STAFILOCOCIISTAFILOCOCI COAGULAZA POZITIVISTAFILOCOCI COAGULAZA NEGATIVI

CRITERII CLSI(CLINICAL AND LABORATORY STADARDS INSTITUTE)

IstoricPrimele observaţii legate de rolul bacteriilor aranjate “în grămezi” în apariţia unor abcese şi faptul că boala poate fi reprodusă la şoarecele alb, prin inocularea puroiul din aceste colecţii, au fost semnalate şi publicate, în 1880, de către chirurgul scoţian, Sir Alexander Ogston

Robert Koch evidentiaza in puroi stafilococii După doi ani de la observaţia lui Koch, în 1880, Pasteur a cultivat pe mediu lichid

stafilococii din conţinutul unui furuncul iar Rosenau l-a obţinut în cultură pură

Definitie: Bacteriile din genul Staphylococcus sunt coci Gram-pozitiv dispuşi izolat, în perechi, scurte

lanţuri, dar mai ales în grămezi neregulate, cu variaţii de dimensiuni (0,5 – 1,5 m), imobili şi nesporulaţi.

Cele mai multe specii sunt catalază-pozitive, facultativ anaerobe, dar cresc mai bine aerob. Există şi excepţii, care preferă anaerobioza (e.g. S.sacharolyticus, S. aureus, subsp.

anaerobius). Nepretenţioşi nutritiv, cultivă pe majoritatea mediilor uzuale şi tolerează concentraţii de peste

5% NaCl, unele specii fiind chiar halofile (tolerează concentraţii de 10 – 15% NaCl).

Genul Stapylococcus a fost separat de fosta familie Micrococacceae datorită - conţinutului total diferit al bazelor, - compoziţiei peretelui celular, - diferenţei imunologice ale catalazelor, - spectrului diferit de sensibilitate la antibiotice- metabolismului în relaţie cu oxigenul (micrococii sunt aerobi, cu metabolism strict

respirator).

Au fost identificate până în prezent 33 de specii de stafilococi, dintre care 16 la om: S. aureus şi 15 specii de stafilococi coagulază-negativi .

Stafilococi: microscopie

1

Habitat Stafilococii se dezvoltă, în mod normal, la nivelul tegumentelor şi mucoaselor atât ale omului

cât şi ale animalelor şi păsărilor, fiind responsabili de majoritatea infecţiilor supurative. Capacitatea lor de a produce coagulază este strâns legată de caracteristicile patogenetice şi S.

aureus este frecvent asociat cu producerea acestei enzime (fiind numit şi coagulază-pozitiv); S. aureus este condiţionat patogen: comensal în 20- 30 % din cazuri, este pe de altă parte

frecvent implicat în infecţii supurative, septicemii, toxiinfecţii alimentare, pneumonii, meningite etc.

Cea de-a doua categorie, în funcţie de acest criteriu, este reprezentată de stafilococii coagulază-negativi, care reunesc 32 de specii, majoritatea nepatogene sau, cel mult accidental patogene (e.g. S. epidermidis, S. saprohyticus, S. lugdunensis, S. scheleiferi S. haemolyticus, S. hominis, S. capitis, etc.)

Stafilococi coagulaza pozitivi S. aureus este prezent, în 20-30%, în narine sau/şi intestin. Pentru personalul de spital proporţia variază, în funcţie de condiţii, între 40 şi 70%. Prezenţa pe tegumente este tranzitorie, variind între 5 şi 10%.

Cultivare Nepretenţioşi nutritiv, deşi facultativ anaerobi, stafilococii cultivă cel mai bine în aerobioză. Temperaturi de creştere: 10 - 44C, optim la 37C, iar pigmentogeneza este mai activă la

20C. Pe geloză nutritivă, după incubare peste noapte la 37C, formează colonii S, mari, rotunde,

bombate, de consistenţă untoasă, pigmentate diferit: orange, galben sau alb. Pigmentogeneza, caracter variabil, este mai intensă în prezenţa aerului şi la temperatura

camerei. Pe agar-sânge coloniile sunt mai frecvent hemolitice. Capacitatea lor de a creşte pe medii cu sare permite izolarea din produse patologice

contaminate (ex. materii fecale sau exsudat naso-faringian).

2

Rezistenta la factori de mediu S. aureus este foarte rezistent: în puroi uscat, la întuneric, poate supravieţui 2-3 luni, dar este

distrus după 30 de min. la 62C căldură umedă şi după 15 minute la 121C, sub acţiunea fenolulului în soluţie 2% după 15 minute, a alcoolului etilic de 70C, după 60 de minute şi este sensibil la acţiunea hexaclorofenului.

Este rezistent la acţiunea lizozimului, la acţiunea bactericidă nespecifică a serului şi a acizilor graşi de pe tegument.

Rezistenta in mediu extern Supravieţuirea în afara gazdei vii este redutabilă: rezistă în produse de carne 60 de zile iar în

carcase de animal 42 de zile. Prezenţa stafilococului auriu a fost obiectivata dupa mai multe ore-zile pe obiecte, pardoseli,

tegumente (minute - ore - zile).

Factori asociaţi bacteriei

Capsulă Proteina A Proteina de legare a fibronectinei Proteina de legare a colagenului

Produşi extracelulari Enterotoxine Toxina epidermolitică Toxina sindromului şocului toxic (TSSS - 1) Hemolizine Leucocindine Stafilochinază

Factori de patogenitateVirulenţa acestei specii este rezultatul efectului combinat al mai multor factori de patogenitate

1. Structuri parietale• peptidoglicanul manifestă proprietăţi endotoxină-like;• acidul ribitol teichoic, cu specificitate de specie, are proprietăţi adezive la

receptorii celulari şi determină reacţii de sensibilizare după infecţii repetate;• proteina A leagă IgG prin Fc şi impiedică opsonizarea şi fagocitoza;• adezine la proteine ale gazdei: fibrinogen/fibrină (coagulaza legată),

fibronectină, colagen;• microcapsula polizaharidică cu efect antifagocitar.

Structura antigenica* Capsula inhibă opsonizarea şi acţiunea fagocitelor; protejează împotriva acţiunii distructive

intermediată de C’; numai unele tulpini de S. aureus prezintă antigene capsulare (in vivo sunt mai frecvente,

comparativ cu posibilităţile noastre de a le menţine in vitro). Peptidoglicanul asigură stabilitatea osmotică; stimulează producerea endogenului pirogen;

este chemoatractant pentru leucocite; inhibă fagocitoza şi chemotaxia.

Proteina A este prezentă la 90% dintre tulpini, în cantităţi variabile, fiind eliberată în mediu în timpul cultivării, are funcţii complexe şi este imunogenă iar anticorpii anti proteină A sunt prezenţi la persoanele cu infecţii severe.

3

Acidul teichoic membranar este un antigen cu specificitate de specie care poate fi evidenţiat prin reacţii de precipitare;

după infecţii repetate determină reacţii de hipersensibilizare, este receptor pentru bacteriofagi, realizează ataşarea la receptorii celulari ai mucoaselor şi reglează concentraţia în cationi la nivelul membranei celulare

Membrana citoplasmică realizează o veritabilă barieră osmotică, reglează aporturile şi eliminările de substanţe intra- şi extracelular, fiind sediul biosintezelor enzimelor respiratorii.

Toxinele şi enzimele implicate în patogenitate sunt şi ele antigene.

Exotoxine si exoenzime S. aureus produce numeroase exotoxine şi exoenzime (agresine); mulţi factori sunt prezenţi doar la unele tulpini Produşi extracelulari Enterotoxine Toxina epidermolitică Toxina sindromului şocului toxic (TSSS - 1) Hemolizine Leucocindine Stafilochinază

2. Exoenzime• coagulaza liberă

- se leagă de protombină şi determină conversia fibrinogenului în fibrină;- înglobează cocii în trama de fibrină, protejându-i de fagocite;- formează trombi, implicaţi în patogenia tromboflebitelor septice;

• stafilokinaza - activează plasminogenul, detreminând disoluţia cheagurilor de fibrină;

• hialuronidaza- hidrolizează matricea intercelulară;

• lipaze- active pe lipidele din plasmă şi sebum, explicând tropismul pentru

unitatea pilo-sebacee.

3. Exotoxinecitotoxine

- hemolizine α, β, γ şi δ, active pe eritrocite provenite de la diferite specii animale; cel mai bine caracterizată este hemolizina α, incriminată în manifestări ale şocului septic;

- leucocidina care are efect leucolitic, prezentă în special la tulpini izolate din leziuni dermonecrotice;

toxine exfoliative (A şi B)- au activitate proteazică, determinând ruperea desmozomilor de la nivelul

stratului granulos, cu formare de bule epidermice;- implicate în sindromul pielii opărite (boala Ritter la copil sau Lyell la

adolescent şi adult);Enterotoxine Unele tulpini de S. aureus produc enterotoxină termostabilă (rezistă 30 de minute la

fierbere) şi rezistentă la acţiunea enzimelor digestive. Prin ingerarea ei împreună cu alimentele în care s-a multiplicat, bacteria poate duce la

fenomene de toxiinfecţie alimentară. S-au descris 6 tipuri antigenice; cel mai frecvent implicate în patologia umană sunt

serotipurile A şi D.

Exotoxine

4

Enterotoxina B este posibil implicată în patogenia sindromului şocului toxic stafilococic (SSTS) ca şi a enterocolitei stafilococice post-antibiotice.

Toxinele exfoliative sau epidermolitice sunt reprezentate de 2 proteine codificate plasmidic, acţionând chiar la distanţă de focarul de infecţie, provocând dizolvarea matricei de mucopolizaha-ride de la nivelul epidermului cu ruperea desmozomilor, desprinderea epidermului până la nivelul stratului granulos, cu pierderea de fluide prin tegumentul lezat.

TSST - 1 Toxina 1 a sindromului şocului toxic stafilococic (TSST-1) sau toxina pirogenă a fost

identificată la tulpinile de stafilococ implicate în etiologia acestui sindrom, care a fost raportat ca o complicaţie a abceselor stafilococice, a osteomielitelor, a suprainfectării plăgilor chirurgicale sau a pneumoniilor stafilococice postgripale.

Rolul său în etiopatogenia SSTS nu este foarte clar; s-a demonstrat cu certitudine, prin modele experimentale pe animale de laborator, rolul său de a amplifica răspunsul letal indus de infime cantităţi de endotoxină (aparţinând bacteriilor Gram negative). Au fost puse la punct numeroase metode de laborator pentru evidenţierea TSST-1: latexaglutinarea, ELISA, imunobloturi pe coloană ş.a

Leucocidina Leucocidina produsă de S. aureus este o exotoxină cu efect toxic direct la nivelul membranei

citoplasmatice şi lizozomale a PMN, determinând degranularea citoplasmei, cu liză celulară în final. Această toxină alterează permeabilitatea celulară pentru K+ şi alţi ioni.

Hemolizinele Hemolizinele, în număr de 4, prezintă numeroase activităţi biologice; alfa-hemolizina are

efect letal pentru mai multe tipuri de celule, inclusiv PMN umane. Lizează eritrocitele mai multor specii animale, este dermonecrotică după injecţii subcutanate şi are efect letal asupra animalelor inoculate intravenos. Mai frecvent implicate în patologia umană sunt hemolizinele şi .

Hemolizina este o citotoxină care inhibă absorbţia apei în intestin şi a fost incriminată în patogenia enterocolitelor post-antibiotice.

Hemolizina b, o sfingomielină, este activă pe mai multe tipuri de celule; are proprietăţi hemolitice ce pot fi amplificate prin expunerea celulelor roşii la rece (este aşa-numita hemoliză “cald-rece”).

Hemolizina c, ca şi , determină liza diferitelor tipuri de celule.

Enzime Enzimele implicate în patogenia infecţiei stafilococice sunt reprezentate de hialuronidaze,

stafilochinază, coagulază, catalază, lipaze, b lactamaze.

Hialuronidaza Hialuronidaza hidrolizează matricea intracelulară a mucopolizaharidelor tisulare,

determinând, mai ales în fazele iniţiale ale infecţiei, diseminarea acesteia. Stafilochinaza, numită şi fibrinolizină, este produsă prin conversie lizogenică, de stafilococi

în fază staţionară, având acţiune fibrinolitică prin activarea plasminogenului. Prin liza trombilor septici intravenoşi ar putea realiza diseminarea infecţiei cu apariţia septicopioemiei.

Coagulaza Coagulaza, forma liberă (solubilă) şi cea legată, este produsă de peste 96% dintre tulpinile

de S. aureus şi poate acţiona ca factor opsonizant şi antifagocitar prin acţiunea ei de a acoperi bacteria cu fibrină. Determină apariţia trombilor septici endovenoşi în focarul de infecţie.

5

Evidenţierea producerii de coagulază reprezintă testul major, prezumtiv de identificare al S. aureus.

Catalaza Inactivează peroxidul de hidrogen toxic şi radicalii liberi formaţi de către sistemul

mieloperoxidază, intrafagocitar, după ingestia bacteriilor.

Lipazele Lipazele sunt active asupra lipidelor din plasmă şi din sebum. Aceasta explică tropismul

stafilococilor pentru unitatea pilosebacee. Virulenţa scade când sinteza lipazelor este reprimată în cursul găzduirii unor profagi.

b lactamazele lactamazele, în număr de patru, explică rezistenţa stafilococilor la penicilină şi antibiotice

penicilin-like. Producerea acestor enzime, de peste 90% dintre tulpinile de S. aureus, poate fi inductibilă

(rezistenţa ce apare numai în prezenţa antibioti-celor b lactam) Genele care codifică sinteza acestor enzime sunt de tip plasmidic (pentru A, C si D) sau

cromozomal (pentru B), ele fiind şi carrier-ul rezistenţei pentru alte antibiotice, cum ar fi eritromicina sau tetraciclinele.

Clasificarea moleculară Ambler a beta-lactamazelor (bazată pe secvenţa a.a. din zona funcţională)

Clasa A: serin – beta-lactamaze (penicilinaze şi cefalosporinaze) Clasa B: metalo (Zn) - beta-lactamaze (carbapanemaze) Clasa C: serin – beta-lactamaze (cefalosporinaze inductibile cromozomale) Clasa D: serin – beta-lactamaze (oxacilinaze)

Grupa 2a betalactamaze (vezi clasificarile Ambler si Bush) Prezente la Staphylococcus sp Enzime inductibile codificate plasmidic

6

Hidrolizează peniciline de biosinteză şi semisinteză cu spectru larg Inactive faţă de peniciline din grupa M, cefalosporine şi carbapeneme Inactivate de inhibitori de betalactamază Hiperproducţia acestora poate determina o rezistenţă de nivel jos faţă de peniciline din grupul

M Transferate orizontal la tulpini de E. faecalis

Manifestări clinice ale infecţiilor stafilococice supurative infecţii cutanate şi ale glandelor anexe: foliculite, impetigo, furuncul, carbuncul,

hidrosadenite, panariţii etc; infecţii ale mucoaselor: otite, sinusite; infecţii ale părţilor moi: abcese, flegmoane; infecţii profunde: osteomielite, osteoartrite, pneumonii, abcese hepatice, cerebrale,

meningite, endocardite; bacteriemii cu sepsis sever sau şoc septic.

Variabilitatea S. aureus In populaţiile de S. aureus, variabilitatea este relativ frecventă, explicând numeroasele

variante având: diverse caractere de cultură (pigmentogeneză, hemoliza prezentă sau nu), rezistenţă la antibiotice patogenitate diferita (prezenţa sau nu a unor factori de virulenţă)

7

Imunitatea antistafilococica Speciile virulente de stafilococi rezistă fagocitozei; cel mai frecvent, aceste tulpini s-au

dovedit a fi de S. aureus. Această rezistenţă poate fi dată de producerea capsulei in vivo şi, în parte, datorată producerii

de coagulază, care protejează bacteria prin bariera de fibrină. Pare a fi unanim acceptată ideea că S.aureus este fagocitat în prezenţa unor cantităţi adecvate

de Ac; bacteria ingerată supravieţuieşte într-o cantitate mică şi este dificil pentru organismul gazdei să elimine complet infecţia.

Când aceasta este controlată insuficient, apar leziuni severe chiar la gazda imunizată; mecanismul cel mai probabil este o reacţie de hipersensibilizare de tip întârziat

Imunitatea antistafilococică este puţin cunoscută: nu se ştie de ce lipseşte o corelaţie între titrul unui anumit anticorp şi rezistenţa sau receptivitatea la infecţiile cu S. aureus.

Ac anti-leucocidină fac excepţie (par a fi protectori faţă de infecţiile recurente). Nu se ştie, de asemenea, dece vaccinul antistafilococic (anatoxina, vaccinul polivalent,

autovaccinul) stimulează rezistenţa imună specifică a organismului doar la 50% dintre vaccinaţi

Diagnosticul de laborator al infecţiilor supurative se bazează pe examen bacteriologic; produsul patologic variază în raport cu localizarea infecţiei; examenul microscopic are în special valoare în cazul produselor provenite din zone normal

sterile; izolarea S.aureus o realizăm prin însămânţare pe geloză-sânge iar în cazul produselor

contaminate pe mediul selectiv Chapman; identificarea se bazează pe caracterele de cultivare, microscopice, testul catalazei şi

coagulazei; în investigaţii epidemiologice (izbucniri epidemice) se poate recurge la lizotipare sau tipare

moleculară.

8

Principii de terapie a infecţiilor stafilococice

în infecţii cutanate ca şi în colecţii purulente profunde, drenajul chirurgical este esenţial; antibioterapia infecţiilor sistemice este ghidată de rezultatele antibiogramei.

9

FENOTIPURI DE REZISTENŢĂ FAŢĂ DE ANTIBIOTICE LA STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Importanţa medicală a S.aureus

determină infecţii care se remarcă prin frecvenţă şi diversitate, unele cu evoluţie deosebit de gravă (bacteriemii cu localizări metastatice, şoc toxic stafilococic); s-a demonstrat capabilă să dezvolte rezistenţă la orice antibiotic folosit în terapie.

Evoluţia rezistenţei la antibiotice 1948-1960 - apariţia de tulpini cu rezistenţă la penicilină, streptomicină, tetraciclină şi eritromicină;

1961-1975 - apariţia tulpinilor cu rezistenţă la meticilină prin achiziţia genei mecA

• antrenează rezistenţă la tot grupul antibioticelor beta-lactamice;

• tulpini cu o mare capacitate de răspândire.

• “Epidemiology of MRSA was described by Daniel Jernigan, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia.

• He noted that when MRSA resistance began in the 1970s it was mostly a phenomenon of strains isolated within hospitals.

• However, by the late 1990s or certainly early 2000's, CA-MRSA had emerged. “ 1976-1997- este semnalată în toate ţările o creştere a frecvenţei infecţiilor nosocomiale cu SAMR;- rezistenţa la meticilină se asociază cu rezistenţa la A din alte clase nou introduse (lincosamide, fluorochinolone, noile aminoglicozide);- la sfârşitul perioadei apar tulpini care şi-au redobândit sensibilitatea la GM;- sunt raportate primele tulpini cu sensibilitate modificată la VA.

1998-2005- apariţia tulpinilor comunitare SAMR

• non-multirezistente,• dotate cu proprietăţi deosebite de colonizare,• originea lor independentă, atestată de studii moleculare;

- emergenţa tulpinilor cu rezistenţă înaltă la VA prin transferul genelor de R de la Enterococcus.

- RI la vancomicina (Japonia, 1996)- R la VA – 8 tulpini până în prezent

Fig.1 (4)

Comportamenul stafilococilor faţă de agenţi antimicrobieni Este cunoscut faptul ca fenotipul salbatic de stafilococ auriu este sensibil la penicilina. Primul mecanism de rezistenţă descris pentru stafilococ a fost sinteza de penicilinaza, ceea ce

a determinat rezistenta la: penicilina G, aminopeniciline, carboxipeniciline si ureidopeniciline.

10

Sensibilitatea la oxacilina Izoxazolilpenicilinele sunt betalactamine rezistente la acţiunea penicilinazelor stafilococice,

la fel ca si cefalosporinele si carbapenemele. Oxacilina este recomandată pentru detectarea rezistentei datorita stabilităţii si

reproductibilităţii rezultatelor.

Rezistenta la meticilina este determinata prin mai multe mecanisme:

a. modificarea ţintei de acţiune - cel mai frecvent mecanism, care conferă rezistenţă la întreaga clasa a betalactaminelor şi este explicată prin existenţa unei proteine suplimentare de legare, PLP2a, cu o afinitate slaba pentru betalactamine.

Proteina este codificată de o gena cromozomală, mecA, concomitent cu pierderea genei mec I (sistem inhibitor al genei mecA).

Există de asemenea 4 gene accesorii - fenA, fenB, fenC, fenD, situate la distanta de mecA, care participă la exprimarea la nivel inalt a rezistentei la meticilină, fiecare fiind implicata intr-o alta etapa de sinteză a peptidoglicanului.

b. modificarea afinitatii oxacilinei fata de PLP normale, determină rezistenţa la izoxazolilpeniciline, persistând sensibilitatea la penicilina, cefalosporine si carbapeneme.

c. hiperproductie de betalactamaze - pentru tulpinile de stafilococ auriu borderline (SA-BOR) care nu au PLP2a, dar care pot inactiva oxacilina datorita cantităţii mari de penicilinaza.

Asocierea la oxacilina a inhibitorilor de betalactamaza reface actiunea oxacilinei asupra acestor stafilococi.

Cefalosporinele sunt active împotriva acestora. Este un mecanism de rezistenţă rar semnalat.

d. Producerea unei meticilinaze in absenţa mecA, determinând un fenotip de rezistenţă rar semnalat:

sensibilitate la penicilina G, aminopeniciline, ureidopeniciline, carbapeneme, cefalosporine si rezistenţa la oxacilina.

Rezistenta la MLSK (macrolide, lincosamide, sinergistine, ketolide) Mecanismele implicate in producerea rezistentei stafilococului la aceste antibiotice sunt:

1. modificarea tintei de actiune-50S ribozomal - este codificată de genele ermA (purtata de transpozoni), ermB si ermC (purtate de plasmide).

o Sunt descrise doua tipuri de expresie fenotipică pentru acest mecanism de rezistenţă: • constitutiva, care conferă rezistenta la macrolide cu 14C, 15C si 16C, lincosamide, ketolide si streptograminaB (fără a modifica actiunea sinergica a celor doua streptogramine);• inductibila, care determina rezistenta la macrolidele cu 14C si 15C, ramânând sensibile macrolidele cu 16C, lincosamidele si ketolidele.

2. enzime inactivatoare;3. eflux activ - prin gena msrE, responsabilă de eliminarea eritromicinei intrabacteriene.

Rezistenţa la macrolide a stafilococilor poate fi determinată prin eflux (codificat de gena msrA cu instalarea R la macrolide si streptogramină B) sau prin modifcarea ţintei ribozomale, cu afectarea macrolidelor, lincosamidelor si streptograminei B – fenotipul MLSB.

Modificarea ţintei ribozomale prin intervenţia unei metilaze (ce acţionează la nivelul 23S a ARNr) scade in acest fel ataşarea antibioticelor din grupul MLS la nivelul ţintei ribozomale

11

Gena erm codifică sinteza enzimelor care determină rezistenţă inductibilă sau constitutivă la grupul MLS.

Gena msrA determină apariţia fenotipului MS (rezistenţă la eritro, rezistenţă inductibilă la streptogramină B si sensibilitate la clindamicină).

Tulpinile MLSB cu rezistenţă inductibilă demonstrează in vitro rezistenţă la macrolidele cu 14 si 15 atomi de C, dar sunt sensibile la cele cu 16 atomi, la lincosamide si streptogramina B

Tulpinile MLSB cu rezistenţă constitutivă sunt rezistente la toţi agenţii.

Rezistenţa inductibilă la clindamicină Demonstrarea rezistenţei inductibile in prezenţa unui inductor puternic al sintezei metilazei

implicate, se detectează prin metoda difuzimetrică, plasând adiacent două discuri de eritromicină şi clindamicină (15 g respectiv 2 g).

Distanţa dintre discuri 15-20 mm.

Interpretare Dacă tulpina prezintă o rezistenţă inductibilă la clindamicină, eritromicina va difuza in mediu,

inducând rezisistenţa la lincosamide, cu apariţia unei turtiri a diametrului z.i. pentru clindamicină (“zona D”).

Tulpinile rezistente la ambele antibiotice – rezistenţă constitutivă (fenotip MLSB).

Rezistenţa la fluorchinolone Mecanismele de aparitie a rezistentei la fluorchinolone sunt:

1. modificarea ADN-girazei si topoizomerazei IV datorită unor mutaţii cromozomiale la nivelul genelor gyrA si parC, ceea ce confera rezistenta la toate fluorchinolonele;

2. pompe de eflux;3. diminuarea penetrării prin peretele bacterian.

Ro: din 589 de tulpini de S aureus (majoritatea din comunitate), 266 dintre tulpini au fost testate si la fluorchinolone, procentul de rezistenta semnalat fiind de 33% (53,1% pentru MRSA si 12,4% pentru MSSA)

Stiudiu: Institutul “Matei Bals”, 2005

Rezistenta la ciclineMecanismele de rezistenta ale stafilococului la cicline sunt:

1. pompa de eflux datorita unei gene, TET, care confera rezistenta la tetraciclina, minociclina ramânand activă;

2. modificarea tintei de actiune, ceea ce confera rezistenta la toate ciclinele.

Ro: aprox. 38% tulpini R (89% pentru MRSA si 27% pentru MSSA).

Rezistenta la rifampicina

12

apare prin modificarea ARN-polimerazei, fiind descrisa o rezistenta de nivel inalt, cu CMI peste 32 mg/l si o rezistenta de jos nivel, cu CMI=1-4 mg/l.

Rezistenta la glicopeptide Aparitia in numar mare a tulpinilor de enterococi rezistenti la vancomicina a atras atentia

cercetatorilor din domeniul medical asupra posibilităţii aparitiei rezistentei la vancomicina si în rândul stafilococilor.

In 1992 s-a obtinut in laborator o tulpina de stafilococ auriu intermediar sensibil la vancomicina (VISA), dupa treceri succesive ale unei tulpini MRSA prin concentratii crescatoare de vancomicină.

Tot in laborator s-a reusit transferarea genelor de rezistenţă ale enterococilor (Van A, Van B, Van C) la o tulpina de stafilococ

Au fost presupuse doua mecanisme de modificare a sensibilitatii stafilococilor la glicopeptide:a. presiune de selectie exercitata de vancomicina; b. transfer de gene de rezistenta de la enterococ vancomicino-rezistent (VRE) la stafilococ.

In 1996, prin pasaje succesive ale unei tulpini MRSA, in mediu conţinând vancomicina, s-a obţinut obţinut prima tulpina VRSA: CMI initial - 1,5 mg/l, CMI final - 100 mg/l.

Au fost presupuse doua mecanisme de modificare a sensibilitatii stafilococilor la glicopeptide:a. presiune de selectie exercitata de vancomicina; b. transfer de gene de rezistenta de la enterococ vancomicino-rezistent (VRE) la stafilococ.

Pe langa tulpinile VISA/GISA, au fost descrise subpopulatii de stafilococ auriu ce reusesc să se dezvolte in mediu de cultura conţinând vancomicina, desi populatia majoritara este sensibila la vancomicina;

analizate separat, aceste subpopulatii minoritare au CMI 8 mg/l, mai mare decat CMI a tulpinii majoritare - 1-4 mg/l.

Acestea au fost numite h-VISA/h-GISA (heterogeneous VISA/ GISA).

Exista inca multe controverse in ceea ce priveste definirea h-VISA, cea mai utilizată definiţie fiind:

cel putin 1/106 colonii de stafilococ auriu care cresc in mediu BHI-agar (infuzie-cord creier – brain heart infusion ), suplimentat cu 4 mg/l de vancomicina

Diferenţierea VISA-VRSA Tenover FC- The threat of glicopeptide resistant S. aureus. The changing faces of S. aureus-

Presentation to ECCMID, 2004, Praha VISA reprezinta o modificare fenotipica datorată unei mutaţii apărute ca urmare a presiunii

de selectie exercitată de vancomicina. VRSA reprezinta o modificare genotipică, necorelata cu o presiune de selectie exercitată de

vancomicina. Se pare ca ar fi vorba de un transfer al genei Van A de la enterococi rezistenţi la o tulpina

MRSA.

Tenover FC- The threat of glicopeptide resistant S. aureus. The changing faces of S. aureus- Presentation to ECCMID, 2004, Praha

A blood agar plate incubated for 24h at 35°C in which the multiple colonial morphologies of the Michigan VISA strain can be observed. The large cream colored colonies and smaller gray colonies demonstrated the same antibiogram (vancomycin MIC= 8 ug/ml) and pulsed field gel electrophoresis profiles.

13

Tulpini VISA – Tenover, 2001 (Raport CDC)

Din punct de vedere morfologic, aceste tulpini au un perete bacterian de doua ori mai gros decat stafilococii sensibili la vancomicină, perete bogat in monomeri care capteaza vancomicina inainte de a ajunge la nivelul situs-urilor reale de acţiune (unde se iniţiază sinteza peretelui bacterian).

Se constată: cresterea lentă, morfologie anormală, inhibarea turnover-ului celular cu inhibarea separării celulelor-fiice la sfârşitul diviziunii celulare;

o corelaţie inversă intre nivelul vancomicin-rezistenţei şi nivelul meticilin-rezistenţei (scaderea CMI pentru meticilina de la 800 la 1,5 mg/l).

(J. Cohen, 2004, Benea O., 2004).

Pana in prezent CDC a raportat 8 tulpini de VRSA documentate bacteriologic si genetic:

1. tulpina Michigan 1 izolata de la un pacient cu diabet zaharat, boală vasculară periferică şi insuficienţă renala cronică, care din aprilie 2001 a primit numeroase scheme de antibiotice pentru o infecţie cutanată cronică (picior diabetic), inclusiv vancomicina. In aprilie 2002 s-a semnalat bacteriemie cu MRSA dupa amputaţia halucelui, pacientul primind vancomicina si rifampicina. In iunie 2002 se diagnostichează infectie de cateter cu o tulpină de stafilococ rezistentă atat la oxacilina, cât si la vancomicina (CMI oxacilina peste 16 mg/l, CMI vancomicina peste 128 mg/l).Concomitent, s-au izolat VRSA si VRE de la nivelul piciorului.

Sievert DM, Boulton ML, Stoltman G et al - Staphylococcus aureus Resistant to Vancomycin - United States, 2002. MMWR, 2002; 51: 565-567

“tulpina 2”: Pensylvania a fost izolata in octombrie 2002 de la un pacient cu ulcer cronic al piciorului şi posibilă osteomielita. Metoda difuzimetrica utilizată a aratat o zonă de inhibiţie de 12 mm, iar pe mediu BHI agar cu adaos de vancomicina s-a semnalat cresterea stafilococului. Determinarea sensibilitaţii la vancomicina a continuat prin efectuare de E-test (CMI, 64 mg/l), precum si prin metoda microdilutiilor in bulion (CMI, 32 mg/l).

Miller D et al- Public Health Dispatch: Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus - Pennsylvania, 2002. MMWR, 2002; 51: 902

3 tulpina New York a fost raportată in aprilie 2004, fiind izolata din urocultura la un pacient asistat intr-un azil. Desi la testarea prin MicroScan, CMI la vancomicina fusese de 4 mg/l, efectuarea unui E-test a indicat CMI/ peste 256 mg/l.Metoda microdilutiilor in bulion a confirmat tulpina drept VRSA (CMI, 64 mg/l).

Kacica M, McDonald LM - Brief Report: Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus - New York, 2004 MMWR, 2004; 53: 322-3

14

4. tulpina Michigan 2 a fost raportata in februarie 2005 la un bărbat diabetic, 78 ani, care primise timp de 9 săptamâni tratament cu vancomicina dupa protezare de valva aortică. Ulterior a avut o infectie de parţi moi de unde s-a izolat VRSA cu CMI-256 mg/l (microdilutii si E-test); concomitent, s-a descoperit VRE în coprocultura. De mentionat ca Vitek2 a încadrat tulpina de stafilococ in mod eronat ca VSSA (CMI sub 1 mg/l).

CDC Atlanta/ www.cdc.gov/ncidod/hip/vanco.htm

5. tulpina Michigan 3 a fost raportata in noiembrie 2005 la o pacientă care prezenta infectie de parţi moi dupa o paniculectomie pentru obezitate. Pacienta avusese initial infectie cu MRSA pentru care a primit cel putin 2 luni vancomicina. Ulterior, s-a izolat VRE şi apoi VRSA (CMI, 512 mg/l) de la nivelul zonei infectate.

J. Rudrick – www.michigan.gov/mdchlab

Aparent, VRSA nu se coreleaza cu administrarea de vancomicina pentru al doilea si al treilea caz (Tenover)

Rezistenta la cotrimoxazol

Mecanismele de rezistenta a stafilococului la cotrimoxazol sunt: 1. modificarea enzimelor-ţintă – dihidrofo-latreductaza si tetrahidrofolatreductaza; 2. hiperproductia acestor enzime ţinta.

Ro: 20% (73% MRSA si 11% MSSA)

TESTAREA SENSIBILITATII – CRITERII CLSI

Condiţii de testare Agar Mueller-Hinton Inoculum – suspensie de colonii, echivalent al standardului 0.5 McFarland Incubare: 35ºC - 16-18 ore (24 ore pentru: oxa, meticilina, nafcilin, vancomicina) Testarea la peste 35ºC – poate sa nu deceleze tulpinile de stafilococi rezistenti la

oxacilina (atât S.aureus cat si SCN)

Controlul de calitate – condiţii minime Tulpini de referinta: S. aureus ATCC 25923 E. coli ATCC 35218 (pentru testarea asociatiei β-lactamice – inhibitori de β-lactamaze) S. aureus ATCC BAA-977 si S. aureus ATCC BAA-976 (pentru controlul de calitate al

testului de inductie la clindamicina)

Consideratii generale SARM, sau SRM , ramân denumirile cele mai frecvente pentru S aureus rezistent la

meticilina sau stafilococi rezistenti la meticilina, desi meticilina nu este antibioticul utilizat in terapie sau/si testare

In multe articole se utilizează denumirile din engleza (MRSA, MRS), toate cu aceeaşi semnificaţie a rezistenţei la oxacilina/meticilina

Pentru tulpinilie de S aureus si de stafilococi coagulaza negativi (SCN) sensibile la oxacilina, rezultatele pentru cefeme orale sau parenterale, β-lactamice – inhibitori de β-lactamaze, carbapeneme trebuie raportate conform criteriilor interpretative.

15

Pentru SARM si SRM ca si pentru stafilococi rezistenti si la alti agenti antimicrobieni (e.g. peniciline, β-lactamice – inhibitori de β-lactamaze, cefeme, carbapeneme), rezultatele in vitro pot indica “sensibilitate”, iar antibioticele sa nu fie active in vivo

Detectarea rezistentei la oxacilina

Testarea rezistentei la oxa prin:

- Gena mecA

- Evidentierea produsului genei mecA (PLP2a)

Sunt testele cele mai utile pentru confirmarea rezultatelor obtinute prin metoda difuzimetrica in cazul infectiilor severe stafilococice

Nu se testează de rutină tulpinile de S.saprophyticus izolate din infectii urinare deoarece infectiile de acest tip răspund bine la concentratiile urinare atinse de antibiotice (in cazul infectiilor fără complicaţii).

E.g: nitrofurantoin, cotrimoxazol, fluorochinolone

Pentru unele asocieri: microorganism – agent antimicrobian, absenţa sau semnalarea rară a tulpinilor rezistente duce la formularea doar a rezultatelor “sensibil”.

In cazul în care, pentru astfel de asocieri, se obţin alte rezultate (R sau IR) se impune confirmarea identificării şi a rezultatelor antibiogramei (tulpina se conservă şi se expediază la un laborator de referinţă care va utiliza criteriile CLSI pentru confirmare/infirmare).

Test/.Grup raportat

Antib Disc

R

Φ zona inhibitieI

S

CMI echivPunct de ruptura(µg/mL) R

S

Peniciline

APenicilina

10U </= 28

- >/= 29

Beta- lactamaze

</= 0.12

Stafilococii sensibili la penicilina sunt S şi la alte peniciline, asocierea β-lactamice – inhibitori de β-lactamaze, cefeme, carbapeneme (aprobate de către FDA pentru tratamentul infectiilor severe).

Tulpinile R la P şi S la oxa, sunt R la penicilinele inactivate de catre penicilinze şi S la alte peniciline stabile la penicilinaze, asocierea β-lactamice – inhibitori de β-lactamaze, unele cefeme si carbapeneme.

Concluzie Testarea sensibilitatii stafilococilor la P si Oxa este suficientă pentru a preciza S sau R pentru

o clasa larga de antibiotice beta-lactam. Nu este indicată testarea altor peniciline, asocierii β-lactamice – inhibitori de β-lactamaze,

cefeme, carbapeneme.

Alte consideratii

16

Tulpinile de S aureus R la P şi S la oxa = produc β-lactamaze – se indica testarea cu discul de 10 UI P (in locul testării A).

Testarea cu P se indica pentru: toate penicilinele sensibile la actiunea beta-lactamazelor (ampicilina, amoxicilina, azlocilin, carbenicilina, mezlocilin, piperacilin, ticarcilina).

Testul (+) pentru producerea de beta-lactamaze = indica rezistenta pentru aceste antibiotice Pentru stafilococii R la oxa – se raporteaza ca R (sau nu se raporteaza.) Pentru S aureus şi S lugdunenesis, ** respectiv S aureus

Test/.Grup raportat

Antib Disc

R

Φ zona inhibitieI S

CMI echivPunct de ruptura(µg/mL) R

S

Peniciline

AOxacilina * 30µg

cefoxitin

** 1 µgoxa

</= 21

</= 10

-

11-12

>/=22

>/= 13

>/= 4 (oxa)>/= 4

</= 2

</= 2

Comentarii Pentru S aureus, testarea cu discul de cefoxitin este comparabilă cu testarea pentru oxa ca test

predictiv pentru prezenţa genei mecA; Citirea pentru cefoxitin este mai uşoară = metoda preferată/indicată Pentru S. lugdunensis se utilizeaza numai testarea la cefoxitin (este testul “surogat” pentru

raportarea pentru oxacilină). Dacă pentru S aureus obţinem pentru oxacilină un rezultat intermediar, recurgem la:

- evidientierea genei mecA sau PLP2a- testul cu discul de cefoxitin

Se raportează rezultatele la testele alternative şi nu rezultatul “I”!

17

Pentru stafilococi coagulaza negativi (excepţie S lugdunensis)Test/.Grup raportat

Antib Disc

R

Φ zona inhibitieI S

CMI echivPunct de ruptura(µg/mL) R

S

Peniciline

AOxacilina 30µg

cefoxitin

1 µgoxa

</= 24

</= 10

-

11-12

>/=25

>/= 13

>/= 0.5 (oxa)>/= 0.5

</= 0.25

</= 0.25

Comentarii

Pentru SCN se prefera metoda discului cu cefoxitin Deşi criteriile pentru oxacilină se corelează cu prezenţa genei mecA in cazul S.epidermidis,

aceste interpretări pot duce la un exces de rezultate “R” in cazul altor SCN (e.g. S. saprophyticus)

Pentru SNC, metoda discului cu cefoxitin are o specificatate mai mare decât cu discul de oxacilină (sensibilitate egală).

Concluzie: metoda discului cu cefoxitin = metoda “surogat” pentru a exprima rezultatele şi pentru oxacilină.

Bazându-ne pe rezultatele pentru cefoxitin, raportam rezultate şi pentru oxacilina (S sau R). Daca se testează o penicilină stabilă faţă de pencilinaze, se preferă oxacilina, iar rezultatele se

aplică şi pentru alte peniciline rezistente la penicilinaze (e.g. cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina).

Oxacilina este mai rezistentă la degradarea prin stocare/depozitare (este mai stabilă) şi poate decela mai bine heterorezistenta tulpinilor de stafilococi.

Cefoxitinul se poate utiliza in locul oxacilinei. Pentru toate tulpinile de stafilococi, diametrul zonei de inhibitie al oxacilinei se citeste “in

lumina transmisa”: orice crestere in zona de inhibitie = rezistenţă la oxacilina. Citirea pentru cefoxitin – in “lumina reflectată” Toate tulpinile de stafilococ cu z.i. </= 14 mm pentru vancomicină, se vor testa pentru

CMI. Metoda difuzimetrică nu diferenţiază tulpinile cu sensibilitate redusă (CMI: 4-8 µg-mL) de

tulpinile sensibile (CMI: 0.5-2 µg-mL), chiar şi dacă sunt incubate 24 ore. Tulpinile de S aureus rezistente la vanco (VRSA) (CMI: >/= 16 µg/mL) pot produce doar o

crestere redusă în jurul discului de vanco. Placa de triaj de agar BHI, conţinând 6 µg/mL vancomicină (folosită pentru detectarea

enterococilor rezistenţi la vanco) poate fi inoculată pentru a creşte sensibilitatea detectării tulpinilor de S aureus cu RI la vanco.

Orice tulpină de S aureus cu CMI peste/egal cu 4 µg/mL se expediază la laboratorul de referinţă.

Recomandări CDC

18

CDC recomandă pentru determinarea VISA-VRSA ca pentru toate tulpinile de MRSA sa se efectueze teste screening de determinare a modificarii sensibilitatii la vancomicina, prin doua metode diferite:

a. inocul de 108 UFC in mediu BHI-agar conţinând 6 mg/l vancomicina;b. însămânţare pe mediu Mueller- Hinton agar (MHA), conţinând 5 mg/l vancomicina.

Se poate confirma modificarea sensibilitaţii la vancomicina dacă: a. CMI: 8-16 mg/l;b. E-test vancomicina inregistreaza un CMI 16 mg/l pe mediu MHA; c. semnalarea creşterii stafilococului pe mediu BHI/agar, dupa incubare 24 h.

• Sensititre® Automated System Accurately Detects VRSA

• TREK Diagnostic Systems supplies Sensititre automated AST/ID instrumentation to clinical diagnostic laboratories throughout the world.

• Sensititre susceptibility plates can be read automatically using the ARIS® 2X or AutoReader instruments.

• Recently, the Sensititre automated system accurately detected four Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VRSA) strains at the Centers for Disease Control (CDC).* A brief summary is presented here, full details can be obtained from Trek Diagnostics.

• Tulpinile de S aureus si SCN rezistente la macrolide pot prezenta o rezistenţă constitutivă sau inductibilă care duce la apariţia

• fenotipului MLSB, (indus de gena erm care codifică metilarea subunităţii 23S a ARNr), adică, rezistenţă pentru macrolide, lincosamide, si streptogramină B sau

• a rezistenţei doar faţă de macrolide (prin mecanismul de eflux, codificat de gena msrA)

.

• Rezistenţa inductibilă la clindamicină se poate detecta prin plasarea discului de 2 µg la o distanţă de 15-26 mm distanţă faţă de un disc de 15 µg eritromicină.

• După incubare, tulpinile care nu determină turtirea zonei de clindamicină, trebuie raportate ca S la clindamicină.

• Tulpinile care determină turtirea diametrului z.i. pentru clindamicină adiacent discului de eritromicină (aşa-numita zonă “D”), indică rezistenţa inductibilă la clindamicină.

• Raportare: tulpină R, la care se adaugă: “acest izolat este probabil R la clindamicină pe baza detectării rezistenţei inductibile. Clindamicina poate totuşi fi eficientă pentru tratarea pacientulu” (nu se raportează pentru izolate din urină).

19

FENOTIPURI DE REZISTENŢĂ FAŢĂ DE ANTIBIOTICE LA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

Importanţa medicală a S.pneumoniae

- reprezintă cel mai frecvent agent etiologic al pneumoniei lobare acute;- mai mult de jumătate din otitele medii acute la copii sunt determinate de această specie;- figurează în primii trei agenţi etiologici majori ai meningitelor purulente, meningita

pneumococică având cel mai sever prognostic .

Habitat natural

• prezentă în excusivitate la om;

• comensal al mucoasei tractusului respirator superior, rata portajului variind în limite largi (5-70%);

• colonizare rară a mucoasei vaginale, în special la fetiţe şi femei tinere.

Caractere morfo-tinctoriale• diplococi gram-pozitivi,cu aspect lanceolat, dispuşi cu axul lung în prelungire,

privindu-se prin extremităţile rotunjite;• în produse patologice prezintă capsulă.

Caractere de cultivare• cultivă numai pe medii imbogăţite cu lichide biologice;• unele tulpini sunt strict carboxifile;• dezvoltă pe geloză-sânge colonii mici α-hemolitice de tip S care sub efectul

autolizinei devin cu centru deprimat;• coloniile au un aspect mucos la tulpinile care sintetizează în cantitate importantă

polizaharid capsular.•

20

Criterii de diferenţiere de alţi streptococi α-hemolitici

• sensibilitatea la optochin;

• testul de solubilitate în bilă;

• patogenitatea pentru şoarece.

Rezistenţa în mediul extern• deosebit de vulnerabil în condiţii de desicaţie; • este fragil la temperaturi scăzute.

Antigene de specificitate- cu specificitate de specie- substanţa C, precipitată de o β-globulină serică (CRP), prezentă în concentraţii

ridicate în boli acute inflamatorii;- cu specificitate de tip- aprox. 90 serotipuri pe baza polizaharidului capsular, identificate prin reacţia de

umflare a capsulei;- proteina M, distinctă antigenic de a S. pyogenes, diferenţiază pneumococul in

serotipuri, diferite de cele capsulare.

21

Factori de patogenitate

capsula , cu proprietăţi antifagocitare, reprezintă factorul major de patogenitate, Ag capsulare stimulând Ac cu efect protector;complexul peptidoglican-acizi teichoici are un efect endotoxină-like;proteine de suprafaţă

- PspA (Pneumococcal surface antigen A) inhibă opsonizarea mediată de complement şi se poate lega de lactoferină;

- CbpA (Cholin binding proteine A) este o adezină majoră la receptorii celulari;- autolizina LytA eliberează fragmente din peretele celular cu efecte inflamatorii

şi pneumolizina;

• citotoxine- pneumolizina exercită un efect citotoxic pe celulele epiteliului bronşic şi

alveolar;• exoenzime

- neuraminidaza, hialuronidaza, IgA1-proteaza.

PsaA

Neuraminidase

Pneumolysin

Autolysin

PspA

Hyaluronate LyaseCbpA

Other Cbps

CellWall

Cell Membrane

22

Manifestări clinice

• Infecţii ale tractusului respirator

• pneumonii lobare:forma clinico-radiologică cel mai frecvent întâlnită la adulţi, cu leziuni de alveolită fibrino-leucocitară; clinic se manifestă cu febră, tuse productivă, junghi toracic;

• otite medii acute: 2/3 din cazuri la copii de 6 luni-2 ani datorită particularităţilor anatomice ale trompei Eustachio;

• sinuzite şi mastoidite acute;

• Infecţii extrarespiratorii

• bacteriemii în 20-30% din cazurile de pneumonie cu sepsis sever şi localizări secundare;

• meningite purulente, cu posibilă evoluţie deosebit de severă

• endocardite , mai ales la cei cu valvulopatii;

• peritonite primitive consecutive ascensiunii bacteriei din vagin (la fetiţe) sau pe cale hematogenă la cei cu ascită;

• alte tipuri de infecţii: conjunctivite purulente (la sugari), osteo-artrite, infecţii urinare, infecţii genitale înalte la femeie.

Imunitatea

• asigurată în special de Ac anticapsulari cu efect opsonizant.

• Diagnostic bacteriologic

• examen microscopic direct se bazează pe caracterele morfotinctoriale şi asocierea bacteriilor cu celule inflamatorii;

• izolarea pe geloză-sânge cu incubare in atmosferă cu CO2;

• identificarea pe baza caracterelor de cultură, sensibilitatea la optochin, testul bilolizei sau identificarea antigenică (latexaglutinare);

• în meningite, poate fi decelat în LCR Ag polizaharidic printr-o reacţie de latexaglutinare;

Evoluţia rezistenţei la antibiotice

1943-1966-au fost izolate primele tulpini cu rezistenţă la SU, T, E, CL, SXT, C;

1967raportarea primei tulpini de pneumococ cu sensibilitate diminuată la P în Noua Guinee;

1967-1976raportarea sporadică de izolate clinice cu sensibilitate modificată la P în diferite ţări;

1977-1978izolarea în Africa de Sud a primelor tulpini R la P şi totodată cu determinanţi de R la 3 sau mai multe antibiotice (tulpini multirezistente);

1992primul caz de meningită pneumococică cu eşec terapeutic după tratament cu cefotaxim (CTX), raportat în Spania, acest fenotip fiind apoi izolat şi în alte ţări;

1997-1998primele tulpini cu sensibilitate modificată la FQ raportate în Canada.

23

În prezent, în majoritatea ţărilor de pe toate continentele se înregistrează o evoluţie ascendentă a frecvenţei tulpinilor rezistente la antibioticele menţionate, unele cu determinanţi multipli de R.

Tulpinile multirezistente aparţin unui număr limitat de serotipuri capsulare (6, 9, 14, 19, 23), fiind recunoscute un număr restrâns de clone cu o largă răspândire pe glob.

24

Rezistenţa la beta-lactamice

- specie natural sensibilă la toate A din această familie, cu excepţia monobactam;- rezistenţa câştigată, de natură cromozomală, prin reducerea afinităţii PLP faţă de

antibiotice:• mutaţii la nivelul genelor PLP: modificarile calitative si cantitative ale

PLP: lipsa PLP1a si 1b, aparitia unei noi PLP 1c, diminuarea afinitatii pentru PLP 2a, lipsa PLP 2b.

• recombinare a genelor PLP (gene “mozaic”);

- nu s-au semnalat tulpini producătoare de β-lactamaze.

Activitatea antipneumococică a antibioticelor beta-lactamice, comparativ cu penicilina

mai active la fel de active mai puţin active

AMOXICILINA OXACILINACEFTRIAXONA PIPERACILINA CEFACLORCEFOTAXIMA CEFPODOXIMA CEFUROXIMACEFPIROMA CEFOPERAZONAIMIPENEM CEFTIBUTENMEROPENEM CEFETAMET

Particularităţi ale pneumococilor penicilino-rezistenţi- rezistenţă de nivel jos (CMI 0,1-1µg/ml) sau de nivel înalt (CMI ≥2µg/ml), cu impact

terapeutic diferit în raport cu localizarea infecţiei;- este influenţată variabil sensibilitatea faţă de toate antibioticele beta-lactamice, cel mai

puţin afectate fiind carbapenemele;- frecvent asociată cu rezistenţa la antibiotice din alte familii (macrolide, T, C, SXT) iar

recent au fost izolate tulpini cu rezistenţă concomitentă la cefalosporine cu spectru larg: (cefotaxim) CTX, ceftriaxonă (CRO);

- VA, telitromicina, quinupristină/dalfopristină sau linezolidul sunt folosite în terapia cu tulpini multirezistente.

-

Rezistenţa la grupul MKLS- sensibilitate naturală faţă de toţi reprezentanţii;- mecanisme de rezistenţă:

prin diminuarea afinităţii ţintei de acţiune (subunitatea ribozomală 50S)- mecanism codificat de gena ermB- rezistenţă de nivel înalt faţă de macrolide şi lincosamide (fenotip MLSB)- CMI la eritromicină >64 µg/ml;

prin eflux- mecanism codificat de gena mefE- rezistenţă de nivel jos numai faţă de macrolidele cu 14 şi 15 atomi C (fenotip M)- CMI la eritromicină 2-16 µg/ml.

Rezistenţa la chinolone- S.pneumoniae este natural rezistent la chinolone din generaţia 1;- pefloxacina, ofloxacina şi ciprofloxacina sunt puţin active in vivo;

25

- pot fi folosite în terapie: levofloxacina, moxifloxacina sau gatifloxacina;- rezistenţa dobândită, recent semnalată, poate apare prin:

• eflux activ (rezistenţă de nivel jos);• mutaţii în mai multe trepte ale genelor care codifică topoizomeraza IV (par C şi

par E) sau /şi ADN-giraza (gyr A şi gyr B), cu scăderea afinităţii acestor enzime pentru FQ active.

• Rezistenţa la alte antibiotice

rezistenţa câştigată la tetracicline, cloramfenicol şi cotrimoxazol are aceleaşi mecanisme ca cele descrise la S.aureus;

ca şi alţi streptococi, prezintă o rezistenţă naturală de nivel scăzut faţă de aminoglicozide; nu au fost semnalate tulpini cu rezistenţă la vancomicină şi linezolid.

Antibiograma interpretativă pentru S.pneumoniae

Antibiotice indicator- OX (1µg) este folosit pentru decelarea tulpinilor cu sensibilitate modificată la P;- E şi L (sau CL) pot aprecia sensibilitatea la grupul MLS şi aduc informaţii

privind mecanismul de rezistenţă;- NOR sau CIP pot fi folosite pentru anticiparea riscului dezvoltării rezistenţei la

FQ în cursul tratamentului.

Citirea interpretativă- pentru tulpinile cu rezistenţă la OX, va fi determinată CMI faţă de P pentru confirmare şi

aprecierea nivelului de rezistenţă;- rezistenţa concomitentă a tulpinilor penicilino-rezistente faţă de cefotaxim sau

ceftriaxonă nu poate fi depistată decât prin determinarea CMI la aceste antibiotice.

Standardul CLSI

• Aceleasi conditii de testare ca pentru S aureus, dar incubarea in atmosferă de 5%CO2, 20-24 ore.

• Tulpina de referinţă S. pneumoniae ATCC 49619.

Precizări

• Antibiotice utile în terapia infecţiilor pneumococice: amoxicilina, ampicilina, cefepim, cefotaxima, cefuroxim, ertapenem, imipenem, meropenem.

• Antibiograma difuzimetrică pentru aceste antibiotice nu este indicată, determinarea CMI fiind cea mai bună metodă de testare a activităţii lor in vitro.

• Penicilina şi cefotaxima sau ceftriaxona sau meropenemul trebuie testate printr-o metodă a diluţiilor adecvată (cea indicată de CLSI) şi cu raportarea de rutină a izolatelor din LCR.

• Aceste izolate se vor testa şi pentru vancomicină, prin determinarea CMI sau prin metoda difuzimetrică.

• Pentru unele combinaţii microorganism-agent antimicrobian, absenţa sau detectarea foarte rar a unor tulpini rezistente duce, în practică doar la obţinerea de rezultate din categoria “S”.

• Dacă în aceste cazuri se obţin rezultate discordante, se impune (ca şi în alte cazuri) repetarea identificării şi confirmarea rezultatelro antibiogramei, şi expedierea tulpini la un laborator de referinţă.

Testarea prin metoda difuzimetrică

26

• Disc - 1g oxacilină

• S: diamentrul: >/= 20 mm

• R si IR -

• Tulpinile de pneumococ cu z.i. pentru oxacilină >/= 20 mm sunt sensibile la P, şi pot fi considerate S şi la:

• ampicilină, amoxicilină, amoxicilină-acid clavulanic, ampicilină-sulbactam, cefaclor, cefdinir, cefepimă, cefetamet, cefiximă, cefotaximă, ceftizoximă, ertapenem, imipenem, loracarbef şi meropenem (evident, nu facem testarea pentru aceste antibiotice).

• Pentru penicilina şi cefotaxima, ceftriaxona, sau meropenem se va determina CMI pentru acele izolate la care z.i. </= 19 mm, deoarece aceste diametre apar pentru tulpini R sau IR la P, sau rar pentru unele tulpini S.

• Nu se raportează tulpinile ca “R” sau “IR” numai pe baza z.i. </= 19 mm!

Concentraţiile critice pentru aprecierea sensibilităţii faţă de peniciline şi cefalosporine cu spectru extins (CLSI 2008)

• Tulpini izolate din meningitepenicilina sensibil ≤ 0,06 μg/ml

rezistent ≥ 0,12 μg/ml

ceftriaxona sensibil ≤ 0,5 μg/mlcefotaxima rezistent ≥ 2 μg/ml

Concentraţiile critice pentru aprecierea sensibilităţii faţă de peniciline şi cefalosporine cu spectru extins (CLSI 2008)

• Tulpini izolate din alte produse decât L.C.R.penicilina sensibil ≤ 2 μg/ml

rezistent ≥ 8 μg/ml

ceftriaxona sensibil ≤ 1 μg/mlcefotaxima rezistent ≥ 4 μg/ml

Vancomicină - disc 30 g/disc

• Nu s-au izolat tulpini de pneumococ cu z.i. </= 17 mm;

• dacă se semnalează, se trimit obligator la un laborator de referinţă.

27

Macrolide

• Sensibilitatea sau rezistenţa pentru azitromicină, claritromicină şi diritromicină se testează folosind eritromicina.

Tetracicline

• Tulpinile sensibile la tetraciclină trebuie considerate sensibile şi la doxiciclină şi minociclină.

28