An insight into the molecular interactions between antimicrobial

peptides and lipoproteic systems

Drd. Irina SCHIOPU

RESEARCH ALEXANDRU IOAN CUZA OF IAŞI

http://www.phys.uaic.ro/bio/ http://biofizicafizicamedicala.wordpress.com/

Trecutul Viitorul

Ne-am propus investigarea și elucidarea interacţiunilor dintre diferite peptide antimicrobiene şi bistraturi lipidice reconstituite, în scopul înţelegerii mecanismelor de acţiune litică a acestor peptide in vivo, esenţială pentru designul unor noi molecule derivate din peptide antimicrobiale naturale, dar cu proprietăţi superioare acestora. Deasemenea şi investigarea interacțiunilor dintre peptidele antimicrobiene și nanoporii proteici, elemente structurale și funcționale esențiale ale membranelor lipidice celulare.

Motivaţia studiilor

GIGAV LKVLT TGLPA LISWI KRKRQ Q – NH2

N = 26; Q = +6

Caracteristici structurale și funcționale ale peptidelor antimicrobiene

Melittin

Structura generală a unui aminoacid Cecropin B

KWKVF KKIEK MGRNI RNGIV KAGPA IAVLG EAKAL – NH2

N = 35; Q = +8

Apis mellifera

Hylaphora cecropia moth

d)

Cl-

Na+

2 nm

Realizarea bistraturilor lipidice

Tehnica “Montal – Muller” de realizare a bistraturilor lipidice planare. Înregistrări electrofiziologice la nivel de

‘singură moleculă’

• Studiul activităţii peptidelor antimicrobiene la nivelul bistraturilor lipidice

• Studiul interacţiunilor dintre peptidele antimicrobiene şi nanoporii proteici

L. Ma and S.L. Cockroft, 2010, ChemBioChem 11, 25-34

mediu hidrofob mediu polar

Reprezentare simplificată a etapelor care stau la baza acestor experimente de spectrometrie de fluorescență.

SUV 30-40 nm

Bistrat lipidic

SUV

MLV

LUV

apă

Tehnici de spectroscopie de fluorescenţă bazate pe emisia aminoacidului triptofan

Structura primara a peptidei melittin

aminoacidul Triptofan (W)

Deplasarea maximă a spectrului de emisie fluorescenţă a aminoacidului triptofan prezent în

secvenţa primară a peptidelor

∆λmax

Cromatografie în gel pe coloane Sephadex G-25 Medium hν

Studiul cineticii de formare a porilor transmembranari utilizând fluoroforul calceină încapsulată în lipozomi

a)

b)

d)

c)

Peptidă antimicrobiană

Efectul modulator al colesterolului asupra inserţiei şi activităţii peptidelor antimicrobiene

PC PC+Chol

kobs (s-1) MLT 0.14 0.02

kobs (s-1) CecB 0.08 0.05

H. Raghuraman and Amitabha Chattopadhyay, Biophysical J. 87, 2004, 2419-2432

Studiul importanţei orientării şi poziţionării aminoacidului triptofan în secvenţa primară a

peptidelor antimicrobiene scurte

(W)

I. Șchiopu, L. Mereuță, A. Apetrei, Y. Park, K.-S. Hahm, T. Luchian, 2012, Molecular BioSystems, 8, 2860 – 2863

W15 W12

LKRLQKLLSKIWNKW-NH2

W12

W13 FKRWQKLLSKIWWKN-NH2

W4

F1

Deplasarea maximă a spectrului de emisie fluorescenţă a aminoacidului triptofan prezent în secvenţa primară a peptidelor

I. Șchiopu, L. Mereuță, A. Apetrei, Y. Park, K.-S. Hahm, T. Luchian, 2012, Molecular BioSystems, 8, 2860 – 2863

α-hemolizina - proteină transmembranară heptamerică, toxina secretată de bacteria Staphylococcus aureus

Studiul la nivel de singură – moleculă a influenţei ionilor de cupru asupra modului de împachetare a peptidelor

antimicrobiene chimerice

His

Peptida antimicrobiană chimerică utilizată: CA(1-8)MA(1-12)

L. Ma and S.L. Cockroft, 2010, ChemBioChem 11, 25-34

His – Cu2+

Studiul la nivel de singură – moleculă a influenţei ionilor de cupru asupra modului de împachetare a peptidelor

antimicrobiene chimerice

His

CA(1-8)MA(1-12) + ioni de cupru

CA(1-8)MA(1-12)

L. Mereuta, I. Şchiopu, A. Asandei, Y. Park, K.-S. Hahm, T. Luchian, 2012, Langmuir, 28, 17079 – 17091

EDTA – Cu2+

Deplasarea maximă a spectrului de emisie fluorescenţă a aminoacidului triptofan prezent în secvenţa primară a peptidei

chimerice CA(1-8)MA(1-12)

Aβ(1-16)_human: Asp - Ala - Glu - Phe - Arg - His - Asp - Ser - Gly - Tyr - Glu - Val - His - His - Gln – Lys

Aβ(1-16)_rat: Asp - Ala - Glu - Phe - Gly - His - Asp - Ser - Gly - Phe - Glu - Val - Arg - His - Gln - Lys

Studierea influenţei ionilor metalelor tranziţionale (Cu2+, Fe3+, Zn2+) asupra modului de împachetare a peptidelor amilodice Ab(1-16)human şi Ab(1-16)rat . Desluşirea importanţei rolului jucat de aminoacidul His suplimentar, prezent în secvenţa primară a peptidei Ab(1-16)human, asupra modificării conformaţiei, prin legăturile coordonative create între ionii metalelor şi azotul din componenţa inelului imidiazol al acestui aminoacid.

V. Svetlana et. all, J. Mol. Bio.,388 (2) 2009, 310 – 326

Influenţa tăriei ionice, a pH-ului şi a compoziţiei lipidice asupra adsorbţiei peptidelor antimicrobiene scurte la nivelul membranelor lipidice prin metoda stingerii emisiei de fluorescenţă cu ajutorul moleculei quencher acrylamid.

Work in progress...

Analiza evoluţiei oligomerizării în timp a segmentelor de Aβ(1-42) şi identificarea secvenţelor răspunzătoare formării de oligomeri şi fibrile prin investigarea modificării fluorescenţei moleculelor de Thioflavin T (ThT) în prezenţa acestor peptide aflate în diferite stări (monomer, dimer, oligomer etc.)

Analiza modului de interacţiune a peptidelor amiloidice cu bistraturile lipidice reconstituite (BLM). Analiza influenţei proprietăţilor BLM asupra adsorbţiei şi activităţii acestor peptide.

timp

S. Kumar and J. Walter, Phosphorylation of amyloid beta (Aβ) peptides – A trigger for formation of toxic aggregates in Alzheimer's disease, AGING, 2011 Vol. 3. No 8, 1-10

Work in progress...