând activitatea proteazică cu 99%. S-a constatat că la Picea abies metacaspaza de tip II, mcII-Pa, este necesară pentru activitatea de tip caspază în celulele supuse MCP în cursul embriogenezei somatice (Suarez et al., 2004), mcII-Pa având probabil rolul de a activa MCP, fapt esenţial în dezvoltarea embrionilor. La Populus, Courtois-Moreau (2008) a identificat două gene pentru metacaspaze, PttMC1omoloagă cu gena AtMC9

159

de Arabidopsis, implicată doar în procesul de dezvoltare a vaselor de xilem şi PttMC2 implicată atât în dezvoltarea vaselor cât şi a fibrelor lemnoase.

Aravind şi Koonin (citaţi de Bonneau et al., 2008) considerau în 2002 că patru ar fi argumentele care sugerează implicarea metacaspazelor în MCP la plante: a) absenţa la plante a unor omologi mai înrudiţi cu caspazele; b) originea lor comună cu a caspazelor; c) proliferarea genelor care codifică metacaspazele în genomul plantelor, asemănător cu ceea ce se întâmplă cu caspazele în genomul animalelor; d) fuziunea tipului I de metacaspaze cu un domeniu Zn-finger prezent şi la proteina LSD1* (*proteină ce monitorizează un semnal superoxid-dependent şi funcţionează ca regulator negativ al morţii celulare la plante) un regulator al răspunsului hipersensibil la plante.

Descoperirea metacaspazelor a ridicat problema dacă nu cumva ele execută activităţi CL (caspase-like) la plante, dacă nu sunt implicate în fenomenul de moarte celulară la fungi, protozoare şi plante. Citând o serie de autori, Bonneau et al. (2008) arătau că s-au produs metacaspaze recombinant la Arabidopsis, observându-se că acestea au preferat în poziţia P1 a substratului in vitro aminoacidul Arg, că o metacaspază recombinant de la pin prezenta un clivaj preferat in vitro pentru EGR (early growth response factor-1), că metacaspaza-9 recombinant de Arabidopsis a preferat substratul sintetic VRPR etc. Ei bine, aceste metacaspaze recombinant nu sunt inhibate de inhibitorii caspazelor şi nu clivează substraturi specifice caspazelor.

Unele studii efectuate la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae) au arătat că producţia în exces a metacaspazei YCA1 a indus procesarea ei autocatalitică, celulele de drojdii fiind mai sesnsibile la agenţii externi şi la îmbătrânirea legată de stresul oxidativ, ceea ce s-a reflectat şi într-o clonogeneză scăzută. Tulpina de drojdii ∆yca1, la care gena YCA1 a fost distrusă (inactivată), prezenta o sensibilitate de 3 ori mai scăzută la H2O2, iar un procent de cca 5% din celule au evitat MC legată de îmbătrânire, (Madeo et al., 2002). Nu este clar dacă aceste observaţii denotă implicarea directă a YCA1 în MC la drojdii, sau dacă desensibilizarea nu a fost rodul unor efecte indirecte. Faptul că la drojdii s-a raportat MC independentă-YCA1 şi activităţi CL independente-YCA1 pune sub semnul îndoielii implicarea meta-caspazelor în MC la această specie, (Vercammen et al., 2007). Într-o lucrare recentă însă, Carmona-Gutierrez et al. (2010) considerau că YCA1 este implicată în MC indusă de stresul oxidativ, că exprimarea ei în exces a indus moartea celulară însoţită de markeri apoptotici, iar deleţia YCA1 a protejat celulele de drojdii de apoptoza produsă de ROS sau de îmbătrânire, argumente care i-au determinat pe autori să conchidă că YCA1, asemănător caspazelor, este implicată în MCP.

Watanabe şi Lam (2005) au studiat expresia inductibilă a AtMCP1b şi AtMCP2b de Arabidopsis în cursul stresului oxidativ sau a procesului de îmbătrânire, utilizând tulpini de drojdii de tip sălbatic şi tulpini cu gena YCA1 inactivată (∆yca1) şi au observat că expresia acestor gene a promovat semnificativ MC de tip apoptoză la drojdii (indiferent de tipul lor), comparativ cu martorul. Dacă celulele erau pre-tratate cu inhibitorul de caspază N-benziloxicarbonil-Val-Ala-Asp-fmk (fluoro-metil-cetonă), fenotipul indus de expresia celor două gene AtMCP a fost inhibat, rezultate care i-au determinat pe autori să sugereze că cele două metacaspaze de la Arabidopsis sunt înrudite funcţional cu Yca1p de drojdii, (au activităţi CL). Autorii au constatat însă că extractele de bacterii şi de drojdii care conţin AtMCP1b, AtMCP2b sau Yca1p nu pot cliva substraturile caspazelor, şi de aici concluzia că probabil exprimarea

160

metacaspazelor ar activa proteazele din aval cu acţiune de tip caspază, necesare în activarea morţii celulare la drojdii în condiţii de stres oxidativ. Watanabe şi Lam (2005) sugerează că metacaspazele la plante ar exercita funcţii similare.

La tomate s-a observat că în timpul infecţiei cu patogenul necrotrofic Botrytis

cinerea are loc o expresie crescută a metacaspazei de tip II (LeMCA1), fapt ce ar sugera un posibil rol al acesteia în moartea celulară (Hoeberichts et al., citaţi de Jan et al., 2008). La concluzii asemănătoare au ajuns şi Bozhkov et al. (2004) care au studiat activitatea proteolitică în cursul embriogenezei somatice in vitro la Picea abies şi au observat o creştere a activităţii de tip VEID-ază (echivalentă cu cea a caspazei-6 umane), concomitent cu moartea celulară masivă. Celulele suspensorului embrionar supuse MC, prezentau o activitate enzimatică ridicată doar asupra substratului sintetic fluorogen al caspazei-6, IEDT-AMC* (Val-Glu-Ile-Asp-AMC*; AMC*= 7-amido-4-metil-cumarină), iar tratamentul cu inhibitorul sintetic VEID-FMK* (Val-Glu-Ile-Asp-FMK*; *FMK = fluoro-metil-cetonă) a inhibat diferenţierea suspensorului embrionar şi moartea ulterioară a celulelor acestuia. Autorii au constatat apoi că mcII-Pa, metacaspaza specifică pentru P. abies, are specificitate de Arg şi nu de Asp. Prin inactivarea genei pentru această metacaspază a avut loc deci blocarea diferenţierii embrionare şi anularea morţii celulelor suspensorului (Suarez et al., 2004), fapt interpretat de Vercammen et al. (2007) ca fiind mai degrabă dovada că mcII-Pa ar fi implicată în diferenţierea suspensorului (ar regla reorganizarea actinei în cursul acestui proces), decât în moartea lui celulară.

Potrivit informaţiilor furnizate de Sanmartin et al., (2005), infecţia cu tulpini compatibile şi incompatibile de Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) a indus la A.

thaliana expresia metacaspazei AtMCP1b, dar mai ales a AtMCP1c. Totodată, infecţia cu Phytophtora infestans sau tratamentele cu NPP1 (un peptid PAMP – pathogen-associated molecular pattern) de la Phytophtora a indus expresia AtMCP1b, -1c şi -2e. Faptul că aceste gene sunt induse de PAMP specifice la diferiţi patogeni i-au determinat pe autori să considere că ele sunt parte a sistemului imun la plante care, în anumite situaţii, include şi MCP. S-a observat de asemenea că genele AtMCP-2a, -2c şi -2d se exprimă la nivel mai ridicat în rădăcini decât în organele aeriene (ceea ce le-ar putea conferi rol diferit în aceste organe), că AtMCP2a este activată în rădăcini în condiţii care pot induce moartea celulară (salinitate, uscăciune, stres genotoxic), că AtMCP2f se exprimă în organele florale care îmbătrânesc şi în culturile de celule senescente (având probabil rol şi în MCP). Sunt observaţii care în opinia autorilor ar fi argumente pentru admiterea rolului metacaspazelor în MCP pe parcursul dezvoltării plantelor sau în condiţii de stres.

Într-o lucrare recentă (Coll et al. – 2010, citaţi de Meslin et al., 2011) se precizează că două dintre metacaspazele de tip I de la A. thaliana reglează în mod diferenţiat moartea celulară dependentă de superoxizi, AtMC1 fiind o protează CL pro-moarte, iar AtMC2 având funcţie pro-supravieţuire.

În timp ce caspazele sunt în general localizate în citoplasmă, metacaspazele de tipul I se consideră că ar putea fi localizate în mitocondrii şi cloroplaste, iar metacaspazele de tipul II ar avea ca locaţie citosolul, (Sanmartin et al., 2005).

Arătam la începutul capitolului că metacaspazele sunt enzime specifice organismelor din celelalte regnuri decât regnul Animalia. Pentru că nu intenţionăm să intrăm în detaliile acestui subiect la alte organisme decât plantele, vom prezenta totuşi

161

câteva exemple şi din lumea fungilor şi protozoarelor. În genomul fungului patogen Aspergillus fumigatus s-au pus în evidenţă metacaspazele de tip I, CasA şi CasB. S-a constatat că aceste gene nu intervin în virulenţa fungului, mutanţii dublu ko pentru aceste gene având însuşirea nealterată. În schimb, produşii genelor menţionate sunt necesari pentru creşterea în condiţii de stres RE, ceea ce ar sugera că aceste metacaspaze ar avea mai degrabă rol pro-supravieţuire decât implicare în procesele MCP (Richie et al., citaţi de Vercammen et al., 2007).

Au fost identificate gene ale metacaspazelor şi în genomul unor protozoare. Vom prezenta unele informaţii de acest gen, sintetizate recent de Vercammen et al. (2007) şi de Meslin et al. (2011). La trei specii de Plasmodium au fost descrise câte 3 gene ale metacaspazelor (MCA), după cum urmează: PfMCA1-3 la P. falciparum, PvMCA1-3 la P. vivax (aceste specii fiind agenţi ai malariei la om) şi PbMCA1-3 la P.

berghei murin. Mutanţii ko pentru gena PbMCA1 nu au prezentat niciun fenotip evident. Expresia PfMCA1 de la P. falciparum la S. cerevisiae deficientă în YCA1 a determinat întârzierea creşterii şi o moarte celulară drastică a drojdiilor. Această metacaspază nu a prezentat activitate CL, ci activitate arginin-proteazică, fiind suspectată a avea rol de iniţiator în procesele ce determină activarea unui efector de aspartat-protează. PfMCA1 are capacitate de autoprocesare, fenomen ce duce la înlăturarea prodomeniului ei, întocmai ca la caspazele iniţiatoare. La P. falciparum s-a decelat recent nucleaza TudorSN şi unele proteine de interacţiune ale ei, dar nu se ştie încă dacă TSN de Plasmodium poate fi substrat pentru metacaspază. P. bergei prezintă 3 gene pentru metacaspaze de tip I (PbMC1-3) din care la PbMc-2 şi -3 lipseşte unul, sau lipsesc ambele reziduuri la situl catalitic, iar mutanţii ko pentru gena PbMC1 nu manifestă nici un fenotip evident. La Trypanosoma brucei s-au identificat 5 gene pentru metacaspaze de tip I, notate cu TbMCA1-5, deleţia uneia din genele TbMCA-2, -3 şi -5 nu a indus moartea celulară, iar mutanţii triplu ko pentru aceste gene au fost capabili de rate de creştere comparative cu ale tulpinilor de tip sălbatic. Doar exprimarea în exces la S. cerevisiae a genei pentru TbMCA4 a indus întârzierea creşterii, pierderea capacităţii respiratorii şi reducerea clonogenezei drojdiilor. La. T.

cruzi s-au raportat genele pentru metacaspaze TcMCA3 şi TcMCA5, ale căror proteine sintetizate se distribuie în întreaga celulă, dar care după expunerea la serul uman proaspăt se relocalizează în nucleu şi induc moartea celulară. Speciile de Leishmania posedă o singură genă pentru metacaspază, cu excepţia subtipurilor infantum şi donovani. Expresia în exces a LmjMCA la L. major a ridicat sensibilitatea parazitului la stresul oxidativ, fapt demonstrat de intensificarea expunerii PS şi de pierderea rapidă a potenţialului membranei mitocondriale comparativ cu paraziţii de tip sălbatic. S-a constatat că H2O2, şocul termic sau medicamentele anti-Leishmania (miltefosina, curcumina) care induc MCP, determină procesarea extensivă a LmjMCA. Pe lângă rolul posibil al metacaspazelor în MCP la unele specii de protozoare parazite umane, ca Trypanosoma spp, Leishmania spp, Plasmodium spp, s-a sugerat şi rolul lor în procesele de reciclare. Faptul că activitatea catalitică a metacaspazelor e diferită de a caspazelor şi că ele lipsesc la mamifere, fac din metacaspaze şi mecanismul de activare subiecte de interes pentru dezvoltarea de noi medicamente pentru tratarea tripanosomiazei, leishmaniozei şi malariei, (Gonzales, 2009).

Revenind la activităţile caspase-like la plante, Bonneau et al., (2008) arătau într-o lucrare de sinteză dedicată MCP la plante, că folosindu-se extracte din plante şi

162

substraturi caspazice sintetice s-au identificat cca 8 activităţi CL în plante, activităţi sumarizate şi prezentate în tabelul 10.3. Cele mai studiate au fost activităţile de tip IVAD-ază şi DEVD-ază, dar pe măsura dezvoltării şi disponibilităţii de substraturi sintetice comerciale noi au fost raportate şi alte tipuri activităţi CL în plante: VEID-ază, IETD-ază, VKMD-ază, LEHD-ază, LEVD-ază şi TATD-ază.

Tabel nr. 10.3 - Activităţi de tip casapază (caspase-like) identificate la plante

(după Bonneau et al., 2008) Activitate de tip Specia şi ţesutul Referinţe bibliografice YVAD-ază (VPE) Ţesut foliar de tutun

Celule embrionare în suspensie de orz Celule în suspensie BY2 de tutun Seminţe germinate de Picea glauca

Plăntuţe de Pisum sativum

Plăntuţe de Arabidopsis thaliana Leziuni foliare induse de fumonizina-B la A. thaliana

Del Pozo et Lam, 1998 Korthout et al., 2000 Mlejnek et Prochazka, 2002 He et Kermode, 2003 Belenghi et al., 2004 Danon et al., 2004 Kuroyanagi et al., 2005

DEVD-ază Celule embrionare în suspensie de orz Celule în suspensie BY2 de tutun Seminţe germinate de Picea glauca

Plăntuţe de Pisum sativum

Linie celulară embriogenă de Picea abies Frunze de Avena sativa

Plăntuţe de Arabidopsis thaliana Polen de Papaver

Korthout et al., 2000 Mlejnek et Prochazka, 2002 He et Kermode, 2003 Belenghi et al., 2004 Bozhkov et al., 2004 Coffeen et Wolpert, 2004 Danon et al., 2004 Thomas et Franklin-Tong, 2004

IETD-ază (saspază) Frunze de Avena sativa

Plăntuţe de Arabidopsis thaliana SI* polen de Papaver

Coffeen et Wolpert, 2004 Rotari et Gallois-date nepublic. Bosch et Franklin-Tong, 2007

LEHD-ază Frunze de Nicotiana benthamiana Kim et al., 2003 LEVD-ază SI polen de Papaver Bosch et Franklin-Tong, 2007 TATD-ază Frunze de tutun Xanthi Chichkova et al., 2004 VEID-ază SI polen de Papaver

Seminţe de orz Linie celulară embriogenă de Picea abies Plăntuţe de Arabidopsis thaliana

Bosch et Franklin-Tong, 2007 Bozhkov et al., 2004 Boren et al., 2006 Rotari et Gallois-date nepublic.

VKMD-ază(saspază) Frunze de Avena sativa Coffeen et Wolpert, 2004 * SI – self incompatibility (auto-incompatibilitate)

Identificarea unor activităţi CL în plante şi corelarea lor cu inducerea MCP nu este suficientă pentru a demonstra implicarea lor în acest proces. O dovadă în plus ar fi dacă prin folosirea unor inhibitori de caspază adecvaţi substratului utilizat s-ar constata că MCP la plante ar depinde de aceste activităţi caspase-like. Cum arată Bonneau et al. (2008), citând o serie de autori, folosirea în acest scop a proteinei p35 a demonstrat blocarea morţii celulare la plante în unele sisteme experimentale: MCP indusă de Agrobacterium tumefaciens în celulele calusului embriogen de porumb; MC în celulele plantelor de tutun ca răspuns hipersensibil la infecţia cu VMT sau cu Pseudomonas

syringae pv. phaseolicola; MC indusă cu UV la Arabidopsis etc. Pe de altă parte, şi utilizarea unor inhibitori sintetici ai activităţilor de tip

caspază a arătat (tab. 10.4) că cei mai mulţi dintre ei au fost eficienţi în inhibarea multor tipuri de MC la plante.

163

Tabel nr. 10.4 - Inhibitori de caspază şi MCP la plante (după Bonneau et al., 2008) Inhibitor Inhibiţie Sistem experimental/referinţă bibliografică

BocD-fmk Da

Nu

- Inducţie suspensie celulară la Nicotiana tabacum folosind xilanază sau staurosporină (Elbaz et al., 2002); - Moarte celulară la tutun indusă de Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Del Pozo et Lam, 1998); - MCP indusă cu menadionă în protoplaştii de tutun (Sun et al., 1999); - Inducţie MCP în suspensii celulare de tomate cu camptotecină, staurosporină şi fumonizina-B1 (De Jong et al., 2000); - MCP indusă UV-c în protoplaştii de A. thaliana (Danon et

al., 2004); - Incompatibilitatea polenului la Papaver (Thomas et Franklin- Tong, 2004); - Eliminarea lăstarilor firavi la plăntuţele de Pisum sativum (Belenghi et al., 2004); - Apoptoza Ca-indusă la celulele cultivate de Taxus cuspidata (Ge et al., 2005); - MC indusă de şocul de căldură la tutunul BY2 (Vacca et al., 2006); - MCP indusă de acidul fusaric în vf. rădăcinilor de Crocus

sativus (Samadi et Shahsavan Behboodi, 2006); - HR indus de P. syringae pv. tabaci (Krzymovska et al., 2007); - HR indus folosind VMT (Hatsugai et al., 2004); - HR indus de P. syringae pv. maculicola (Krzymovska et al., 2007);

Ac-DEVD-cmk Da - Celule ale mega-gametofitului de Picea abies (He et Kermode, 2003)

z-DEVD-fmk Da - MCP indusă în celulele BY2 de tutun cu isopentiladenozină (Mlejnek et Prochazka, 2002);

z-LEHD-fmk Nu - Linie celulară embriogenă de Picea abies (Bozhkov et al., 2004); Biotin-TATD-CHO Da - HR la tutun mediat de gena-N (Chickova et al., 2004); z-VAD-fmk Da - Linie celulară embriogenă de Picea abies (Bozhkov et al., 2004);

- MCP indusă în celulele BY2 de tutun cu isopentiladenozină (Mljnek et Prochazka, 2002);

z-VEID-fmk Da - Linie celulară embriogenă de Picea abies (Bozhkov et al., 2004); - MCP indusă în celulele BY2 de tutun cu isopentiladenozină (Mljnek et Prochazka, 2002);

Ac-YVAD-CHO Da Nu

- MCP indusă cu UV-C în protoplaştii de A.thaliana (Danon et al., 2004); - HR indus folosind VMT (Hatsugai et al., 2004); - MCP indusă cu acid fusaric în vf. rădăcinii de Crocus sativus (Samadi et Shahsav Behboodi, 2006); - Remodelarea ţesutului în plantele de Aponogeton madagascariensis (Gunawardena, 2007); - Formarea xilemului la sistemul Zinnia (Fukuda, 1997); - Incompatibilitatea polenului la Papaver (Thomas et Franklin- Tong, 2004); - HR indus de P. syringae pv. maculicola (Krzymovska et al., 2007);

Ac-YVAD-cmk Da - MC la tutun indusă de P.syringae pv. phaseolicola (Del Pozo et

164

Lam, 1998); - Inducţia MCP în celule în suspensie de tomate cu camptotecină, staurosporină şi fumonizină-B1 (De Jong et al., 2000); - MCP indusă NO în culturi în suspensie de Arabidopsis (Clarke et al., 2000); - HR indus de P.syringae pv. tabaci (Krzymovska et al., 2007);

z-IVAD-fmk Da - MCP indusă celulelor BY2 de tutun cu isopentiladenozină (Mlejnek et Prochazka, 2002);

Biotin-YVAD-fmk Da - Formarea de leziuni induse de fumonizina B1 (Kuroyanagi et al., 2005);

Nu este însă clar, aşa cum precizam la un moment dat, dacă activităţile CL din

plante sunt rodul metacaspazelor, sau dacă misiunea acestor enzime nu este de a activa proteaze din aval cu acţiune de tip caspază, sau dacă nu cumva ele sunt implicate în controlul MCP la plante.

10.5. Enzimele de procesare vacuolară (VPE) Sunt enzime intens studiate pentru rolul pe care îl au în maturarea proteinelor

de rezervă din seminţele plantelor. În ultimul timp s-a constatat că enzime de acest fel sunt exprimate şi în ţesuturile vegetative ale plantelor, fiind localizate în veziculele precursor de proteaze (PPV – protease precursor vesicles) şi în vacuole. Enzimele de procesare vacuolară sunt cistein-proteaze care au specificitate de substrat pentru resturi de Asn şi Asp. Familia de proteaze VPE execută activităţi de tip caspază-1 (YVAD-ază) în plante, (Bonneau et al., 2008). Deşi iniţial VPE (o legumaină) a fost considerată ca fiind o protează responsabilă doar de maturarea proteinelor de rezervă din seminţe, s-a constatat ulterior că este implicată în maturarea diverselor proteine vacuolare şi ale ţesuturilor vegetative. Tipul vegetativ de VPE se exprimă în cursul senescenţei sau a HR indus de patogeni. S-a observat că deficienţa VPE a abolit MCP în cursul HR la frunzele de tutun infectate VMT, (Yamada et al., 2005).

Cum arătam într-un capitol anterior, în genomul de Arabidopsis s-au identificat 4 gene VPE, notate cu α-, β-, γ- şi δVPE. Aceste gene/enzime formează două sub-familii: VPE de tip sămânţă şi VPE de tip vegetativ (Kinoshita et al., 1995, citaţi de Zhang et al., 2010). Genele/enzimele αVPE şi γVPE se exprimă în ţesuturile senescente ale organelor vegetative, iar βVPE şi δVPE se exprimă în seminţe. Aceste enzime se acumulează în compartimente vacuolare diferite: αVPE şi γVPE se acumulează în cele litice, iar βVPE şi δVPE în compartimentele de conservare a proteinelor, (Courtois-Moreau, 2008). S-au identificat totodată şi asemănări de structură între VPEγ de Arabidopsis şi caspaza-8, precum şi faptul că γVPE reglează degradarea proteinelor în cursul senescenţei, aspecte ce se pot constitui în argumente că VPE exercită funcţii asociate cu MCP la plante, (Sanmartin et al., 2005).

Unele studii recente sugerează că enzimele VPE sunt ortoloage ale caspazelor ce activează MCP la plante şi intervin în interacţiunile plantă-patogeni. S-a constatat că VPE au activitate caspase-like (CL) şi reglează MC la Nicotiana (Hatsugai et al., 2004) şi Arabidopsis, (Rojo et al., 2004). Tratamentele cu inhibitori VPE sau cu inhibitori de caspază-1 la N. tabacum au inhibat răspunsul MCP la infecţia cu VMT. Hara-Nishimura et al. (citaţi de Jan et al., 2008) au verificat dacă VPE sunt implicate în moartea celulară la plante folosind un sistem plantă/patogen (tutun, N-TMV) sensibil la temperatură. La 30oC virusul (VMT) infectează sistematic plantele de tutun

165

(expresia genelor pentru MC şi protecţie a plantelor fiind inhibată), iar prin schimbarea temperaturii la 23oC a fost semnalată moartea celulară pretutindeni în plantă. Folosindu-se un inhibitor de caspază (biotin-XVAD-FMK), care a fost infiltrat în frunzele de tutun înaintea schimbării temperaturii, s-a constatat că MC a fost blocată, iar inhibitorul utilizat s-a legat de două fracţiuni proteice, de 40 şi 38 kDa. Cu ajutorul anticorpilor specifici s-a stabilit că aceste fracţiuni erau de fapt două forme ale VPE, activitatea caspase-like în plantele de tutun fiind deci realizată de VPE.

S-a constatat de asemenea că la plantele de N. benthamiana (N.b.), silenţiate VPE, activitatea de tip caspază ca răspuns la infecţia VMT este inhibată, colapsul vacuolar şi MCP sunt blocate, având loc proliferarea infecţiei virale. Datele sugerează că la plantele de tutun, enzimele de procesare vacuolară (VPE-1a şi VPE-1b) exercită activitate de tip caspază şi pot promova MCP în cursul infecţiei VMT, iar silenţierea genelor ce codifică aceste enzime a inhibat moartea HR indusă de VMT. Deşi VPE are activitate de tip caspază-1, este structural neînrudită cu caspazele, (Hatsugai et al, 2004). În investigaţii efectuate pe aceeaşi plantă (cu câte una sau cu ambele gene silenţiate), în care s-a studiat rolul VPE ca răspuns la 3 elicitori (harpina bacteriană, Nep1 fungic şi boehmerina de oomicete), Zhang et al. (2010) au ajuns la concluzia că VPE la N.b. participă nu numai la HR, ci şi la închiderea stomatelor indusă de elicitori, ceea ce sugerează că VPE ar putea fi implicată în imunitatea declanşată de elicitori.

La Arabidopsis s-a observat de asemenea o creştere a activităţii de tip caspază şi iniţierea unui răspuns rapid MCP în urma infecţiei cu Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst), activitate compromisă la mutanţii vpeγ, care sunt mai sensibili la infecţia cu Pst şi totodată mai suceptibili la infecţia cu virusul mozaicului napului (VMN). Enzimele VPE reglează deci negativ proliferarea unor patogeni biotrofici precum VMT, Pst şi VMN, probabil prin promovarea MCP, (Sanmartin et al., 2005). Plantele au dezvoltat o strategie de suicid celular mediat de VPE şi de vacuola celulei, spre deosebire de animale - unde sunt implicate caspazele.

VPE conţin peptide semnal pentru inserţia pe sistemul de endo-membrane şi se consideră că sunt localizate în PPV sau vacuole. La Nicotiana benthamiana ele ar fi situate în vacuole şi ar induce MCP din lumenul vacuolar, acţionând probabil după ruperea tonoplastului la procesarea enzimelor citosolice care iau parte la execuţia MCP. În legătură cu activarea VPE lucrurile nu sunt încă foarte clare. Este posibil ca aceste enzime să se autoproceseze în mediul acid din vacuolă. Ele se pot menţine sub formă latentă prin păstrarea în compartimentele non-acide ale căii secretoare, cum ar fi veziculele PPV, iar în condiţiile care induc MCP ar fi transferate în vacuole unde se activează şi produc colapsul vacuolar (Rojo et al., 2002 şi 2004 – citaţi de Sanmartin et al., 2005).

Ca şi caspazele, enzimele de procesare vacuolară sunt cistein-proteaze şi deşi nu sunt înrudite cu caspazele şi metacaspazele, VPE au unele proprietăţi enzimatice comune cu ale caspazei-1: două reziduuri (His şi Cys) ale diadei catalitice VPE sunt comparabile cu His-237 şi Cys-285 din diada catalitică a caspazei-1 de la om; tot astfel, pentapeptidul QACRG din centrul activ al caspazei-1 este asemănător cu pentapeptidul E(A/G)CES din centrul activ al VPE; cei 3 aminoacizi (Arg-179, Arg-341 şi Sr-347) care formează buzunarul de legare a substratului la caspaza-1 se regăsesc şi la cele peste 20 de enzime VPE cunoscute; atât VPE cât şi caspaza-1 sunt supuse procesării autocatalitice din formele precursor, (Jan et al., 2008).

166

După descoperirea metacaspazelor la plante s-a introdus un termen nou, legat de MCP la plante, degradomul. Sub această denumire sunt reunite proteazele, substraturile şi inhibitorii lor, implicaţi în MCP la un anumit grup de celule. Miezul degradomului la plante avea să fie ulterior stabilit ca fiind format de un trio de proteaze - VPE, tipul II de metacaspaze şi VEID-azele, toate esenţiale în MC la plante, având însă localizare celulară şi specificitate de substrat diferite, (Courtois-Moreau, 2008).

Alături de VPE şi saspaza, o serin protează de tip subtilizină (subtilisin-like, SL), care este structural diferită de caspaze, prezintă specificitate de clivare a substratului de tip CL. Saspaza este inhibată de inhibitorii caspazei şi ar fi implicată în proteoliza produsă de victorină a proteinei Rubisco în cursul MCP la ovăz. A fost descoperită în extractele de frunze de Avena sativa tratate cu victorină (toxină produsă de fungul Cochliobolus victoriae). MCP indusă de victorină se asociază cu două activităţi de tip caspază, care pot fi diferenţiate după sensibilitatea acestora la inhibitorii de caspază, (Coffeen and Wolpert, 2004). Saspaza purificată a prezentat activitate maximă la pH=6,5 şi a manifestat specificitate strictă de substrat pentru Asp în poziţia P1. Ea s-a dovedit capabilă să cliveze multe din substraturile caspazelor testate şi în special ale caspazei-6, cum ar fi VKMD, VEHD şi VNLD. Saspaza a dovedit o activitate redusă pentru YVAD şi nu a clivat substraturile VEID, WEHD şi DEVD. Faptul că saspaza apare ca o enzimă ce funcţionează în spaţiul extracelular şi că enzima purificată nu a clivat Rubisco i-au determinat pe Coffeen şi Wolpert (2004) să sugereze că saspaza s-ar afla în amonte de cascada ce conduce în final la clivarea Rubisco. Saspazele conţin peptide semnal şi au fost identificate în vacuole sau în spaţiul extracelular. Saspaza de ovăz ar fi localizată în celulă, probabil în RE sau în aparatul Golgi, iar secreţia ei spre apoplasmă iniţiază MCP, ceea ce sugerează că enzima activează MC din apoplasmă, (Sanmartin et al., 2005). Această saspază se exprimă constitutiv, foarte probabil ca o enzimă activă (Coffeen and Wolpert, 2004). Ea ar fi reţinută în calea secretoare în stare inactivă şi ar fi activată prin secreţia în apoplasmă, unde are acces la proteinele efector ce iniţiază MCP.

Chichkova et al. (2010) raportează identificarea şi caracterizarea unei noi proteaze SL implicată în MCP la tutun şi orez, denumită fitaspază, aspartat protează specifică plantelor, care posedă specificitate diferită de a altor proteaze CL cunoscute. Spre exemplu, fitaspaza are ca motiv preferat de clivare VEID, fapt ce o diferenţiază de saspază, care nu clivează VEID. Autorii consideră că fitaspaza se sintetizează în celulă ca proenzimă, s-ar activa prin autoprocesare şi ar fi sechestrată în apoplast înaintea MCP. Stimulii care induc moartea ar determina re-locarea (transferul) fitaspazei din apoplast în interiorul celulei. Prin urmare, spre deosebire de alte proteaze CL care operează fie în apoplast (cum ar fi saspaza), fie în vacuolă (cum ar fi VPE), fitaspaza ar acţiona atât în apoplast cât şi în compartimentele celulare. icaspÎÎÎÎÎÎÎ...azică diferită de a ccccc 11. MCP la animale versus MCP la plante

Aşa cum a rezultat din informaţiile prezentate în lucrarea de faţă, se poate aprecia că, deşi între semnalizarea, trăsăturile, căile şi mecanismele morţii celulare programate (MCP) la animale şi la plante există o serie de asemănări, dovadă a descinderii celor două categorii de organisme dintr-un ancestral comun îndepărtat, diferenţele existente în realizarea acestui proces fiziologic la cele două regnuri sunt

167

totuşi importante, dovadă a divergenţei lor, a evoluţiei lor separate. Acum mai bine de un deceniu, Krishnamurthy et al. (2000) încercau într-un articol de sinteză ca, pe baza cunoştinţelor acumuate până la sfârşitul secolului trecut în domeniul MCP, să facă o paralelă între animale şi la plante sub acest aspect, sinteză argumentată şi interesantă considerăm noi şi de care ne vom folosi în cele ce urmează pentru a face unele aprecieri comparative asupra MCP la animale şi plante. Unele din trăsăturile comune, dar şi diferenţele existente între moartea celulară programată prin apoptoză la animale, şi moartea celulară programată la plante sunt prezentate sintetic în tabelul 11.1.

Tabel nr. 11.1 – Asemănări şi diferenţe între moartea celulară programată (MCP) la animale

şi plante, (după Krishnamurthy et al., 2000; cu unele modificări)

ANIMALE PLANTE La animale sunt prezente toate cele 8 categorii de celule care se supun morţii celulare (MCP).

La plante, din cele 8 categorii de celule supuse MCP, sunt prezente doar 6; în acest caz lipsesc celulele care se produc în exces, precum şi celulele a căror moarte se soldează cu boli.

La celulele supuse MCP are loc întotdeauna condensarea, micşorarea şi fragmentarea citoplasmei.

S-a observat condensarea şi micşorarea citoplasmei, dar nu şi fragmentarea ei; raportările privind fragmentarea citoplasmei sunt fie artefacte, fie observaţii necritice.

Are loc micşorarea celulelor. Micşorarea celulelor în cele mai multe categorii de celule la plante, cu excepţia celor ce diferenţiază în ET, fibre, sclereide

Cadavrele celulare sunt înghiţite şi eliminate prin fagocitoză de către celule învecinate sau macrofage.

Cadavrele celulare persistă datorită peretelui celular. La ET, fibrele şi sclereidele nu numai că persistă, ci şi devin funcţionale după MCP. Citoplasma moartă este eliminată de regulă prin autofagia vacuolară; este posibilă eliminarea ei şi de către plastolisomi.

MCP se datorează unui sindrom de mecanisme bine organizate şi executate, care implică efectori, adaptori, regulatori şi semnale.

Mecanismele care stau la baza MCP la plante incomplet cunoscute; nu se cunosc molecule adaptor sau reglatoare. Sunt probleme şi în legătură cu prezenţa moleculelor semnal sau efectoare.

Sunt activate şi se exprimă caspazele efectoare şi granzimele; caspazele au specificitate pentru acidul aspartic în P1.

Plantele nu au gene pentru caspaze, dar au în schimb metacaspaze, care pot executa activităţi caspase-like şi sunt implicate în MC, deşi nu pot cliva substraturile caspazelor. Metacaspazele au în structura lor un buzunar S1 înalt acid, care determină o specificitate bazică pentru arginină şi lizină în poziţia P1. La plante, sunt implicate în MC şi au activitate caspase-like şi enzimele de procesare vacuolară (VPE), care sunt cistein-proteaze cu specificitate de substrat pentru resturi de Asn şi Asp.

Clivarea PARP cu formarea fragmentelor apoptotice de 89 kDa este un marker al MCP; la animale există un singur tip de PARP.

Nu sunt informaţii privind clivarea PARP. Abundenţa PARP la plante este foarte limitată. Se cunosc două tipuri de PARP, un tip la Zea mays şi altul la Arabidopsis thaliana.

Proteina anti-apoptotică Bcl-XL inhibă MCP cel puţin în unele celule.

Bcl-XL nu suprimă MCP asociată răspunsului hipersensibil (HR).

Speciile reactive de oxigen (ROS) de tipul O2 şi H2O2 pot activa MCP

O2 şi H2O2 sunt implicate în MC, în special în răspunsul HR la stresul abiotic şi biotic. Implicarea raportată a H2O2 în moartea ET şi HR trebuie privită cu prudenţă.

168

Creşterea concentraţiei Ca2+ citosolic poate activa MCP, prin activarea endonucleazelor şi caspazelor.

Creşterea Ca2+ poate activa MCP prin activarea endonucleazelor. Nu există date privind proteinaze activate de Ca2+ în MCP la plante.

Rolul mitocondriilor în execuţia MCP este indiscutabil (calea intrinsecă a apoptozei) şi bine descifrat.

Deşi există unele date care arată permeabilizarea mitocondriilor şi eliberarea cyt. c în cursul MCP la plante, nu sunt dovezi certe că acest proces activează moartea celulară la plante.

Umflarea membranei plasmatice este un fenomen obişnuit.

La plante nu a fost raportată umflarea membranei plasmatice.

Are loc o expunere crescută a fosfatidil-serinei (PS) la suprafaţa externă a membranei plasmatice (demosntrabilă prin legarea anexinei V)

S-a observat expunerea PS (evidenţiată prin legarea anexinei V) doar la protoplaştii de tutun supuşi stresului abiotic.

Se produc schimbări în fosforilarea/defosforilarea proteinelor.

Schimbări în fosforilarea/defosforilarea proteinelor au fost raportate numai în celulele aleuronice şi în celulele supuse hipoxiei şi HR.

Lipsa factorului de creştere (growth factor deprivation - GFD) promovează moartea celulară.

Sunt raportări privind MC promovată-GFD la unele tipuri de celule vegetale. Unele rezultate sunt contradictorii (suplimentarea cu regulatori de creştere poate promova MC).

În celulele supuse apoptozei are loc condensarea cromatinei.

Condensarea cromatinei s-a observat doar în unele categorii de celule care mor.

Clivarea şi fragmentarea sistematică a ADN-ului, demonstrată prin formarea de ladderi electroforetici şi prin metoda TUNEL; fragmentarea ADN are loc în zonele internucleosomale, fiind generate fragmente oligo-nucleosomale de cca 180 pb sau multiplu al acestui număr.

La plante, doar la unele categorii de celule a fost demonstrată clivarea şi fragmentarea ADN, prin formarea de ladderi electroforetici şi prin metoda TUNEL. În unele celule fragmentele de ADN conţin 50 kb, iar în altele 140 pb. În ET, fibre şi sclereide nu pare să se producă fragmentarea ADN.

De procesarea şi fragmentarea ADN-ului sunt responsabile endonucleazele dependente de Ca2+; în aproape toate cazurile (exceptând unul la C. elegans) nucleaza este produsă de însăşi celula care moare.

Prezenţa nucleazelor a fost semnalată şi în cazul morţii unor celule la plante, dar nu există o dovadă directă a implicării lor în MCP. La plante, nucleazele sunt dependente fie de Ca2+, fie de Zn2+. Ele pot fi produsul celulei care moare sau pot proveni din celulele adiacente.

Se formează corpi apoptotici tipici, formaţi din resturi de citoplasmă, organite şi fragmente oligo-nucleosomale de ADN.

La plante, formarea de corpi apoptotici în MCP nu a fost raportată (de fapt, prezenţa peretelui celular nici nu ar permite formarea lor).

În cursul morţii celulare nu sunt sintetizate proteine de stres.

În MCP la plante sunt frecvent sintetizate proteine de stres, bogate în hidroxi-prolină, glicină şi treonină, arabino-galactani, care devin componenţi ai pereţilor celulari ai unor categorii de celule supuse morţii.

După cum precizează autorii amintiţi mai sus, la animale au fost stabilite un

număr de 8 categorii (notate de la I la VIII) de celule care se supun morţii celulare programate: I) celule care şi-au îndeplinit funcţia. Exemple: celulele cozii la mormolocul de broască, celule ale tractusului reproductiv sau intestinal - la animale; celula vegetativă a polenului, sinergidele, antipodele, celulele tapet ale anterei, celulele suspensorului embrionar etc, la plante; II) celule nedorite din start. Exemple: cele 131 de celule somatice care dispar pe parcursul dezvoltării embrionare la nematodul C. elegans, celulele ductului Müller la

169

masculi şi ale ductului Wolf la mamifere etc; celulele primordiale ale staminelor şi carpelelor la florile mascule şi respectiv femele, celulele nefuncţionale care se formează în cursul iniţierii embrioizilor în culturile de celule in vitro. În această categorie credem că s-ar putea include la animale şi MCP a unor structuri care au existat pe parcursul evoluţiei unor specii, dar care fie au devenit nefuncţionale, fie au funcţii tranzitorii, fie au importanţă doar pe parcursul dezvoltării embrionare a acestora; III) celule care mor şi prin rediferenţiere formează celule specializate. Exemple: dacă la animale acest tip de celule este mai rar întâlnit, cum e cazul keratinocitelor de la suprafaţa pielii la vertebrate, la plante în schimb este relativ bine reprezentat prin celulele scoarţei, sclerenchimul, elementele traheale din xilem, celule ale spinilor, ghimpilor, trichomilor etc. Avem în acest caz de-a face cu celule care devin funcţionale după moartea lor, în urma unor schimbări morfologice şi chimice importante din pereţii lor. În această categorie s-ar putea include ca o subcategorie şi unele celule specializate, supuse doar „parţial” morţii în cursul diferenţierii, cum ar fi la animale hematiile, celulele epiteliale din cristalin, iar la plante elementele ciuruite ale floemului; IV) celulele supuse răspunsului hipersensibil (HR). Atât la animale cât şi la plante unele celule sunt supuse MCP, ca răspuns HR la patogeni, dar şi la diverşi factori de stres (înfometare, radiaţii, temperatură, toxine, metale grele, stres osmotic sau oxidativ etc), MC care serveşte ca mijloc de protecţie la stres, sau pentru a avertiza celule învecinate de a-şi lua măsuri de protecţie sau imune. V) celule lezate, incapabile de a funcţiona ulterior. În acest caz este vorba de celule potenţial periculoase, a căror moarte previne multiplicarea şi răspândirea lor în organismul animal. Nu toate celulele lezate vor fi supuse MCP la animale, unele fiind capabile să-şi repare leziunile şi să-şi reia funcţia, altele (puternic lezate), să fie supuse necrozei. După cum arată Krishnamurthy et al., (2000), la plante este mai dificil de distins între această categorie de celule şi cea precedentă şi nu este cert dacă moartea unor astfel de celule lezate este programată; VI) celule produse în exces. În timp ce la plante nu se cunosc exemple de MCP de acest gen, la animale cel mai elocvent exemplu ar fi cel al neuronilor la vertebrate; VII) celule plasate greşit. Sunt celule a căror dispariţie prin MCP asigură modelarea tisulară sau a unor organe. În acest fel are lor la vertebrate formarea degetelor (prin dispariţia membranei interdigitale), formarea orificiilor inimii, a palatului bucal la mamiferele superioare, formarea tubului neural etc. În cazul plantelor celule supuse MCP asigură formarea foleolelor la frunzele compuse, a lobilor frunzei la frunzele lobate, a golurilor prezente în limbul frunzelor (cum ar fi la Monstera sp); VIII) celule care prin moartea lor generează boli. Dacă la plante această categorie de celule şi de MCP nu pare să existe, la animale poate fi exemplificată prin moartea unor neuroni din creier (care pot genera o serie de boli ca Alzheimer, Huntington, Parkinson), sau moartea celulelor T-helper din sistemul imun (care poate determina SIDA) etc. Cum rezultă din cele de mai sus, la plante sunt prezente doar şase din cele opt categorii de celule care pot fi supuse MCP, iar din acestea sunt mai bine cunoscute patru, şi anume MCP la categoriile de celule I - IV. Dintre celulele supuse MCP la

170

plante, cele din prima categorie (care mor după îndeplinirea funcţiei lor) seamănă cel mai bine cu moartea prin apoptoză de la animale, în sensul că şi în acest caz asistăm la o serie de evenimente celulare asemănătoare, cum ar fi: condensarea şi micşorarea citoplasmei, semnalizare prin ROS, fosforilarea/defosforilarea unor proteine, prezenţa unor proteaze efectoare, creşterea concentraţiei calciului în citosol, condensarea cromatinei, fragmentarea ADN-ului (care arată că au fost activate unele endo-nucleaze) etc. În schimb, MCP la celulele din categoria a III-a a plantelor diferă net şi poate fi considerată unică prin schimbările celulare care asigură rediferenţierea lor. Reamintim, este vorba despre ET, fibrele de sclerenchim, sclereide etc. Celulele în acest caz nu se micşorează, ci dimpotrivă se măresc sau alungesc, nucleii lor se păstrează (uneori suportând fenomene de reduplicare) şi sunt metabolic foarte activi transcripţional, fiind responsabili de producerea unor substanţe necesare organizării peretelui celular secundar, în celule sunt încă prezente şi active o serie de proteaze care degradează proteinele citoplasmatice în vederea refolosirii produşilor rezultaţi pentru structurile specializate. Dacă unele din evenimentele ce se petrec în apoptoza celulei animale se pot regăsi şi în moartea celulară programată a celulei vegetale, o diferenţă importantă între cele două tipuri de celule este prezenţa peretelui celular la plante. Din acest motiv, dar probabil nu numai, în celulele plantelor nu s-au identificat corpi apoptotici. Lipsa peretelui celular face ca la animale să nu se păstreze cadavrele celulelor, aşa cum se întâmplă la plante. Dacă la animale, membrana plasmatică a celulelor supuse MCP se umflă şi se cutează, în celulele plantelor nu s-a observat acest fenomen. Spre deosebire de animale la care corpii apoptotici sunt înghiţiţi şi eliminaţi de macrofage sau de celule învecinate, plantele nu posedă fagocite, iar conţinutul celular în acest caz este eliminat prin autofagie vacuolară sau plastolisomie, (Krishnamurthy et al., 2000). Dacă în apoptoză la animale, celulele se condensează şi micşorează, fapt caracteristic şi multor tipuri de celule vegetale supuse MCP, la unele totuşi (ET, fibre, sclereide) putem asista după MCP la lărgirea şi alungirea celulelor afectate, acestea devenind funcţionale după ce mor, în urma unor schimbări de morfologie, structură şi compoziţie chimică pe care le suportă, situaţie neîntâlnită la animale. În timp ce la animale apoptoza are la bază un mecanism complex şi bine articulat, format din molecule semnal, receptori, adaptori, efectori, reglatori etc, la plante mecanismele MCP sunt mai puţin cunoscute şi par să nu implice molecule cu rol de adaptor sau de reglare. Cum arătam la un moment dat, în cursul dezvoltării plantelor sau în urma expunerii lor la factori de stres, unele tipuri de celule sunt supuse morţii într-un mod asemănător apoptozei (apoptosis-like), având loc degradarea rapidă a nucleului şi pierderea organizării celulare. Ar fi aceasta un tip de MC indusă prin semnalizare – via mitocondrii şi ar presupune micşorarea nucleului, condensarea cromatinei şi formarea de ladderi ADN. În MCP apoptosis-like la plante are loc eliberarea citocromului c din mitocondrii, efect asociat cu activarea endonucleazelor, dar nu sunt dovezi că acest proces ar activa moartea celulară. În timp ce la animale efectorii cheie ai apoptozei sunt caspazele, plantele nu au caspaze, în schimb dispun de metacaspaze, enzime care execută în celulele vegetale activităţi de tip caspază (caspase-like), enzime cărora nu li se cunosc exact substraturile pe care acţionează, dar care nu pot cliva substraturi specifice caspazelor. Spre deosebire de caspaze la care buzunarul S1 este bazic, la metacaspaze acesta este

171

puternic acid, fapt ce determină o specificitate bazică pentru Arg şi Lys în poziţia P1 a substratului, în timp ce caspazele au specificitate pentru Asp în poziţia P1. În MCP la plante sunt implicate şi enzimele de procesare vacuolară (VPE), enzime ortoloage cu caspazele, care sunt cistein-proteaze cu specificitate de substrat pentru resturi de Asn şi Asp, cu activitate caspase-like şi care intervin în interacţiunile plantă/patogeni. Recent însă, s-a descoperit că proteina Tudor-SN, care are funcţie anti-apoptotică, poate fi degradată în timpul MCP de proteaze specifice: de caspaze în cazul celulelor animale şi de metacaspaze în cazul plantelor, proteina TSN fiind primul substrat biologic pentru metacaspaze, (Sundström et al., 2009). La plante s-au descoperit şi alte proteaze ca saspaza şi fitaspaza (serin-proteaze de tip subtilizină), care au specificitate de clivare a substratului de tip caspază.

La animale există un singur tip de PARP, iar clivarea PARP de către caspaze determină formarea unor fragmente apoptotice de 89 kDa, care reprezintă un marker al apoptozei; la plante se cunosc două tipuri de PARP, enzima este mai puţin răspândită în acest regn şi nu există date privind clivarea şi implicarea ei în MCP (având probabil responsabilităţi în reparaţia leziunilor ADN şi în metabolismul secundar al plantelor). Se pare că animalele şi plantele dispun de endonucleaze diferite, de sisteme independente de degradare a ADN-ului în cursul morţii celulare. Un marker important al MCP la animale este fragmentarea inter-nucleosomală a ADN-ului de către endonucleaze, în segmente de 180 pb sau multiplu al acestui număr, în timp ce la plante aceste fragmente au dimensiuni diferite, de 50 kpb şi 140 pb, mărimea lor fiind dată de intervenţia unui set diferit de endonucleaze, care acţionează probabil eşalonat. Endonucleaza implicată în MCP la animale este dependentă de ionii de Ca2+ şi/sau Mg2+, în timp ce la plante activitatea nucleolitică în diversele tipuri celulare poate depinde de ionii de Ca2+, Mg2+ sau Zn2+.

În ciuda marilor progrese înregistrate în domeniul căilor şi mecanismelor morţii celulare programate la animale şi plante, mai cu seamă în ultimele două decenii, sunt încă destule necunoscute şi incertitudini, aşa cum a reieşit din informaţiile prezentate. Dacă la animale lucrurile sunt ceva mai clare, în sensul existenţei unui program unic al MCP (cu două căi principale de realizare), la plante par să existe mai multe programe operaţionale ale MCP. Este evident că sistemele de MCP la animale şi la plante nu sunt similare. Nici unul din sistemele de moarte celulară descrise la plante nu pare a avea toate trăsăturile specifice apoptozei de la animale, (Krishnamurthy et al., 2000). Totuşi, metacaspazele şi VPE apar ca fiind primii candidaţi cu responsabilităţi de activităţi CL în plante. Sunt aşteptate de asemenea rezultate care să ne edifice asupra mecanismelor de control al MCP la plante, (Jan et al., 2008; Nanda et al., 2010). O altă problemă care rămâne de elucidat într-un viitor apropiat este cea a mecanismelor prin care sunt activate metacaspazele. Dispun cumva plantele de o structură moleculară asemănătoare apoptosomului? Prin cercetările lui Sundström et al. (2009) s-a stabilit că metacaspazele şi caspazele împart substraturi naturale comune legate de moartea celulară. O mai bună cunoaştere a degradomului metacaspazelor la plante şi fungi ar putea duce la identificarea şi a altor substraturi relevante în execuţia MC la animale. În accepţia unor autori, există suficiente argumente să se considere că metacaspazele şi caspazele au origine comună, că ele ar reprezenta în fond variante ale aceleeaşi enzime, care au variat în cursul evoluţiei în special în privinţa locului de clivare. Speculaţiile merg chiar mai departe şi, pe baza unor trăsături comune ale celor două

172

categorii de enzime, a faptului că metacaspazele sunt prezente la toate categoriile de eucariote lipsite de caspaze, iar prezenţa caspazelor o exclude pe cea a metacaspazelor, să se acrediteze ideea descinderii caspazelor din metacaspaze, (Carmona-Gutierrez et al., 2010).z

i care formează buzunarul S1a caspazelor se aliniază la Leu

173

REFERINȚE

ABRAHAM C. M., SHAHAM S., Death without caspases, caspases without death. Trends in Cell Biology, 2004, 14, 4, 184-193. AGGARWAL B. B., Nuclear factor – kappaB: the enemy within. Cancer Cell, 2004, 6, 3, 203 -208. ASHKENAZI A., DIXIT V. M., Death receptors: signaling and modulation. Science, 1998, 281, 1305-1308. ASHKENAZI A., DR4, DR5, DcR1, DcR2. http://apresslp.gvpi.net/apcyto/lpext.dll?f= objects&fn=c16012.pdf ASHKENAZI A., Targeting death and decoy receptors of the tumour-necrosis factor superfamily. Nat. Rev. Cancer, 2002, 2, 6, 420-430. BAEK K.H., CHOI D., Roles of plant proteases in patogen defense. Plant Pathol. J., 2008, 24, 4, 367-374. BASSHAM D. C., Plant autophagy – more than a starvation response. Curr. Opin. Plant Biol., 2007, 10, 587-593. BEERS P. E., Programmed cell death during plant growth and development. Cell Death and Differentiation, 1997, 4, 649-661. BEIDLER R. D., TEWARI M., FRIESEN D. P., POIRIER G., DIXIT M. V., The baculovirus p35 Protein inhibits Fas- and Tumor Necrosis Factor- induced apoptosis. JBC online, 1995, 270, 28, 16526-16528. BELZACQ A. S., VIEIRA L.A.H., KROEMER G., BRENNER C., The adenine nucleotide translocator in apoptosis. Biochimie, 2002, 84, 2-3, 167-176. BENDER L. M., MORGAN M. J., THOMAS L. R., LIU Z-G., THORBURN A., The adaptor protein TRADD activates distinct mechanisms of apoptosis from the nucleus and the cytoplasm. Cell Death and Differentiation, 2005, 12, 473-481. BIAN Z. M., ELNER S. G., ELNER V. M., Dual involvement of caspase-4 in inflammatory and ER stress-induced apoptotic responses in human retinal pigment epithelial cells. Journal Investigative Ophthalmology and Visual Science, 2009, 50, 12, 6006-6014. BOS J. L, The ras gene family and human carcinogenesis. Mutation Res., 1988, 195, 3, 255-271. BOZHKOV P.V., Mechanisms of programmed cell death in plants. http://www.slu.se/ Bozhkov. BOZHKOV P.V., FILONOVA L.H., SUAREZ M.F., HELMERSSON A., SMERTENKO A.P., ZHIVOTOVSKY B., VON ARNOLD S., VEID-ase is a principal caspase-like activity involved in plant programmed cell death and essential for embryonic pattern formation. Cell Death Differ., 2004, 11, 175-182. BRAS M., QUEENAN B., SUSIN S.A., Programmed cell-death via mitochondria: different modes of dying. Biochemistry (Moskow), 2005, 70, 231-239. CAO J., HE X-Q., WANG Y-Q. S., CUI K-M., Programmed cell death during secondary xylem differentiation in Eucommia ulmoides. Acta Botanica Sinica, 2003, 42, 12, 1465-1474. CARDONE M. H., ROY N., STENNICKE H. R., SALVESEN G. S., FRANKE T. F., STANBRIDGE E., FRISCH S., REED J. C., Regulation of cell death protease caspase-9 by phosphorylation. Science, 1998, 282, 1318-21. CARMONA-GUTIERREZ D., FRÖHLICH K.U., KROEMER G., MADEO F., Metacaspases are caspases. Doubt no more. Cell Death and Diffferentiation, 2010, 17, 377-378. CASCIOLA-ROSEN L. A., MILLER D. K., ANHALT G. J., ROSEN A., Specific cleveage of the 70-kDa protein component of the U1 small nuclear ribonucleoprotein is a characteristic biochemical feature of apoptotic cell death. J. Biol.Chem., 1994, 269, 49, 12. CHICHKOVA V.N., SHAW J., GALIULLINA A.R., DRURY E.G., TUZHIKOV I.A., KIM H.S., KALKUM M., HONG B.T., GORSHKOVA N.E., TORRANCE L., VARTAPETIAN

174

B.A., TALIANSKY M., Phytaspase, a relocalisable cell death promoting plant protease with caspase specificity. The EMBO Journal, 2010, 29, 1149-1161. CHINNAIYAN A. M., The apoptosome: heart and soul of the cell death machine. Neoplasia, 1999, 1, 5-15. CLEMENS M. J., Van VENROOIJ W.J., Van De PUTTE L. B. A., Apoptosis and autoimmunity. Cell death and Differentiation, 2000, 7, 1, 131-133. COFFEEN W.C., WOLPERT T.J., Purification and characterization of serine proteases that exhibit caspase-like activity and are associated with programmed cell death in Avena sativa. Plant Cell, 2004, 16, 857-873. CONRADT B., HOROVITZ R. H., The C. elegans protein EGL-1 is required for programmed cell death and interacts with Bcl-2 like protein CED-9. Cell, 1998, 93, 4, 519-529. COURTOIS-MOREAU CH., Programmed cell death in xylem development. Doctoral Thesis, Umeå University, Sweden, 2008, 58p. DANGL J. L., JONES J. D. G., Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature, 2001, 411, 826, 833. DĂNĂILĂ L., ALECU M., COMAN G., Apoptoza. Moartea celulară programată. Edit. Acad. Române, Buc., 1999, 410p. DEBATIN K. M., GOLDMAN K. C., WALDMANN A. T., KRAMMER H. P., APO-1- induced apoptosis of leukemia cells from patients with adult T-cell leukemia. Blood, 1993, 81, 11, 2972 – 2977. DeCOSTER M. A., MASVEKAR R., MADDI S., JACK J., McNAMARA J., Cellular morphological and biochemical changes during apoptosis in vitro: Links to Modeling. Louisiana Biomedical Research Network, 2008. http://lbrn.lsu.edu/portal/pdf/DeCoster_Pres_ 08.04.08.pdf DENAULT J. B., ECKELMAN P. B., SHIN H., POP C., SALVESEN G., Caspase-3 attenuates XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein)-mediated inhibition of caspase-9. Biochem. J., 2007, 405, 11-19. DENECKER G., OVAERE P., VANDENABEELE P., DECLERCQ W., Caspase-14 reveals its secrets. JCB, 2008, 180, 3, 451-458. DUAN Y., ZHANG W., LI B., WANG Y., LI K., SODMERGEN S., HAN CH., ZHANG Y., LI X., An endoplasmic reticulum response patway mediated programmed cell death of root tip induced by water stress in Arabidopsis. New Phytopatologist, 2010, 186, 3, 681-685. ECKARDT A. N., Programmed cell death in plants: a role for mitochondrial-associated hexokinases. The Plant Cell, 2006, 18, 2097-2099. EGUCHI K., Apoptosis in autoimmmune diseases. Intern. Med., 2001, 40, 4, 275-284. ELMORE S., Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology, 2007, 35, 4, 495-516. EVANS D.E., Programmed cell death in response to abiotic stress. Programmed cell death in plants, John G. (EDS), Blackwell Publishing, UK, 2004, 194-210. FAN T. J., HAN L. H., CONG R. S., LIANG J., Caspase family proteases and apoptosis. Acta Biochim. et Biophys. Sinica, 2005, 37, 11, 719-727. FERRARI D., LOS M., BAUER M. K., VANDENABEELE P., WESSELBORG S., SCHULZE-OSHOFF K., P2Z purinreceptor ligation induces activation of caspases with distinct roles in apoptotic and necrotic alterations of cell death. FEBS Letters, 1999, 447, 1, 71-75. FILONOVA H.L., BOZHKOV V.P., BRUKHIN B.V., DANIEL G., ZHIVOTOVSKY B., Von ARNOLD S., Two waves of programmed cell death occur during formation and development of somatic embryos in the gymnosperm, Norway spruce. Journal of Cell Science, 2000, 113, 4399-4411.

175

FINK L. S., GOOKSON T. B., Apoptosis, pyroptosis and necrosis: mechanistic description of dead and dying eucariotic cells. Infection and Immunity, 2005, 73, 4, 1907-1916. FRADEJAS N., PASTOR M. D., BURGOS M., BEYAERT R., TRANQUE M., CALVO S., Caspase-11 mediates ischemia-induced astrocyte death: Involvement of endoplasmic reticulum stress and C/EBP homologous protein. Journal of Neuroscience, 2010, 88, 5, 1094-1105. FULDA S., DEBATIN K. M., Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer chemotherapy. Oncogene, 2006, 25, 4798-4811. GADJEV I., STONE M. J., GECHEV T. S., Programmed cell death in plants: new insight into redox regulation and the role of hydrogen peroxide. International Review of Cell and Molecular Biology, 2008, 270, 87-144. GARDNER L., LEE L., DANG C., The c-Myc oncogenic transcription factor. 2002. http://myc-cancer-gene.org/documents/MycReview.pdf GECHEV T. S., GADJEV I. Z., HILLE J., An extensive microarray analysis of AAL-toxin-induced cell death in Arabidopsis thaliana brings new insights into the complexity of programmed cell death in plants. Cell. Moll Life Sci., 2004, 61, 1185-1197. GECHEV T. S., VAN BREUSEGEM F., STONE J. M., DENEV I., LALOI C., Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioassays, 2006, 28, 1091-1101. GEWIES A., Introduction to apoptosis. ApoReview, 2003, 23p. www.celldeath.de/ encyclo/aporev.htm GHIORGHIŢĂ G., Despre biogeneză şi bioevoluţie. Edit. „Alma Mater”, Bacău, 2009, 186p. GREENBERG J. T., Programmed cell death in plant-pathogen interactions. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant mol. Biol., 1997, 48, 525-545. GONZALES J. I., Metacaspases and their role in the life cycle of human protozoan parasites. Biomedica revista del Instituto Nacional de Salud, 2009, 29, 3, 485-493. GONZALES M. A., ORLANDO A. R., Curcumin and resveratrol inhibit nuclear factor-kappaB-mediated cytokine expression in adipocytes. Nutrition and Metabolism, 2008, 5, 17. GRAHAM R. K., DENG Y., SLOW E. J., HAIGH B., BISSADA N., et al., Cleavage of the caspase-6 site is required for neuronal disfunction and degeneration due to mutant huntigtin. Cell, 2006, 125, 6, 1179-1191. GROOVER A., Plant cells get the axe!!! www.bio.unc.edu/faculty/jones/lab/pcd GUO Y., SRINIVASULA S.M., DRUILHE A., FERNANDES-ALNEMRI T., ALNEMRI E.S., Caspase-2 induces apoptosis by releasing proapoptotic proteins from mitochondria. J. Biol. Chem., 2002, 277, 16, 13430-13437. HAIMOVITZ-FRIEDMAN A., KOLESNICK R. N., FUKS Z., Ceramide signaling in apoptosis. British medical Bull., 1997, 53, 3, 539 – 553. HATSUGAI N., KUROYANAGI M., ZAMADA K., MESHI T T., TSUDA S., KONDO M., NISHIMURA M., HARA-NISHIMURA I., A plant vacuolar protease, VPE, mediates virus-induced hypersensitive cell death. Science, 2004, 305, 5685, 855-858. HAY A. B., WOLF T., RUBIN M. G., Expression of baculovirus P35 prevents cell death in Drosophila. Development, 1994, 120, 2121-2129. HAYASHI T., FAUSTMAN D. L., Role of defective apoptosis in type 1 Diabetes and other autoimmune diseases. Recent Progress in Hormone Research, 2003, 58, 131-153. HENGARTNER M. O., The biochemistry of apoptosis. Nature, 2000, 407, 770-776. HETTS W. S., To die or not to die. An overview of apoptosis and its role in disease. The Journal of the American Medical Association (JAMA), 1998, 279, 4, 300-307. HITOMI J., KATAYAMA T., EGUCHI Y., KUDO T., TANIGUCHI M. et al., Involvement of caspase-4 in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis and Abeta-induced cell death. J. Cell Biol., 2004, 165, 3, 347-356.

176

HITOSHI Y., LORENS J., KITADA S.I., FISHER J., LABARGE M., RING H.Z., FRANCKE U., REED J.C., KINOSHITA S., NOLAN G.P., Toso, a cell surface, specific regulator of Fas-induced apoptosis in T cells. Immunity, 1998, 8, 4, 461-471. HORVITZ H. R., Genetic control of programmed cell death in the nematode Caenorhabditis elegans. Cancer Res., 1999, 59, 1701 – 1706. HSU H., XIONG J., GOEDDEL D. V., The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell death and NF-kappaB activation. Cell, 1995, 81, 4, 495-504. HSU H., HUANG J., SHU H.B., BAICHWAL V., GOEDDEL D.V., TNF-dependent recruitment of the protein kinase RIP to TNF receptor-1 signaling complex. Immunity, 1996, 4, 4, 387-396. HUR G.M., KIM Y.S., WON M., CHOCSI S., LIU Z.G., The death domain kinase RIP has an important role in DNA damage-induced, p53-independent cell death. J. Biol. Chem., 2006, 281, 35, 25011-25017. IAKIMOVA E., ATANASOV A., WOLTERING E., Chemical- and patogen-induced programmed cell death in plants. Biotechnol. and Biotechnol. Eq., 2005, 19, 124-138. INOHARA N., DING L., CHEN S., NUNEZ G., Harakiri, a novel regulator cell death, encodes a protein that activates apoptosis and interracts selectively with survival-promoting protein Bcl-2 and Bcl-XL. EMBO Journal, 1997, 16, 7, 1686-1694. JAN N., HUSSAIN M., ANDRABI K., Programmed cell death or apoptosis: Do animals and plants share anything in common. Biotechnol. and Mol. Biol. Reviews, 2008, 3, 5, 111-126. JANG M., PARK B. C., KANG S., LEE H. D., CHO S., BAE K. H., PARK G. S., Mining of caspase-7 substrates using a degradomic approach. MOLL. Cells, 2008, 26, 152-157. JOHNSON D. E., Noncaspase proteases in apoptosis. Leukemia, 2000, 14, 1695-1703. JONES M. A., Progammed cell death in development and defense. Plant Physiology, 2001, 125, 94-97. KAMADA SH., FUNAHASHI Y., TSUJIMOTO Y, Caspase-4 and caspase-5 members of the ICE/CED-3 family of cysteine proteases are CrmA-inhibitable proteases. Cell Death and Differentiation, 1997, 4, 6, 473-478. KANG S. J., WANG S., HARA H., PETERSON E. P., NAMURA S., AMIN-HANJANI S. et al., Dual role of caspase-11 in mediating activation of caspase-1 and caspase-3 under pathological conditions. J. Cell Biol., 2000, 149, 3, 613-622. KANG S. J., WANG S., KUIDA K., ZUAN J., Distinct downstream pathways of caspase-11 in regulating apoptosis and cytokine maturation during septic shock response. Cell Death and Differentiation, 2002, 9, 1115-1125. KANOUCHI H., NISHIZAKI H., MINATOGAWA Z., TONE S., Large complex formation of the inhibitor of caspase-activated Dnase. Apoptosis: an Internat. J. on PCD, 2005, 10, 3, 651-656. KERR F. R. J., A personal account of events leading to the definition of the apoptosis concept. Apoptosis: Biology and mechanisms. Ed. by S. Kumar, Springer, 1999, 1-10. KLEIN C., VASSILEV L. T., Targeting the p53-MDM2 interaction to treat cancer. British J. of Cancer, 2004, 91, 1415-1419. KOENIG U., ECKHART L., TSCHACHLER E., Evidence that caspase-13 is not human but a bovine gene. Biochemical and Biophysical Res. Communications, 2001, 285, 5, 1150-1154. KRISHNAMURTHY V.K., KRISHNARAJ R., CHOZHAVENDAN R., CHRISTOPHER F.S., The programme of cell death in plant and animals – A comparison. Current Science, 2000, 79, 9, 1169-1181. KUIDA K., Caspase-9. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2000, 32, 2, 121-124. LAKSHMAN U., PORTER G. A., Caspase-4 interacts with TNF receptor-associated factor 6 and mediates lipopolysaccharide-induced NF-kB-dependent production of IL-8 and CC

177

chemokine ligand 4 (Macrophage-inflamatory protein-1β). The Journal of Immunology, 2007, 179, 8480-8490. LAMB C., DIXON R. A., The oxidative burst in disease resistance. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1997, 48, 251-275. LEE H., HERNDON M. J., BARREIRO R., GRIFFITH S. T., FERGUSON A. T., TRAIL: A mechanism of tumor surveillance in an Immune privileged site. The Journal of Immunology, 2002, 169, 4739-4744. LEVINE A., TENHAKEN R., DIXON R., LAMB C., H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell, 1994, 79, 583-593. LIN J.D., The role of apoptosis in autoimmune thyroid desorders and thiroid cancer. BMJ, 2001, 322, 7301, 1525-1527. LIN Y., DEVIN A., RODRIGUEZ Y., LIU Z., Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 promote TNF-induced apoptosis. Genes and development, 1999, 13, 2514-2526. LIN Y., DEVIN A., COOK A., KEANE M.M., KELLIHER M., LIPKOWITZ S., LIU Z., The death domain kinase RIP is essential for TRAIL (Apo2L)-induced activation of IkB kinase and c-Jun N-terminal kinase. Moll. Cell. Biol., 2000, 20, 18, 6638-6645. LIU Z., SCHIFF M., CZYMMEK K., TALLOCZY ZS., LEVIN B., DINESH-KUMAR S.P. – Autophagy regulates programmed cell death during the plant innate immune response. Cell, 2005, 121, 4, 567-577. LOCKSHIN R. A., ZAKERI Z., Apoptosis, autophagy, and more. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2004, 36, 2405-2419. MACKAY I., LESKOVSEK N.V., ROSE N.R., Cell damage and autoimmunity: A critical appraisal. Int. Colloquium „Cell damage and autoimmunity”. Res. Report, American Autoimmune, 2007. MADEO F., HERKER E., WISSING S., JANGWIRTH H., EISENBERG T., FRÖLICH K.U., Apoptosis in yeast. Current Opinion in Microbiology, 2004, 7, 655-660. MAJNO G., JORIS I., Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am. J. Pathol., 1995, 146, 3-15. MANZL C., KRUMSCNABEL G., BOCK F., SOHM B., LABI V., LOGETTE E., BAUMGARTNER R.F., TSCHOPP J., VILLUNGER A., Caspase-2 activation in the absence of PIDD-osome formation. The Journal of Cell Biology, 2009, 185, 2, 291-303. MARGULIS L., Origin of eukaryotic cells. Yale University Press, 1970. MERINO D., LALAOUI N., MORIZOT A., SCHNEIDER P., SOLARY E., MICHEAU O., Differential inhibition of TRAIL-mediated DR5-DISC formation by decoy receptors 1 and 2. Mol. and Cell. Biol., 2006, 26, 19, 7046-7055. MESLIN B., ZALILA H., FASEL N., PICOT S., BIENVENU A.L., Are protozoan metacaspases potential parasite killers? Parasites and Vectors, 2011, 4, 26. MOLDOVEANU E., POPESCU M. L., Apoptoza. Mecanisme moleculare. Edit. Univ. „Carol Davila”, Buc., 1999, Ediţia a II-a, 165p. MOLL M. U., PETRENKO O., The MDM2-p53 interaction. Mol. Cancer Res., 2003, 1, 1001-1008. MORGAN M., THORBURN J., PANDOLFI P. P., THORBURN A., Nuclear and cytoplasmic shuttling of TRADD induces apoptosis via different mechanisms. Journal of Cell Biology, 2002, 157, 6, 975-984. MUHLENBOCK P., PLASZCZYCA M., MELLEROWICZ E., KARPINSKI S., Lysigenous aerenchyma formation in Arabidopsis is controlled by lesion simulating disease1., Plant Cell, 2007, 19, 3819-3830. NAKAGAWA T., ZHU H., MORISHIMA N., LI E., XU J., YANKNER B. A., YUAN J., Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum specific apoptosis and cytotoxicity by amiloid-beta. Nature, 2000, 403, 6765, 98-103.

178

NANDA S., MISHRA S., VARSHNEZ P.V., SINGH B.R., A biotechnological approach to apoptosis of somatic and germ cells in living organisms. The Open Nutraceuticals Journal, 2010, 3, 81-93. NATHANIEL R., MAC NEILL L. A., WANG Y. X., TURNER C. P., MOYER W. R., Cowpox virus CrmA, Myxoma virus SERP2 and baculovirus P35 are not functionaly interchangeable caspase inhibitors in poxvirus infections. Journal of General Virology, 2004, 85, 1267-1278. NGUYEN X.H., LANG P.A., LANG K.S., ADAM D., FATTAKHOVA G., FÖGER N., KAMAL M.A., PRILLA P., MATHIEU S., WAGNER C., MAK T., CHAN A.C., LEEK.H., Toso regulates the balance between apoptotic and nonapoptotic death receptor signaling by facilitating RIP1 ubiquitination. Blood, 2011, 118, 3, 598-608. NICULAE M., BRCA1, BRCA2 – markeri genetici în cancerul de ovar, 2008. http: //www.blogdesanatate.ro OBENG A.E., BOISE H. L., Caspase-12 and caspase-4 are not required for caspase-dependent endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis. Journal of Biol. Chem. (JBC), 2005, 280, 29578-29587. OBERST A., DILLON P. C. H., WEINLICH R., MCCORMICK L. L., FITZGERALD P., POP C., HAKEM R., SALVESEN S. G., GREEN R. D., Catalytic activity of the caspase.8-FLIPL complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature, 2011, 471, 7338, 363-367. PALAVAN-UNSAL N., BUYUKTUNCER E. D., TUFEKCI M. A., Programmed cell death in plants. Journal of Cell and Molecular Biology (Turky), 2005, 4, 9-23. PĂUNESCU V., Aspecte actuale în carcinogeneza colo-rectală. Rolul apoptozei. Jurnalul de Chirurgie, Iaşi, 2006, 2, 4, 344-351. PENNELL I. R., LAMB C., Programmed cell death in plants. The Plant Cell, 1997, 9, 1157-1168 PETRUŞCA N. D. POPA O. M., MEŞTER L., Apoptoza. Implicaţii în patologia malignă, 157-178. http://www.docstoc.com/docs/112313178/ PHILCENKOV A., ZAVELEVICH M., KROCZAK J. T., LOS M., Caspases and cancer: mechanisms of inactivation and new treatment modalities. Exp. Oncology, 2004, 26, 2, 82-97. PISTRITTO G., JOST M., SRINIVASULA M. S., BAFFA R., POYET J. L., KARI C., LAZEBNIK Y., RODECK U., ALNEMRI E. S., Expression and transcriptional regulation of caspase-14 in simple and complex epithelia. Cell Death and Differentiation, 2002, 9, 9, 995-1006. POP C., SALVESEN S.G., Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biol. Chemistry, 2009, 284, 21777-21781. REN Y. G., WAGNER W. K., KNEE A. D., AZA-BLNC P., NASSOF M., DEVERAUX L. Q., Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the recognition particle. Mol. Biol. Cell., 2004, 15, 11, 5064-5074. POP C., OBERST A., DRAG M., VAN RAAM J. B., RIEDL J. S., GREEN R. D., SALVESEN S. G., FLIPL induces caspase-8 activity in the absence of interdomain caspase-8 cleavage and alters substrate specificity. Biochem. J., 2011, 433, 447-457. PORTMAN A. M., The adenine nucleotide translocator: regulation and function during myocardial development and hypertrophy. Clinical and Exp. Pharmacol. and Physiol., 2002, 29, 334-338. QI Y., WANG H., ZOU Y., LIU C., LIU Y, WANG Y., ZHANG W., Over-expression of mitochondrial heat shock protein 70 supresses programmed cell death in rice. FEBS Letters, 2009, 55, 1, 231-239. RAO V. K., STRAUSS S. E., Causes and consequences of the autoimmune lympho-proliferative syndrome. Haematology, 2006, 11, 15-23.

179

REAPE J. T., MOLONY M. E., McCABE F. P., Programmed cell death in plants: distinguishing between different modes. 2007. http: jxb.oxfordjournals.org/cgi/content/ full/erm258v1. REHEMTULLA A., HAMILTON C.A., CHINNAYAN A.M., DIXIT V.M., Ultraviolet radiation-induced apoptosis is mediated by activation of CD-95 (Fas-Apo1). J. Biol. Chem., 1997, 272, 25783-25786. RICCI J. E., Les mecanismes moleculaire de l’apoptose. 123bio.net. Biologie et Recherche. Sofia Antipolis. 2002, 48p. France. http://www.123bio.net/revues/jericci /iapoptose.html ROGERS H. J., Programmed cell death in floral organs: How and why do flowers die? Ann. Bot., 2006, 97, 309-315. SAHDEV S., SAINI S. K., HASNAIN E. S., Baculovirus P35 protein: An overview of its applications across multiple therapeutic and biotechnological arenas. Biotechnology Progress, 2010, 26, 2, 301-312. SALEH M., GREEN D.R., Caspase-1 inflammasomes: choosing between death and taxis. Cell Death and Differentiation, 2007, 14, 1559-1560. SALSKOV-IVERSEN M. L., JOHANSEN C., KRAQBALLE K., IVERSEN L., Caspase-5 expression is upregulated in lesional psoriatik skin. J. Investigative Dermatology, 2011, 131, 3, 670-676. SANMARTIN M., JAROSZEWSKI L., RAIKHEL V.N., ROJO E., Caspases. Regulating death since the origin of life. Plant Phsiol., 2005, 137, 3, 841-847. SARASTE A., PULKKI K., Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. Cardiovascular Research, 2000, 43, 3, 528-537. SCHIMMER D. A., HEDLEY W. D., PENN Z. L., MINDEN D. M., Receptor- and mitochondrial-mediated apoptosis in acute leukemia: a translational view. Blood, 2001, 98, 13, 3541-3553. SCHNEIDER P., THOME M., BURNS K., BODMER J. L., HOFMANN K., KATAOKA T., HOLLER N., TSCHOPP J., TRAIL receptors 1 (DR4) and 2 (DR5) signal FADD-dependent apoptosis and activate NF-kappaB. Immunity, 1997, 7, 6, 831 – 836. SHEN Q., QIN F., GAO Z., CUI J., XIAO H., XU Z., YANG CH., Adenine Nucleotide Translocator cooperates with core death machinery to promote apoptosis in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology, 2009, 29, 14, 3881-3893. SHIMIZU SH., MATSUOKA Y., SHINOHARA Y., YONEDA Y., TSUJIMOTO Y., Essential role of Voltage-dependent anion channel in various forms of apoptosis in mammalian cells. J. Cell Biology, 2001, 152, 2, 237-250. SOMANI R. R., KALANTRI P., OKADAM V., Apoptosis: concept, mechanisms and clinical implications. Pharmainfo. net. 2010. SORELLE R., Faulty dendritic cell mechanism triggers autoimmune diseases. Baylor College of Medicine (BCM), 2006, 5, 3, 4. SONG Y., JACOB C.O., The mouse celle surface protein TOSO regulates Fas/Fas ligand-induced apoptosis through its binding to Fas-associated death domain. J. Biol. Chem., 2005, 280, 10, 9618-9626. SOUNG H. Y., LEE W. J., KIM S. H., PARK S. W. et al., Inactivating mutations of caspase-7 gene in human cancers. Oncogene, 2003, 22, 8048-8052. SPANDIDOS D. A., SOURVINOS G., TSATSANIS C., ZAFIROPOULOS A., Normal ras genes: their onco-suppressor and pro-apoptotic functions (Review). Int. J. of Oncology, 2002, 21, 237-241. SPRICK R. M., RIESER E., STAHL H., GROSSE-WILDE A., WEIGAND A. M., WALCZAK H., Caspase-10 is recruited to an activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signaling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. The EMBO Journal, 2002, 21, 4520-4530.

180

STOIAN M., Semnificaţia şi implicaţiile apoptozei în studiul citogenetic al cancerului colorectal. 2006. http:// www.embo.ro/article.php? Story…mode. STRAUSS S. E., SNELLER M., LENARDO M. J., PUCK J. M., STROBER W., An inherited disorder of lymphoproliferative apoptosis: the autoimmune lympho-proliferative syndrome. Annals of Internal Medicine, 1999, 130, 591-601. STUART L., HUGHES J., Apoptosis and autoimmunity. Oxford J. Med., Nephrology, Dialysis Transplantation, 2002, 17, 697-700. SUAREZ M.F., FILONOVA l.H., SMERTENKO A., SAVENKOV E.I., CLAPHAM D.H., von ARNOLD S., ZHIVOTOVSKY B., BOZHKOV P.V., Metacaspase-dependent programmed cell death is essential for plant embryogenesis. Curr. Biol., 2004, 14, 339-340. SUK K., Role of caspases in activation-induced cell death of neuroglia. Current Enzyme Inhibition, 2005, 1, 43-50. SUK K., KIM S. Y., KIM H., Essential role of caspase-11 in activation-induced cell death of rat astrocytes. Journal of Neurochemistry, 2002, 80, 2, 230-238. SUNDSTRÖM F.J., VACULOVA A., SMERTENKO P. A., SAVENKOV I. E., GOLOVKO A., MININA E., TIWARI S. B. et al., Tudor staphylococcal nuclease is an evolutionarily conserved component of the programmed cell death degradome. Nature Cell Biology, 2009, 11, 1347-1354. TAI T.S., FANG L.V., LAI M.Z., c-FLICE inhibitory protein expression inhibits T cell activation. Cell Death Differ., 2004, 11, 69-79. TINEL A., TSCHOPP J., The PIDD-osome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science, 2004, 304, 5672, 843-846. UREN A.G., O’ROURKE K., ARAVIND L., PISABARRO M.T., SESHAGIRI S., KOONIN E.V., DIXIT V.M., Identification of paracaspases and metacaspases: two ancient families of caspase-like proteins one of which plays a key role in MALT lymphoma. Mol. Cell, 2000, 6, 961-967. VAIDYA S., HARDY A. J., Caspase-6 latent state stability relies on helical propensity. Biochemistry, 2011. http://people.umass.edu/jhardy/pdfs/Vaidya 2011 VALLAN C., FENG ZH., JAGGI R., Morphological changes during programmed cell death (PCD) in the involuting mouse mammary gland. 1998. Site: http://mammary.nih.gov/reviews/ development/Jaggi001/index.html. VAN CRUCHTEN S., VAN DEN BROECK W., Morphological and biochemical aspects of apoptosis, oncosis and necrosis. Anat. Histol. Embryol., 2002, 31, 214-223. VAN WAES C., Nuclear factor-kappaB in development, prevention, and therapy of cancer. Clin. Cancer Res., 2007, 13, 4, 1076 -1082. VANNIER M. V., Imaging apoptosis in rheumatoid arthritis. J. of Nuclear Med., 2002, 43, 10, 1366-1367. VERCAMMEN D., DECLERQ W., VANDENABEELE P., VAN BREUSEGEM F., Are metacsapases caspases? The Journal of Cell Biology, 2007. http:// jcb.rupress.org/content. VOUSDEN K. H., LU X., Live or let die : the cell’s response to p53. Nat. Rev. Cancer, 2002, 2, 8, 594-604. WAHEED S., HAMMOND L., BIRO A., MIRAKIAH R., Apoptotic gene expression in autoimmune thyroid disease. Endocrine Abstracts, 2002, 4, 94. WALSH G. J., CULLEN P. S., SHERIDAN C., LUTHI U. A., GERNER CH., MARTIN J. S., Executioner caspase-3 and caspase-7 are functionally distinct proteases. 2008. http://www.pnas.org/content/105/35/12815.short WANG K.L.C., LI H., ECKER J.R., Ethylene biosynthesis and signaling networks. Plant Cell, 2002, 14, 131-151. WANG L., DU F., WANG X., TNF-α induces two distinct caspase-8 activation pathways. Cell, 2008, 133, 4, 693-703.

181

WANG SH., EL-DEIRY S. W., TRAIL and apoptosis induction by TNF-family death receptors. Oncogene, 2003, 22, 8628-8633. WARING P., MÜLLBACHER A., Cell death induced by the Fas/Fas ligand pathway and its role in pathology. Immunology and Cell Biol., 1999, 77, 312/317. WATANABE N., LAM E., BAX Inhibitor-1 modulates endoplasmic reticulum stress-mediated programmed cell death in Arabidopsis. J. Biol. Chem., 2008, 283, 3200-3210. WATANABE N., LAM E., Two Arabidopsis metacaspases AtMCP1b and AtMCP2b are arginine/lysine-specific cysteine pro. J. Biol. Chem., 2005, 280, 14691-14699. WHITE S., ROSEN A., Apoptosis in systemic lupus erythemathosus. Current opinion in Rheumatology, 2003, 15, 5, 557-562. WOLTERING E.J., van der BENT A., HOEBERICHTS F.A., Do plant caspases exist? Plant Physiol., 2002, 130, 1764-1769. XUE D., HORVITZ H., Baculovirus p35 protein is a substrate for and inhibitor of the C.

elegans cell-death protease CED-3. Worm Breeders Gazette, 1995, 14. XUE Y., DALY A., YNGVADOTTIR B., LIU M. Et al., Spread of an inactive form of caspase-12 in humans is due to recent positive selection. Am. J. Human Genet., 2006, 78, 4, 659-670. YAMADA k., SHIMADA T., NISHIMURA M., HARA-NISHIMURA I., A VPE family supporting various vacuolar functions in plants. Phsysiologia Plantarum, 2005, 123, 4, 369-375. YAMAMOTO R., FUJIOKA S., TAKATSUTO S., ZOSHIDA S., FUKUDA H., Brassinosteroid levels increase drastically prior to morphogenesis of tracheary elements. Plant Physiol., 2001, 125, 556-563. YAMAMURO A., KISHINO T., OHSHIMA ZU., YOSHIOKA Y., TOMOKI K., KASAI A., MAEDA S., Caspase-4 directly activates caspase-9 endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis S-SY5Y cells. Journal of Pharmacological Sciences, 2011, 115, 2, 239-243. ZHANG H. Y., MAN J. H., LIANG B., ZHOU T., WANG C. H., LI T., et al., Tumor-targeted delivery of biologically active TRAIL protein. Cancer Gene Therapy, 2010, 17, 334 – 343. ZHANG J., ZHANG D., HUA Z., FADD and its phosporilation. Life, 2004, 56, 7, 395-401. ZHANG W.H., WNG C.X., QIN C.B., WOOD T., OLAFSDOTTIR G., WELTI R., WANG X.M., The oleate-stimulated phospholipase D, PLD delta and phosphatidic acid decrease H2O2-induced cell death in Arabidopsis. Plant Cell, 2003, 15, 2285-2295. http://www.bio.davidson.edu/COURSE/Immunology/Students/spring 2006/McCraken/ALPS. html http://adam.about.com/reports/000063_1.htm http://www.rndsystems.com/mini_review_detail_objectname_MR97_Caspases.aspx http://en.wikipedia.org.wiki/Programmed_cell_death http: www.sciencedaily.com/releases/2009/10/0910131055335.htm ‘Cell death occurs in same way in plants and animals’ http: //www.cancerquest.org/ras-oncogene.Oncogenele Ras. http: //deathbase.org/protein_report.php?id=C.elegans_F23B129. Deathbase http: //www.science20.com. Programmed cell-death – in plants, animals and humans, One thing we all have in common. http://www.uniprot.org/uniprot/P29466 http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/Casp1ID145ch11q22.html http://www.uniprot.org/uniprot/P42575 http://www.uniprot.org/uniprot/P42574 http://www.uniprot.org/uniprot/Q13158

182

http://www.uniprot.org/uniprot/P49662 http://www.uniprot.org/uniprot/P51878 http://uniprot.org/uniprot/P55212 http://uniprot.org/uniprot/Q14790 http://uniprot.org/uniprot/Q92851 http://uniprot.org/uniprot/P31944 http://www.uniprot.org/uniprot/P78527 http://www.uniprot.org/uniprot/O75601 http://www.sigmaldrich.com/etc/medialib/does/Sigma/Datasheet/3 http://www.celldeath.de/encyclo/caspases/caspase9.htm http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/CASP9ID423ch1p36.htm http://en.wikipedia.org/wiki/Pyroptosis http: ro.wikipedia.org/Apoptoza http:// en.wikipedia.org.wiki/Apoptosis http: //en.wikipedia.org/wiki/Caspase http: //en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death http://en.wikipedia.org/wiki/Nerve_growth_factor http://en.wikipedia.org/wiki/Thioredoxin http://en.wikipedia.org/wiki/Poly_ADP_ribose_polymerase http://en.wikipedia.org/wiki/TRAIL http://en.wikipedia.org/wiki/NF+%CE%BAB http://en.wikipedia.org/wiki/Tumor_necrosis_factor/alfa http://www.ganfyd.org.indexphp?title=Nuclear_factor_kappaB http://www.copewithcytokines.de/cope.cgl.l?key=EGL-1 http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi?key=baculovirus%20p35%20protein http://www.copewithcytokines.de/cope.cgl?key=crmA http://www.copewithcytokines.de/cope.cgl?key=RIP http://www.copewithcytokines.de/cope.cgl?key=RAIDD http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology... http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application..... http://deathbase.org/protein_report.php?id=C.elegans_F23B12.9 http://apresslp.gvpi.net/apcyto/lpext.dll/Family/part15/lis16c012/hpro6 http://www.sabiosciences.com/pathhway.php?sn=TRAIL

183

Glosar de termeni

AIF (factorul de inducere a apoptozei) - este o moleculă situată în spaţiul intermembranar mitocondrial, care are funcţie dublă: de oxido-reductază şi de factor apoptogen. AKT sau protein-kinaza B - este o enzimă cu rol în apoptoză, având acţiune anti-apoptotică. S-a observat că prezenţa ei în exces în neuroni a crescut rezistenţa acestora la apoptoză. Amfipatic. Structurile amfipatice au două suprafeţe, una hidrofilă şi una hidrofobă. Lipidele sunt molecule amfipatice, dar şi unele regiuni ale proteinelor pot forma helixuri amfipatice (cu o faţă încărcată şi alta neutră). Annexina-1. Proteină de 37 kDa, reglată de glucorticoizi, considerată a fi implicată în reglarea fagocitozei, în semnalizarea şi proliferarea celulară. ANT (adenine nucleotide translocator) sau ADP/ATP-translocator. Proteină mitocondrială care catalizează schimbul de ADP şi ATP prin membrana mitocondrială internă. Proteina are 3 izoforme, notate cu ANT1, ANT2 şi ANT3, codificate de gene reglate diferenţiat. ANT3 este exprimată ubiquitar în toate ţesuturile şi nivelul ei de transcripţie este proporţional cu nivelul metabolismului oxidativ. Apaf-1 (apoplastic peptidase activating factor 1). Proteină ce iniţiază apoptoza prin interacţiune cu cyt.c şi dATP, formând apoptosomul. Apoptosomul leagă apoi procaspaza-9, pe care o clivează, generând forma ei matură, caspaza-9. Apoplast. Spaţiul de difuzie din afara membranei plasmatice, important în interacţiunea plantelor cu mediul. El include pereţii celulari, spaţiile intercelulare şi lumenul structurilor moarte (cum sunt vasele xilemului) prin care apa şi soluţiile trec liber. În timpul stresului oxidativ local apa oxigenată şi anionul superoxid pot difuza prin apoplast şi genera un semnal de avertizare la celulele învecinate. Apoptosom. Complex format din citocromul c, Apaf-1 (în prezenţa ATP) şi procaspaza-9, care asigură activarea caspazei-9. Această caspază activează la rândul ei cascada de caspaze efectoare (caspazele -3, -7 şi -6), care în final determină moartea celulară Apoptoză. Apoptoza sau moartea celulară programată la animale este un fenomen fiziologic normal prin care un organism pluricelular elimină unele celule, realizându-şi astfel homeostazia celulară. Procesul este unul activ (se petrece cu consum de energie), programat, dependent de semnale celulare codificate genetic şi se caracterizează prin rotunjirea şi micşorarea celulei, condensarea cromatinei (picnoza), fragmentarea nucleului (cariorexie), formarea de vezicule la suprafaţa externă a membranei celulare (blebbing), clivajul internucleosomal al ADN-ului în fragmente caracteristice de 180 pb şi formarea de corpi apoptotici care sunt fagocitaţi şi dispar fără urme şi fără instalarea unui răspuns inflamator. Un rol foarte important în apoptoză au caspazele. ARC protein. Membru al familiei de gene IEG (immediate-early gene). Proteina ARC intervine în fenomenele de plasticitate sinaptică Autofagie. Autofagia reprezintă un proces catabolic major la eucariote, în care o porţiune a citoplasmei este înghiţită într-o membrană şi este livrată lizozomilor (la animale) şi vacuolei (la plante şi fungi), unde va fi digerată de enzimele hidrolitice. Autofagia începe deci cu sechestrarea de material citoplasmatic în vezicule cu membrană dublă (autofagosomi), proces controlat de GTP-aze şi fosfatidil-inositol-kinaze, autofagosomii fuzionând apoi cu lizozomii.

Bcl-2. Proteinele din familia Bcl-2 sunt omoloage şi joacă un rol major în reglarea apoptozei, mai cu seamă prin modularea activităţii unor caspaze (în special a caspazei-9) şi a unor factori apoptogeni.

CAD (dezoxiribonucleaza activată de caspază). Endonuclează dependentă de magneziu, care joacă rol important în degradarea ADN în apoptoza mamiferelor. Sediul ei este în nucleu, unde formează un complex cu inhibitorul ei specific ICAD. Calrecutilina. Proteină de legare a calciului. Cariorexie. Faţă de condensarea normală a cromatinei specifică mitozei, în apoptoză se produce o condensare rapidă a cromatinei, urmată de intervenţia imediată a endonucleazelor, care o degradează în fragmente de ADN de cca 180-200 pb (la nivelul zonelor internucleosomale, un marker important al apoptozei), fenomen denumit cariorexie (karyorrhexis).

184

Cascadă de activare, imediat după activarea caspazelor iniţiatoare, ele clivează alte caspaze aflate încă în stadiul de zimogen (în special caspazele de execuţie). Caspazele (cysteinil-aspartate-cleaving-proteases). Cistein-proteaze care fac parte din clanul CD, familia C14 şi au rol extrem de important în apoptoză. Denumirea lor s-a stabilit astfel: „c” provine de la cisteina prezentă în centrul activ (QACRG, după alţii QACxG), iar „aspază” de la specificitatea lor strictă de a scinda legăturile peptidice ale substratului după un rest de acid aspartic. Caspazele au fost clasificate pe subfamilii: caspaze activatoare (iniţiatoare) a apoptozei, caspaze de execuţie a apoptozei şi caspaze care mediază inflamaţia. ced/Ced. Denumirea genelor/proteinelor de la nematodul Caenorhabditis elegans care controlează apoptoza la acest vierme (C. e. death): proteinele Ced-3 şi Ced-4 sunt implicate în iniţierea şi desfăşurarea apoptozei, iar proteina Ced-9 o blochează. Chaperon. Proteinele chaperon asigură împachetarea tridimensională corectă a unor proteine după părăsirea ribozomului (asigură maturarea lor, cu alte cuvinte). Ele iau parte la transportul transmembranar al proteinelor, la degradarea unor proteine, la fenomenul de inhibare a agregării proteinelor, la reactivarea proteinelor denaturate, la reglarea răspunsului la şocul termic etc. Ciclofilina-D. Proteină localizată în matrixul mitocondrial, componentă a porului de tranziţie (PT) care reglează deschiderea acestuia. Deschiderea PT determină creşterea permeabilităţii membranei interne a mitocondriilor şi permite influxul moleculelor din citosol în matrix. Volumul matrixului se măreşte şi ca urmare se produce ruperea membranei mitocondriale externe. c-Myc. Genă localizată pe cromosomul 8 la om, care codifică un factor de transcripţie care se leagă la ADN-ul altor gene. Se crede că acest factor de transcripţie reglează expresia a 15% din toate genele prin legarea la secvenţele Enhancer Box (E-boxes) şi recrutarea acetil-transferazelor histonice. c-Myc reglează de asemenea şi structura globală a cromatinei prin procesul de reglare a acetilării histonelor. În multe forme de cancer s-a identificat o variantă mutant a genei Myc, care face ca ea să se exprime continuu, ceea ce determină exprimarea neregulată a multor gene, unele din ele implicate în proliferarea celulară. Gena Myc a fost descoperită prima dată la pacienţii cu limfom Burkitt, dezvoltat în urma unei translocaţii a genei [t(8:14)]. CrmA. Proteină codificată de o genă precoce a virusului cowpox (virusul vaccinului), care are efect inhibitor asupra inflamaţiei şi a recrutării macrofagelor la locul infecţiilor. Gena crmA (care reglează răspunsul la citokine) codifică o proteină (serpina) care inhibă specific caspaza-1 şi astfel împiedică proteoliza IL-1β (şi implicit răspunsul la infecţiile virale). Este o modalitate prin care virusurile inhibă apoptoza în celulele infectate. CrmA este un inhibitor puternic al caspazelor-1 şi -8 şi un inhibitor mai slab al caspazelor -3 şi -6.

DPPI (dipeptidil-peptidaza I sau catepsina C). Cistein-protează cu specificitate de clivare a dipeptidelor de la capătul N-terminal al proteinelor. Degradom. Denumire sub care sunt reunite proteazele, substraturile şi inhibitorii lor, implicaţi în MCP la un anumit grup de celule. DISC (Death Inducing and Signaling Complex). Complex format din receptorii morţii, proteinele adaptor FADD/TRADD şi procaspaza-8, a căror cuplare determină activarea caspazei-8.

Eferocitoză (efferocytosis).Fenomenul de înlăturare a celulelor moarte de către celulele fagocitare din vecinătate.

FADD/MORT1, (Fas-associated protein with death domain). Gena FADD codifică o proteină adaptor localizată în citosol, care interacţionează cu receptori celulari de suprafaţă, mediind semnale de apoptoză celulară. Prin intermediul domeniului morţii (DD), C-terminal, ea poate fi recrutată de receptorul TNFR (participând la semnalizarea morţii celulare), iar prin domeniul efector al morţii (DED), N-terminal, mediază oligomerizarea şi activarea zimogenilor caspazei-8 (activând astfel cascada de caspaze). Fas/Fas-ligand. Sistemul Fas/FasL (APO-1/CD95) este un sistem de inducere a apoptozei în celulele tumorale şi în celulele infectate cu virusuri. Receptorul Fas la om este o proteină transmembranară constituită din 325 de aminoacizi, având o secvenţă semnal la capătul N-terminal şi o regiune de legare la membrană situată în mijlocul moleculei (este o moleculă membranară de tip I). Structura lui este omoloagă cu a familiei de receptori TNF şi NGF. La exterior se cuplează cu ligandul specific

185

FasL (care este o citokină ce aparţine familiei TNF). Prin cuplarea Fas cu FasL se produc modificări de conformaţie a domeniilor tanatogene ale receptorului Fas, care permit legarea la acest domeniu a moleculelor adaptor. FasL. Moleculă homotrimerică de membrană. Fiecare trimer FasL leagă trei molecule de receptor Fas de la suprafaţa celulei ţintă. Are loc apoi recrutarea proteinei adaptor FADD din citosol prin legarea domeniilor morţii DD. Fc. Domeniul Fc al imunoglobulinelor este format din două lanţuri grele şi asigură ca fiecare anticorp să genereze un răspuns imun adecvat pentru un antigen dat. Fenton. Reacţia Fenton reprezintă cataliza de către Fe a peroxidului de hidrogen cu formarea de radicali liberi hidroxil. Este o reacţie folosită practic în tratarea unor poluanţi acvatici precum fenolii, formaldehida, unele pesticide etc Fitoalexine. Substanţe antimicrobiene sintetizate de plante. c-FLIP. Proteină care inhibă apoptoza receptor-mediată prin interacţiuni specifice cu FADD şi procaspaza-8. Fodrina. Endoproteină globulară specifică citoscheletului. Fos. Familie de gene cu 4 membrii (Fos, FosB, FosL1, FosL2), care codifică proteine capabile să dimerizeze cu proteinele din familia JUN şi să formeze un factor complex de transcripţie, AP1. Participă la reglarea proceselor de proliferare, diferenţiere şi transformare a celulelor, în unele cazuri expresia genelor Fos fiind asociată cu apoptoza.

Gene omolo(a)ge. Genă înrudită cu o altă genă, care au descins dintr-o secvenţă de ADN ancestrală comună. Gene ortolo(a)ge. Gene prezente la specii diferite, care au aceeaşi funcţie şi care provin prin speciaţie dintr-o genă ancestrală comună (gene care au devenit divergente după un eveniment de speciaţie). Gene paralo(a)ge. Gene provenite prin duplicaţie care, deşi sunt înrudite, dezvoltă funcţii diferite (sunt gene care au devenit divergente în urma unui proces de duplicaţie). GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) – este o citokină pleiotropică ce controlează producţia şi funcţia celulelor sanguine. GM-CSF promovează creşterea, supravieţuirea, diferenţierea şi activarea celulelor mieloide normale şi joacă rol important în leucemiile mieloide. Granzime. Familie de serin-proteaze specifice CTL, prezente alături de perforină în granulele citolitice. Granzimele sunt sintetizate ca precursori inactivi, care prezintă un dipeptid la capătul N-terminal, prin a cărui eliminare se realizează activarea enzimei.

hsp (heat shock proteins). Proteine cu funcţii importante în viaţa celulelor şi în supravieţuirea lor în condiţii de stres (în special la temperaturi ridicate, de unde şi denumirea lor), fiind înalt conservate de-a lungul evoluţiei.

IAP genes (Genele/proteinele IAP). Gene/proteine identificate prima dată în celulele de insecte infectate de baculovirus. Ele sunt prezente la mamifere, insecte şi baculovirusuri (fiind gene înalt conservate în evoluţie). Ele codifică proteine care inhibă apoptoza. În plus, aceste gene sunt implicate în semnalul de transducţie, în reglarea ciclului celular şi se pare că posedă însuşiri neuroprotectoare. Inflamasomi. Platforme multi-proteice de activare pentru caspazele inflamatoare.

JNK (MAPK8), (c-Jun N-terminal kinases). Membrii familiei de proteine JNK (protein-kinaze mitogen-activate) acţionează ca punct de integrare pentru semnale biochimice intracelulare ce guvernează o serie de procese celulare (proliferare şi diferenţiere celulară, apoptoză etc); sunt proteine care mediază expresia timpurie a genelor ca răspuns la semnale de stres diverse. Activarea JNK poate determina iniţierea apoptozei Fas-indusă. Prin activitatea ei serin-treonin-kinazică, JNK poate participa la fosforilarea unor proteine din familia Bcl-2 sau a proteinei p53, implicându-se astfel în procesul de apoptoză. JNK prezintă 10 izoforme derivate de la 3 gene: JNK1, JNK2, JNK3. c-Jun. Kinază care în combinaţie cu c-Fos formează factorul de transcripţie AP-1. Iniţial a fost identificată ca proteina-39. Este activată prin fosforilare dublă de JNK. Absenţa genei c-Jun este letală. Se consideră că proteinele c-Jun au 3 funcţii: dimerizarea cu c-Fos, legarea la ADN şi activarea transcripţională.

186

Laminine (lamine). Complex glicoproteic ce constituie lama bazală, cu greutatea moleculară de 850 kDa, alcătuit din 3 lanţuri polipeptidice: laminina A (400 kDa), laminina B1 (230 kDA) şi laminina B2 (200 kDa). Cele 3 lanţuri formează un trimer sub formă de cruce, la nivelul căruia fiecare lanţ polipeptidic prezintă domenii globulare funcţionale prin care se leagă la receptori specifici de pe suprafaţa celulelor şi de componente ale matricei extracelulare. Lisofosfatidilcolină (LPC). Fosfolipid bioactiv a cărui acţiune este mediată prin activarea proteinelor G de membrană; stimulează expresia MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) Lizigenie. Mecanism prin care are loc diferenţierea canalelor secretoare şi a cavităţilor în care se strâng uleiurile volatile la unele specii de plante. Un fenomen asemănător se petrece şi în cazul formării aerenchimului lizigen la alte specii de plante (orez, grâu, orz, porumb etc), în care mor celule formate anterior în ţesut pentru a crea spaţii prin care circulă aerul. LSD1. Proteină ce monitorizează un semnal superoxid-dependent şi funcţionează ca regulator negativ al morţii celulare la plante.

Metacaspaze. Rude îndepărtate ale caspazelor, specifice doar eucariotelor lipsite de caspaze; execută activităţi de tip caspază, fiind implicate în moartea celulară la plante, deşi nu pot cliva substraturile caspazelor. Motiv. Secvenţă înalt conservată de aminoacizi din structura unei proteine care este asociată cu o anumită funcţie a proteinei.

Necroza celulară. Formă patologică de moarte celulară, accidentală, necontrolată, haotică, datorată unor leziuni mecanice, hipoxiei, acţiunii unor agenţi fizici dăunători sau unor toxine etc, care se produce fără consum de energie, care se caracterizează prin umflarea celulelor (oncoză), dilatarea organitelor, ruperea membranei plasmatice şi a endo-membranelor, având drept consecinţă eliberarea rapidă a enzimelor hidrolitice în celulă care determină distrugerea celulei. Fragmentele rezultate în urma dezintegrării aleatorii a celulei moarte sunt fagocitate de macrofage întocmai ca particulele străine pătrunse în organism, de unde şi apariţia unui proces inflamator. NF-kB. Factorul nuclear kB (Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B

cells).Proteină ce acţionează ca factor de transcripţie care se găseşte în aproape toate tipurile de celule animale. Are rol cheie în reglarea răspunsului imun la infecţii. Este implicat în răspunsul celulelor la stimuli diverşi (citokine, stres, UV, radicali liberi, antigeni virali sau bacterieni), dar şi în procesele de plasticitate sinaptică şi de memorie. NGF (nerve growth factor). Citokină cu rol în creşterea şi dezvoltarea celulelor nervoase. Receptorii NGF sunt situaţi pe suprafaţa unor celule, inclusiv a celulelor nervoase. Se consideră că NGF poate induce în anumite situaţii apoptoza, condiţiile şi mecanismul prin care realizează acest proces fiind încă insuficient cunoscute. NK (celule Natural Killer). Celule cu rol în apărarea organismului, înrudite cu limfocitele T, capabile de a ataca structuri şi antigeni non-self, care nu au nevoie să fie activate. Ele recunosc molecule CMH şi se activează când receptorii lor nu întâlnesc astfel de molecule la suprafaţa celulelor ţintă. Recunosc şi produc liza unor celule tumorale şi celule infectate de virusuri. Noxa. Proteină pro-apoptotică BH-only din familia Bcl-2, care interacţionează cu membrii anti-apoptotici ai familiei Bcl-2, determinând activarea caspazei-9 Pare a fi un mediator al apoptozei p53-dependentă. NuMA (nuclear mitotic apparatus protein). NuMA este o proteină multifuncţională localizată în nucleu în interfază şi la polii aparatului mitotic în cursul mitozei; are rol esenţial în organizarea microtubulilor.

Oncoza (de la „onkos” – umflare) este considerată o stare pre-letală ce duce spre moartea celulară din cauza depleţiei rezervelor energetice celulare şi perturbării pompelor ionice din membrana plasmatică (fiind însoţită de umflarea celulei, umflarea organitelor celulare, creşterea permebilităţii membranei). Celulele oncotice ar fi totuşi supuse necrozei, un element esenţial al acesteia fiind natura inflamatorie.

187

Paracaspaze. Enzime înrudite îndepărtat cu caspazele. Au fost identificate atât la eucariotele cărora le sunt proprii caspazele, cât şi la cele lipsite de caspaze. Sunt implicate în dezvoltarea limfomului MALT, dar nu şi în execuţia morţii celulare. PARP sau poli-(ADP-ribozil)-polimeraza. Enzimă cu rol în procesele de excizie şi reparaţie a ADN-ului. Clivarea PARP este un indiciu clar al instalării apoptozei. Perforina (proteina care formează pori). Proteină responsabilă de activitatea litică a CTL calciu-dependentă. Această proteină a fost iniţial identificată în granulele litice din celulele NK şi CTL. Se află în granulele litice în asociere cu proteoglicani şi calreticulina. PIDD-osom (p53-induced protein with a death-domain). Complex molecular generat în timpul apoptozei indusă de lezarea ADN, care este format din proteina PIDD, proteina adaptor RAIDD şi pro-caspaza-2, complex care asigură procesarea şi activarea caspazei-2. Piroptoza. Formă de moarte celulară care îmbină trăsăturile necrozei şi ale apoptozei, determinată de infecţia cu specii de Salmonella şi Shigella, care este inflamatorie, şi ar fi dependentă doar de caspaza-1 (caspază care nu este implicată în moartea celulară apoptotică). PKA sau serin-treonin-kinaza. Enzimă a cărei activitate este reglată de GTP-ază (guanozin-trifosfatază), care pare a fi implicată în apoptoză, fiind responsabilă de modificările ce se produc la nivelul citoscheletului. PPT (porii permeabilităţii de tranziţie). În structura PPT ar intra: ciclofilina D - din matrixul mitocondrial; VDAC (Voltage-Dependent Anion Channel) - din membrana externă; ANT (adenine

nucleotide translocator) - din membrana internă; receptorul periferic al benzodiazepin; Bcl-2; hexokinaza legată de VDAC şi creatin-kinaza inter-membranară. PPT sunt dependenţi de voltaj şi sensibili la ciclosporina A. Proteina p35. Proteină specifică baculovirusului, capabilă să se lege la caspaze, să le cliveze şi inactiveze, fiind un inhibitor eficient al caspazelor-1 la -8, dar nu are efect inhibitor asupra granzimei

B. Proteina p53. Proteină care exercită efect inhibitor asupra proliferării tumorale. Ea are capacitatea de a recunoaşte leziunile produse ADN-ului din celule şi de a activa gene şi respectiv proteine care intervin în înlăturarea acestor leziuni. Prin intermediul p53 este blocat ciclul mitotic în G1, asigurându-se astfel posibilitatea intervenţiei mecanismelor de reparaţie ale ADN prezente în celule, iar în cazul în care refacerea ADN-ului nu este posibilă, celula este dirijată spre apoptoză. PT (permeabilitatea de tranziţie) reprezintă o creştere bruscă a permeabilităţii membranei interne a mitocondriilor (la soluţii cu masa moleculară sub 1,5 kDa). PTEN (phosphatase and tensin homolog) este o fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfat 3 fosfatază, care defosforilează preferenţial substraturile fosfoinositol. PTEN este o proteină de inhibare tumorală. Mutaţiile genei PTEN stau la baza a multor forme de cancer. Puma (p53 up-regulated modulator of apoptosis) – proteină pro-apoptotică din familia Bcl-2 (BH3-only). Este implicată în apoptoza dependentă- şi independentă-p53, indusă de o varietate de semnale. Interacţionează cu membrii anti-apoptotici Bcl-2, inhibând interacţiunea lor cu proteinele pro-apoptotice Bax şi/sau Bak.

Ras. Gene(oncogene)/proteine implicate în căile kinazice de semnalizare celulară, care controlează transcripţia genelor, reglează creşterea şi diferenţierea celulară, adeziunea şi migrarea celulară. Mutaţii ale acestor gene/proteine sunt frecvent întâlnite în tumorile umane. Răspuns hipersensibil (HR). Răspuns de rezistenţă la plante care duce la moartea rapidă (în decurs de ore) a celulelor infectate, limitând astfel extinderea infecţiei la celulele vecine Rb (proteina retinoblastomului). Proteină care face parte din familia aşa-ziselor proteine buzunar (pocket proteins), care formează un buzunar pentru legarea funcţională a altor proteine. Ea previne creşterea celulară excesivă şi poate recruta unele enzime de remodelare a cromatinei (cum ar fi metilazele şi acetilazele). Această proteină este codificată la om de gena RB1, situată pe cromosomul 13. Este o proteină supresoare de tumori care este disfuncţională în multe forme de cancer. Receptorii morţii (death receptors) – aparţin superfamiliei de gene TNFR. Membrii familiei de proteine TNFR au structură primară diversă, dar toţi au subdomenii extracelulare bogate în cisteină, care adoptă înfăşurări terţiare similare. Particularităţile lor structurale le permit recunoaşterea specifică, şi în cele mai multe cazuri exclusivă, a liganzilor lor. În plus, receptorii morţii conţin o secvenţă citoplasmatică omoloagă denumită “domeniul morţii” (DD). Moleculele adaptor, cum ar fi

188

FADD, TRADD sau DAXX, conţin la rândul lor DD, astfel încât ele pot interacţiona cu receptorii morţii şi să transmită semnalul apoptotic la maşinăria morţii. Retinoizi - derivaţi ai vitaminei A, cu rol important în creşterea, diferenţierea şi dezvoltarea unor ţesuturi, care pot declanşa şi apoptoza în diverse tipuri de celule canceroase. Rezistenţă sistemică dobândită - un fel de imunitate căpătată de plantele care au suportat în una sau mai multe frunze un răspuns de rezistenţă (ce include HR) şi la alţi patogeni ai frunzelor, la care nu au fost expuse anterior, rezistenţă care se manifestă şi la organele situate la distanţă RIP(receptor interacting protein). Serin-treonin-kinază cu capacitatea de legare la domeniul DD al APO-1. S-a constatat că TRADD interacţionează puternic cu RIP, pe care o recrutează la TNFR1 într-un proces TNF dependent. Expresia în exces a RIP induce atât activarea NF-kB, cât şi apoptoza, (Hsu et al., 1996). Degradarea RIP sensibilizează celulele la apoptoza TNF- indusă. Şoarecii KO pentru RIP prezintă după naştere o moarte celulară masivă prin apoptoză în ţesutul limfoid şi adipos, şi mor în răstimp de 1-3 zile după naştere.

Saspaza. Serin-protează din familia subtilizinei, care poate cliva substraturile caspazei (are activitate caspase-like) şi este inhibată de inhibitorii caspazei. A fost descoperită în extractele de frunze de Avena sativa tratate cu victorină (toxină produsă de fungul Cochliobolus victoriae). Sfingomieline. Sunt fosfolipide prezente în membrana plasmatică, a căror degradare se face de către sfingomielinază. Prin intervenţia acestei enzime, semnalul tanatogen din apoptoză determină transformarea sfingomielinei în ceramide (N-acil sfingozine), mesageri pentru efectorii apoptozei. Smac/DIABLO (small mitochondria-derived activator of caspases). Proteină care (după ce se sintetizează) este importată în mitocondrii, iar în timpul apoptozei este eliberată din spaţiul intermembranar mitocondrial şi se leagă de proteinele IAP, cărora le anulează efectul inhibitor asupra caspazelor. Stem Cell Factor (SCF). Citokină care poate exista atât ca proteină trans-membranară, cât şi ca proteină solubilă şi este implicată în hematopoieză (promovează diferenţierea şi creşterea celulelor stem hematopoietice), spermatogeneză şi melanogeneză.

TCR (T cell receptor). Moleculă descoperită la suprafaţa limfocitelor T, responsabilă de recunoaşterea antigenilor legaţi de moleculele CMH. Legarea TCR de antigen este de afinitate relativ scăzută şi degenerează, astfel că mulţi TCR recunosc acelaşi antigen şi mulţi antigeni sunt recunoscuţi de acelaşi TCR. TGF-beta (transforming growth factor beta) este o citokină multifuncţională care reglează creşterea, diferenţierea şi apoptoza diverselor tipuri de celule. Induce apoptoza în hepatocite, fiind considerată un supresor tumoral în ficat. T-helper. Celulele T-helper sunt limfocite care nu au activitate citotoxixă sau fagocitară şi sunt implicate în activarea şi dirijarea altor celule importante pentru sistemul imun; sunt esenţiale în determinarea repartizării claselor de anticorpi pentru celulele B, în activarea şi creşterea celulelor T citotoxice şi în maximizarea activităţii bactericide a fagocitelor (cum ar fi macrofagele). Tioredoxina (TRX). Proteină care împreună cu metionin-sulfoxid-reductaza reactivează proteinele în care au fost oxidate resturile de metionină. TRX este implicată şi în reglarea unor molecule redox-sensibile, printre care NF-kB (factorul nuclear kappa-B), AP1 (activator protein-1) şi receptorul gluco-corticoid. TNF (tumor necrosis factor). Citokină secretată de macrofagele active, care îşi exercită acţiunea prin intermediul a doi receptori aflaţi pe suprafaţa celulelor. Legarea TNF la aceşti receptori declanşează, în anumite condiţii, o serie de procese celulare care se pot finaliza cu intrarea în apoptoză a celulei. TNF are rol important în distrugerea celulelor tumorale şi a altor tipuri de celule. TRADD (TNFR1 associated protein with death domain). Proteină adaptor ce conţine un domeniu al morţii (DD) care interacţionează cu TNFR1 şi mediază semnalizarea apoptozei şi activarea NF-kB. Poate interacţiona cu TRAF2 şi să diminueze în acest fel recrutarea proteinelor IAP TRAMP (tyrosine-rich acid matrix protein). Proteină exprimată abundent în timocite şi limfocite, membru al familiei de receptori TNF, care la om este formată din 393 resturi de aminoacizi. Exprimarea în exces a acestei proteine determină activarea NF-kB şi apoptoza. Moartea celulară indusă de TRAMP nu este inhibată de Bcl-2. β-Tubulină. Proteină necesară în procesul de formare a corpilor apoptotici

189

Tunel method. Metodă de identificare a celulelor apoptotice prin folosirea deoxinucleotidil-transferazei (TdT) pentru a transfera biotin-dUTP la rupturile catenare de ADN. Locurile de clivare biotin marcate sunt apoi decelate prin reacţia cu streptovidină HRP (horseradish peroxidase) - conjugată şi vizualizate cu DAB (diaminobenzidină), prezentând culoare maro.

U1. Particulă ribonucleoproteică din nucleu esenţială în racordarea precursorilor ARNm. Una din formele ei specifice în acest proces este proteina U1 de 70 kDa, care în celulele apoptotice este clivată, rezultând un fragment de 40 kDa, (în celulele apoptotice cantitatea fragmentului proteic de 40 kDa creşte evident). Ubiquitina. Proteină înalt conservată genetic, prezentă în celulele eucariotelor, care marchează proteinele de prisos şi le dirijează către proteasom, unde urmează a fi degradate şi reciclate. VDAC (Voltage-Dependent Anion Channel). Proteină specifică membranei mitocondriale externe implicată în respiraţia mitocondrială şi în controlul efluxului ATP din membrana mitocondrială externă. Perturbările VDAC determină creşterea permebilităţii acestei membrane şi eliberarea cyt.c. VDAC are rol esenţial în eliberarea apoptogenă a cyt. c din mitocondrii. VPE – enzime de procesare vacuolară. Sunt cistein-proteaze care au specificitate de substrat pentru resturi de Asn şi Asp. Ele au fost clasificate la plante în 3 subfamilii: de tip sămânţă, de tip vegetativ şi de tip necaracterizat. Studii recente sugerează că enzimele VPE sunt ortoloage ale caspazelor, activează MCP la plante şi intervin în interacţiunile plantă-patogeni. VPE conţin peptide semnal pentru inserţia pe sistemul de endo-membrane şi se consideră că sunt localizate în PPV (protease

precursor vesicles) sau vacuole

190

Programmed Cellular Death and its Mechanisms

Summary Inside a mature human organism, cell division and cell death (CD), two opposite processes, ensure the maintenance of a constant cell number in a certain organ. This balance, the cell homeostasis, is accomplished when the mitotic ratio is compensated by the cell death ratio within a tissue. If this balance is disturbed, there may occur two major unwanted events: 1) cells divide more rapidly than die, and a new tumor development begins; 2) cells divide more slowly than they die and cell loss occur (in case of neuro-degenerative diseases). Although the phenomenon of programmed cellular death was noticed since the second half of the 19th century, its establishment took place much later, as a consequence to the effected tests ran by Kerr and his collaborators on rat liver; those experiences pointed out that, besides cell necrosis from injured tissues, the death of some cells in the non-affected, normal tissues, occurs. For this type of cell death in animals, J. Cormack proposed the name apoptosis (apo = from; ptosis = fall), ancient Greek name that describes the fall of the leaves from trees or of flower petals, term adopted and established by Kerr et all., (1972). Apoptosis was acknowledged as a definite mechanism of programmed death in animals after the results of Horvitz’ reasearch on Caenorhabditis

elegans (1999). Cell necrosis is a pathological form of cell death, caused by mechanical injuries, hypoxia, damaging agents of physical, chemical or biological nature, that takes place without any energy discharge and consists of cell bloating, destruction of plasmatic membrane integrity and of cell organelles, random degradation of DNA, loss of cell content and appearance of an inflammatory process (affected cells’

removal takes place by mononuclear system’s phagocytosis). In apoptosis cells maintain their plasmatic membrane integrity, the cells shrink, cell nucleus compacts and then splits into fragments, their content separates into smaller regions delimited by membranes named apoptotic

bodies, that are phagocyted by macrophages or by neighbor cells; their elimination do not trigger any inflammatory process. Apoptosis is a physiologically normal process, that takes place with energy discharge, following a well-established genetic program, encrypted in the cell genome, non-destructive, that ends with cell death, through which a multicellular organism eliminates some cells and accomplishes cell homeostasis. At present, there are known three types of cell death (CD): the

apoptosis (CD Type I), autophagy (CD Type II), and necrosis (CD Type III), (Lockshin şi Zakeri, 2004). Autophagy is a catabolic major process in eukaryotic organisms, in which cytoplasm fragments and cell organelles are withheld in double-membrane vesicles and delivered to lysosomes (in animals) or to vacuoles (in plants and fungi), where they will be digested by hydrolytic enzymes (Elmore, 2007). At the beginning of apoptosis, translocation of phosphatidylserine from inner to outer surface of plasmatic membrane occurs, a process that foregoes nucleus and nuclear DNA splitting into fragments of 180 pb or multiples of this number, fact that turns apoptotic cell death inevitable. DNA splitting is caused by endonucleases' action on the inter-nucleosomal regions; these enzymes’ activity depends on the presence of calcium and magnesium ions, and is

191

inhibited by zinc ions, (Dănăilă et al., 1999; Jan et al., 2008). Apoptosis in-going of some cells in a group is probably caused by: the lack of external stimuli that ensure the survival; the presence of some stimuli that trigger apoptosis; the disturbance of some mechanisms by which the cell may repair several lesions in the organelles or nuclear material (Raff, citat de Dănăilă et al., 1999). The range of physical, chemical and biological factors that may induce apoptosis is wide: ionizing and non-ionizing radiation, hyperthermia, low-frequency electromagnetic fields, free radicals, chemotherapeutic drugs (methotrexate, cyclosporine A, vincristine, cisplatin, most of the cytostatics), cytotoxic drugs, hormones, interferon, retinoids, viruses, some antibodies, cytotoxic lymphocytes etc. There are several apoptotic inhibitors: - physiological factors: growth factors, extracellular matrix, CD-40 ligand, neutral aminoacids, zinc, estrogenic and androgenic hormones; - pharmacological factors: inhibitors of cysteine-proteases, calpain inhibitors, tumor promoters; - viral genes: E1B (from adenoviruses), p35 and IAP (from baculoviruses), CrmA (from smallpox virus), LMW5-HL (African swine fever virus) etc. The protein family Bcl-2 and p53 play an important part in the apoptotic processes (Dănăilă et al., 1999; Moldoveanu şi Popescu, 1999; Ricci, 2002; Sahdev et al., 2010). Apoptosis occurs under the influence of some factors such as those mentioned before, that become signals for the effective structures of apoptosis. Depending on the morpho-biochemical changes of the apoptotic cells, there were delimited several phases of this process: the initiation phase, the decision phase, the

execution phase, and the removal of

affected cells phase. Apoptosis is controlled by some specific genes. These genes/proteins in the nematode Caenorhabditis elegans are: ced-3 and ced-

4, involved in the initiation and development of apoptosis, and ced-9 stops it (ensures the survival of the cells programmed to die). The ced-3 encodes a cysteine protease (caspase), and ced-4 a kinase activated by calcium. The ced-3 may induce apoptosis in the absence of ced-4 gene, but not otherwise. They have homologous in mammals: the ced-3 gene’s homologous in mammals is the ice (interleukin 1β converting enzyme) gene; ced-4 has the homologous Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1), and the product of ced-9’s homologous in mammals are the proteins of the family Bcl-2 (Bcl-2 and Bcl-XL). The apoptotic factors influence the activity of some specific receptors such as: Fas, the receptor for TNF, the P22 purinergic receptor from cell surface. After the apoptosis’ initiation, the transduction molecular signals (messengers) aim the target-structures from the cell, especially towards the nucleus and cytoskeleton. Soon afterwards the cell is involved in apoptosis, the specific enzymes from the cytoplasm intervene, with a cascade evolution of decomposing the cell organelles and macromolecules that prepare the cell for phagocytosis. The caspases that accomplish the apoptosis are activated (caspases -3, -6 and -7), that, at their turn, activate the endonucleases and other proteases from the cell, that cause the degradation of nuclear proteins and cytoskeleton. The apoptotic process ends with cell death and formation of apoptotic bodies, that are digested by the phagocytes or by some neighbour cells (without affecting the latter, or altering the structure and activity of the tissue, or triggering any inflammatory process). The macrophages recognize the apoptotic bodies by means of certain specific products from their membranes (Alberts et al., 1999; Moldoveanu şi Popescu, 1999; Dănăilă et al, 1999; Ricci, 2002; Elmore, 2007 etc). The apoptotic signaling is ensured by activating some receptors from cell surface, called “the death receptors”, that

192

bind with specific ligands and then transmit apoptotic signals. These receptors are coded by a gene superfamily for the tumor necrosis factor receptor (TNFR), that include TNF-R1, Fas/CD95, receptors (TRAIL) DR-4, and DR-5. The members of this TNFR family comprise extracellular domains rich in cysteine, that allow the recognition of specific ligands, which leads to the trimerization and activation of the respective death receptor. The signal is subsequently transmitted through the cytoplasmic region of the death receptor that contains a well-preserved sequence, called death domain (DD). The Fas/Fas-ligand is a system of inducing apoptosis into tumor cells and into the virus-infected cells. The distribution of Fas receptors varies with the cell type. The cytoplasmic domain of the Fas receptor plays an important part in apoptosis induction, therefore it was named the death domain. Coupling Fas with Fas-L causes alterations in the structure of the Fas receptor death domains, that allow the binding of adaptor molecules to this domain. The main adaptor molecule for Fas is FADD (Fas-

associated death domain), protein that comprises a death effector domain – DED, that binds with an analogous domain - DED of caspase-8. By coupling procaspase-8 with FADD, it occurs its splitting and activation (caspase-8), (Dănăilă et al., 1999; Ricci, 2002). The TNF/TNFR-1 represents another system of death signaling. The tumor necrosis factor (TNF) is a large family of pro-inflammatory cytokines involved in: cell signaling, inflammatory and immune response, and cell differentiation. There are two types of TNF: TNF-alfa and TNF-beta. TNF-alfa is produced mostly by the macrophages, and by the lymphocytes, fibroblasts, and keratinocytes as well, it has a cytotoxic effect on tumor cells, and TNF-beta is excreted by the T-helper cells, its effects are similar to those of TNF-alfa, enhancing the activity of macrophages and neutrophils. The response induced by TNF is generated by means of two types of

receptors for this cytokine, present on the surface of somatic cells: TNF-R1 and TNF-R2. The interaction TNFα – TNF-R1 causes the trimerization of TNF-R1 and the association between their death domains (that lie in the cytoplasm), which draws the adaptor protein TRADD (TNFR associated

death domain). TRADD is the main adaptor protein for the TNFR death domain. The formation of the TNF-TNFR1-TRADD complex induces a multi-path activation: a) activation of nuclear factor kappa B (NF-kB) that mediates the transcription of several proteins involved in the survival and cell proliferation, the anti-inflammatory response, the anti-apoptotic factors; b) activation of MAPK-JNK path, mainly pro-apoptotic, involved in proliferation and cell differentiation; c) apoptotic signals by binding to FADD and recruiting caspase-8, (Moldoveanu şi Popescu, 1999; Dănăilă et al., 1999; Dash, 2002; Ricci, 2002). DR4-DR5/TRAIL is another death-signaling system. TRAIL (TNF-related

apoptosis-inducing ligand or APO2L) protein belongs to TNF superfamily. A number of five receptors for this protein were identified as well: TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), TRAIL-R3 (DcR1), TRAIL-R4 (DcR2), and osteoprotegerine (Opg). The first two receptors comprise the functional death domain (DD) and the ability to induce apoptosis by means of binding to TRAIL, and the other three function as “trap” receptors (they can bind to TRAIL, but they do not induce apoptosis). By binding DR4 or DR5 to TRAIL, there take place: the receptor’s trimerization, the recruitment of FADD protein (probably indirectly), the formation of DISC (death inducing and signaling complex) and then binding and activating caspase-8 or -10. The activated caspases -8 and -10 split, and activate caspase-3, that also causes the splitting of death substrates. The molecular complexes associated with the death receptors may induce the activation of caspases by means of the DD, DED and CARD domains, by interactions

193

such as: FADD/caspase-8 or -10 (the Fas case); TRADD/FADD/caspase -8/-10, or TRADD/RIP/RAID/caspase-2 (the TNF-R1 case), (Lee et al., 2002; Wang et El-Deiry, 2003; Ren et al., 2004; Merino et al., 2006; Zhang et al., 2010). Other proteins may interfere with the apoptotic process. One of them is the nuclear factor kappa B (NF-kB, nuclear

factor kappa-light-chain-enhancer of

activated B cells), which is a complex protein that may be found in almost all types of animal cells and is involved in the cellular response to various stimuli, exerting a key-role in the regulation of the immune response to infections. The NF-kB factor is an important modulator of gene functioning program. The transcription of IAP genes (inhibitor of apoptosis), of the genes that encode TRAF-1 and TRAF-2 proteins (anti-apoptotic), and also of the genes involved in the inflammatory response depend on the activation of NF-kB factor. The NF-kB factor is activated by the receptor family TNF and therefore prevents the cells from entering apoptosis. The nuclear factor NF-kB may save the apoptotic signal induced by TNFR-1, and not the one induced by Fas receptor (Dănăilă et al., 1999). The proteins belonging to Bcl-2 family may be deeply involved in the apoptotic process. The Bcl-2 protein was first evinced in the cells of the B human lymphoma. The proteins from this family hold homologous domains that favor protein-protein interactions, marked with BH4, BH3, BH1, and BH2. The homologous proteins from Bcl-2 family were classified into two groups: I - anti-

apoptotic proteins (such as: A1/Bfl1, Bcl-2, Bcl-w, Bcl-xL, Boo/Diva, Mcl-1, NR-13 and Nrf3 in mammals, and Ced-9 in C.

elegans). Their most obvious mode of action would be the binding to pro-apoptotic proteins, to whom they inhibit the functions; II - pro-apoptotic proteins (such as: Bad, Bak, Bax, Bcl-rambo, Bcl-xS, Bid, Bik, Bim, Blk, BNIP3, Bok/Mtd, Hrk, and Nip3 in mammals, and Egl-1

protein in C. elegans). The anti-apoptotic proteins (pro-survival) comprise all the four BH domains. The pro-apoptotic proteins may be classified into two subgroups: a) the Bax subfamily, that withholds the BH1, BH2, and BH3 domains – that comprise Bax, Bak and Bok; b) the subfamily of proteins that have only BH3 domain (BH3-only) – that contain Bid, Bim, Bik, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma, Blk, Bnip3, and Spike, (Gewies, 2003). The presence within the protein family Bcl-2 of some domains with a high level of homology (BH1, BH2, BH3) permits the formation of homo- and hetero-dimers. The anti-apoptotic homodimers Bcl-2 or Bcl-XL are formed by means of BH1 and BH2. The pro-apoptotic members of Bcl-2, that comprise only the BH3 (Bax, Bak) domain, may interact with Bcl-2 or with Bcl-XL either by means of the BH3 domain, either with the help of the hydrophobic pocket formed by the domains BH1, BH2 and BH3 of Bcl-2 and Bcl-XL. The balance between cellular death and survival depends on the type and proportion of pro- and anti-apoptotic dimmers (Ricci, 2002). Another way of interfering with the apoptotic process of some Bcl-2 proteins (the anti-apoptotic molecules Bcl XL and Bcl-2, and the pro-apoptotic protein Bax) would be their ability to form pores (ion channels) in the cellular membranes. The addition of Bcl-2 and Bcl-XL proteins on the inner side of some membranes within the cell (nuclear, mitochondrial or endoplasmic reticulum) leads to the formation of this channels that transport and distribute some ions (mainly calcium) within some cellular compartments. A particular significance in the apoptotic process seems to be attributed to the trans-membrane channels from mitochondria. The anti-apoptotic activity of Bcl-2 and Bcl-XL proteins consists of transit inhibition through these channels. Although the excess of Bcl-2 proteins reduces the transitory permeability (TP) of the mitochondrial membrane, the excess of Bax proteins augments it. The

194

transitory permeability pores (the TP pores) are oligoprotein channels from the outer membrane secreted by porine (or VDAC – Voltage Dependent Anion

Channel); those in the inner membrane - by ANT (Adenine Nucleotide Translocator) and cyclophilin-D (a matrix protein), (Ricci, 2002). The formation of ion channels causes, directly or indirectly, the hyperpolarization of the mitochondrial membrane, with the following repercussions: the flow of Ca2+ is intensified by the mitochondria, the formation of free radicals is diminished, the rupture of outer mitochondrial membrane is prevented and implicitly the release of certain adaptogenic proteins in the cytosol (Cyt. c), that may activate the caspases. The release of Cyt. c from mitochondria to cytoplasm leads to the activation of caspase-3. The Bcl-2 and Bcl-XL role is to block the release of Cyt. c in the cytoplasm and implicitly to inhibit the activity of caspase-3. The Bcl-XL protein impends the hyperpolarization of the mitochondrial membrane, inhibits the apoptotic signals towards the mitochondrial structures, prevents their bulging and the rupture of the mitochondrial membrane, (Dănăilă et al., 1999; Moldoveanu şi Popescu, 1999; Ricci, 2002). Another protein with significant implications in the apoptotic process is p53. The p53 wild type gene belongs to the anti-oncogene category, of the genes that suppress the tumor growth. The p53 protein is localized in the nucleus, where it may exist under two forms: phosphorylated and non-phosphorylated. It fulfills two main roles: transcription factor and inhibitory of DNA replication. In case of DNA damage, the p53 acts on certain effectors such as: Waf-1 and Gadd-45, that block the transition from phase G1 to phase S of the cellular cycle, ensuring a larger time span for DNA damage repair-systems to intervene, thus avoiding mutations. The p53 protein is regarded as a general mechanism of cellular protection, mainly

anti-tumor, that displays its action under various circumstances, and the phenomenon that activates and values it seems to be the altering of cell DNA. If DNA damage is reparable, the cell survives; if they are irreparable, the cell enters apoptosis, (Choisy-Rossi et al., 1999; Dănăilă et al., 1999; Moldoveanu şi Popescu, 1999). The effector molecules of programmed cellular death (PCD) in animals are caspases and granzymes. Caspases are able to split the peptidic bonds of the substrate after the remains of aspartic acid (cysteinil-

aspartate-cleaving-proteases). 14 caspases were discovered until present. They are dimers made of two tightly-associated subunits (of 10 and 20 kDa) that comprise a preserved active pentapeptidic site, made of a cysteine residue included in a peptidic sequence - type QACRG (or QACXG, where X may be R, Q or G), that allows the substrate recognition and clivage in the aspartate residue from P1 position. Caspases’ substrate proteins consist of cytoplasmic and nuclear proteins that are part of metabolism and repair of DNA, protein-kinases, proteins involved in signal transduction and gene expression, in the regulation of cell cycle and cell proliferation etc. Inside the cells, caspases are synthesized under the shape of an unique inactive protein chain (zymogen or proenzyme), that consists of four domains: a NH2-terminal pro-domain of variable length, a big subunit - p20 (with a molecular weight of about 20 kDa), a small subunit - p10 (of about 10 kDa) and a linker region that connects these catalytic subunits. By splitting pro-caspases, the NH2-terminal pro-domain is removed, and the two subunits are provided; the active enzyme is a hetero-tetramer that comes into being from the association of two heterodimers, [2(p10/p20)]. Caspases display a strict specificity for a tetrapeptidic sequence (a sequence of at least 4 aminoacids – noted with P1-P4), situated at the left of the splitting region. Target-proteins must hold an aspartate

195

residue in P1 position, that will be placed in a pocket (named site S1) and aligned to the caspase’s tetrapeptidic sequence, (Moldoveanu şi Popescu, 1999; Ricci, 2002; Philchenkov et al., 2004; Fan et al., 2005; Cojocaru, 2007). Depending on the content in aminoacids of the substrate tetrapeptide (substrate specificity), caspases were divided into 3 groups (subfamilies): caspases-1 (ICE – Interleukine Converting Enzyme), caspases-2 (ICH-1) and caspases-3 (CPP32). The first group comprises caspases -1, -4 and -5, -12, -13 and -14(?); these caspases intervene in the cytokine maturation, their role is pro-inflammatory, their substrate comprises the WEHD tetrapeptide. The second group comprises the caspases -2, -3, -7, and also the Ced-3 protein; their substrate contains the DEXD tetrapeptide sequence, as they are caspases that are involved in the effector stage of the apoptotic process. The third group comprises the caspases -6, -8, -9, and -10, the structure of the substrate tetrapeptide is, in this case, (V/L)EXD and they are caspases that function as activators of the effector caspases. Other authors classify the caspases as it follows: I. caspases that activate the apoptosis, such as caspases -2, -8, -9 and -10; II. caspases that effect the apoptosis, among which there are caspases -3, -6 and -7; III. caspases that mediate the bulging, among which there are caspases : -1, -4, -5, -11, -12, -13 and -14. Caspases differ from one another not only by substrate specificity, but also by size and aminoacid sequence of their -NH2 terminal pro-domain. Effector caspases’ pro-domains are short (maximum 30 amino-acil residues), while the pro-domains for initiator caspases and pro-inflammatory caspases are long (over 90 aminoacyl residues). There are two categories of apoptotic caspases: initiator caspases (apical) and execution caspases

(effector or downstream). They are cascade - organized, the initiator are situated upstream, and the execution downstream, (Dănăilă et al., 1999; Philcenkov et al.,

2004; Fan et al., 2005; Fink şi Gookson, 2005; Jan et al., 2008; Pop şi Salvesen, 2009). Caspases with a short pro-domain activate by splitting their catalytic domain, and the long-prodomain caspases activate by dimerization. In order to activate, the initiator caspases pass through the homo-dimerization, that is facilitated by their recruitment to the specific activating platforms as a consequence to an apoptotic signal. The pro-domain of some initiator caspases (-8 and -10) contains death effector domains (DED) that ensure the caspase binding to adaptor molecules (FADD or TRADD). Other caspases pro-domain (-1, -2, -4, -5, -9, -11, and -12) presents a caspase-recruiting domain (CARD), that plays an important role in the caspase interaction. The recruitment of the initiator caspases by means of DED (caspases -8 and -10) or CARD (caspases -1, -2 and -9) causes a local augmentation of their content and ensure a proximity-induced dimerization. Each apical caspase has its own activating platform: by means of DISC there are recruited and activated the caspases -8 and -10, the formation of the apoptosome activates caspase-9, and PIDD-osome would be involved in the activation of caspase-2. In the case of the inflammatory caspases, the multiprotein activating platforms are called inflammasomes (Moldoveanu şi Popescu, 1999; Ricci, 2002; Tinel şi Tschopp, 2004; Pop şi Salvesen, 2009). The activation of the initiator caspases is followed by the proteolytic activation of the effector caspases (-3, -6 and -7), that subsequently split the large number of specific substrate proteins (from the nucleus, cytoplasm, and cytoskeleton). An important marker of apoptotic cellular death is the generation of DNA-ladders after the chromatin inter-nucleosomal splitting, resulting fragments of 180pb or multiples of 180pb, process accomplished by CAD (caspase-activated

DN-ase), (Fink şi Gookson, 2005). Two main apoptotic paths were identified: a) the extrinsec way – death induced by death signals, using the death receptors

196

mediated path; b) the intrinsec way – stress- induced death, by the path mediated by mitochondria (Fan et al., 2005). Some authors add a third way: that of the cytotoxicity mediated by T-cells, which is a way of cellular death that depends on perforin/granzyme. Regardless of the apoptotic way, it is finalized with the execution phase, that assumes the splitting of caspase-3, DNA fragmentation, degradation of nuclear proteins and of the cytoskeleton, cross-binding of some proteins, formation of apoptotic bodies, ligand expression for the phagocyte receptors and ingestion of apoptotic bodies by the phagocytes. There are two types of cells that enter the extrinsec apoptotic way. In case of the Type-I cells, the apoptosis is induced directly, mainly using the path of caspase-cascade signaling. By coupling the receptors belonging to TNFR family with the specific ligands, the cells receive the apoptotic signal, the multiprotein DISC complex (made of: the death receptor, the adaptor proteins, and the initiator caspases (procaspases -8 or -10)) is formed, that leads to the autocatalytic processing and activation (mainly of caspase-8). Thus, caspase-8 is thoroughly activated and it will activate the effector downstream procaspases (particularly procaspase-3), that will decompose the specific substrates, which eventually leads to cellular death (Gewies, 2003; Fan et al., 2005). In case of the Type II cells, the signal from the activated death receptor is not sufficiently strong to generate the caspase cascade and it has to be amplified on the mitochondria-dependent apoptotic way (by splitting and activating the Bid protein, releasing Cyt.c in the cytosol, formation of apoptosome (the molecular complex Cyt.c/ Apaf-

1/procaspase-9) and autocatalytic activation of procaspase-9), (Slee citat de Gewies, 2003; Wang şi El-Deiry, 2003). The intrinsec apoptotic way is generally based on mitochondria. As a result to certain stimuli, they may release apoptogenic factors, such as: Cyt. c, Apaf-1, AIF, procaspase-3, Ca2+, and ROS.

These factors are released out from the mitochondria by the pro-apoptotic proteins: Bax, or Bax coupled with VDAC (voltage-dependent anion channel) or with tBid, that induce the formation of pores that allow the passage of some soluble proteins among which: Cyt. c, apoptotic induction factor (AIF), endonuclease G, Smac/DIABLO protein, serine protease HtrA2/Omi (Gewies, 2003; Elmore, 2007; Jan et al., 2008). The release of Cyt. c from mitochondria to cytosol, as displayed previously, activates the apoptosome and induces the caspase cascade, that leads to cellular death. Apoptosis is a physiologically normal, yet controlled process. In this view, the cells may use strategies such as: caspase inhibition, caspase degradation, inhibitor intake etc. In order to prevent the death of the infected cells before replication, the viruses may synthesize caspase inhibitors such as: p35/p49 proteins, IAP proteins for the baculoviruses, CrmA protein for the vaccine virus etc. Apoptotic control may be accomplished by means of proteins that „prevent caspase activation”, such as: the FLIP protein, or the proteins: E8 (for the herpes virus type II), MC159, and MC160 (for the virus Molluscum contagiosum). A key role in the apoptotic regulation is due to the homologous proteins of the Bcl-2 family, either by direct control of caspase activation, or by defending mytochondrial integrity (Cory, citat de Gewies, 2003). A caspase regulation mechanism, and implicitly of apoptosis would be represented by caspase degradation via proteasome, or by caspase phosphorylation (by protein kinases or phosphatases). The Toso gene/protein may intervene in the apoptotic regulation of some cells (it appears to be a regulator of the Fas-mediated apoptosis), (Hitoshi et al., 1998; Song et Jacob, 2005; Nguyen et al., 2011). Apoptosis is present both in physiologically normal and pathological processes. The studies on vertebrate embryonic development showed that selective cell proliferation, in relation with

197

selective apoptosis, mold the tissues. There are several examples of apoptotic tissue molding during vertebrate embryogenesis: finger formation by way of interdigital membrane extinction, appearance of heart valves, formation of hard palate in superior mammals, neural tube formation (by invagination of epithelial sheet) etc. Apoptosis ensures, as well, the removal of certain structures that are a reminder of organs existent during the evolution of some species, but are either disfunctional, or display transitory functions, or they are important only during the embryonic development, e.g.: some neurons (endowed with temporary functions during the embryonic development), or some structures specific to one sex in mammals (Müller channel in males, Wolf channel in females). Apoptosis is also present in the formation of specific cells (deprived of organelles), such as: keratinocytes, red blood cells, epithelial cells from crystalline lens etc. Apoptosis plays an important role in the maintenance of homeostasis during hematopoesis, in the proper functioning and regulation of the immune system (a process in which immunitary cells that recognize antigens specific to the organism, or that provide anti-self antibodies, the cells with an inefficient immune system etc). During the senescence process in animal multicellular organisms, some injured or disfunctional cells (fibroblasts, hepatocytes), or cells like neurons, myocytes etc. are removed, and cannot be ever replaced (Dănăilă et al., 1999). Apoptosis has its own role and place in the pathological processes from animal organisms. In case of viral infections, apoptosis represents a mechanism of eliminating the virus-invaded cells, thus reducing the risk of their multiplication and spreading to other cells. Nevertheless, many viruses developed strategies to avoid apoptosis: they encode proteins that may inhibit apoptosis (CrmA protein for the smallpox virus, p35 and IAP for baculoviruses) or provide homologous

proteins Bcl-2 (as it is the case of some herpes viruses, such as: Epstein Barr virus, or the virus associated to type 8 Kaposi sarcoma, Saimiri virus etc), inhibitors of FAS/TNF ways, antagonists of p53 proteins, inhibitors of PKR etc, (Dănăilă et al., 1999). Some cells' loss of ability to enter apoptosis may lead to cancer, autoimmune diseases etc., whereas the stimulation of apoptosis may lead to neurodegenerative diseases (Alzheimer, Parkinson, Huntington, amyotrophic lateral sclerosis), osteoporosis etc, (Moldoveanu şi Popescu, 1999). The genes responsible with tissue homeostasis, apoptosis and tumor growth belong to 4 classes: a) oncogenes – genes that induce cell proliferation (c-myc, src, ras and others); b) genes that inhibit tumor growth (p53, Rb); c) genes that cause cellular death (e.g.: ced-3 and ced-4 in C. elegans); d) genes that ensure cell survival (such as: ced-9 in C. elegans and bcl-2 in mammals), (Dănăilă et al., 1999). It was ascertained that in many tumors there is an excessive expression of c-myc genes, or mutations of these genes occur. In case of lung, bronchi, or prostate tumors, the gene, respectively the protein Rb, cease its function. Bcl-2 is an oncogene (like crmA) that, by interacting with other genes or directly (possibly), may induce tumor growth. The main role of bcl-2 is apoptotic inhibition, without blocking the mitotic cycle, that facilitates the survival of some cells that accumulate mutations incompatible with the normal development, fact that may promote malignant proliferation. For some types of cancer, the Bcl-2 protein may be substituted by Bcl-XL protein. At the same time, Bcl-2 and Bcl-XL confer resistance to chemotherapeutic agents that destroy tumor cells (Păunescu, 2006). Mutations of p53 gene were signaled in many cancer types. The role of p53 protein in carcinogenesis is a complex one and, besides the ability to induce apoptosis, it may function as a transcription factor for other genes. The cells that comprise mutant

198

forms of p53 protein become incapable of apoptosis, which may explain the resistance of those cells to chemo- and radiotherapy. The alterations induced to Fas gene (that inhibits the tumor process), may turn this gene nonfunctional and implicitly incapable to induce apoptosis, fact that may stimulate the oncogenesis, (Moldoveanu şi Popescu, 1999).. The protection against apoptosis may be ensured to the cell that was altered by an improper expression or activation of anti-apoptotic proteins, or by inactivation of some pro-apoptotic factors. Mutations or disorders in the proteins Bax and Bak occur in varied types of cancer. In the process of cancer metamorphosis there may be excessively expressed or improperly activated the proteins: NF-kB and Mdm2. Another element involved in tumor growth is the absence or the inactivation of DAP-kinase. There is a possibility that the promotion of oncogenesis takes place by inhibiting the activity of caspases (the effectors of apoptosis), (Moldoveanu şi Popescu, 1999). Apoptosis may occur in metastases, only its frequency at this level is lower than in the primary tumor. Deficient apoptosis may be involved in tumor occurrence and development, in metastase process, and also in the cancer drug resistance. It is more and more obvious that the tumour genesis is not only the result of an excessive cell proliferation as a consequence of oncogene activation, but depends (to a certain extent) on the alteration of apoptotic check-points. Although the apoptotic role in the initiation of autoimmune diseases is inexplicit and controversial, it seems that the disorders in the apoptotic process may trigger the appearance of autoimmune diseases, such as: autoimmune lymphoproliferative

syndrome (ALPS), systemic lupus

erythematosus (SLE), thyroid diseases (Hashimoto's thyroiditis, Graves disease), autoimmune diabetes, rheumatoid arthritis etc, (Dănăilă et al., 1999; Clemens et al., 2000; Eguchi, 2001; Hayashi şi Faustman,

2003; White şi Rosen, 2003; Rao şi Straus, 2006; MacKay et al., 2007). Programmed cellular death (PCD) is also present during plant growth and development from seed germination to plant maturity and senescence. Although PCD in plants displays a series of similarities to apoptosis in animals, there are some major differences, considering that the plants do not have an immune system, do not contain phagocytes, and the cell wall specific to plants blocks the formation of apoptotic bodies. Based on the morphological characteristics expressed by the affected cells, PCD in plants is framed after three types: 1) cellular death similar to apoptosis (apoptosis-like, AL), that implies the rapid degradation of nucleus and the loss of cell structure. This type of CD is frequently induced by mitochondrial signaling and is followed by nucleus shrinking, chromatin condensation, and DNA-laddering; 2) CD specific to plant senescence, that is a slow process, associated with the recovery of cell content and the relocation of nutrients; 3) PCD induced by vacuole collapse (that displays an average speed of the previously-presented two types), that implies the action of the vacuole proteases (their release into the cytosol causes the degradation of cell content), (Courtois-Moreau, 2008). PCD in plants is involved in a series of specific processes, as it follows: embryo formation, degeneration of aleurone layer during seed germination in monocotyledons, appearance of aerenchyma and some types of epidermal trichomes, xylem tracheary elements formation, ablation of floral organs, the removal of the stamina primordial cells in female flowers of monoecious species, degeneration of anther tapetum cells, pollen auto-incompatibility, lobe and leaf perforation formation, fruit dehiscence or pod opening etc, (Pennell et Lamb, 1997; Vercammen et al., 2007; Gadjev et al., 2008). As in the case of animals, PCD in plants is involved in pathogen response (the hypersensitive response) or in the

199

response to stress factors (aerenchyma formation, for instance). The generation of DNA ladders was reported in plants during their development, during the death of aleurone layer in monocotyledons, or petal, carpelar tissue and leaf senescence, during anther development, of the stress caused by some agents such as: cold, nutrient deprivation, saline or D-manose stress, stress induced by UV, pathogens or their toxins. Unlike animals, in which these nucleosomal fragments represent 180 pb or a multiple of this number, the DNA plant fragments due to PCD are of 50 kb in some cases, and of 140 pb in other cases (Pandey et al., citaţi de Jan et al., 2008). It was ascertained that the resemblance between apoptosis in animals (the extrinsec way) and PCD in plants is sometimes present as a release of Cyt. c from mitochondria and even as an activation of certain caspase-type proteases. Despite all the progresses registered in PCD lately, there were not found any homologous enzymes related to caspases in plants, but an ancestral protease family involved in PCD - metacaspases was identified. Recently, Sundström et al. (2009) from the Agricultural Sciences University in (Sweden) noticed that a well preserved protein (from the evolutionary viewpoint), TSN (Tudor Staphylococcal Nuclease) - with an antiapoptotic role, is degraded by specific proteases during PCD: by caspases in animal cells and by metacaspases in plant cells (fact that cancels the antiapoptotic role of this protein). Cells that lack the TSN protein are often affected by premature PCD. As plants do not own macrophages or neutrophils, dead cells processing is accomplished by means of autolysis. Vacuole collapse marks the beginning of the dead cell degradation, considering that the type of degradation depends on the types of hydrolases from vacuoles. Inside the cells that will turn into tracheary elements, for instance, auxins and cytokinins induce the synthesis de novo for nucleases and proteases, but not for

hydrolases in order to remove the cell walls; in the process of ethylene-induced aerenchyma, the vacuole also comprises hydrolases for cell wall (such as cellulose) to degrade not only the cytoplasm, but the extracellular matrix as well; in case of a hypersensitive response, the signals coming from the pathogen induce the production of phytoalexins, polyphenols and chitinases, that are toxic compounds for the pathogen, and are released at the moment of vacuole collapse. The release of vacuole content marks, in fact, the beginning of post-mortem cellular events (Jones, 2001). The programmed elimination of some cells is important during the vegetative plant growth, in their own organism, organ shape and architecture modelling etc. For instance, the death of some cells during leaf primordia development in species of Monstera ensures the formation of leaf perforations, that, together with leaf growth, get larger to a final perforated appearance of the leaf lamina (Gadjev et al., 2008). The cells of the aleurone layer are submitted to PCD after seed germination in cereals. In plants, some cellular types become functional after cellular death, facilitated by the maintenance of the cell wall (that may go through a series of morphological, structural, and chemical changes according to their role), as it is the case of the tracheary elements (TE). TE and sclereid fibers ends with the formation of a thickened cellular wall (usually lignified). After the appearance of secondary walls, TE lose their cell content, bind head-to-head under the shape of long, continuous tubes, providing a tissue that carries water inside the plants - the xylem (Krishnamurthy et al., 2000; Cao et al., 2003; Palavan-Unsal et al., 2005). As a consequence of some subepidermal cells' death (cells from the surface of citrus fruits), cavities appear, and they comprise essential oils; the mechanism of differentiation of secretory channels and cavities is called lysigeny. PCD is present

200

during some processes specific to plant reproductive development, such as: sex determination, formation of gametes, fertilization and embryogenesis. During early stages of floral development in unisex species, the flower comprises both primordia for male and female sex organs, but either the male or the female ones are eliminated by means of PCD. PCD is involved in the anther breakage (dehiscence), that discharges the pollen from the pollen tubes (Gadjev et al., 2008). Plant exposure to various stress agents, e.g.: hypoxia, hydric deficit, UV radiation, salts, extreme temperatures, pollutants, toxins, heavy metals etc. may induce an oxidative stress and may be followed by PCD. For instance, plant adaptation to drought or intense illumination is frequently followed by their covering with a protective layer of dead unicellular hairs, that were provided by PCD (Palavan-Unsal et al., 2005). Inside corn and sunflower roots, and also in the stems of many herbs, hypoxia causes the formation of aerenchyma (lysigenous). The cellular wall and the protoplast are removed from the mature roots' cells, thus forming some channels through which the air may pass from stem to root (Evans, citat de Palavan-Unsal et al., 2005). PCD in plants may occur as a response to pathogens. At the moment a plant is infested by a pathogen, it develops a defensive response to inhibit its growth/development and spreading inside the plant. To block the disease's development, two conditions have to be fulfilled: the pathogen should possess the avirulence gene – avr, and the host plant should have the resistance gene – R (that ensures the avr recognition for the pathogen), a process that is called „gene-for-gene” resistance (Greenberg, 1997). During the resistance response, the de novo synthesis of some ARNm transcriptors and defense-related proteins is induced; these proteins, together with the phytoalexins, are important in pathogen growth limitation. Finally, most of the resistance responses lead to a rapid death (within a

few hours) of the infected cells and to a limited infection spread in the neighbor cells, cellular death called hypersensitive

response (HR). The plants that were faced to, in one or many leaves, a resistance response that includes HR, develop a certain immunity to other leaf pathogens, that they weren't exposed to before, called systemic acquired resistance (Greenberg, 1997). In case of a protective role exerted by HR, PCD caused by a pathogen attack may be restricted at the infection area. As a consequence of a non-virulent pathogen attack, a localized HR occurs, that causes the rapid collapse of the tissue at the infection area and its proximity, forming a dry lesion, clearly delimited by the healthy tissue that surrounds it. PCD that is caused by pathogens is in fact induced by a series of specific toxins. As Iakimova et al. (2005) observed, the main factors involved in HR activation are: ROS, nitric oxide (NO), calcium and proton pumps, mitogen-activated protein kinases (MAPK), salicylic acid, and ethylene. It appears that ROS represents the general inductor of PCD in plants. During HR the DNA splitting takes place, and also the reorganization of cytoskeleton and disorganization of cell organelles. With respect to the regulation and execution of cellular death associated to HR, Greenberg (1997) showed that HR is accompanied by e series of events, such as: oxidative explosion, membrane damage, ionic flows, endonuclease activation, DNA splitting, and the expression of some genes. There is a chance that some of these events are solely related to the plant resistance response. The massive release of ROS (superoxides and H2O2) apparently triggers HR. The fact that some events related to the apoptosis in animals and PCD in plants are similar lead to the research and identification of caspases in the vegetal regnum as well. In this view, there were used some synthetic substrates appropriate to all three caspase types (the ones that process the cytokinins, or initiate the

201

apoptosis, or are effectors of apoptosis). These investigations proved that the plants do not possess caspase genes, and the genome sequencing in Arabidopsis and then in rice confirmed the absence of certain caspase-orthologous sequences in plants (Bonneau et al., 2008). For this reason, some enzymatic activities in plants, similar to the ones effected by caspases in animals, were called caspase-like activities (CL). By means of in silico analysis of some eukaryote genome, Uren et al. (2000) identified two new enzyme families - metacaspases and paracaspases, distantly related to caspases. Paracaspases are involved in the growth of MALT lymphoma, but they do not operate cellular death. Metacaspases are specific solely to caspase-free eukaryotes and effect CL activities, as they are involved in CD, although they may not split the caspase substrates. Metacaspases were ranged in two types: Type I - their molecule displays a N-terminal extension that reminds of the inflammatory and initiator caspases pro-domain; Type II - in which this pro-domain is absent, but presents a linker region between the large and the small subunits (Vercammen et al., 2007). An interesting aspect is that the plants display both types of metacaspases, while Protozoa, Fungi and Chromista only comprise the type I metacaspases. Metacaspases' structure contains a highly acid S1 pocket, that causes a base specificity to arginine and lysine in P1 locus, whilst the caspases present a substrate specificity for the aspartic acid in P1. A decade ago, Aravind and Koonin (quoted by Bonneau et al., 2008) considered that there are four arguments suggesting the metacaspase involvement in PCD in plants: a) certain caspase - related homologous are absent in plants; b) metacspases and caspases have a common origin; c) proliferation of the genes that encode metacaspases in plant genome, a similar process to caspases' in animal genome; d) the fusion between the type I metacaspases with a Zn-finger domain also present in LSD1* protein

(*protein that monitors a superoxide-dependent signal and operate as a negative regulator of PCD in plants) a regulator of the hypersensitive response in plants. While caspases are generally localized in cytoplasm, it seems that type I metacaspases should lie in mitochondria and chloroplasts, and type II metacaspases should be located into the cytosol. In a review article on PCD in plants, Bonneau et al. (2008) proved that, using plant extracts and synthetic caspase layers, there were identified about 8 CL activities in plants mytochondria and chloroplasts. The most studied and reported were the activities IVAD-ase and DEVD-ase type, but, along with the development and availability of new commercial synthetic substrates, there were identified other types of CL activities in plants: VEID-ase, IETD-ase, VKMD-ase, IETD-ase, VKMD-ase, LEHD-ase, LEVD-ase, and TATD-ase. The CL activities' identification in plants and their correlation with the triggering of PCD is certainly not enough to demonstrate their involvement in this process. Another evidence should reside in the use of caspase inhibitors proper to the substrate, that would trigger that PCD in plants depend on these caspase-like activities. The use of synthetic inhibitors of caspase-like activities displayed that the most were efficient in the inhibition of many types of CD in plants. It is not obvious if the CL activities in plants are due to metacaspases, or if the role of these enzymes is to activate caspase-like activity downstream proteases, or if, by any chance, they are involved in PCD control in plants. It was ascertained that another protease family – the vacuole processing enzymes (VPE), that were initially considered only responsible with the maturation of seed reserve proteins, operate caspase-1 type activities (YVAD-ase) in plants. VPE is a cysteine proteinase with substrate specificity toward an asparagine residue. Within the Arabidopsis genome there were identified 4 VPE genes, noted with α-, β-,

202

γ- and δVPE. These genes/enzymes form two sub-families: seed-like VPE and vegetative-like VPE. The genes/enzymes αVPE and γVPE are expressed in the senescent tissues of the vegetative organs, and βVPE and δVPE are expressed in seeds. αVPE and γVPE enzymes are gathered in the hydrolytic compartments of the vacuole, and βVPE and δVPE accumulate in the protein preserving compartments (Kinoshita et al., 1995, citaţi de Zhang et al., 2010; Courtois-Moreau, 2008). At the same time, there were identified some structure similarities between VPEγ from Arabidopsis and caspase-8, and also the fact that γVPE regulates the protein degradation during senescence, aspects that may represent arguments that VPE fulfills roles related to PCD in plants (Sanmartin et al., 2005). It was noticed that VPE present a caspase-like (CL) activity and regulate the CD in Nicotiana and Arabidopsis (Hatsugai et al., 2004; Rojo et al., 2004). As Jan et al. (2008) showed, the vacuole processing enzymes are cysteine proteases (like caspases); although they are not related to caspases or metacaspases, VPE present enzymatic properties common to caspase-1: two residues (His and Cys) of the VPE catalytic dyad are comparable to His-237 and Cys-285 from the catalytic dyad of human caspase-1; similarly to this example, the QACRG pentapeptide of caspase-1 active center is similar to the E(A/G)CES pentapeptide of the VPE active center; the 3 aminoacids (Arg-179, Arg-341, and Sr-347) that form the binding pocket of the substrate to caspase-1 are

also present in the more than 20 known VPE enzymes; both VPE and caspase-1 are submitted to autocatalytic processing from the previous forms. Besides VPE, saspase, a subtilisin-like serine protease (structurally different from caspases), present a CL type substrate splitting specificity. The saspase is blocked by the caspase inhibitors and is apparently involved in the proteolysis caused by the victorin of the Rubisco protein during PCD in oat. It was capable of splitting numerous substrates of the tested caspases, mainly of caspase-6, such as: VKMD, VEHD, and VNLD. Oat saspase is probably localized in E.R. or in the Golgi apparatus, and its secretion into the apoplasm initiate PCD, suggesting that the enzyme activates CD in the apoplasm (Coffeen şi Wolpert, 2004; Sanmartin et al., 2005). Despite the major progress registered in the paths and mechanisms of programmed cellular death in animals and plants, mainly during the latest two decades, there are still many unknown facts and uncertainties. If in animals things are more definite, as there is an unique PCD program (with two main operating paths), in plants there seem to be several operating programs of PCD. Obviously, the PCD programs in plants and animals are not similar. None of the cellular death systems described in plants has all the specific traits of animal apoptosis (Krishnamurthy et al., 2000). Nevertheless, metacaspases and VPE appear to be the first candidates responsible with caspase-like activities in plants. More results to elucidate the PCD control mechanism in plants are expected (Jan et al., 2008; Nanda et al., 2010)