Frotiul de sânge

Frotiul este un preparat microscopic care se realizează prin etalarea materialului biologic în monostrat pe lame portobiect. Aceste preparate se efectuează din sânge, din secreţii (mamare, bronşice, vaginale), din celule provenite din descuamări epiteliale sau exfoliere şi din sedimente celulare (urină, suc gastric, bilă, LCR, lichid de ascită sau lichid pleural). Indiferent de materialul biologic utilizat, tehnica frotiului este o metodă des utilizată în citologie, devenind prioritară atât în domeniul cercetării biologice cât şi ca procedeu diagnostic în practica medicală.• Examenul morfologic al elementelor celulare se face pe:• preparate proaspete necolorate • Metoda : Pentru examinarea elementelor celulare sanguine pe preparate

proaspete necolorate, se recoltează cea de a doua picătură de sânge apărută după puncţionare, pe partea centrală a unei lame portobiect degresată, se acoperă cu o lamelă şi se examinează imediat la microscop.

• Rezultate : hematiile apar colorate galben-verzui, aşezate în fişicuri, leucocitele apar ca celule mai mari decât hematiile, mai rare şi mai strălucitoare.

• preparate proaspete colorate supravital• Metoda : Pentru examinarea preparatului proaspăt colorat supravital, se

procedează ca în cazul preparatelor proaspete necolorate, adăugându-se la marginea lamei portobiect, o picătură de albastru de metilen. Colorantul pătrunde prin capilaritate.

• Rezultate: Nucleii leucocitelor şi unele din granulaţiile acestora, se colorează în albastru.

• preparate permanente, fixate şi colorate prin tehnici de colorare obişnuite sau speciale, cea mai des folosită fiind tehnica May Grünwald Giemsa.

Materiale necesare: • lame obişnuite degresate (se spăla cu apă şi detergent, apoi se

degresează cu alcool-eter)• lame rodate• ace sterilizate• mănuşi de protecţie• alcool, tampoane de vată• hârtie de filtru• stativ pentru aşezarea lamelor

• Efectuarea frotiului permanent:1. Recoltarea sângelui

• La adult se face prin puncţionarea părtii laterale a pulpei mediusului sau inelarului de la mâna stângă. Se dezinfectează pulpa degetului cu un tampon de vată îmbibat în alcool, se puncţionează locul dezinfectat cu un ac steril, având grijă să se perforeze numai pielea, fără a se pătrunde prea mult în adâncime. Se şterge prima picătură de sânge apărută la locul înţepăturii, prin tamponare cu o hârtie de filtru, deoarece conţine prea mult lichid interstiţial şi impurităţi de pe piele. La noul născut şi la copilul mic, locurile de puncţie sunt: tegumentul lobului urechii şi pielea călcâiului.

2. Efectuarea frotiului permanent• A doua picătură se recoltează cu marginea mică a unei lame rodate şi

se aplică pe una din extremităţile unei lame portobiect, aşezată orizontal pe o suprafaţă plană. Pentru recoltarea celei de a doua picături, se poate chiar exprima (stoarce) pulpa degetului, deoarece în rezultatul final formula leucocitară şi aspectul morfologic al elementelor figurate sanguine nu sunt influenţate de cantitatea de plasmă. Cu lama şlefuită pe a cărei latură mică s-a recoltat picătura de sânge, se imprimă picăturii câteva mişcări de lateralitate pe o lamă portobiect, pentru ca sângele să se întindă pe toată linia de contact. Se imprimă apoi lamei rodate o unică mişcare de translaţie în lungul lamei portobiect. Se recomandă ca unghiul realizat între cele două lame să fie de 30-35 grade

3. Fixarea frotiului permanent• Se realizează prin :• metode fizice- uscare (desicare) la temperatura camerei, prin agitarea

lamei pentru a se obţine o uscare rapidă (uscarea lentă duce la ratatinarea celulelor).

• metode chimice– cu alcool metilic timp de 2 minute sau alcol etilic şi eter în părţi egale, timp de 5-15 minute.

• ! Executarea unui frotiu permanent corect depinde de :• -mărimea picăturii de sânge• -unghiul dintre lama rodată şi lama portobiect să fie de 30-35 grade• -viteza de întindere : la viteză mare se obţin frotiuri groase.

• ! Frotiul permanent corect executat trebuie să îndeplinească următoarele condiţii :

• să fie omogen• să fie subţire• să aibă margini drepte• să fie mai mic decât suprafaţa lamei• să aibă culoare roz-cărămiziu după uscare• să se termine în franjuri•

Frotiu corect executat• Nu se utilizează frotiurile care nu îndeplinesc condiţiile mai sus

arătate.• În practica medicală se notează numele celui de la care s-a recoltat

produsul pe un capăt al lamei, cu un ac subţire sau cu creionul.

Tehnica colorării frotiului sanguin permanent• Frotiurile de sânge se pot colora cu tehnici de colorare obişnuite

(hematoxilin-eozină, tricromic) sau cu tehnici de colorare speciale. În practica medicală curentă se foloseşte tehnica de colorare panoptica May Grünwald Giemsa.

Materiale necesare• -cutii Petri sau cristalizoare cu capac• -suporturi de sticlă sub formă de “u” sau “v”.• -soluţie May Grünwald (eozinat de albastru de metilen, colorant

neutru, dizolvat în alcool metilic pur, neutru)• -soluţie Giemsa concentrată (amestec de eozinat de azur de metilen,

azur de metilen, glicerină neutră, alcool metilic)

• -apă bidistilată• -cilindru gradat• -pipete

Tehnica de colorare1. Pe lamelele aşezate cu frotiul în sus se picură 10-15 picături din soluţia May Grümwald pentru a acoperi toată suprafaţa frotiului. Se lasă 2-3 minute, timp în care se produce o fixare a frotiului, alcoolul metilic din coloratul May Grünwald acţionând ca un fixator.2. Se toarnă apoi peste soluţia May Grünwald, un număr egal de picături de apă distilată neutră. Soluţia May-Grünwald diluată acţionează ca un colorant, colorând granulaţiile acidofile şi bazofile. Se lasă 1-2 minute.3. Se îndepărtează soluţia May Grünwald diluată fără spălare, prin înclinarea lamelelor, după care se acoperă frotiurile cu soluţia Giemsa diluată 1:1 cu apă distilată neutră. Se lasă 15-20 minute.

Tehnica de colorare4. Se spală lama sub jet de apă.5. Se sugativeaza usor, se usucă.6. Se examinează la microscop cu obiectivul cu imersie, pentru a observa morfologia eritrocitelor, frecvenţa şi morfologia leucocitelor .

• Pentru a se studia frecvenţa şi morfologia trombocitelor, frotiul se colorează 45 de minute cu soluţie Giemsa şi nu se spală sub jet de apă , deoarece jetul de apă antrenează trombocitele.

Rezultatele colorării• Hematiile (globulele roşii, eritrocitele) • Pe frotiul sanguin hematiile reprezintă majoritatea elemetelor celulare

şi sunt răspândite pe toată suprafaţa frotiului. Elesunt considerate echivalente celulare(celule anucleate), au formă de disc biconcav, cu diametrul de 7.1-7.3 microni (figura 6). Mişcând alternativ în sus şi în jos viza micrometrică, observăm centrul hematiei mai subţire, mai palid colorat (la periferie hematia este mai groasă

• Aceste aspecte de mai sus, sunt datorate şi faptului că hematia conţine în citoplasmă hemoglobină în cantitate mai mare în zona periferică (unde grosimea este mai mare) ; încărcarea cu hemoglobină este uniformă şi proporţională cu cantitatea de citoplasmă. În aspectul normal denumim aceasta ca izocromie, iar încărcarea inegală cu hemoglobină (în stările patologice), anizocromie.

• Dimensiunile hematiei sunt constante (izocitoză), dar pot varia în plus sau în minus în diferite boli (anizocitoză). Forma poate şi ea varia în stări patologice : aspect inelar, în rachetă, (poikilocitoză).

• Numărul hematiilor este constant (4-5 milioane hematii/ml. sânge), iar numărătoarea hematiilor se face prin diferite metode. Variaţiile în plus, peste limita superioară a numărului de hematii admis la omul normal, le denumim poliglobulie; aceasta poate fi fiziologică (la nou-născut, la cei care trăiesc la mare altitudine), sau patologică.

• Scăderea numărului de hematii sub limita admisă ca normală, apare în stări de anemie, de obicei asociată cu scăderea încărcării cu hemoglobină sau cu modificări de formă celulară.

• Uneori hematiile pot prezenta resturi nucleare, de exemplu : corpi Jolly, 1-3 granule bazofile sau resturi de membrană nuclear, Inelele Cabot, mai numeroase în stări patologice.

Leucocitele (globulele albe)• Aceste elemente figurate prezintă nucleu, deci sunt celule. Pe un frotiu

sanguin colorat May Grünwald Gimsa, se pot observa aspecte de structură, număr, ş.a

• Dupa forma nucleului şi prezenţa (sau absenţa ) în citoplasmă a granulaţiilor specifice, leucocitele se clasifică în :

• -leucocite polimorfonucleare sau granulocite - neutrofile - acidofile - bazofile

• -leucocite mononucleare sau agranulocite - limfocite - monocite

Polimorfonuclearele neutrofile• Aceste leucocite apar pe frotiul colorat May Grunwald Gimsa ca

celule sferice, de 9-15 microni, cu citoplasma acidofilă care conţine fine granulaţii specifice, colorate în violet.Aceste granulatii au dimensiuni mici, sunt foarte dese si răspândite egal în toată citoplasma. Nucleul lor este format din mai mulţi lobi uniţi între ei prin filamente de cromatină. Numărul lobilor unui nucleu arată gradul de maturitate al granulocitului. Cu cât sunt mai mulţi lobi , 5-6, cu atât celula respectivă este mai bătrână (formula Arneth)

Polimorfonuclear neutrofil, col MGG, ob X401. nucleu polilobat, 2. granulatii specifice, 3. hematie

• În sângele recoltat de la femei, 80% din neutrofile prezintă un corpuscul cromatinian, sferic sau oval, ataşat printr-un filament de unul din lobii nucleului. Acest corpuscul reprezintă cromatina sexuală şi după aspect se numeşte « drumstick » (beţişor de tobă).

• Numărul neutrofilelor dintr-o sută de leucocite variază între 62-68 ; când această proporţie este mai mare, apare neutrofilia, ce caracterizează infecţiile acute, iar când numărul lors cade, apare neutropenia.

• Polimorfonuclearele neutrofile intervin activ în apărarea organismului, în procesele inflamatorii. Rolul lor este fie acela de a excreta fermenţi proteolitici în focarul inflamator, ce vor acţiona distrugând microbii sau ţesuturile alterate, fie prin fagocitarea microorganismelor pe care le distrug apoi cu ajutorul fermenţilor. Viaţa unui polimorfonuclear neutrofil este foarte scurtă, se admite că în sângele circulant ele nu depăşesc 3-4 zile.

Polimorfonuclearul acidofil (eozinofilul)

• Apare ca o celulă sferică, de12-17 microni. Nucleul este în general bilobat, cei doi lobi fiind legaţi printr-o fină punte de cromatină (aspect de nucleu în desagă). În citoplasmă observăm granulaţii colorate în roşu viu, egale între ele, rotunde, uniform răspândite, mai mari decât la neutrofile. Prin forma şi culoarea lor, aceste granulaţii amintesc de Icrele de Manciuria (figura 8). Granulaţiile conţin peroxidaze, diferite de mieloperoxidazele neutrofilelor şi hidrolaze acide.

• Mobilitatea lui este scăzută şi au o slabă capacitate de fagocitoză. • Proporţia de eozinofile la suta de leucocite este de 1-3. Creşterea

numărului lor poartă denumirea de eozinofilie, întâlnită în stări alergice precum astmul, urticaria sau parazitoze, iar scăderea numărului lor, eozinopenie.

Eozinofil, ME. În microscopie electronică, granulaţiile(2) sunt voluminoase, de 0.5-1.5 µmin diametru şi conţin o matrice granulară, iar nucleul este în general bilobat(1).

• Aceste celule acţionează sinergic cu celelalte celule în reacţiile de hipersensibilitate de tip imediat şi întârziat. Ele au rol esenţial în distrugerea paraziţilor prin intermediul proteinelor (Eosinophil Cationic Protein - ECP şi Major Basic Protein - MBP) conţinute în cistalele din granulaţii . Membrana plasmatică are receptori pentru IgE şi pentru histamină. Numărul eozinofilelor poate fi influenţat hormonal. Granulocitul eozinofil are o viaţă mai lungă decât a neutrofilului, considerându-se că ajunge până la 9-12 zile.

Polimorfonucleatul bazofil.

• Este o celulă sferică de 10-14 microni. Nucleul bazofilului este ovalar, mai puţin lobulat, apărând uşor scobit, uneori ca o frunză de trifoi. Citoplasma deşi uşor acidofilă, conţine granulaţii răspândite în citoplasma de culoare albastră, de formă şi mărime diferită, deseori suprapuse pe nucleu, mascându-l (figura 9).

• Aceste granulaţii bazofile sunt metacromatice. Bazofilul poate trece prin peretele capilar în ţesuturi, transformându-se în mastocit.

• • Proporţia bazofilelor la suta de leucocite este de 0.25-0.50. creşterea

numărului lor, bazofilie, poate să ne indice o leucemie mieloidă.• Mobilitatea lor este scazuta si nu fagociteaza. Pot trăi în sânge 12-15

zile.

Polimorfonucleatul bazofil, ME. În microscopia electronică granulaţiile (1) apar omogene formate din mici granule dense înconjurate de o membrană. Aceste granulaţii bazofile conţin histamină şi heparină, (glicozaminiglicani sulfataţi)

Limfocitul

• Este o celulă sferică, de 7-16 microni, cu nucleul mare ce ocupă aproape toată celula, sferic, intens colorat cu coloranţi bazici, datorită faptului că prezintă o cromatină bogată dispusă în grunji mari, conglomeraţi.

• Citoplasma este mult redusă, (apare ca o banda îngustă dispusă în jurul nucleului), intens bazofilă, colorată în albastru. Obiectivul cu imersie poate detecta inconstant în citoplasmă, rare granulaţii mici, azurofile, nespecifice.

• Dupa dimensiunile lor se clasifică în :• -limfocite mici ( 7-8 microni) • -limfocite mijlocii ( 8-10 microni)• -limfocite mari (10-14 microni)• Fiecare dintre aceste limfocite prezintă caracteristici morfofuncţionale

(vezi cursul)

Limfocit, ME. În microscopia electronică se observă că nucleul prezintă cromatină densă şi nu prezintă nucleol(1). Citoplasma este saracă în organite(2)

Monocitul• Este leucocitul cel mai mare din sânge, 16-20 de microni, are formă

sferică sau ovalară, cu citoplasmă abundentă, slab bazofilă, putând prezenta granulaţii nespecifice, azurofile. Nucleul este mare, deseori reniform, sărac în cromatină, având aspect spongios. Cromatina este dispusă sub forma unor reţele fine , slab cromatică, nu conţine nucleol (figura 11). Este socotit histiocit sanguin.

• Numărul lor este de 6-10 la 100 leucocite. Creşterea numărului lor poartă denumirea de monocitoză, apare în boli infecţioase : sifilis, etc.

Monocit, ME. 1. nucleu reniform, 2. granulaţii azurofile, 3. citoplasmă abundentă.

• Studiul sângelui se efectuează prin tehnici cantitative (numărători), calitative şi biochimice. Caracterele morfologice ale elementelor figurate sanguine se studiază prin tehnici calitative.

Trombocitele

• Trombocitele - (plachetele sanguine) au dimensiuni care variază între 2-5/lm şi se găsesc în sângele periferic în număr de 150.000-400.000/mm3.

• Trombocitele se formează în măduva hematogenă, din citoplasma unui precursor, megacariocitul. Trombocitul adult este elipsoidal, cu formă de lentilă biconvexă. Este anucleat, fiind alcătuit din membrană şi citoplasmă.

• Pe frotiu poate avea forme diferite: de stea, discoidală, poligonal, depinzând de gradul de uscare a frotiului, timpul scurs de la recoltare la fixare, etc

Trombocite, col MGG, obX40