fdi2

PROTEINE

Definiţie

• Biomacromolecule formate din una sau mai multe catene, rezultate prin policon-densarea aminoacizilor.

Funcţionalitate extrem de diversă

• Biocataliza enzimatică• Hormoni• Transport, stocare• Formaţiuni motile• Suport structural• Anticorpi• Transmitere de impulsuri nervoase• Reglarea unor procese metabolice

Determinarea compoziţiei și purificarea proteinelor

1. Evaluarea conţinutului de proteină brută

• 1. Metoda KjeldahlSe bazează pe corelaţia conţinutului de

azot cu cel de proteină. Se consideră că proteinele contin 16 %

azot

Norg (NH4)2SO4

H2SO4

(NH4)2SO4 NH4OHNaOH

NH4OH NH3

NH3 NH4Cl

HCl

– Mineralizarea probei– Antrenarea amoniacului şi

dozarea acestuia

1. Evaluarea conţinutului de proteină brută

• 2. Metoda LowrySe bazează pe absorbanţala 660 nm a complexuluireacţiei de tip Biuret (proteină

+ Cu+2) şi formei reduse a reactivului Folin de catre Cu+

rezultat la oxidarea Tyr, Cysşi Trp

• Reactivi:– Soluţie alcalinocuprică– Reactiv Folin Ciocâlteu

(soluţie fosfomolibdo-wolframică NaWO4 2H2O NaMoO4 2H2O)

NO

N

H

R

H

N O

N

HR

H

Cu+2

Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)

1. Evaluarea conţinutului de proteină brută

N

N

CO2H

CO2H

N

N

HO2C

HO2C

Cu+

• 3. Varianta reactivbicinconinic

Acid 2,2’ bichinolin 4,4’ dicar-boxilic

Proteina interacţionează cu ionul Cu2+ într+o reacţie similară cu reacţia Biuret. În urma acestei reacţii, în mediu alcalin are loc reducerea Cu2+ la Cu+ care dezvoltă o coloraţie purpurie prin complexare cu reactivul

562 nmAnal Biochem. 1985 Oct;150(1):76-85

• 4. Metoda Bradford• Deplasarea maximului de

absorbţie al colorantului în urma ataşării acestuia de proteină (465 595 nm)

CH3H3C

N

N

NH

O SO3-

SO3-

Coomassie Blue G-250

Bradford, M. M. (1976), Anal. Biochem. 72:248-254

2.Separarea și purificarea proteinelor

• 2.1. Distrugerea membranelor şi pereţilor celulari– Mijloace nechimice

• Utilizarea de abrazivi• Forfecarea prin de destindere• Ultrasonare

– Mijloace chimice• Solvenţi organici• Detergenţi• Agenţi chaotropici• Tratament alcalin• Enzime (lizozim)

DezintegratoareUltrasonic Forfecare la destindere

Dezintegratoare (continuare)

Centrifugarea2.2. Îndepărtarea resturilor de la omogenare

2.3. Purificarea grosieră a proteinelor

• Precipitare lapunctul izoelectric

• Precipitarea prin efect salin

Solubilitatea carboxihemoglobinei funcţie de tăria ionică și natura ionilor

Dializa

Purificarea fină a proteinelor

• Metode cromatografice• Metode electroforetice

Cromatografia de excluziune sterică

Electroforeza (principiu)

Relaţia mobilitate masa la separările electroforetice Gel electroforetic după migrare

Determinării structurii primare a proteinelor

1. Separarea catenelor (desfacere de legături slabe)– Utilizare de valori extreme ale pH-ului– Agenţi chaotropici (distrugători de structură)

• Uree 8M• Clorohidrat de guanidiună 6M

– Concentraţii ridicate de săruri (sulfat de amoniu)

2. Desfacerea puntilor disulfurice– metode reductive– metode oxidative

3. Stabilirea compoziţiei în aminoacizi– Hidroliza, separare

Secvenţa determinării structurii primare a proteinelor (continuare)

• 4. Stabilirea aminoacizilor de capăt– N, C.

• 5. Fragmentarea catenelor lungi– Chimic, enzimatic

• 6. Secvenţarea propriuzisă Edman• 7. Reconstituirea secvenţei prin alinierea

fragmentelor– Evaluarea secvenţelor pe tip de fragment

• 8. Relocarea punţilor disulfurice– Electroforeza fragmentelor înainte şi după desfacerea punţilor disulfurice

2.Desfacerea punţilor disulfurice

1. Căi reductiveMercaptoetanol

Ditiotreitol

2. Căi oxidativeAcid performic

3.Determinarea compoziţiei in aminoacizi

• Hidroliza acidă (HCl 6N la reflux 72-96h)

1. Separare cromatografica2. Identificare, cuantificare

O

O

OH

OH

O

O

O

O

O

NCH

R

O

O-H3N

R

CO2-

O

O-

NCH

R

CO2O

O-

NH2

R CHO

HOH

O

O-

N

O

O

OH

H

O

O-

N

O

OPurpura lui RUHEMANN

Ninhidrinã(tricetohidrindenhidrat)

dsdf

Rf=100 x ds/df

Reactia ninhidrinei şi determinarea calitativă prin cromatografie pe strat subţire a aminoacizilor

4. Determinarea aminoacizilor de capăt

• Aminoacizii N-teminali– a) dansilarea

• Aminoacizii C-teminali• a) Metoda Akabori

+ aa1 +...

hidrolizãacidã

-CH(R)-CO2H

NH3C CH3

SO2NH

Clorurã de dansil

-CH(R)-CO-NH-CH...

NH3C CH3

SO2NH

H2N-CH(R)-CO-NH-CH-....

NH3C CH3

SO2Cl

2,4 dinitrofluorobenzen

NO2

NO2

NH

NO2

NO2

NHNO2

NO2

F

+ aa1 +...

hidrolizãacidã

-CH(R)-CO2H-CH(R)-CO-NH-CH...

H2N-CH(R)-CO-NH-CH-....

a) Metoda Sanger

NH CH CO NH CH CO NH CH CO2-

R1R2R3

H2N NH2H2N NH2

H3N+ CH CO

Ri

NH NH2

H3N+ CH CO2

-

R1

i=2,...

Enzima Situs preferatTripsina R1: Lys, ArgClostripaina R1: ArgChimotripsina R1: Tyr, Phe, Leu, Ile, Val, TrpTermolisina R2: Tyr, Phe, Leu, Ile, Val, TrpPepsina R1: Phe, Leu, mulţi alţi aminoaciziProtează stafilococică (tampon fosfat) R1: Asp, GluProtează stafilococică (tampon HCO3- ) R1: GluSubtilizina R1: MulţiCarboxipetidaza A R2: Aminoacid C- terminal (exceptie, Arg,

Tyr, Trp)

H3N CH C

R1 O

O COOH3N CH

R2

H3N CH C NH

R1 O

COOCH

R2

5. Fragmentarea catenei polipeptidice

a. Fragmentare enzimatică

+

bromocian

homoserinolactona

H3NC NH CH C O

O

CH2

CH2

O

HO

H

SCNH3C

C NH CH C N

O

CH2

CH2

O

H

C NH CH C N

O

CH2

CH2

SH3C CN

O

H

C

N

Br

C NH CH C NH

O

CH2

CH2

SH3C

O

b. Fragmentare chimică cu bromocian

6. Secvenţarea Edman

N

NH

O

R1

S

NC

S

R1

NH

H2N

O

R2O

(H*)

R1

NH

N

O

R2O

S

CNH

H

(H*)

NH2

R2O

R1N

OS

CN

H(H*)

CF3CO2H

pH = 9

mediu apos

feniltiocarbamoil peptidă

peptida fărăaminoacidul N-termina

AnilinotiazolinonăFeniltiohidantoină (PTH)

7. Reconstitu-irea secvenţei totale

8. Relocarea puntilor disulfurice

Alanina A alaArginina R argAsparagina N asnAcidul Aspartic D aspCisteina C cysGlutamina Q glnAcidul Glutamic E gluGlicina G glyHistidina H hisIzoleucina I ileLeucina L leuLizina K lysMetionina M metFenilalanina F pheProlina P proSerina S serTreonina T thrTriptofan W trpTirozina Y tyrValina V val

Aminoacizii naturali, sistematizaţi pe diferite criterii

L-prolinaL-aminoacid

Structura primară şi secundară a unei proteine

Diagrama Ramachandran

Unghiurile de torsiune şi

Conformatiedefavorizata

Structuri helix

Principalele tipuri de structuri secundare dispuse pe diagrama Ramachandran

Modelulalfa helix în diferitereprezentări

Modele foi plisate (modele beta) paralel si antiparalel

Modelul paralel

Modelul antiparalel

Foi beta : model antiparalel

Foi beta : model paralel

Model paralel

Model antiparalel

FOI BETA

Model foaie beta antiparalel extins

Modalităţi de conectare ale structurilor beta:a) Antiparalel, prin buclăb) Paralel, prin buclă de dreapta, cazul comunc) Paralel, prin buclă de stânga, caz extrem de rar

Modalităţi de formare a structurilor helicoidale din proteine

Bucle• Buclele se plasează

între helixuri sau foi plisate. Ele nu sunt atât de rigide. De regulă aceste regiuni sunt zone de recunoaştere

Structuri suprasecundare

Interacţiuni care stabilizează structurile terţiare proteice