metode de purificare-2

Gel-cromatografia(sitare moleculară )

Metoda se bazează pe diferenţele de mărime ale proteinelor:•perlele de răşină prezintă mici pori, în care pot difuza moleculele de proteină ce sunt suficient de mici. •cele cu dimensiuni mai mari vor rămâne în faza mobilă

şi vor fi eluate din coloană

Proteina mare Proteina mica

Traseu scurt Traseu lung

Structura Sephadex

Cromatografia de schimb ionic

Enzimele posedă o anumită sarcină electrică în soluţie, în funcţie de : structura lor pH izoelectric. valoarea de pH, •În soluţii cu valori de pH:• sub valoarea punctului izoelectric, enzimele vor avea încărcare pozitivă şi se vor lega de schimbători cationici, •în soluţii cu pH mai mare de punctul izoelectric vor fi încărcate negativ şi se vor lega de schimbători anionici.

•Valoarea de pH trebuie să fie astfel aleasă încât să menţină încărcarea electrică opusă a proteinei/enzimei şi a schimbătorului de ioni.

•Tăria ionică trebuie să fie suficientă pentru a asigura solubilitatea proteinei, fără ca sarcinile să competiţioneze cu proteina pentru situsurile schimbătorului de ioni.

+

_Sar

cina

net

a de

la s

upra

fata

pro

tein

ei

4 5 6 7 8 9 pH

Legare la schimbatori cationici

Legare la schimbatori anionici

Domeniu de stabilitate de pH

++

++

+ ++

+

-

- -++

+

+

+

++

+ +-

- -+

Matrice schimbatoare de ioni cu

sarcini pozitive (anionica)

Proteina cu sarcina negativa

la valoare de pH selectataProteina legata de matrice

Schimbătorii de ioni sunt, în general polimeri insolubili în apă, ce conţin grupări cationice sau anionice.

- schimbătorii cationici conţin grupări anionice: SO3-, -OPO3-, COO-;- schimbătorii anionici conţin grupări cationice: grupări terţiare şi

cuaternare de amoniu, cu formula generală –NHR2+ şi +NR3+.

Principalele tipuri de schimbători de ioni

Tip de schimbător

Grupare funcţională Contra-ion

Denumire

Schimbător cationic slab

carboximetil-O-CH2-COO-

Na+ CM(celuloză, sephadex)

Schimbător cationic puternic

sulfopropil-O-CH2- CH2- CH2-SO3

-

Na+ SP(sephadex)

Schimbător anionic slab

dietilaminoetil Cl- DEAE(celuloză, sephadex)

Schimbător anionic puternic

amină cuaternară(dietil-(2-hidroxipropil) amino etil)

QAE(sephadex)

Pentru un amestec de proteină, care la pH 7,0 au următoarele sarcini electrice :poteina 1 +4proteina 2 +2proteina 3 0proteina 4 -2proteina 5 -4

Etapele procesului de schimb ionic sunt:a) se alege faza staţionară (răşina) cu încărcare pozitivă, şi se utilizează un tampon de tărie ionică mică ce conţine grupări

negativeb) – când se adaugă amestecul de proteine, proteinele încărcate negativ (4 şi 5) vor înlocui ionii negativi ai tamponului şi se

vor lega de răşinăc) – proteine încărcate pozitiv şi neutre nu vor interacţiona cu faza staţionară şi vor trece în volumul de lichid V0 prin eluţie;d) – după legarea proteinelor, se adaugă un tampon (faza mobilă) ce are tărie ionică mare (se foloseşte de obicei NaCl);e) – ionii negativi din acest tampon mai concentrat vor competiţiona cu proteina pentru sarcinile electrice pozitive ale răşinii;f) – când tăria ionică este suficient de mare pentru a dislocui proteina, aceasta va fi eliberată, putând fi eluată din coloană;g) – cu cât sarcina electrică negativă a proteinei este mai mare, cu atât concentraţia ionică a tamponului de eluţie este mai

mare.

++++

-

-

-

-

Incarcarea coloanei-initial

Incarcarea coloanei-finalSpalarea coloanei cu solutie

cu tarie ionica mica

Proteine nelegate

Gradient saruri

0

1M

Gradient saruri-initial

Gradient saruri-final

IIIII

I

Adsorbtia proteinelor

Echilibrare

Aplicarea probei si spalare

ElutieRegenertare

Test rapid

Cromatografie de schimb ionicElutie prin gradient de tarie ionica (concentratie de saruri)

Cromatografia de afinitate

Metode de purificare a enzimelor ce au în comun faptul că se stabilesc interacţii mai mult sau mai puţin specifice între enzimă şi un ligand imobilizat.

Proba Tip de ligand

Enzima Substrat, inhibitor, cofactor

Antigen Anticorp, virus, celula

Lectina Polizaharide, glicoproteine, receptor de celula

Acid nucleic Secventa complementara de baza, histone, acizi nucleici, polimeraze, proteine de legare

Hormoni Receptori, proteine de transport

Matrice de cromatografie de afinitate in prezenta proteinei-tinta

A-suport de imobilizareB- spacer armC- ligandulD-proteina-tinta

Matrice de cromatografie de afinitate cu metal imobilizat

Suport de imobilizare pe care este atasat un agent de chelare ce leaga coordinativ un ion metalic