spectrometrie (1)
Post on 22-Dec-2015
79 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Spectrometria de absorbtie
moleculara in UV-VIS
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Radiatia electromagnetica (luminoasa)
𝒄 =𝝀
𝑻= 𝝀𝝂
𝝀~𝟏
𝝂
Unde: l = lungimea de unda, n = frecventa, T = perioada
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Spectru – toate valorile pe care le poate lua o marime
fizica
Continuu – poate lua orice valoare
Discret – poate lua
numai anumite valori
Spectre
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Spectrul electromagnetic
ln
chhE
h = 6,62 * 10-34 J*s (const. lui Planck)
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Spectrometrie/Spectroscopie
SPECTROMETRIE – pentru
determinarea unei cantitati
(analiza cantitativa)
SPECTROSCOPIE – pentru
determinarea naturii
substantei (analiza calitativa)
Spectru de absorbtie moleculara in IR
Spectru de absorbtie moleculara in UV-VIS
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Clasificarea tehnicilior spectroscopice/spectrometrice
Spectroscopie atomica Spectroscopie moleculara
Spectrometrie de absorbtie atomica
Spectrometrie de emisie atomica
Spectrometrie de fluorescenta atomica
Necesita atomizarea probei
Spectre de linii (discrete)
Spectroscopie de absorbtie moleculara in IR
Spectrometrie de absorbtie moleculara in
UV-VIS
Spectrometrie de fluorescenta moleculara
In general spectrele contin benzi
spectrale
Spectrometrie de fluorescenta de raze X
Spectrometrie de masa
Spectroscopie Raman
Spectroscopie RMN
Spectroscopie de rezonanta electronica
de spin (RES)
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Interactia unei molecule cu energia EM –
absorbtie/emisie
o O molecula va absorbi radiatia electromagnetica, trecand intr-o
stare excitata :
M + hn → M**
o Molecula nu va ramane in starea excitata M* sau M**, ea va
reveni la starea fundamentala M fie prin procese neradiative, fie
prin procese radiative (emisie). In cazul din urma, n’ ≤ n
M** → M* (fara emisie de lumina)
M* → + hn’
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Nivelurile energetice ale unei molecule
Energia totala a unei molecule – suma energiilor: electronica, de vibratie, de rotatie
DE = DEel + DEvib + DEr
DEel > DEvib >DEr
Domeniu EM Tranzitii
Microunde Rotationale
Infrarosu Vibrationale + Rotationale
Ultraviolet si vizibil Electronice + Vibrationale +
Rotationale
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Absorbtia energiei de catre molecule
Diferitele grupari functionale din molecule
(cromofori) absorb energie la anumite lungimi de
unda. Cand in molecula e un sistem de legaturi
duble conjugate – absorbtie la energii mai mici
(lungimi de unda mai mari).
In functie de lungimea de unda la care o
substanta absoarbe, ea va aparea ochiului ca
fiind colorata in culoarea sa complementara
(radiatia neabsorbita fiind reflectata).
Substanta va fi colorata in culoarea opusa pe
roata fata de culoarea absorbita. Substanta alba
– absorbtie nesemnificativa in VIS; substanta
neagra – absorbtie puternica in tot domeniul VIS.
Ex : absorbtie la 420 nm (in albastru) → culoare
galbena
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Legea Lambert-Beer
Exprima legatura intre intensitatea luminii absorbite si concentratia solutiei.
cl
oII 10
I0 – intensitatea luminii incidente
I – intensitatea luminii transmise
– coeficient de absorbtie molara
(caracteristica a substantei)
c – concentratia substantei din cuva
l – lungimea cuvei
O substanta absoarbe diferit in functie de lungimea de unda :
= f (l)
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Marimi folosite in spectrofotometrie
Transmitanta
cl
I
IT 10
0
10010100%0
cl
I
IT
Dependenta neliniara fata de concentratie – mai greu de lucrat. Se prefera
obtinerea unei dependente liniare.
Absorbanta
clI
ITA )log()log( 0
clA lO alta forma a legii
Lambert-Beer
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Aplicatie – analiza fluidelor biologice
• Fluidele biologice contin un numar mare de substante dizolvate
• Spectrofotometria nu poate fi utilizata pentru a da informatii
calitative despre substantele dizolvate in absenta unei separari
prealabile
• Separarea substantelor chimice – obtinuta prin cromatografie
• Detectia e asigurata prin spectrofotometrie (de obicei prin
masurarea la o lungime de unda fixa) – rezulta o cromatograma
(absorbanta in functie de timpul pe care substanta il petrece in
coloana cromatografica)
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
1. SURSA DE RADIATII
2. MONOCROMATOR – selecteaza radiatia de o singura lungime de unda
3. COMPARTIMENT PENTRU PROBA
4. DETECTOR
5. COMPUTER
o Detectorul masoara intensitatea radiatiei transmise. Pentru a putea
masura absorbanta e nevoie de si de intensitatea radiatiei incidente.
o Trebuie masurata intensitatea luminii ce trece printr-o solutie cat mai
asemanatoare cu cea pe care o analizam, dar care nu contine
substanta de interes – solutie blank.
Spectrofotometrul de absorbtie
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Schema dublu fascicul permite o analiza mult mai rapida, fara a mai fi
nevoie sa schimbam proba cu blank de fiecare data cand schimbam
lungimea de unda. Dezavantaj – pret mai mare.
Monofascicul
Dublu fascicul
Spectrofotometrul monofascicul/dublu fascicul
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Parte experimentala
1. Trasarea spectrului de absorbtie pentru o solutie de colorant
alimentar Sunset Yellow (E110) in intervalul 400 – 700 nm prin
citirea absorbantei din 20 in 20 nm
2. Alegerea lungimii de unda la care absorbanta este maxima (lmax)
3. Masurarea absorbantei la aceasta lungime de unda pentru solutii
de Sunset Yellow de concentratie cunoscuta (3, 5, 10, 20, 30, 40
mM)
4. Trasarea dreptei de calibrare/etalonare A = f (c) si gasirea
parametrilor dreptei
5. Masurarea absorbantei unei solutii de Sunset Yellow de
concentratie necunoscuta la lmax
6. Aflarea concentratiei necunoscute prin interpolare pe dreapta de
calibrare
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Mod de lucru
1. Se porneste spectrofotometrul si se asteapta pana cand pe
ecran e afisata absorbanta.
2. Se selecteaza lungimea de unda la care se doreste citirea
absorbantei.
3. Deoarece spectrofotometrul din laborator este monofascicul, este
necesara aducerea absorbantei la 0 de fiecare data cand se
schimba lungimea de unda. Pentru aceasta se introduce o
cuva cu solventul probei (apa) si se apasa pe butonul ZERO.
4. Se introduce in spectrofotometru cuva cu solutia de interes si se
citeste absorbanta.
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Trasarea spectrului Sunset Yellow (E110)
Spectrul de absorbtie al Sunset Yellow se obtine prin reprezentarea A = f (l)
Gasirea maximului de absorbtie in
intervalul ales
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Trasarea dreptei de calibrare
c (mM) A (… nm)
3
5
…
X
X = ?
Parametrii dreptei y = a + bx se obtin cu
Excel / Origin sau cu ecuatiile :
N
xbya
xxN
yxxyNb
22
Ax
Almax
c (mM)
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu
Observatii
1. Folosim pentru determinari cantitative numai absorbanta masurata
la o lungime de unda unde avem un maxim.
2. Legea Lambert-Beer e valabila cand se folosesc concentratii
molare sau normale.
3. Absorbanta este aditiva. Daca in solutie ar mai exista o alta specie
care sa absoarba la aceeasi lungime de unda ca si colorantul
nostru, absorbanta ar fi suma absorbantelor individuale date de
cele doua componente.
4. Metoda spectrofotometrica e sensibila pana la concentratii de ~ 1
ppm (1 mg/mL)
top related